CN102382154A - 皂苷化合物及其制备方法与在制备免疫佐剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种皂苷化合物，包括金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C，从中药金铁锁中提取分离得到。本发明的皂苷化合物可诱导机体同时产生Th1型和Th2型免疫应答，且显示出比铝胶佐剂能诱导机体对疫苗产生更强的细胞免疫和体液免疫反应，因此，可以作为多种疫苗的免疫佐剂，达到较强的免疫效果。本发明提供的皂苷化合物溶血性小和安全性好，制备方法简便、质量容易控制、使用方便、可冷冻保存，有较大的临床应用价值。

金铁锁皂苷B

Description

皂苷化合物及其制备方法与在制备免疫佐剂中的应用

技术领域

本发明涉及药物化学，具体涉及从中药金铁锁中提出分离得到的皂苷化合物及其制备方法与在免疫佐剂中的应用。

背景技术

随着分子生物学的发展，第二代疫苗多以纯化重组蛋白、合成肽抗原和质粒DNA抗原为主，以替代第一代疫苗活的弱病毒抗原产生的安全隐患。然而纯化抗原通常免疫原性较弱，为了克服这一弱点，抗原需要与适当的佐剂相混合。但是，需要该佐剂有较长的稳定期，不易产生降解并易于生产。另外，最重要的是佐剂可以激发机体强烈的细胞免疫应答与抗体生成能力，使机体产生较强的免疫保护能力。由于不同的佐剂需要和不同的抗原进行作用，因而疫苗在研究中对各种类型的感染，就需要有选择性地促进机体诱导适宜的免疫应答。目前，用于人用疫苗的佐剂为铝盐佐剂(主要是氢氧化铝及其磷酸盐，Alum)。1926年至今，铝盐佐剂已成为人用疫苗中经常使用的佐剂。但铝盐佐剂存在一些问题，主要有：(1)因其理化性质特点，铝盐疫苗冷冻后胶体状态被破坏，因此不能冷冻干燥和在低温状态下运输。(2)因含盐量高，贮存日久有结晶沉淀，而分批制备相同的疫苗也显得比较困难。(3)虽然，铝是否与老年性痴呆诱发相关尚无定论，但对人、畜的神经系统可能有影响。(4)在注射部位有时会发生局部无菌性脓肿，甚至可以形成肉芽肿，轻度局部反应较为常见。(5)以铝盐佐剂作疫苗较少，它主要适用于以抗体为保护性免疫的疫苗。(6)由于主要激活2型T辅助(Th2)细胞和诱导体液免疫应答，佐剂活性低，因此，一般在如白喉、破伤风、乙肝、麻疹等疫苗中使用。(7)铝盐佐剂释放抗原物质的速度缓慢，效应也比较弱，对许多抗原都不够有效，对抗原的要求比较高。

皂苷经研究发现其可以激活哺乳动物的免疫系统，故它们的免疫佐剂活性受到了广泛关注。皂苷QS-21是最具代表性的物质，其研究已进入临床试验阶段。皂苷QS-21是南美皂树树皮提取物皂树皮皂苷(Quil A)的主要成分，研究表明其产生抗体应答持续保护时间要比铝盐佐剂长，因此可以作为铝盐佐剂替代物。但是，Quil A存在严重的毒性，对小鼠的致死量在100-125μg，除此还有严重的溶血性，在注射部位可引起肉芽肿和注射部位症状，所以限制了在人用疫苗中的使用。至今，从Quil A中分离得到23种单体化合物。皂苷QS-21对小鼠的致死剂量是500μg，毒性虽小于Quil A，但是它还是仅用于肿瘤疫苗中。而且，皂苷QS-21等分子结构中存在酯键结构影响了其稳定性。因而，人们越来越关注从其它植物中寻找具免疫佐剂活性且毒性相对较低的皂苷。

皂苷QS-21的化学结构式

                                                      。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计具免疫佐剂活性且毒性较低的皂苷化合物。

本发明提供一种皂苷化合物，包括金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C，如下列结构式：

金铁锁皂苷B

金铁锁皂苷C

                                                。

本发明的另一目的是提供了上述皂苷化合物的制备方法。

本发明的皂苷化合物是从中药金铁锁中提取分离得到的金铁锁皂苷A单体(Cp1)，再经过结构修饰得到金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C。

本发明提供的制备方法包括以下步骤：

(1)金铁锁干燥根，粉碎后80％乙醇加热回流提取三次，合并提取液，减压浓缩得浸膏(无醇味)，浸膏kg用纯水L按1∶10的比例稀释后，过大孔树脂柱HP-20，分别用纯水，70％乙醇，丙酮依次洗脱；取70％乙醇洗脱部位为总皂苷，该总皂苷部位过C-18反相键合硅胶柱(ODS)划段，用纯水，30％乙醇，70％乙醇，90％乙醇依次洗脱，共分为四个洗脱部分(S1-S4)。取S4段过硅胶柱，以甲醇-乙酸乙酯1∶1洗脱分为3部分(S6-1，S6-2和S6-3)按照薄层板上斑点的Rf值对斑点依次收集划断，薄层板色谱展开剂为甲醇-乙酸乙酯1∶1(体积比)，20％硫酸显色剂。取S6-2部分经过C-18反相键合硅胶柱(ODS)依次用40％，60％，80％和纯甲醇洗脱，得到4个洗脱部分(S6-2-a，S6-2-b，S6-2-c和S6-2-d)按照薄层板上斑点的Rf值依次收集划断，薄层板色谱展开剂为甲醇∶水1∶1(体积比)20％硫酸显色剂。取S6-2-c过凝胶柱(Sephadex LH-20)，用甲醇作流动相洗脱，最后分离到1个化合物

金铁锁皂苷其化学结构如下式A：

金铁锁皂苷A

上式中：Glc：D-葡萄糖

        Gal：D-半乳糖

        Xyl：D-木糖

        Fuc：夫糖

        Rha：鼠李糖                                         。

(2)制备金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C：

i、NaOH水解金铁锁皂苷A中葡萄糖醛酸上羧基所连的正丁醇链：向Cp0(金铁锁皂苷A)的THF(四氢呋喃)溶液中加入NaOH溶液，在室温条件下搅拌过夜，然后，混合物用酸性树脂(Dowex Resin H⁺form)中和后过滤，滤液蒸干后过Sephadex LH-20柱，用甲醇洗脱，得到水解产物TS1(金铁锁水解皂苷1)。原料基本完全转化为水解产物。

ii、葡萄糖醛酸的羧基上接上不同的脂肪胺链或醚链：分别向上述步骤i水解产物TS1的DMF(二甲基甲酰胺)溶液中加入正己胺和1-氨基四甘醇单甲醚，于1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐，HOBt(1-羟基-苯并-三氮唑)和DIEA(N，N-二异丙基乙胺)中，在室温(25℃)条件下反应搅拌过夜，然后减压浓缩至干，两个反应产物分别过C-18反相键合硅胶柱(ODS)，各用40％，50％和60％的甲醇溶液梯度洗脱得到金铁锁皂苷B(转化产率73％)和金铁锁皂苷C(转化产率88％)。

本发明使用的金铁锁干燥根原料可以通过市售得到。

金铁锁皂苷A、金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C的理化数据见实施例1。

本发明的又一目的是提供了上述皂苷化合物在制备免疫佐剂中的应用。

本发明人进行了系列实验：金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C对小鼠肝功能损伤影响，金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C对卵清蛋白(OVA)特异性免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)抗体时效影响，金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C对OVA免疫小鼠血清免疫小鼠血清中特异性抗体IgG以及IgG亚型，即免疫球蛋白G1(Immunoglobulin G1，IgG1)、免疫球蛋白G2a(Immunoglobulin G2a，IgG2a)和免疫球蛋白G2b(Immunoglobulin G2b，IgG2b)抗体水平影响，金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C对分裂原诱导OVA免疫小鼠脾细胞增值反应影响，QuilA，金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C对OVA免疫小鼠血清中肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)、γ-干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)、白细胞介素-4(Interleukin-4，IL-4)和白细胞介素-5(Interleukin-5，IL-5)细胞因子水平影响等。结果显示金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C能显著增强OVA免疫小鼠的体液免疫的能力，且免疫佐剂活性优于铝胶组。金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C合适的剂量能显著增强OVA受免小鼠的细胞免疫能力。QuilA，Cp1，金铁锁皂苷B对TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5的影响，相比卵OVA组均有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。提示金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C均对1型T辅助细胞(Th1)和2型T辅助细胞(Th2)型细胞因子有显著的促进作用。金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C在体内能引起Th1和Th2混合型免疫应答。另外，通过溶血性测定、急性毒理、肝功能损伤等实验，说明其溶血率很小，未见明显毒性，对肝的损伤作用很小。因此，可用于制备免疫佐剂。

所述免疫佐剂是由金铁锁皂苷B或金铁锁皂苷C作为活性成分与药用载体组成的药物组合物。

所述免疫佐剂中，本发明的皂苷化合物的量为5μg-1000μg/单剂量，优选为10-50μg/单剂量。

本发明提供的的皂苷化合物(包括金铁锁皂苷B，金铁锁皂苷C)可诱导机体同时产生Th1型和Th2型免疫应答，且显示出比铝胶佐剂能诱导机体对疫苗产生更强的细胞免疫和体液免疫反应，因此，可以作为多种疫苗的免疫佐剂，达到较强的免疫效果。本发明提供的的皂苷化合物溶血性小和安全性好，制备方法简便、质量容易控制、使用方便、可冷冻保存。有较大的临床应用价值。

附图说明

图1金铁锁皂苷B对小鼠肝功能损伤影响的折线图；图中■金铁锁皂苷B

图2金铁锁皂苷C对小鼠肝功能损伤影响的折线图；图中▲金铁锁皂苷C

图3金铁锁皂苷B对OVA免疫小鼠血清中OVA特异性抗体IgG时效影响的折线图

图4金铁锁皂苷C对OVA免疫小鼠血清中OVA特异性抗体IgG时效影响的折线图

图5为金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C对OVA免疫小鼠血清中特异性抗体IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体水平影响的条形图。

图中

IgG

IgG1IgG2aIgG2b。

图6为金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C对分裂原诱导OVA免疫小鼠脾细胞增值反应影响的条形图。

图中OVALPS

Con A。

图7为金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C对OVA免疫小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5细胞因子水平影响的条形图。

图中

OVA

Quil A(10μg)

金铁锁皂苷B(50μg)

金铁锁皂苷C(25μg)。

具体实施方式

实施例1 皂苷化合物制备

(1)金铁锁干燥根(市售、产地云南怒江)(41kg)，粉碎后80％乙醇(150L)加热回流提取三次(提取间分别为4小时，3小时，3小时)，合并提取液，减压浓缩得浸膏(无醇味)，浸膏0.86kg用纯水8.6L稀释后，过大孔树脂柱(HP-20)，分别用纯水(400L)，70％的乙醇(300L)，丙酮(200L)依次洗脱。取70％乙醇洗脱部位主要为总皂苷，该总皂苷部位过C-18反相键合硅胶柱(ODS)划段，用纯水，30％乙醇，70％乙醇，90％乙醇依次洗脱(各5L)，共分为四个洗脱部分(S1-S4)。取S4段过硅胶柱，以甲醇-乙酸乙酯1∶1洗脱(总量为3L)(体积比)分为3部分(S6-1，S6-2和S6-3)按照薄层板上斑点的Rf值对斑点依次收集划断，薄层板色谱展开剂为甲醇-乙酸乙酯1∶1(体积比)，20％硫酸显色剂。(该薄层板方法参考2010版《中国药典》一部附录VIB薄层色谱法)。取S6-2部分经过C-18反相键合硅胶柱(ODS)依次用40％，60％，80％和纯甲醇(各2L)洗脱，得到4个洗脱部分(S6-2-a，S6-2-b，S6-2-c和S6-2-d)按照薄层板上斑点的Rf值依次收集划断，薄层板色谱展开剂为甲醇∶水1∶1(体积比)20％硫酸显色剂。(该薄层板方法参考2010版《中国药典》一部附录VIB薄层色谱法)取S6-2-c过凝胶柱(SephadexLH-20)，用甲醇(3L)作流动相洗脱，最后分离到1个化合物(经光谱法鉴定确证结构)金铁锁皂苷(A)(Cp0)176mg。

(2)制备金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C：

i、NaOH水解步骤(1)制得的金铁锁皂苷A中葡萄糖醛酸上羧基所连的正丁醇链：向含有金铁锁皂苷A(40mg，0.025mmol)的4mL THF(四氢呋喃)溶液中加入4mL 0.25M的NaOH溶液，在室温(25℃)条件下搅拌过夜，然后，该混合物用酸性树脂(Dowex Resin H⁺form)中和后过滤，滤液蒸干后过SephadexLH-20柱，用甲醇(1L)洗脱，得到水解产物TS1(通过光谱法确定羧基上连接的正丁醇链已经脱除)(39mg，99％)。

ii、在上述水解后产物的葡萄糖醛酸的羧基上接上不同的脂肪胺链或醚链：A.向上述步骤i水解产物TS1(5.0mg，0.0032mmol)的DMF(二甲基甲酰胺)溶液中(1mL)加入正己胺；(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐)(6.3mg，0.032mmol)，HOBt(1-羟基-苯并-三氮唑)(4.4mg，0.032mmol)和DIEA(N，N-二异丙基乙胺)(8.5μL，0.048mmol)，于室温(25℃)条件下反应搅拌过夜，然后，将反应物减压浓缩至干，得到的浓缩物过C-18反相键合硅胶柱(ODS)，用40％，50％和60％的甲醇溶液各200ml梯度洗脱得到金铁锁皂苷B。转化产率73％。

B.向上述步骤i水解产物TS1(5.0mg，0.0032mmol)的DMF(二甲基甲酰胺)溶液中(1mL)加入1-氨基四甘醇单甲醚((0.032mmol)；其它步骤同上述A，得到金铁锁皂苷C34.3mg。转化产率88％。

金铁锁皂苷A、金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C的理化数据如下：

金铁锁皂苷A：白色粉末，¹H and ¹³C NMR data see Table 1.ESI-MS：[M+Na]⁺m/z1621，[M-H]^-m/z 1597，[M+Cl]^-m/z 1633.

Table 1 ¹H(600MHz)and ¹³C NMR(150MHz)data of Cp1 in C₅D₅N(

in ppm，Jin Hz)

除非特别说明，所有质子信号积分都是1个氢。

金铁锁皂苷B的理化数据

白色固体。[α]_D ³⁰＝-13.9(c 0.3，MeOH)；¹H NMR(400MHz，C₅D₅N)：δ9.95(s，1H)，8.90(t，J＝5.2Hz，1H)，8.01(d，J＝4.0Hz，1H)，7.36-7.32(m，3H)，7.21(m，3H)，7.15-7.11(m，2H)，6.90(d，J＝8.8Hz，1H)，6.76(d，J＝5.6Hz，1H)，6.72(d，J＝6.0Hz，1H)，6.55(d，J＝4.0Hz，1H)，6.46-6.40(m，2H)，6.16(d，J＝4.0Hz，1H)，6.10(s，1H)，6.05(s，1H)，6.01(d，J＝8.0Hz，1H)，5.78(d，J＝6.0Hz，1H)，5.64-5.61(m，2H)，5.57(d，J＝8.0Hz，1H)，5.49(d，J＝8.0Hz，1H)，5.38(d，J＝7.2Hz，1H)，5.28(br s，1H)，5.24(d，J＝2.0Hz，1H)，4.95(dd，J＝8.8，2.4Hz，1H)，4.83(d，J＝7.2Hz，1H)，4.66-3.95(m，34H)，3.78-3.57(m，18H)，3.47-3.37(m，2H)，3.35(s，3H)，2.79(t，J＝13.2Hz，1H)，1.73(d，J＝5.2Hz，3H)，1.53(d，J＝8.0Hz，3H)，1.83，1.54，1.22，1.05，1.03，0.95(s×6，each 3H)；¹³C NMR(100MHz，C₅D₅N)：δ210.2，176.0，169.3，144.6，121.9，105.7，105.0，104.9，104.2，103.6，101.7，95.2，86.0，84.4，82.7，79.2，78.6，78.5，78.4，78.3，76.8，76.6，75.8，75.5，75.4，75.3，74.7，74.2，73.7，72.9，72.4，72.2，71.8，71.3，71.2，71.1，70.8，70.7，70.6，70.5，70.1，68.9，67.3，62.8，61.6，58.6，55.0，49.2，47.0，42.1，41.7，40.3，39.7，36.3，33.1，30.7，29.9，27.2，24.4，20.5，18.8，17.4，16.9，15.9，11.2；ESI-HRMS m/z：1754.7911(M+Na⁺)，Calcd for C₇₉H₁₂₉NO₄₀Na⁺：1754.7983.

金铁锁皂苷C的理化数据

白色固体。[α]_D ²⁵＝-8.9(c 0.1，MeOH)；¹H NMR(400MHz，C₅D₅N)：δ9.85(s，1H)，8.85(br s，1H)，8.56(t，J＝4.4Hz，1H)，7.83(br s，1H)，7.02(br，6H)，7.24(br s，1H)，6.55(br s，1H)，6.30(br，3H)，6.03(s，1H)，5.99(s，1H)，5.91(d，J＝6.0Hz，2H)，5.54-5.51(m，2H)，5.46(d，J＝6.4Hz，1H)，5.38(d，J＝6.4Hz，1H)，5.27(d，J＝5.6Hz，1H)，5.17(s，1H)，5.14(br s，1H)，4.74(d，J＝5.6Hz，1H)，4.54-3.85(m，41H)，3.69-3.28(m，12H)，2.69(t，J＝10.8Hz，1H)，1.64(d，J＝3.2Hz，3H)，1.43(d，J＝5.6Hz，3H)，1.73，1.45，1.12，0.96，0.93，0.87(s×6，each 3H)，0.75(t，J＝5.2Hz，3H)；ESI-HRMS m/z：1648.7735(M+Na⁺)，Calcd for C₇₆H₁₂₃NO₃₆Na⁺：1648.7717.

实施例1 制得的金铁锁皂苷A、B、C用于下列实施例。

实施例2 溶血性测定

以真空采血管从兔耳静脉采集血液，加入生理盐水，混匀，2000r，离心10min，用生理盐水洗涤3次，收集红细胞，用生理盐水稀释制成0.5％的红细胞悬液。取实施例1制得的金铁锁皂苷A、B、C适量，分别用生理盐水稀释制成4mg/mL溶液。经过0.22μL微孔滤膜过滤，再用生理盐水依次稀释成浓度为1000、500、250、100、50、25、10、5μg/mL的稀释液。在96孔板中，每孔加入0.5％的红细胞悬液100μL，再加入不同浓度的皂苷稀释液100μL，混匀，一个浓度重复3孔。再设最大和最小的溶血对照，分别为生理盐水及蒸馏水。在37℃培养箱中，放置30min，1000r，离心10min。取各孔上清液100μL，波长405nm酶标仪检测，测定吸光度值。实验需重复3次，所测各组的吸收值减去生理盐水对照组的吸收值就可以表示溶血性，按照下面的公式计算其溶血率。

公式：溶血率＝(T_i-T₀)/(T_max-T₀)×100。并用软件计算引起50％溶血的浓度值(HD₅₀)。

T_max：阳性对照蒸馏水作用组的吸光度；T₀：生理盐水作用组吸光度；T_i：不同浓度的金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C作用时测得吸光度。结果见表2。

表2 金铁锁皂苷B，金铁锁皂苷C对兔红细胞的溶血活性

从表2可见，Quil A(皂树皮皂苷)的引起半数溶血率的浓度为5.39±0.23μg/ml，而同等条件下，金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C的为77.89±0.38μg/ml，347.9±0.35μg/ml。证明金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C的溶血率很小。本发明利用金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C的溶血率很小的特性来制备免疫佐剂时可以降低免疫佐剂的溶血率。

实施例3 急性毒理

用PBS将样品Quil A、金铁锁皂苷B、金铁锁皂苷C分别稀释为5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg，5个剂量组，并以PBS为空白对照组，共计16组，将ICR小鼠随机分为16组，每组5只。各组小鼠于颈部皮下一次性注射相应剂量，常规饲养72天，并观察小鼠的毒性反应(脱毛、疼痛、肿胀等)以及死亡情况。

金铁锁皂苷B与金铁锁皂苷C的急性毒理的结果见表2

从表2-1中可以看出，Quil A在100μg时，小鼠已经死亡2只，显示出很强的毒性，半数致死量(LD₅₀)是125μg。且72小时内观察毒性反应明显，如注射部位脱毛严重，并伴有疼痛以及肿胀，精神萎靡食欲不振等情况；而金铁锁皂苷B与金铁锁皂苷C未见明显毒性指标，仅金铁锁皂苷B在1600μg时死亡一只。本发明可以利用金铁锁皂苷B与金铁锁皂苷C安全范围大的特点提高免疫佐剂的计量。

实施例4 肝功能损伤

实验动物与实验操作同实施例3。PBS将样品金铁锁皂苷B，金铁锁皂苷C分别稀释为2.5mg/kg，10mg/kg和40mg/kg剂量组，并以PBS(磷酸盐缓冲液)为空白对照组，将(Institute of Cancer Research，ICR)小鼠随机分为7组，每组5只。各组小鼠于颈部皮下一次性注射相应剂量，常规饲养，三天后，取血后脱颈处死。3500r/min离心10分钟，取上清，4-6小时内，采用柯达700临床化学分析仪检测天门冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase，AST)和丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)的变化。

由图1、2可见，小鼠血清中ALT和AST的含量随着金铁锁皂苷B、金铁锁皂苷C剂量的增高而不规律的升高，没有明显的量效关系，但升高倍数均在在1.3-1.7之间，均小于定义为肝损伤的5倍。所以在0-0.8mg之间，金铁锁皂苷B、金铁锁皂苷C对肝的损伤作用很小。本发明可以利用金铁锁皂苷B与金铁锁皂苷C安全范围大的特点提高免疫佐剂的剂量。

实施例5 金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C对OVA(卵白蛋白)受免小鼠血清中IgG(免疫球蛋白G)抗体时效的影响

雄性ICR小鼠随机分组，每组5只。以OVA为抗原，每次免疫量为100μg。Cp1、金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C不同剂量(10μg、25μg和50μg)为佐剂，Alum(200μg)、QuilA(10μg)为阳性对照，于第0天皮下注射免疫小鼠，并在第14天加强免疫。在0，4，8，12，16，20，24，28，32，36天时，眼眶静脉取血并制备血清。在加强免疫后14天，分离脾淋巴细胞。

在96孔酶标板上，包被液(OVA的50μg/ml的碳酸盐缓冲液)100μL/孔，置4℃，孵育24小时，用含有0.5％的吐温-20的磷酸盐缓冲液洗3次。然后加封闭液100μL/孔，37℃，孵育1小时，PBST洗3次。甩干之后，加入第0，4，8，12，16，20，24，28，32，36天时取的100μL待测血清稀释液(1∶1000)，重复3孔。37℃，孵育1h，PBST洗3次。甩干之后，每孔加辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗小鼠lgG抗体稀释液100μL(1∶4000)，37℃，孵育1，小时，PBST洗3次，3min/次。每孔加100μL的底物溶液(在25mL底物缓冲液中，加入10mg邻苯二胺与30％H₂O₂37.5μL)，37℃，暗处放10min，加50μL/well 2N H₂SO₄溶液终止反应。酶标仪于波长492nm处检测，测定吸光度值。

由图3、4可以看出，小鼠在第0和14天免疫时，金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C对OVA特异性IgG抗体表达的影响均随着时间增加而渐渐升高，在第12天时急剧升高，并在第20天到第32天时达到平台期，之后缓慢下降。本发明可以利用金铁锁皂苷B与金铁锁皂苷C可使OVA受免小鼠在20天到32天中血清OVA特异性免疫球蛋白(IgG)抗体达到平台期的特点，确定第28天为小鼠最佳采血时间。

以下实施例6-8中，实验的小鼠处理以及OVA抗原、Cp1、金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C的剂量同实施例5。

实施例6 金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C对OVA受免小鼠血清中特异性抗体效价的影响

在96孔酶标板上，每孔加入100μL包被液(OVA的50μg/m的碳酸盐缓冲液)，置4℃孵育24h，用PBST洗涤3次。然后每孔加封闭液100μL，于37℃孵育1h，用PBST洗涤3次。甩干后，加入100μL待测血清稀释液(IgG，1∶1000；IgG1，1∶1000；IgG2a，1∶50；IgG2b，1∶50)，重复3孔。37℃孵育1h，用PBST洗涤3次。甩干后，每孔加辣根过氧化物酶标记兔抗小鼠lgG、羊抗小鼠免疫球蛋白IgG1、IgG2a或IgG2b抗体稀释液(1∶4000)100μL，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，每次3min。每孔加100μL底物溶液(25mL底物缓冲液中加入10mg邻苯二胺和30％H₂O₂37.5μL)，37℃暗处放至10min，加50μL/孔2N H₂SO₄溶液终止反应。置酶标仪于波长492nm处测定OD(吸光度)值

由图5可见，金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C的三个剂量组(除金铁锁皂苷C 50μg组外)均能显著提高OVA免疫小鼠血清中IgG，IgG1，IgG2a和IgG2b的水平，并IgG2a和IgG2b水平显著高于Alum组对照组。说明金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C能显著增强OVA免疫小鼠的体液免疫的能力，且免疫佐剂活性优于铝盐组。

实施例7 金铁锁皂苷B与金铁锁皂苷C对OVA受免小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应的影响

无菌条件下，取小鼠的脾脏，加PBS，研磨，以200目筛网滤过，1500r，离心5min，弃掉上清，加破红细胞溶液，1500r，离心5min，再加PBS液，重复洗3次。收集脾细胞，加Roswell Park Memorial Institute-1640(RPMI-1640)完全培养液混悬，加台盼兰计数，活细胞数≥95％，根据计数结果，调整细胞浓度1×10⁷个/mL。在96孔中，每孔加入脾细胞悬液100μL加入，一个样品重复12孔，然后分别加入刀豆蛋白A(Concanavalin A，Con A)液(终浓度为5μg/mL)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)液(终浓度为10μg/mL)、OVA液(终浓度为10μg/mL)或RPMI 1640培养液至总体积为200μL。并设空白对照组。37℃、5％CO2培养44h后，各孔加15μL Cell Counting Kit-8(CCK-8)溶液，继续培养4h。以酶标仪于波长570nm处测定吸光度值，并计算刺激指数(SI值)。

由图6可见，金铁锁皂苷B 50μg组和金铁锁皂苷C 25μg组均能显著增强ConA，LPS和OVA诱导的OVA免疫小鼠的脾细胞增值反应，而铝胶组与OVA组无显著性差异。说明金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C合适的剂量能显著增强OVA受免小鼠的细胞免疫能力。本发明可利用本特性在制备佐剂时增强细胞免疫的能力。

实施例8 金铁锁皂苷B与金铁锁皂苷C对OVA受免小鼠血清中细胞因子的影响

使用BD公司的流式细胞仪四色校准微球(BD CaliBRITE Beads)试剂(市售)通过BDFASComp软件(仪器自带)校正BD FACS Calibur流式细胞仪的荧光补偿和灵敏度。再使用小鼠Th1/Th2细胞因子流式微珠阵列(Mouse Th1/Th2Cytokine Cytometric Bead Array，Mouse Th1/Th2 Cytokine CBA)试剂盒中的流式设置微球(Cytometer setup beads)设定实验所需的特定参数(设门、调节电压和补偿)。使用Mouse Th1/Th2 Cytokine CBA)试剂盒中的细胞因子标准品，倍比稀释一系列不同浓度0、20、40、80、156、312.5、625、1250、2500和5000pg/ml的细胞因子标准液。将血清50μL置于待检管中，再加入五种捕获微球等量的混合液50μL、藻红蛋白(PE)检测试剂50μL，避光，37℃，孵育3h，加入洗涤液至总体积500μL，1500rpm，离心10min，弃上清液，加200μL/管洗涤液，用BD CellQuest检测。

由图7可见，Quil A，金铁锁皂苷B，金铁锁皂苷C对肿瘤坏死因子(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)和白介素-5(IL-5)的影响，相比OVA组均有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。提示金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C均对Th1和Th2型细胞因子有显著地促进作用。本发明可利用金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C在体内能引起Th1和Th2混合型免疫应答的特性制备佐剂。

Claims (8)

1.一种皂苷化合物，其特征在于，所述化合物包括金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C，以下列结构式表示：

金铁锁皂苷B

金铁锁皂苷C

                                                。

2.一种如权利要求1所述皂苷化合物的制备方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

(1)金铁锁干燥根，粉碎后80％乙醇加热回流提取三次，合并提取液，减压浓缩得浸膏无醇味，浸膏kg用纯水L按1∶10的比例稀释后，过大孔树脂柱HP-20，分别用纯水，70％乙醇，丙酮依次洗脱；取70％乙醇洗脱部位为总皂苷，该总皂苷部位过C-18反相键合硅胶柱划段，用纯水，30％乙醇，70％乙醇，90％乙醇依次洗脱，共分为四个洗脱部分S1-S4；取S4段过硅胶柱，以甲醇-乙酸乙酯1∶1洗脱分为3部分S6-1，S6-2和S6-3，按照薄层板上斑点的Rf值对斑点依次收集划断，薄层板色谱展开剂为甲醇-乙酸乙酯1∶1体积比，20％硫酸显色显色剂；取S6-2部分经过C-18反相键合硅胶柱，依次用40％，60％，80％和纯甲醇洗脱，得到4个洗脱部分S6-2-a，S6-2-b，S6-2-c和S6-2-d，按照薄层板上斑点的Rf值依次收集划断，薄层板色谱展开剂为甲醇∶水1∶1体积比，20％硫酸显色显色剂；取S6-2-c过凝胶柱，用甲醇作流动相洗脱，最后分离到1个化合物金铁锁皂苷A，其化学结构以下式表示：：

金铁锁皂苷A

上式中：Glc：D-葡萄糖

        Gal：D-半乳糖

        Xyl：D-木糖

        Fuc：夫糖

        Rha：鼠李糖                                     ；

(2)制备金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C：

i、NaOH水解金铁锁皂苷A中葡萄糖醛酸上羧基所连的正丁醇链：向Cp0的THF溶液中加入NaOH溶液，在室温条件下搅拌过夜，然后，混合物用酸性树脂Dowex Resin H⁺form中和后过滤，滤液蒸干后过Sephadex LH-20柱，用甲醇洗脱，得到水解产物TS1：

ii、葡萄糖醛酸的羧基上接上不同的脂肪胺链或醚链：分别向上述步骤i水解产物TS1的DMF溶液中加入正己胺和1-氨基四甘醇单甲醚，于1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐，HOBt和DIEA中，在室温条件下反应搅拌过夜，然后减压浓缩至干，两个反应产物分别过C-18反相键合硅胶柱ODS，各用40％，50％和60％的甲醇溶液梯度洗脱得到金铁锁皂苷B和金铁锁皂苷C：

3.一种如权利要求1所述皂苷化合物在制备免疫佐剂中的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述皂苷化合物为金铁锁皂苷B或金铁锁皂苷C。

5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述免疫佐剂是由金铁锁皂苷B作为活性成分与药用载体组成的药物组合物。

6.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述免疫佐剂是由或金铁锁皂苷C作为活性成分与药用载体组成的药物组合物。

7.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述免疫佐剂中，皂苷化合物的量为5μg-1000μg/单剂量。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述免疫佐剂中，皂苷化合物的量为10-50μg/单剂量。

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