CN102375062B - 乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段的检测方法，首先构建出N-末端或C-末端缺失的6种突变蛋白，然后以HRP标记的黏蛋白为指标一抗，进行WB和拷马斯亮蓝染检测，将WB结果与拷马斯亮蓝染染色结果进行对比，从而确定活性片段在乳酸杆菌整合膜蛋白序列中的位置。

Description

乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段检测方法

技术领域

本发明涉及一种整合膜蛋白活性片段的检测方法，尤其涉及一种乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段的检测方法。

背景技术

益生菌是指改善宿主微生态平衡而发挥有益作用，达到提高宿主健康水平和健康状态的活菌制剂及其代谢产物，其广泛存在于地球上的各个角落，是一种对人和动物有益的细菌，它们可直接作为食品添加剂服用，以维持肠道菌丛的平衡，在肠道内的黏附和定植能抑制致病菌的损伤，对于保护肠道黏膜的完整性具有重要的意义；自90年代初以来，形形色色的“益生菌”类保健品风靡了整个世界，与此同时，“益生菌”的研究业已成为国际上的热门研究课题。

乳酸杆菌是益生菌中及其重要的一种，可以与靶细胞黏附，竞争抑制致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）和侵袭性大肠杆菌（EIEC）等致病菌对人体肠道屏障功能的损害；激发继发于黏附的细胞内信号转导途径，降低肠上皮细胞（IEC）的通透性；调节人体肠道黏膜免疫功能，促进树突状细胞（DC）分化成熟，以及诱导肠道T细胞分化成熟等。

近几年来研究表明，乳酸杆菌的表面蛋白（surface layer protein，SLP）在乳酸杆菌益生作用中起着核心作用。有学者将SLP进行分离和纯化，发现表面蛋白P40和P70与乳酸杆菌类似，能增加IEC紧密连接（TJ）蛋白的表达，维持TJ的完整性，进一步研究发现其调节机制可能与促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路有关。Bernet 等研究益生菌与体外培养Caco-2细胞的黏附，认为其黏附成分可能是细菌表面的不稳定蛋白质。Fujiwara等从益生菌液上清中分离出一种分子量为52kDa的蛋白质，此种物质能抑制EPEC对人肠道上皮细胞（HIEC）的黏附。Konstantinov等在研究嗜酸性乳酸杆菌与树突状细胞相互作用时，发现其SLP能调节IL-10和IL-12的合成与分泌（Proc Natl Acad Sci U.S.A. ，2008；105（49）：19474-79）。我们的前期研究（BMC Microbiol，2008；9：63）也发现经植物乳酸杆菌（LP）分离纯化的SLP具有生物学活性，能上调IEC表面TJ的表达，抑制EPEC对IEC的损伤作用，但其蛋白片段较大，结构域不清，作用机制尚不明，抗病能力较弱。

我们通过对乳酸杆菌SLP进行筛选，质谱分析，克隆表达和反复筛选验证，发现其表层黏附蛋白为整合膜蛋白（integral membrane protein，IMP，GI：28378881），并且黏附区域为与表层蛋白的中间片段IMP455-755（中华实验外科杂志，2009；26（5）：1626-1631）。

但是对于乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段的研究较少，而活性片段为具有黏附活性的微小片段（Micro Integral Membrane Protein，MIMP），其分子较小，具有较高的效价和特异性，应用价值较大；此外，因其特有的亲疏水性结构及其所发挥的生物学效应，可以弥补乳酸杆菌易位及不耐抗生素的缺陷，有着重要的临床应用价值。因此，对乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段的确认具有重要的应用价值。

发明内容

本发明提供了一种乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段（MIMP）的检测方法，通过构建N-末端或C-末端缺失的突变蛋白，得到6个突变蛋白；以HRP标记的黏蛋白为指标一抗，通过Western bolt（WB）检测结果与拷马斯亮蓝（Coomassiebrilliant Blue）染检测结果进行对比，进行确认MIMP。

本发明乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段（MIMP）检测方法，步骤如下：

步骤1，以乳酸杆菌整合膜蛋白DNA作为模板，加入引物进行RT-PCR反应，构建出7种PCR扩增产物；其中，所述PCR扩增产物包括：IMP455-755，以及N-末端或C-末端缺失的6种突变蛋白IMP455~515， IMP455~635，IMP455~575，IMP635~755，IMP575~755和IMP515~755；所述引物与PCR扩增产物对应关系如下：

步骤2，将上述PCR扩增产物进行SDS-PAGE电泳，然后以HRP标记的黏蛋白为直标一抗，进行WB和拷马斯亮蓝染检测，将WB结果与拷马斯亮蓝染结果进行对比；在WB检测结果呈阳性反应的DNA片段中，找出与呈阴性反应DNA片段没有重复区域的DNA片段1，和完全包含呈阴性反应DNA片段的DNA片段2；所述DNA片段1和2的重复区域为所述整合膜蛋白活性片段。

所述N-末端或C-末端缺失的突变蛋白构建方法如下：

步骤1，加入所述引物和质粒模板，进行PCR扩增反应；优选地，反应体系包括：10X缓冲溶液，dNTP，引物，质粒模板，rTag聚合酶和重蒸水；

步骤2，PCR产物进行电泳分离，然后进行凝胶回收得到所述6个突变DNA和IMP455-755；

步骤3，加入核酸内切酶、IMP455-755分别对6个突变DNA进行酶切；然后将酶切产物与载体BL21（DE3）按10：1比例，在连接酶的作用下进行连接；优选地，酶切反应体系包括：醋酸盐缓冲溶液，酶切产物，载体BL21 （DE3），BSA和两种内切酶，所述两种内切酶可以是XhoⅠ和HindⅢ；连接反应体系包括：突变DNA酶切产物，IMP455-755酶切产物，DNA连接酶及其10X缓冲溶液，所述DNA连接酶可以是T4 DNA连接酶；

步骤4，加热至65℃将连接产物灭活，用TOP10感受态细胞、无抗LB培养基以及涂有Amp抗性的平皿进行转化；

步骤5，取所述转化产物，用Rosetta（DE3）XplyE、无抗LB培养基以及涂有Ch1、Amp抗性的平皿进一步培养；挑取菌落接种于TB培养基，IPTG进行诱导表达；离心分离后悬浮，95℃煮20分钟，然后进行SDS-PAGE电泳纯化。

所述HRP标记黏蛋白方法如下：

步骤1，取黏蛋白溶解于碳酸盐缓冲液，配置成黏蛋白溶液；

步骤2，配置HRP溶液：HRP溶于水中，加入过碘酸盐溶液，进行搅拌；然后于乙酸盐缓冲液中，透析；向所述透析产物中加入碳酸盐缓冲液，调节PH值至9.0～9.5，制备出HRP溶液；优选地，所述乙酸盐缓冲溶液PH值为4.4。

步骤3，将所述黏蛋白溶液与所述HRP溶液混合，搅拌；

步骤4，向步骤3所得混合溶液中加入硼氢化钠，然后置于硼酸缓冲溶液中透析；制备出HRP标记的黏蛋白。

根据所述HRP标记黏蛋白的方法，优选地，所述透析均在4℃下进行。

肠道微生物生态系统数量庞大、组成复杂，其细菌数量大约10倍于人体体细胞，与人类健康状况的维持和疾病的发生有着密切的联系。其中，益生菌在肠道内的黏附和定植对抑制病菌的定植、移位和感染，维护肠道黏膜的完整性具有特别重要的意义。乳酸杆菌是益生菌中重要的一类，其在发挥益生作用时，表面蛋白（surface layer protein ，SLP）的黏附结构起着核心作用。本发明乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段（MIMP）的检测方法，通过PCR扩增反应，构建了6种N-或C-末端缺失的突变蛋白，并根据WB结果和SDS-PAGE胶电泳后拷马斯亮蓝染结果的对比发现，MIMP为IMP结构区域片段，该黏附结构区域位于菌体表面的整合膜蛋白中，为具有黏附活性的微小片段。我们研究发现：MIMP分子量为6.95kDa，分子式为C₃₁₅H₅₀₂N₈₆O₈₇S₂，等电点9.90，共包含61个氨基酸，其中酸性氨基酸数量较多，占13.1%。MIMP分子小，具有较高的特异性，因其特有的亲疏水性结构及该结构所发挥的生物学效应，由于蛋白不会发生易位，也不会与抗生素作用，故可以很好弥补乳酸杆菌易位和不耐抗生素的缺陷，因此临床应用价值较大，有着广阔的医药应用前景。

附图说明

图1为构建的6个突变蛋白和IMP455~755序列示意图；

图2为WB检测结果；

图3为拷马斯亮蓝染的染色结果。

具体实施方式

发明人长期研究发现，乳酸杆菌的黏附结构区域位于菌体表面的整合膜蛋白中，为具有黏附性的微小片段。

原料采用植物乳酸杆菌（Lactobacillus plantarum，简称LP，CGMCC No.1258），对本发明乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段MIMP的检测方法具体介绍如下：

乳酸杆菌（CGMCC No.1258）表面整合膜蛋白序列（即SEQ ID No：1）：

1 mktvrkiplv vwytamfvvi atitysglfl agrtliwevd giaqhfpill efqrilqhhp

61 qqlfswswnl glgadqlttf syyvvgdpfn ylvafvsrah lewayqalil lrlyfvglaf

121 lgfsrqfkfk rvsqligalt ytftaytfyv gmhhpffllp miwfpllcwa iervlrgrhw

181 lplslitavv ilsnfyfayl lalgglvyal vrfwsrrrdh ltmrsfgqlf wrllvavglg

241 vtmagillvp tllamltatr asfnfanglt sypinyyvnl pnrlltnggs vqywvtlgls

301 sisfiaiiyt lrhfrrywvl nwvlvvmmlg illpqfaavf nvfstpsnrw llmatlvfay

361 atmafmdqvt altaadlkwl agisggllvi iwlingfyln irkhdiatyl illaligvll

421 vkqslkltnr qfyvlllgiv tlnlannglg wlsintnsns teqlrqgaam kwvknyfdga

481 qksltttsqf yrtalapnyy tmrsaesdvp mvlgthtvgs yfsvqngyvg afsqalgnse

541 yamnsplgsl dgrttmynll gvkylfared qlkkqalpag yevvkmktge pkifadkfiy

601 gmsnhtgtil lksknalplv ytqqhqisqr qfnrlnavdr eqallqgavt tqqvsgvktv

661 kptvtgknva ytvqadttnv ldtldkviiy rnqhatgasn naltklpadt itltpeqres

721 ltpatglttp snrvlnliaa nqklvqknqe nnadeltsmv sdvqghqipy qltiqhpkky

781 rntelylvld gisyrrssik halttsqnin vftarpytkv dylddvrdgl kgnlsasgys

841 ltaqttdnlt sfsqlgttnm sdyeprtsav inlgyskyar klitlnftsi rslhfksakl

901 iavplgktyr qrtrqlqtsg lkhqqvtnnq itgttltkta tvlttsipys tgwqlrvdgq

961 tvrtqvvnkg fvgakltagr hqirltyhtp glkigiwssi iggvisilia cwwglhkrvr

1021 qs

1．构建N-末端或C-末端缺失的6种突变蛋白

1.1．克隆

1.1.1．PCR扩增

    以乳酸杆菌整合膜蛋白DNA作为模板，加入引物进行RT-PCR反应，构建出； IMP455-755、以及N-末端或C-末端缺失的6种突变蛋白IMP455~515， IMP455~635，IMP455~575，IMP635~755，IMP575~755和IMP515~755共7种PCR扩增产物；所述引物与PCR扩增产物对应关系如下：

优选地，PCR扩增反应体系如下：

10X缓冲溶液：10ul

dNTP：2.5mM，8ul

引物1：10um，4ul

引物2：10um，4ul

质粒：50ng/ul，0.5ul

rTag聚合酶（购自TAKARA公司）：2ul

加入重蒸水（ddH₂O）至反应体系总体积为100ul。

将上述反应体系加热至94℃预变性3分钟；然后进行热循环，热循环条件为：94℃变性30秒，迅速冷却至55℃使引物退火30秒，使引物结合到靶序列上，然后快速升温至72℃（该温度为rTag聚合酶最佳活性温度），使引物链沿模板延伸1分钟，进行30次热循环；然后在72℃下恒温反应15分钟。

1.1.2．PCR产物电泳，回收

按照常规方法，将PCR产物进行电泳检测。应注意的是，电泳检测应在PCR扩增反应当日进行，以免电泳检测带型不规则；可以选择10g/L琼脂糖电泳等方式进行电泳检测。

经电泳检测，PCR反应完全，然后进行凝胶回收。可以选用Qiagene凝胶回收试剂盒，回收方法如下：将回收产物加入到5ul 醋酸钠（3M）和120ul冷的乙醇中，-20℃放置15分钟；然后在离心机上12000rmp离心10分钟；去上清，用70%乙醇洗涤两次；室外晾干，加30ul去离子水溶解，制成DNA片段溶液。

1.1.3．将回收后的PCR产物进行酶切

酶切反应所用两种内切酶优选为Hind Ⅲ和XhoⅠ。

酶切反应体系如下：

缓冲溶液：3M，5ul

DNA片段溶液（或载体）：40ul

牛血清白蛋白（BSA）：0.5ul

HindⅢ：2.5ul 

XhoⅠ：2.5ul

将上述体系在37℃下反应34小时。然后在65℃下灭活10分钟。

1.1.4．将双酶切产物进行连接

将双酶切后的DNA片段与载体进行凝胶定量分析，然后进行连接，优选地，连接反应体系如下：

DNA片段：15ul

载体：2ul

T4 DNA连接酶：1ul

10X连接酶缓冲溶液：2ul

在16℃下，反应过夜。

1.1.5．转化

将连接产物在65℃下灭活10分钟。

取10ul连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞（如Rosetta（DE3）XplyE），在冰上孵育30分钟后，加热至40℃热激1分钟；加入无抗的LB培养基400ul，在37℃温度下保温1小时。

取100ul涂有Amp抗性的平皿，在37℃培养16小时。

1.1.6．蛋白的表达与纯化

取5ul转化的Rosetta（DE3）XplyE感受态细胞，在冰上孵育30分钟，42℃热激1小时，加无抗的LB培养基400ul，37℃下保温1小时。取100ul涂有Amp和Chl抗性的平皿，在37℃培养16小时。

挑取单菌接种于TB培养基，37℃培养2小时，然后加入1ul的IPTG（1M）诱导2小时。12000prm下离心1分钟以收集菌体，倒掉上清，用100ulXSDS悬浮，然后95℃煮20分钟。

进行SDS-PAGE电泳分离。

通过上述过程构建出N-末端或C-末端缺失的6种突变蛋白，按照模板序列分别命名为IMP455~515、IMP455~575、IMP455~635、IMP635~755、IMP575~755和IMP515~755。

2．辣根过氧化酶（HRP）标记黏蛋白

2.1配制黏蛋白溶液

取黏蛋白溶解于缓冲溶液中，配制成4mg/ml的黏蛋白溶液。其中，所述缓冲液优选为碳酸盐缓冲溶液，其PH值优选为9.5。

2.2．配制HRP溶液

辣根过氧化酶（HRP）8mg溶解于2ml蒸馏水中，加入新鲜配制的过碘酸盐溶液至400ul，室温搅拌20min；然后置于乙酸盐缓冲溶液中，透析过夜。其中，所述过碘酸盐优选为过碘酸钠，其溶液浓度优选为0.1M；所述乙酸盐缓冲液浓度优选为0.001M，PH值为4.4；透析温度优选为4℃。

取出透析后的HRP，加入碳酸盐缓冲溶液调节PH值至9.0~9.5。优选的，碳酸盐缓冲液浓度为0.1M，PH值为9.5。

2.3进行HRP标记

将配制的HRP溶液和黏蛋白溶液按1：1体积进行混合，室温搅拌2小时。然后加入新鲜配制的硼氢化钠缓冲溶液（4mg/L）100ul，以去除连接反应。

将混合溶液置于硼酸盐缓冲溶液中透析过夜。优选地，所述硼酸盐缓冲溶液浓度0.1M，PH值为7.4；透析温度优选为4℃。

然后将标记好的黏蛋白等体积加入甘油（80%浓度），在-20℃进行保持待用。

3．Western Bolt（WB）检测和拷马斯亮蓝染检测

Western Bolt（WB）检测：纯化的蛋白经Western bolt 二抗孵育后，转印至保鲜膜上，按每10cm²膜加1m的ECL工作液的比例，与HRP标记的黏蛋白进行杂交，然后去除ECL工作液，进行压片或荧光成像仪检测目的蛋白。

拷马斯亮蓝染检测：电泳转膜后，用TBS清洗膜2次，以去除转移缓冲液和一些碎胶，拷马斯亮蓝进行染色，室温振荡3次，每次30分钟。观察结果。

4．结果分析

图1为构建的6个突变蛋白和IMP455-755序列示意图。

图2为WB检测结果。以HRP标记的黏蛋白作为直标一抗，对6个突变蛋白作Western bolt（WB）检测，由图中可以看出，片段IMP455~575、IMP455~635、IMP455~695以及IMP515~755均呈阳性反应，而IMP635~755和IMP575~755则呈阴性反应。

图3为拷马斯亮蓝染的检测结果。SDS-PAGE胶电泳后，进行拷马斯亮蓝染检测，经过对比，可以看出片段IMP455-575和IMP515-755MIMP的重复区域IMP515~575（即图1阴影部分）为活性片段MIMP。

测试结果显示：MIMP包含61个氨基酸，其中酸性氨基酸数量较多，占13.1%；MIMP分子量为6.95kDa，分子式为C₃₁₅H₅₀₂N₈₆O₈₇S₂。

由于MIMP为位于菌体表面的整合膜蛋白中、具有黏附活性的微小片段，分子较小，具有较高的效价和特异性；同时还可以弥补乳酸杆菌易位和不耐抗生素的缺陷，因此具有很大的临床应用价值和前景。

上述内容为本发明的具体实施例的例举，对于其中未详尽描述的试剂、设备、操作方法等，应当理解为采取本领域已有的普通及常规试剂、设备、操作方法等来予以实施。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (8)

1.一种乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段的检测方法，其特征在于，以乳酸杆菌整合膜蛋白DNA作为模板，加入7组不同引物进行RT-PCR反应，构建出IMP455～755、以及N-末端或C-末端缺失的6种突变蛋白IMP455～515，IMP455～635，IMP455～575，IMP635～755，IMP575～755和IMP515～755共7种PCR扩增产物；具体步骤如下：

步骤1，加入所述引物，将所述膜蛋白进行PCR扩增反应；所述引物与PCR扩增产物对应关系如下：

步骤2，对PCR扩增产物进行电泳分离，凝胶回收后得到所述6个突变DNA和IMP455-755；

步骤3，加入核酸内切酶、IMP455-755分别对所述6个突变DNA进行酶切；然后将酶切产物与载体BL21(DE3)按10：1比例，在连接酶的作用下分别进行连接；

步骤4，加热至65℃将连接产物灭活，用TOP10感受态细胞、无抗LB培养基以及涂有Amp抗性的平皿进行转化，得到转化产物；

步骤5，取所述转化产物，用Rosetta(DE3)XplyE、无抗LB培养基以及涂有Ch1、Amp抗性的平皿进一步培养；挑取菌落接种于TB培养基，IPTG进行诱导表达；离心分离后悬浮，95℃煮20分钟，然后进行SDS-PAGE电泳纯化。

步骤6，将上述表达产物进行SDS-PAGE电泳，然后以HRP标记的黏蛋白为直标一抗，进行WB和拷马斯亮蓝染检测，通过WB结果与拷马斯亮蓝染结果进行对比；在WB检测结果呈阳性反应的DNA片段中，找出与呈阴性反应DNA片段没有重复区域的DNA片段1，和完全包含呈阴性反应DNA片段的DNA片段2；所述DNA片段1和2的重复区域为所述整合膜蛋白活性片段，其中所述HRP标记黏蛋白方法如下：

步骤(1)，取黏蛋白溶解于碳酸盐缓冲液，配置成黏蛋白溶液；

步骤(2)，配置HRP溶液：HRP溶于水中，加入过碘酸盐溶液，进行搅拌；然后于乙酸盐缓冲液中，透析；向所述透析产物中加入碳酸盐缓冲液，调节PH值至9.0～9.5，制备出HRP溶液；

步骤(3)，将所述黏蛋白溶液与所述HRP溶液混合，搅拌；

步骤(4)，向步骤(3)所得混合溶液中加入硼氢化钠，然后置于硼酸缓冲溶液中透析；制备出HRP标记的黏蛋白。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述RT-PCR扩增反应体系包括：10X缓冲溶液，dNTP，引物，DNA模板，rTag聚合酶和重蒸水。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酶切过程中，反应体系包括：醋酸盐缓冲溶液，插入DNA目的片段，BSA和两种内切酶。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述两种内切酶为Xho Ⅰ和HindⅢ。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述连接过程中，反应体系包括：载体，所插入的DNA片段，DNA连接酶及其10X缓冲溶液。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述乙酸盐缓冲溶液PH值为4.4。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述透析均在4℃下进行。