CN104178441A

CN104178441A - 一种高效益生菌及其制备方法

Info

Publication number: CN104178441A
Application number: CN201310188066.3A
Authority: CN
Inventors: 刘志华; 秦环龙; 汪建平
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-05-20
Filing date: 2013-05-20
Publication date: 2014-12-03

Abstract

本发明提供了一种高效益生菌，能够高表达I58基因（IMP501-580）的乳酸杆菌。制备方法为：依据I58基因序列设计扩增引物，经PCR克隆I58基因片段；将所得I58基因片段克隆至表达载体中，获得重组载体；转化所述重组载体至感受态的乳酸杆菌中，得到高效益生菌。本发明提供的高效益生菌能够高表达I58基因，黏附活性高，不会发生易位，也不会与抗生素作用，故可以很好弥补普通乳酸杆菌易位和不耐抗生素的缺陷，抑制病菌的定植、移位和感染，因此临床应用价值较大，有着广阔的医药应用前景。

Description

一种高效益生菌及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种高效益生菌，尤其涉及一种高表达I58基因的乳酸杆菌及其制备方法。

背景技术

益生菌是指改善宿主微生态平衡而发挥有益作用，达到提高宿主健康水平和健康状态的活菌制剂及其代谢产物，其广泛存在于地球上的各个角落，是一种对人和动物有益的细菌，它们可直接作为食品添加剂服用，以维持肠道菌丛的平衡，在肠道内的黏附和定植能抑制致病菌的损伤，对于保护肠道黏膜的完整性具有重要的意义；自90年代初以来，形形色色的“益生菌”类保健品风靡了整个世界，与此同时，“益生菌”的研究业已成为国际上的热门研究课题。

乳酸杆菌是益生菌中及其重要的一种，可以与靶细胞黏附，竞争抑制致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）和侵袭性大肠杆菌（EIEC）等致病菌对人体肠道屏障功能的损害；激发继发于黏附的细胞内信号转导途径，降低肠上皮细胞（IEC）的通透性；调节人体肠道黏膜免疫功能，促进树突状细胞（DC）分化成熟，以及诱导肠道T细胞分化成熟等。

研究表明，益生菌包括乳酸杆菌对肠道炎症性相关疾病，如炎症性肠病、肠易激综合征、抗生素相关性腹泻、新生儿坏死性小肠结肠炎、和胆道感染等，具有重要的防治作用。然而，益生菌在使用过程中也存低效性问题，即在病理状态下，益生菌剂量较难在肠道长期维持一个较高的剂量。因此，建立高效能的益生菌对于肠道菌群失调引起的疾病的治疗，以及新药的开发具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足，提供一种高效益生菌，能够高表达I58基因（IMP501-580）。

本发明提供了一种高效益生菌，所述高效益生菌为高表达I58基因（IMP501-580）的乳酸杆菌。

优选地，将含有I58基因的重组载体转染乳酸杆菌中，得到高表达I58基因的乳酸杆菌。

优选地，所述乳酸杆菌选自保加利亚乳杆菌、干酪乳酸菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌、短乳杆菌。

本发明还提供了一种制备上述高效益生菌的方法，包括以下步骤：

步骤1，依据I58基因序列设计扩增引物，经PCR克隆I58基因片段；

步骤2，将所得I58基因片段克隆至表达载体中，获得重组载体；

步骤3，转染所述重组载体至感受态的乳酸杆菌中，得到高效益生菌。

优选地，在扩增引物设计过程中，使所设计的上游引物在I58基因上游引入Bgl Ⅱ酶切位点；使所设计的下游引物在I58基因下游引入Xho Ⅰ酶切位点。

优选地，步骤1中所述扩增引物如下：

上游引物：5’-atcAAGCTTTTTTCAGTTCAAAATGGTTA-3’；

下游引物：5’-atcctcgagAGTTTTCATCTTAACAACCT-3’；

其中所述上游引物中atc为Bgl Ⅱ酶切位点，所述下游引物中atcctcgag为Xho Ⅰ酶切位点。

优选地，所述表达载体为含有Bgl Ⅱ酶切位点和Xho Ⅰ酶切位点的表达载体。

优选地，所述表达载体为pET32载体。

本发明还提供了上述高效益生菌在制备治疗肠道菌群失调引起的疾病的药物中的应用。

益生菌在肠道内的黏附和定植对抑制病菌的定植、移位和感染，维护肠道黏膜的完整性具有特别重要的意义。乳酸杆菌是益生菌中重要的一类，其在发挥益生作用时，表面蛋白（surface layer protein，SLP）的黏附结构起着核心作用。其中，乳酸杆菌表面蛋白的活性片段I58（IMP501-580）为具有黏附活性的片段。

本发明提供的高效益生菌能够高表达I58基因，黏附活性高，不会发生易位，也不会与抗生素作用，故可以很好弥补普通乳酸杆菌易位和不耐抗生素的缺陷，抑制病菌的定植、移位和感染，因此临床应用价值较大，有着广阔的医药应用前景。

附图说明

图1为竞争黏附实验结果图。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步地说明，以更好地理解本发明。

本实施例提供了一种高表达I58基因的高效益生菌，将含有I58基因的重组载体转染乳酸杆菌中，得到高表达I58基因的乳酸杆菌。

制备方法具体为：

1、克隆I58基因

1.1基因组NDA的提取

1)抽提缓冲液65℃预热；

2)加菌体（植物乳酸杆菌CGMCC1258）到已经预热的缓冲液（700μl）中混匀，65℃，10min；

3)加酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡，离心12,000rpm，10min；

4)取上清，加氯仿/异戊醇（24:1）振荡，离心12,000rpm，10min；

5)取上清，重复4步骤；

6)加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），-20℃沉淀；

7)离心12,000rpm，10min；

8)弃上清，70％乙醇洗，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100mL水中。

1.2目的基因的克隆

1）克隆

以基因组DNA为模板，根据GenBank中目的基因的DNA序列设计引物（表1）对目的基因进行扩增（表2）。程序：94℃3min；94℃30秒，55℃30秒；72℃1min，30个循环；72℃15min。

表1扩增引物

上游引物	atcAAGCTTTTTTCAGTTCAAAATGGTTA
		下游引物	atcctcgagAGTTTTCATCTTAACAACCT

表2PCR反应体系（100μl）

成分	体积
		Mg²⁺	10μl
10×buffer	10μl
		dNTP	4μl
Primer	2μl
		LA taq酶	1μl
ddH2O	71μl

2）胶回收（参考Axgen胶回收试剂盒说明书）

在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提前记录1.5mL离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如100mg=100μl体积）；

加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热（低熔点琼脂糖凝胶于40℃加热），间断混合（每2-3min），直至凝胶块完全熔化（约6-8min）；

加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀；当分离的DNA片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇；

正确连接负压装置，将DNA制备管插到负压装置的插口上。吸取步骤3中的混合液，转移到制备管中，开启并调节负压至-20-30cmHg，缓慢吸走管中溶液；

加500μl Buffer W1，吸尽管中溶液；

加700μl Buffer W2，吸尽管中溶液，以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次；

将制备管置于2mL离心管（试剂盒提供）中，12,000×g离心1min；

将制备管置于洁净的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加25-30μl去离子水，室温静置1min，12,000×g离心1min洗脱DNA。

2、重组载体的建立

1）酶切

对胶回收产物和pET32载体分别以Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ进行酶切（表3）。程序：37℃，34h，酶切完后用65℃灭活10min。加5μl3M醋酸钠，和冷却的无水乙醇120μl，-20℃放置15min。然后12000rpm离心10min，去上清，再用70%乙醇洗2次，室温晾干，加30μl去离子水溶解。

表3酶切体系（50μl）

成分	体积
		DNA	30μl
BiglI	2.5μl
		XhoI	2.5μl
2×buffer	10μl
		ddH2O	5μl

2）连接

待插入的DNA片段和载体经琼脂糖凝胶电泳定量后以10：1的比例连接，程序：16℃过夜（连接体系如表4所示）。

表4连接体系（20ul）

3、转染所得重组载体至乳酸杆菌中

连接产物65℃灭火10min。然后取10μl的连接产物转染感受态的植物乳酸杆菌（LP），冰上孵育30min，42℃热激1min，加无抗的LB培养基400μl，200rpm，37℃孵育1h。然后取100μl涂氨苄青霉素（Ampicillin,Amp）抗性的平板。37℃，培养16h，得到高表达I58基因的植物乳酸杆菌（HLP）。

鉴定：每一块平板取4个形态饱满生长良好的菌落进行PCR鉴定，程序同步骤1，挑经过鉴定的阳性克隆到1mL TB培养液培养8h，然后用Axgene的质粒小抽试剂盒抽提质粒，溶解在50μl去离子水中并测序，测序结果用BLAST软件进行比较，结果表明本实施例I58基因正确克隆至植物乳酸杆菌中。

竞争黏附实验：取所得HLP进行竞争黏附实验，结果如图1所示，肠侵袭性大肠埃希杆菌（enteroinvasive E.coli，EIEC）对NCM460细胞的黏附率为15%-28%，肠道致病性大肠杆菌（EPEC）为20%-45%。当植物乳酸杆菌（LP）预处理后，EIEC和EPEC的黏附率下降，分别为8-18%和8-22%，而高表达I58基因的植物乳酸杆菌（HLP）预处理后，EIEC和EPEC的黏附率均明显下降，分别为6-10%和6-16%(P<0.05)。结果表明，HLP高表达I58基因，黏附活性高，不会发生易位，可以有效抑制病菌的定植、移位和感染。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种高效益生菌，其特征在于，所述高效益生菌为高表达I58基因的乳酸杆菌。

2.根据权利要求1所述高效益生菌，其特征在于，将含有I58基因的重组载体转化乳酸杆菌中，得到高表达I58基因的乳酸杆菌。

3.根据权利要求1或2所述高效益生菌，其特征在于，所述乳酸杆菌选自大肠杆菌保加利亚乳杆菌、干酪乳酸菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌、短乳杆菌。

4.一种制备权利要求1所述高效益生菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤3，转化所述重组载体至感受态的乳酸杆菌中，得到高效益生菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在扩增引物设计过程中，使所设计的上游引物在I58基因上游引入Bgl Ⅱ酶切位点；使所设计的下游引物在I58基因下游引入Xho Ⅰ酶切位点。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1中所述扩增引物如下：

上游引物：5’-atcAAGCTTTTTTCAGTTCAAAATGGTTA-3’；

下游引物：5’-atcctcgagAGTTTTCATCTTAACAACCT-3’；

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述表达载体为含有Bgl Ⅱ酶切位点和Xho Ⅰ酶切位点的表达载体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pET32载体。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述乳酸杆菌选自保加利亚乳杆菌、干酪乳酸菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌、短乳杆菌。

10.一种如权利要求1所述高效益生菌在制备治疗肠道菌群失调引起的疾病的药物中的应用。