CN102373196A - 利用染色体替换技术使鲑鱼降钙素蛋白在转基因油菜油体中超高量、靶向表达的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种综合利用植物油体特异表达和基因打靶来实现染色体靶向替换，在转基因油菜籽中超高量表达鲑鱼降钙素蛋白的方法。用Race克隆得到1900bp的油菜5’UTR序列，以“油菜oleosin基因5游UTR序列-‘芝麻oleosin+CT融合蛋白基因’-Pnos-NPTII-Tnos-油菜oleosin基因3’UTR序列”替代油菜基因组中的固有的内源序列。通过inplanta法，获得转基因油菜植株及株系。检测结果表明，油菜基因组中的内源序列被新序列所取代，成功的实现了目标基因的靶向表达，使鲑鱼降钙素蛋白在转基因油菜籽中超高量地表达。该方法具有目的蛋白表达量高，表达的蛋白易于储存和纯化的显著优点。

Description

利用染色体替换技术使鲑鱼降钙素蛋白在转基因油菜油体中超高量、靶向表达的方法

技术领域

本发明涉及综合利用植物油体特异表达技术和基因打靶技术进行染色体替换的方法，特别涉及利用Race技术克隆得到1900bp的油菜5’UTR序列和酵母染色体重建蛋白ScRAD54，以“油菜oleosin基因5游UTR序列-‘芝麻oleosin+CT融合蛋白基因’-Pnos-NPTII-Tnos-油菜oleosin基因3’UTR序列”替代油菜基因组中的固有的内源序列“油菜oleosin基因5’UTR序列-油菜oleosin基因-油菜oleosin基因3’UTR序列”，获得的转基因油菜籽油体中可超高量表达鲑鱼降钙素蛋白的方法。

背景技术

基因打靶(gene targeting)产生于70年代末和80年代初，是指将携带有选择标记的外源目的基因采用一定的实验方法导入受体细胞，再通过外源DNA序列与受体细胞染色体上同源DNA序列间发生重组，最终将外源DNA定点整合入受体细胞基因组某一预定位点，改变细胞遗传特性，或对某一预先确定的受体位点进行定点突变，导致受体细胞基因功能敲除或者点突变的技术。虽然基因打靶的原理和技术路线并不复杂，但是由于高等真核生物细胞内外源DNA与靶细胞DNA序列发生同源重组的机率非常低，所以获得定点整合的转基因植株仍然是一件非常困难的工作。研究表明，植物细胞同源重组起始于DNA双链断裂(doublestrandbreak，DSB)。受体DNA双链断裂产生DSB位点、供体DNA整合进入受体DSB位点是进行同源重组的必要步骤。RAD54属于SWI2/SNF2超家族，编码蛋白具有ATP酶/解旋酶的保守序列。RAD54在酵母中促进供体DNA向DSB位点的整合。酵母RAD54基因或鼠胚胎干细胞和鸡DT40细胞系中的RAD54同源基因被破坏，基因靶向整合的几率降低而辐射敏感性提高。在拟南芥中表达RAD54蛋白，基因靶向整合的几率提高27倍，达到10^-2到10^-1。

植物种子中贮存的营养物质主要包括：蛋白、脂肪和碳水化合物。所有植物中的脂类物质均以三酰甘油(triacylglycerols，TAG)的形式存在，只有jojoba是唯一例外，它贮存蜡酯(wax esters)。种子中的TAG分子之间不是彼此聚合的，而是分散成许多小的稳定的亚细胞微滴，这些小的亚细胞微滴被称为油体(Huang HC，1992)。油体有其自身的结构和特征，为直径0.5～2.5μm的球体，其大小因植物种类的不同而不同，且受营养、环境影响。油体的成份包括：92～98％的中性脂类[主要为TAG及少量的二酰甘油(DAG)和自由脂肪酸]；1～4％的磷脂(PL)(主要为磷脂酰胆碱-占60％～70％及少量的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇)、1～4％油体蛋白oleosin和少量的油体钙蛋白(CALEOSIN)、油体固醇蛋白(STEROLEOSIN)、细胞色素C还原酶。油体内部为液态TAG，外部是由单层磷脂分子及其镶嵌蛋白-oleosin组成的半单位膜。油体蛋白oleosin是小分子量(15～26kD)的碱性疏水蛋白，在种子中特异表达，为油体所特有，对维持油体的稳定极为重要，占油体总重量的1～4％。不同物种来源的oleosin分子量不同，但都具有3个基本的结构域，即：N端40～60个氨基酸组成的两亲性区域(兼具亲水性和亲脂性)，这一区域分布于油体表面朝向胞浆的一面；中间68～74个氨基酸的保守区域，为伸入油体内部的反式平行β-折叠结构，这一区域的氨基酸序列在不同来源的oleosin中高度保守；位于或靠近C端的33～40个氨基酸组成的α-螺旋结构域。该结构域兼具亲水和亲脂性，其带正电荷的基团朝向油体表面的磷脂层(PL)，带负电荷的部分位于油体表面朝向胞浆的一面。虽然所有的oleosin均具有上述3个结构域(3个结构域加起来约15kD)，但oleosin分子量的差别却很大(15～26kD)，多出的1～11kD以C-端或N-端的延伸形式存在。通过对不同植物oleosin氨基酸序列的研究发现，不同oleosin分子间除中部疏水区域高度保守外，N端和C端氨基酸序列差异很大。这使人们想到，外源蛋白插入oleosin分子的N端或C端后，不会影响oleosin在植物油体上的定位。

植物油体表达体系正是以此为理论基础建立起来的，将目的蛋白插在油体蛋白基因的N端或C端，构成融合蛋白，在转基因植物种子的油体上特异表达，利用油体亲脂疏水的特性，将种子粉碎-离心-回收上层油相-去油，即可获得融合蛋白，具有提取工艺简单，目的蛋白易于分离纯化的优点。

发明内容

本发明是提供一种综合利用植物油体特异表达技术和基因打靶技术实现油菜染色体替换，在转基因油菜籽油体中特异、超高量表达鲑鱼降钙素蛋白的方法。

本发明利用染色体步移技术，克隆得到来源于甘蓝属油菜(Brassica napus)oleosin基因5’UTR，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：1由2031个碱基组成。

本发明中按照双子叶植物偏爱密码子人工合成了鲑鱼降钙素基因(Salmon Calcitonin，sCT)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：2由132个碱基组成，为便于获得天然的鲑鱼降钙素，序列插入了肠激酶的酶切位点。

本发明为提高同源重组的几率从酿酒酵母基因组中PCR克隆得到了RAD54蛋白的基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：4的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：5的DNA序列

序列表中的SEQ ID NO：2由2697个碱基组成，编码具有序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸残基序列的蛋白质。

本发明中为确保获得的转基因油菜是同源重组而非随机插入的转基因油菜，我们引入了正、负筛选系统。正筛选系统采用的是抗化学试剂标记基因basta基因，正筛选系统采用的CodA基因。

本发明中从大肠杆菌JM109基因组克隆了CodA基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：6的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：7的DNA序列

序列表中的SEQ ID NO：6由1284个碱基组成，编码具有序列表中SEQ ID NO：7的氨基酸残基序列的蛋白质。

本发明所提供在转基因油菜籽油体中特异、超高量表达鲑鱼降钙素蛋白的方法是含有所述目标基因的植物表达载体导入植物组织或细胞后与染色体进行同源重组。

用于构建所述植物表达载体的出发载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它的参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

研究表明酿酒酵母RAD54蛋白可提高染色体同源重组的机率，本发明构建含有RAD54基因的植物表达载体pRAD3301。在pRAD54上有3个完整的基因表达盒，分别是P35S-Basta-35SpolyA表达盒、P35S-ScRAD54-Tnos表达盒和P35S-GUS-Tnos表达盒。

本发明中为实现油菜染色体同源重组，在转基因油菜籽油体中特异、超高量表达鲑鱼降钙素蛋白的方法，构建包括4个完整的基因表达盒的植物表达载体psCT，4个表达盒分别是P35S-codA-Tnos表达盒、1900bp油菜oleosin基因5’UTR-“芝麻oleosin+sCT融合蛋白基因”-Pnos-NPTII-Tnos表达盒、油菜oleosin基因3’DNA序列表达盒和P35S-codA-Tnos表达盒。

将pRAD3301和pGTO分别转入农杆菌LBA4404，用蘸花法转化油菜，获得转基因油菜植株及株系。转基因油菜后代分子生物学检测结果表明，油菜基因组中的固有的内源序列“油菜oleosin基因5’UTR序列-油菜oleosin基因-油菜oleosin基因3’UTR序列”被新序列“油菜oleosin基因5’UTR序列-‘芝麻oleosin+CT融合蛋白基因’-Pnos-NPTII-Tnos-油菜oleosin基因3’UTR序列”所取代，成功地综合运用基因打靶技术和油体特异表达技术替换了油菜染色体部分序列，使鲑鱼降钙素蛋白在转基因油菜籽中特异地、超高量地表达，目的蛋白表达量为种子总蛋白的10％，远远高于现有的外源基因在转基因植物中0.2-1％的表达量。该方法具有目的蛋白表达量高，表达的蛋白易于储存和纯化的显著优点。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为RAD54基因PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为pRAD54的限制性内切酶HindIII酶切鉴定结果

图3为中间载体p3301 EcoRI/HindIII双酶切鉴定结果

图4为植物表达载体pRAD3301 SacI、PstI单酶切鉴定结果

图5为构建oleosin基因5’上游序列步移文库的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图6为CodA基因PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图7为pCodA BamHI/SacI双酶切鉴定结果

图8为中间载体pCodA121 BamHI/SacI双酶切鉴定结果

图9为中间载体pCodAE2300/ka^-EcoRI单酶切鉴定结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物均由上海生工合成，测序工作均由中国农业科学院重大工程楼实验室协助完成。

实施例1、酿酒酵母RAD54基因的克隆

一、酿酒酵母基因组的提取

1)挑取酵母菌单菌落(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号31141)，接种于10mlYPD(1％酵母提取物，2％葡萄糖，1.5％琼脂粉，2％蛋白胨)液体培养基中，30℃摇床培养过夜；

2)取过夜培养的1ml酵母菌液，5000rpm离心5min，去上清，加入1ml无菌水，重悬沉淀，5000rpm离心1min，去上清，沉淀中加入200μl破菌buffer(1％SDS，2％TritionX-100，100mM NaCl，10mMTris-ClpH8.0，1mM EDTA)，剧烈震荡。

3)加入200μl酚/氯仿/异戊醇(体积比25∶24∶1)，剧烈震荡，12000rpm离心5min，取上清，加入等体积氯仿，颠倒轻微震荡，12000rpm离心5min，取上清，加入2倍体积无水乙醇和1/10体积NaAc，颠倒混匀，置于-20℃冷冻10min。

4)4℃12000rpm离心，沉淀用70％乙醇洗涤2遍，吹干，溶于20μl水或TE溶液，-20℃保存备用。

二、RAD54基因PCR引物的设计

根据GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的酿酒酵母RAD54基因(序列号为M63232.1)，设计5’引物P1，3’引物P2，引物序列如下：

P1：5’-CTGCAGGATGGCAAGACGCAGATT-3’

P2：5’-CTGCAGGTAAGAGATCAATGTG-3’

三、RAD54基因的克隆

以酿酒酵母基因组为模板，以引物P1和P2进行RAD54基因的扩增，PCR程序为：先95℃5min；再94℃30s，59℃1min，72℃1min30s，共32个循环；最后72℃10min。PCR反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示，在2700bp处有一明显的扩增条带。

使用载体pMD18-T(TaKaRa，Cat.No.D504A)试剂盒进行PCR产物的克隆。具体方法为：取步骤2获得的PCR产物2μL，依次加入0.5μL载体pMD18-T、2.5μL Ligase Solution I，然后16℃连接8h。将连接产物用热激法转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选得到阳性重组克隆，将阳性克隆质粒命名为pRAD54，用限制性内切酶HindIII进行酶切鉴定，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，表明2700bp的目的片段已正确连接入载体pMD18-T中，对pRAD54做进一步的测序鉴定，测序结果表明插入片段具有序列表中的核苷酸序列。

实施例2、RAD54植物表达载体pRAD3301的构建

一、中间载体p3301的构建

本实施例所构建的基因pRAD3301的表达盒中包括以下基因表达调控元件：35S启动子、RAD54基因和NOS终止子。首先将pTΩ4A以限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切，回收999bp片段，将其与相同酶切的植物载体pCAMBIA3301连接，得到中间载体，命名为p3301。以EcoRI和HindIII双酶切进行验证，酶切鉴定结果如图3所示，结果证明pTΩ4A片段已经连在pCAMBIA3301上。

二、RAD54植物表达载体pRAD3301的构建

用限制性内切酶PstI酶切质粒RAD54，回收2700bp片段，与相同酶切的载体p3301连接，得到RAD54植物表达载体，命名为pRAD3301。对其分别用限制性内切酶SacI和PstI进行单酶切鉴定，酶切鉴定结果如图4所示，酶切产物片段大小分别为1170bp和2700bp，与预期结果相符。

实施例3、油菜oleosin基因5’上游序列的克隆

植物材料：油菜品种中双4号，苗龄4周时。

一、oleosin基因5’上游序列染色体步移引物的设计

同源序列的大小是影响基因打靶效率的重要因素，构建基因打靶载体时，一般要求需要有2kb左右的DNA同源序列，但Genbank上已登录的oleosin基因(序列号为M63985)5’上游序列大小仅为944bp，为此，需用染色体步移进一步克隆oleosin上游序列。

根据Genbank上登录的oleosin基因5’UTR序列和GenomeWalker^TM Universal Kit的要求，设计2个特异引物，引物序列如下

GSP1：5’-TAATCTCCGCCGCGTCTCTCTCTAAAC-3’

GSP2：5’-CCAAAGCTGCACTCTCTCTATCCAAAAG-3’

二、oleosin基因5’上游序列的克隆

用下述方法进行oleosin基因5’上游序列的克隆，具体过程包括以下步骤：

1)油菜基因组DNA提取

取25～100mg新鲜油菜叶片，加液氮碾成粉末，转入1.5mL离心管中。加450μL提取缓冲液(100mmol·L^-1Tris-Cl，pH 8.0，500mmol·L^-1NaCl，10mmol·L^-1β-巯基乙醇，50mmol·L^-1EDTA，pH 8.0)及100μL10％SDS，剧烈振荡。65℃水浴30min，加160μL 3mol·L^-1NaAc(pH 5.2)，置冰上20min。12000g 4℃离心10min，取上清。加2倍体积的预冷的无水乙醇，颠倒混匀以利于DNA析出。用玻棒挑出丝状DNA，置于1.5mL小离心管中，70％乙醇漂洗数次后晾干备用。

2)基因组DNA步移文库的构建

参照GenomeWalker^TM Universal Kit中的说明书进行。具体步骤如下：

①基因组DNA的酶切消化。将基因组DNA分别以DraI、EcoRV、PvuI和StuI平末端酶酶切消化，37℃，18h～20h，以0.6％的琼脂糖凝胶进行电泳，检测酶切是否完全。

②DNA的纯化。在上一步酶切完全的EP管中加入等体积的苯酚，混匀，离心，12000rpm，5min；取上清到新的EP管中，加入等体积的氯仿，混匀，离心，12000rpm，5min；将上清吸到新的EP管中，每管加2倍体积冰预冷的95％的乙醇，1/10体积3mol·L^-1NaAc，轻轻混匀，4℃，14000rpm离心15min；去上清，加入100μL冰预冷的80％的乙醇洗DNA，重复几次，4℃，14000rpm离心10min；去掉液体，空气干燥；用20μL无菌水溶解。

③纯化后的DNA与GenomeWalker^TM接头的连接。将上一步回收的4管DNA分别与GenomeWalker^TM接头连接，16℃过夜，之后70℃，5min终止反应，构建得4个基因组步移文库(DL1、DL2、DL3和DL4)。

3)oleosin基因5’上游序列的克隆

oleosin基因5’上游序列的克隆通过两轮PCR完成。

①第一轮PCR反应：在4个0.5mL的EP管(C1～C4)中分别以构建好的DNA文库(DL1、DL2、DL3和DL4)为模板，以基因特异引物GSP1和接头引物(GenomeWalker^TM Universal Kit提供)AP1(5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’)在热循环仪(BIO-RAD)上进行PCR反应。反应程序为：95℃预变性5min；随后紧接着7个循环为94℃25s，72℃3min；然后接着32个循环，94℃25s，67℃3min；最后67℃延伸7min。反应完成后，将上述4管PCR产物稀释50倍(D1～D4)用作第二轮PCR扩增的模板。

②第二轮PCR反应：以基因特异引物GSP2和接头引物AP2(5’-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’)进行PCR扩增，反应程序为：首先94℃25s，72℃3min扩增5个循环；紧接着94℃25s，67℃3min扩增20个循环，最后67℃延伸7min。

③PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测(如图5所示1：λDNA EcoRI/HindIII Marker2：DarI酶切文库3：StuI酶切文库4：EcoRV酶切文库5：PvuII酶切文库6：阴性对照7：试剂盒阳性对照8：试剂盒阴性对照9：试剂盒中提供构建好的文库)，通过胶回收纯化后与pMD19-T Vector连接，转化E.coli DH5α，筛选重组子酶切鉴定，测序验证。

4)oleosin基因5’上游序列的分析

将重组子测序结果利用DNAMAN软件进行分析，筛选获得oleosin基因5’上游序列，将该阳性克隆命名为pOPF。

实施例4、基因打靶载体pGTO的构建

实验材料：大肠杆菌JM109

一、大肠杆菌CodA基因的克隆

1)大肠杆菌基因组DNA的提取

①挑取E.coli单菌落，接种到5ml带有相应抗生素的液体LB培养基中，200rpm、37℃培养过夜。

②将2ml菌液加入2ml Eppendorf管中，12000rpm离心1min，弃上清。

③向管中加人200μl Solution I(50mM蔗糖，10mM EDTA pH8.0，25mM Tris-Cl pH8.0)混匀。

④加入400μl SolutionII(1％SDS，0.2M NaOH)，上下颠倒混匀2次。

⑤迅速加入300μl SolutionIII(每100ml含5M KAc 60ml，冰乙酸11.5ml，蒸馏水28.5ml)，轻轻混匀，室温放置10min。

⑥12000rpm离心10min，吸上清于另一EP管中。

⑦分别用苯酚和氯仿各抽提一次，抽提条件是：12000rpm离心10min。

⑧小心取上清，加入2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置10min，12000rpm离心10min，DNA沉淀用70％乙醇洗2次，晾干备用。

2)克隆CodA基因的引物设计

根据GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的大肠杆菌CodA基因(序列号为AY552602)，设计5’引物codA5，3’引物codA3，引物序列如下：

CodA5：5’-GGATCCATGTCGAATAACGCTTTAC-3’

CodA3：5’-GAGCTCTCAACGTTTGTAATCGATG-3’

3)CodA基因的克隆

以大肠杆菌JM109基因组为模板，以引物codA5和codA3进行PCR扩增，程序为：95℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃1min，共32个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图6所示，在1290bp处有一明显的扩增条带。

使用载体pMD18-T(TaKaRa，Cat.No.D504A)试剂盒进行PCR产物的克隆。具体方法为：取上一步获得的PCR产物2μL，依次加入0.5μL载体pMD18-T、2.5μL Ligase Solution I，然后16℃连接8h。将连接产物用热激法转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选得到阳性重组克隆，将阳性克隆质粒命名为pCodA，用限制性内切酶BamHI和SacI进行双酶切鉴定，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明1290bp的目的片段已正确连接入载体pMD18-T中(如图7)，对pCodA做进一步的测序鉴定，测序结果表明插入片段是序列表中的核苷酸序列。

二、中间载体pCodA2300/ka^-的构建

1)中间载体pCodA121的构建及表达盒酶切位点的改变

①中间载体pCodA121的构建

本实施例所构建的基因pCodA121的表达盒中包括以下基因表达调控元件：5’端的35S启动子、基因CodA和3’端的NOS终止子。首先将质粒pCodA以限制性内切酶BamHI和SacI进行双酶切，回收1290bp片段，将其与相同酶切的载体pBI121连接，构成中间载体，命名为pCodA121。以BamHI和SacI双酶切进行验证，酶切鉴定结果如图8所示，结果证明CodA片段已经连在pBI121上。

②中间载体pCodA121表达盒酶切位点的改变

受可用限制性内切酶位点的限制，本发明中将pCodA121表达盒两端的酶切位点分别改变为I：两端都是HindIII，命名为pCodA121H；II：两端都是EcoRI，命名为pCodA121E。

2)中间载体pCodA2300/ka^-的构建

①将pCAMBIA2300用限制性内切酶XhoI酶切消化，将nptII基因切下，再用T4连接酶连接，得到不含nptII基因的pCAMBIA2300，命名为pCAMBIA2300/ka^-。

②将质粒pCodA121E用限制性内切酶EcoRI酶切消化，回收2400bp片段，与相同酶切的pCAMBIA2300/ka^-连接，得到中间载体，命名为pCodAE2300/ka^-。以EcoRI单酶切验证，证明2400bp片段已经连在pCodAE2300/ka^-上，酶切鉴定结果如图9所示。以限制性内切酶PstI单酶切，验证CodA表达盒的方向。

③将质粒pCodA121H用限制性内切酶HindIII酶切消化，回收2400bp片段，与相同酶切的pCodAE2300/ka^-连接，得到中间载体，命名为pCodA2300/ka^-。以HindIII单酶切验证2400bp片段是否连上，以限制性内切酶BamHI单酶切验证方向，此步连上的CodA表达盒的方向需与上步的方向相反。

三、基因打靶载体pGTO的构建

基因打靶载体pGTO所用的内源序列I(OPF)为实施例3获得的油菜oleosin基因5’上游序列，内源序列II(OPS)为油菜oleosin基因全长(包括exon1+intron1+exon2+intron2+polyA)，目的基因为鲑鱼降钙素(sCT，本实验室构建好的)，正筛选标记为NptII(具有卡那霉素抗性)，负筛选标记为CodA。构建过程如下所示：

设计引物从质粒pBI121中将NptII表达盒序列PCR扩增出来，序列长度为1783bp，引物序列如下：

Npt5：5’-GGATCCAACGACAATCTGATC-3’

Npt3：5’-GAATTCGCCCGATCTAGTAAC-3’

将扩增出来的序列连到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌DH5α，酶切验证正确的送测序，将测序结果正确的质粒以BamHI和EcoRI双酶切，将得到的1783bp片段，与相同酶切的载体Bluescript II KS+/-连接，得到中间载体，命名为pBluA。

根据实施例3得到的序列设计引物，从油菜基因组中PCR得到1800bp产物，将其连在pMD19-T载体上，测序，正确的克隆命名为OPF(内源序列1)。将OPF以限制性内切酶XhoI和EcoRI双酶切，将得到的片段与相同酶切的中间载体pBluA连接，得到中间产物，命名为pBluB。

根据实验室已有的质粒pBOSC(载体为pTΩ4A，基因为油菜promoter-His6-芝麻oleosin-EK-sCT)设计引物，将His6-芝麻oleosin-EK-sCT-NOS ter这一段基因PCR扩增出来，改变酶切位点为两端都是EcoRI，将PCR产物连接到pMD19-T载体上，测序，将测序结果正确的质粒以限制性内切酶EcoRI单酶切，回收780bp片段，与相同酶切的中间载体pBluB连接，得到中间载体，命名为pBluC。引物序列如下：

Hoec5：5’-GGATCCAACGACAATCTGATC-3’

Hoec3e：5’-GAATTCGCCCGATCTAGTAAC-3’

根据Genbank上已登录的oleosin基因(序列号为M63985)设计引物，从油菜基因组中PCR扩增内源序列2，将PCR产物连到pMD19-T载体上，测序，正确克隆命名为pOPS。将pOPS质粒以限制性内切酶SpeI单酶切，回收1672片段，与相同酶切的中间载体pBluC连接，得到中间产物，命名为pBluD。

将中间载体pBluD以限制性内切酶KpnI单酶切，回收片段，与载体p2300/ka-codA连接，得到基因打靶载体，命名为pGTO。

实施例5、转基因油菜的获得

植物材料：油菜中双4号

一、植物表达载体pRAD3301和pGTO

将构建好的通过热激法转化根癌农杆菌LBA4404。具体方法如下：

1)采用Promega公司的WizardTM plus minipreps DNA purification system，提取质粒DNA加入到100μLLBA4404感受态细胞中，混匀，冰浴5min。

2)将离心管置液氮中冷冻5min，迅速转至37℃水浴中温浴5min。

3)加入1mL YEB液体培养基，在28℃摇床上250rpm复苏4-5h。

4)取适量菌液涂布到含利福平50mg/L和Kan(卡那霉素)100mg/L的YEB固体培养基上，置28℃培养24-48h。

挑取单菌落碱裂解法提取质粒DNA筛选不同的重组子，转化E.coli JM109，(具体方法同上)，酶切验证将pRAD3301、pGTO转化到根癌农杆菌LBA4404中。

二、in planta方法转化油菜

从平板上挑取农杆菌单菌落，接种到5mLYEB液体培养基中(Kan 100mg/L+Rif 50mg/L)，振荡培养过夜，取1mL菌液接种到50mL YEB液体培养基(Kan 100mg/L+Rif 50mg/L)中，剧烈振荡培养至OD600为0.4-0.5(约3-4h)，2100g离心5min，菌体MS0培养基洗一次，重悬，使OD660＝1～1.5。

将上述的农杆菌悬浮液在5000×g下离心10min，沉淀后的农杆菌用1L新鲜的LB培养基重新悬浮。为提高侵染的转化效率，添加了0.5％的表面活性物质有机硅和5％的蔗糖。用农杆菌悬浮液直接浸染油菜花序。选择花即将开放且没有露水和泥土的的分枝，剪去分枝上已经开放的花。将枝条弯曲，使整个花序浸泡在盛有菌液的烧杯中，上下摇动1min左右。在确保所有花都已被浸染后，用杂交袋将处理过的花序套住。整个过程自第一次浸染后每天进行一次，共5-10次。每次浸染选择清晨和傍晚进行，以避免太阳紫外线过强使农杆菌活性降低。雨天暂停浸染。

待种子成熟时，将经过in planta处理过的分枝剪下单独收获种子，晒干后脱粒储藏。

三、基因打靶转基因油菜的筛选

将in planta处理获得种子灭菌后均匀播撒于含有270mg·L-1卡那霉素和500mg·L-15-氟胞嘧啶的MS固体培养基上。四到五天后，in planta方法获得的种子在含卡那霉素和5-氟胞嘧啶的MS培养基上萌发出幼苗。萌发的幼苗中转入外源基因者具有卡那霉素抗性，可以正常存活；未转入外源基因的幼苗不具有卡那霉素抗性，子叶叶片边缘褐化，在子叶及第一片真叶表面出现白斑，叶柄变紫变红，最终死掉。CodA蛋白可将无毒5-氟胞嘧啶转化为有毒的5-氟脲嘧啶。转基因油菜中非同源重组的转基因油菜由于CodA蛋白而将非同源重组的转基因油菜杀死。将存活下来的幼苗移栽至营养钵，经DNA检测确信外源基因的存在后移至土壤中。

Claims (10)

1.油菜oleosin基因5’UTR序列，是下列序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：1由1900个碱基组成。利用染色体步移技术，克隆得到1900bp油菜oleosin基因5’UTR。

2.按照双子叶植物偏爱密码子人工合成了鲑鱼降钙素基因，是下列序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：2由132个碱基组成，编码40个氨基酸。为便于获得天然的鲑鱼降钙素，在鲑鱼降钙素基因5’端引入了肠激酶的酶切位点。

3.酿酒酵母RAD54蛋白的基因序列，是下列序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：4的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：5的DNA序列

序列表中的SEQ ID NO：2由2694个碱基组成，编码898个氨基酸。

4.大肠杆菌CodA基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：6的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：7的DNA序列

序列表中的SEQ ID NO：6由1284个碱基组成，编码427个氨基酸。

5.含有权利要求2、3、4、和5所述基因构建的表达载体，转基因细胞系和宿主菌。

6.一种综合利用植物油体特异表达技术和基因打靶技术实现油菜染色体替换，在转基因油菜籽油体中特异、超高量表达鲑鱼降钙素蛋白的方法。

7.根据权利要求6所述的方法，该方法通过在转基因油菜中过量表达ScRAD54蛋白，使编码芝麻oleosin+sCT融合蛋白的基因通过同源重组的方式，靶向整合到油菜基因组中，并在油菜油体中特异地、超高量地表达。

8.根据权利要求7所述的方法，其中的目的蛋白包括但不限于芝麻oleosin+sCT融合蛋白、sCT、突变型sCT、高胰血糖素类似肽GLP-1等医用或工业用蛋白。

9.根据权利要求5、6所述的方法所获得的表达目的蛋白的转基因植物包括根、茎、叶、花、果、种子等所有植物体部分和细胞、组织等。 

10.根据权力要求9获得的油菜作为亲本杂交或转育所产生的植物。 

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