CN102369427A - 探测分子的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及探测附着于表面的分子的方法，该方法包括探测附着于所述分子的珠子(珠粒)。该方法可用于单个分子的探测，并且可以使表面形状适应于接收珠子。本发明还包括用于探测具有珠子附着的分子的存在的装置，该装置包括一个设置有用于探测珠子的设备的表面，其中所述表面的形状被构造为接收和保留珠子。本发明提供包括该装置的成套工具，并预期该装置用于探测珠子或附着到珠子上的分子的用途。

Description

探测分子的方法和装置
技术领域
本发明涉及分子探测领域，特别地，涉及用于分子探测的微阵列技术领域。
背景技术
现有技术中已知很多不同的方法可用于分子探测。尤其是微阵列技术已经发展为探测很多不同类型分子，例如DNA、RNA、蛋白、抗体和化合物的有力工具。微阵列已被开发用于研究基因表达，用于识别基因突变、非整倍性和多态性，以及用于识别蛋白质：蛋白质相互作用，用于命名一些用途。已证明该技术是重要的技术，特别是对研究和诊断而言。
微阵列芯片通常由附着于固体表面例如玻璃，硅片或尼龙膜的微观分子点的集合组成。通过测定对在特定微阵列上的分子的目标分子的结合图案，可以对样品中的目标分子进行评价。通常对目标分子进行荧光标记，从而可以读取微阵列，并通过测定微阵列上每个分子点处荧光的存在(和水平)来探测目标分子，所述荧光的存在(和水平)对应于样品中目标分子的存在(和量)。然而，荧光标记的使用要求使用荧光扫描仪，虽然这是精确和灵敏的方法，但是这种方法成本昂贵。对昂贵扫描仪的需求阻止了微阵列作为常规工具在研究和诊断学中的应用。
此外，通常不可能使用荧光标记和微阵列技术探测单个分子。特别在核酸探测的情形中，在将样品应用至微阵列之前，实施放大步骤通常是必须的。荧光扫描仪/探测通常不够灵敏探测到单个荧光标记的存在以及由此的单个分子的存在。Mallard等人(Biosensors and Bioelectronics，20，1813-1820，2005)开发了一种CMOS光探测阵列作为DNA芯片的固体载体，其中探测通过化学发光的方式进行。虽然该系统不需要使用昂贵的探测或荧光扫描仪，但是其还是不足以灵敏到探测单个分子。Tokuda等人(Proceedings of the 2005 IEEE，Engineering in Medicine and Biology 27thAnnual Conference，Shanghai，China，September 1-42005，7269-7272)还开发了一种用于生物成像应用的CMOS图像传感器，其中使用了荧光成像。
Chan等人(US2006/0084069)开发了一种集成电路光学探测作为用于阵列的固体载体，其中通过接收和感应来自纳米颗粒标记的光学信号来探测目标的存在。然而，虽然该方法不需要使用昂贵的扫描仪或探测，但是非常小的纳米颗粒的光学探测不足以灵敏到探测单个分子。
因此，对这样的阵列分子探测系统存在需求：其能够探测单个分子并且不依赖使用昂贵的扫描仪或探测。
发明内容
本发明致力于解决该问题并且能够在不需要昂贵的外部设备的同时通过使用阵列探测单个分子，所述阵列设置有一个或多个光敏元件以及用于分子的珠子(珠粒)标记，当珠子存在或与附着于该阵列的单个分子结合时，所述珠子标记具有足够的尺寸的分子阻止所述一个或多个光敏元件接收光。因此，本发明中所使用的标记的尺寸可以对应于阵列上每个光敏元件的尺寸，以便可以探测单个分子。
换一种角度来看，如以下详细讨论的那样，珠子标签具有与每个光敏元件的尺寸相关的最小尺寸，并且典型地例如，该珠子的直径应当至少为1μm。
根据第一方面，本发明由此提供探测附着于表面的分子的方法，该方法包括探测附着于所述分子的珠子，其中所述表面设置有一个或多个光敏元件，并且其中排列每个光敏元件以探测其邻近的珠子。
如上讨论的那样，为了探测单个分子，使用特定尺寸的珠子标记，并且通常选择尺寸与在表面上的每个光敏元件的尺寸相对应的珠子。在该方法中，通过光敏元件可以探测到在特定位置处附着于单个分子的单个珠子。
因此，本发明还提供探测附着于表面的分子的方法，该方法包括探测附着于所述分子的珠子，其中所述表面设置有一个或多个光敏元件，其中排列每个光敏元件以探测其邻近的珠子，并且其中所述珠子(i)其尺寸对应于所述一个或多个光敏元件的尺寸，或(ii)直径至少为1μm，从而可以探测附着于该表面的单个分子。
因此，通过探测附着于分子的珠子是否存在可以探测附着于表面的该分子是否存在。在表面上或表面内部提供的所述一个或多个光敏元件能够输出信号，该信号依赖于珠子是否存在，并且来自每个光敏元件的所提供的信号将因此指示是否存在珠子以及由此是否存在与该珠子结合的分子。因此，通过所述一个或多个光敏元件并且无需借助任何外部扫描仪、照相机或其它设备就可以直接探测到珠子自身。虽然可以将该珠子安排为发射能够被光敏元件探测到的光线(例如其可以是荧光)，但这不是必须的。然而，优选的是，当珠子挡住光从而使光不能到达讨论中的光敏元件时，该珠子被探测到。因此，它们有效地在该元件上投射了一个阴影。该光源可以是简单的环境光线，但是为了提供更可靠，提供专用的光源是更优选的。可以提供探测对其敏感的在任意频率的光，但优选地，其在350-750nm的可见光范围内。通过照亮该表面，由珠子的存在而产生的任何阴影的探测或来自光敏元件的光的阻碍可以被更容易地探测到。应当理解，当表面被照亮时，珠子的是否存在将在信号上产生更巨大的差别，因此通过使用外部光源照明能得到更灵敏的方法。
为了防止外部光源影响结果，优选地，通过合适的外罩遮住外部光源来保护光敏元件。
我们将看到，光敏元件因此能够测量由表面接收到的光的量，这能够测定珠子是否存在或珠子存在的数量。通过单个光敏元件或通过一组光敏元件，依靠珠子的尺寸、光敏元件以及珠子离表面的距离可以探测到珠子。如前讨论的那样，使用本发明的方法可以探测单个珠子并由此探测单个分子，因为通常珠子的尺寸对应于每个光敏元件的尺寸。因此，取决于珠子和元件尺寸，可能单个光敏元件能够探测一个珠子或2、3、4或更多个光敏元件能够探测一个珠子。通过每个光敏元件探测光的量并由此从光敏元件输出信号，当没有珠子存在时，其可被用作其它测量可以与之比较的参照点。光敏元件接收到的光的减少(即由珠子的阴影产生)将导致信号的输出，该信号不同于珠子不存在时所输出的信号。如下所讨论的那样，当珠子存在时每个光敏元件接收到的光的量将取决于各种不同的因素，包括珠子尺寸，每个光敏元件的尺寸，分子附着于表面的长度并且还取决于珠子存在的数量。
换个角度来看，本发明提供了探测附着于表面的分子的方法，所述表面设置有一个或多个光敏元件，所述方法包括通过探测其上附着的珠子来探测所述分子，其中通过所述表面提供的一个光敏元件或一组光敏元件来探测所述珠子。
因此，为了探测单个分子，珠子的尺寸应当对应于光敏元件的尺寸，以至于单个珠子能够挡住到达光敏元件的光。
如下面进一步讨论的那样，本发明的方法在探测步骤之前可以进一步包括将分子附着至所述表面的步骤和/或将珠子附着至分子的步骤。此外，在探测方法开始之前，可以除去未结合的珠子。探测珠子之后，可以实施将珠子从分子上和从所述表面上分离的步骤。
因此，本发明的发明人提出了一种探测方法，藉此方法，使用图像传感器而不需要昂贵的探测扫描仪就可以探测单个分子。在这点上，发明人已经发现在图像芯片上可以探测到珠子。使用图像芯片的分子探测因此将可能使用珠子标记。比起荧光标记或化学发光或甚至纳米颗粒，珠子较大并且较易于探测，因此使用具有珠子标记的分子的探测方法将允许少量或单个分子的探测。珠子标记可以是允许探测单个分子的特定最小尺寸，并且如前所讨论的那样，珠子的尺寸可以对应于光敏元件的尺寸。附加地且有利地，与荧光标记或诱导化学发光所需的酶相比，在该方法中，未结合的珠子标记可以被容易地从样品的任意点上除去，例如，通过使用用于磁性珠子的磁体。在此方法中，过量标记的移除可以减少在该方法中所要求的清洗步骤，并且在后续反应中过量的珠子标记可以被重复利用。重要的是，由于图像芯片能够探测珠子，本发明中提出的方法和设备将进一步回避对昂贵扫描仪和探测的要求。
发明人因此已确定了一种用于分子，特别是单个分子的非常灵敏且廉价的探测方法，在现有技术中这种方法还未有人提出或提及。
本文中所使用的术语“珠子”是指一种微粒，所述微粒典型地，但不必然是，球状的固体载体。所述珠子不是纳米颗粒，例如纳米金属颗粒或金簇。在本领域中，将这样的纳米颗粒理解为具有非常小的尺寸，并且典型地直径小于2nm。这样的标记不包括在本文中所使用的术语“珠子”中。所使用的珠子通常具有与表面上提供的光敏元件的尺寸相应的尺寸，并且因此通常一起选择在本发明的方法中所使用的所述表面和珠子，即，可以选择特定尺寸的组合。如上所讨论的那样，为了使该方法能够探测单个分子，所使用的珠子标记通常具有与表面上的光敏元件的尺寸相对应的最小尺寸。所述珠子可以由允许下文中更详细描述的适合载体形成的任意材料制备。所述珠子和所述表面是不同的实体。
所述“表面”优选地设置有被排列为形成阵列的大量光敏元件。所述光敏元件可以在该表面上或形成该表面的外层，或可以被包含在该表面内，例如，可以在一种或多种其它材料层下面存在。光传感器或光敏元件的阵列在本领域中是公知的，并且包括带电耦合的设备，例如在摄像机或CMOS有源像素传感器中所使用的类型。在本发明中，如下文中讨论的那样，可以对例如CCD或CMOS图像芯片进行修改。所述表面可以是这样的设备的基板。因此，所述表面提供一个或多个光敏元件，并且优选地，对于分子探测而言，不使用或不需要由该表面提供的外部摄像机(例如CCD)或传感器。
可以将待探测的分子附着于或置于存在于该表面中或该表面上的一个或多个光敏元件上以使输出从附着的珠子上产生。可以将一个或多个分子与一个或多个光敏元件关联，例如，可以将一种或若干种分子与每个光敏元件关联或光敏元件组关联，但是典型地，每个光敏元件或光敏元件组将仅有一种分子类型与其关联(但可以存在该分子类型的一个或多个拷贝)。优选地，可以将单个分子与一个光敏元件或一组元件关联，并且使用本发明的方法可以探测该单个分子。
当珠子存在时，该珠子可以在该表面上以及在一个光敏元件上或一组光敏元件上投影，并由此减少光敏元件接收到的光的量。例如，珠子可以使光敏元件接收到的光的量减少约10-100％，例如，特别地减少20、30、40、50、60、70、80或90％。一方面，珠子可能阻碍由光敏元件接收到的所有光。应当理解，所提供的输出将依赖于所使用的珠子的尺寸，存在于表面上的单个光敏元件的尺寸，以及珠子距离表面的所限制的距离。因此，与光敏元件的尺寸相同或较大的珠子可以阻碍大部分的光落在光敏元件上。当任意数量的珠子存在或附着于每个光敏元件时，通过测量信号输出可以校准每个光敏元件和珠子尺寸的组合。
取决于表面中或表面上的光敏元件的尺寸，选择特定的珠子尺寸是可能的。特别地，对于单个分子的探测，可以选择与表面中或表面上的一个或多个光敏元件的尺寸相对应的珠子。与一个或多个光敏元件的尺寸“相对应”的珠子是指，当附着于该表面时，该珠子可以将所述一个或多个光敏元件接收到的光的量减少至少50、60、70、80或90％。这样的珠子的直径典型地是一个光敏元件或一组光敏元件的宽度和/或幅度(或直径)的至少30、40、50、60、70、80、90或95％。因此，如果将通过单个光敏元件探测一个珠子，则珠子的尺寸(即直径)可以对应于该光敏元件的尺寸，例如，可以是该光敏元件的宽度或幅度(或直径)的至少30、40、50、60、70、80或90％。可供选择地，如果将通过一组光敏元件(例如多余切割光敏元件)探测该珠子，则该珠子的尺寸(直径)可以对应于该组光敏元件的尺寸，例如，可以是该组光敏元件的宽度和/或幅度(或直径)的至少30、40、50、60、70、80或90％。典型地，该珠子可以具有1μm的最小尺寸(直径)，即，直径至少为1μm。在本发明中这样的尺寸通常允许单个分子的探测。例如，1μm直径的珠子可以与1.75 x 1.75μm的光敏元件组合使用，或者2.8μm直径的珠子可以与3.2 x 3.2μm的光敏元件组合使用。
此外，光敏元件可以探测结合至特定位置或特定分子的珠子的数量，这通过探测在该位置处所接收到的光的量来实现。在此方面，使用小于单个光敏元件或一组光敏元件的珠子将是必要的。因此，珠子应当小于附着于一个光敏元件或一组光敏元件的一种特定类型的分子所覆盖的区域。在这种情况中，探测珠子的数量可以指示在该位置处特定分子类型的浓度。优选地，可以限制孵育时间。
在上述方法中可以使用彩色珠子，当用光照明时，通过一个或多个光敏元件可以探测到所述彩色珠子。特别地，所述彩色珠子可以是完全透明的或部分透明的，例如，该珠子可以含有非透明的内核，所述内核可以是磁性的(例如顺磁性的)。通过用不同颜色的光照射表面，通过每个光敏元件可以探测在表面上的不同颜色的珠子。因此，通过用不同颜色的光照射，通过表面可以探测两种、三种、四种或多种不同颜色的珠子。对于所应用的每种颜色珠子/光颜色的组合，所述表面能够提供一种输出。所探测到的光强度可以再次指示与每个光敏元件结合的珠子的数量，并由此可以指示在该位置处附着的分子的数量或浓度。
所述光敏元件能够将接收到的光能转换为电压，然后所述电压被转换为数字数据，例如通过集成电路。这样，通过探测附着于分子的珠子，包括该元件的表面自身就能够探测到该分子的存在。不需要使用外部的昂贵设备来探测附着于该分子的信号或标记的存在。该表面自身就能够探测到该分子。
如上面注意到的那样，在本发明中适用已知的CMOS或CCD探测。例如，在本发明的方法中可以使用在移动电话中所使用的那种图像芯片。在优选的方面，例如CMOS或CCD图像传感器的表面形成本发明的所述表面。
CMOS光探测(或有源像素传感器)实质上已被开发用于消费者摄像机应用，例如在网络摄像头或移动电话中。该探测的两种变异体是可利用的，即，裸芯片变异体或具有保护玻璃的用芯片包装的并与垫片结合的变异体，所述垫片与用于焊接的外部垫片连接。裸芯片变异体可以直接用于本发明中，而通过除去玻璃盖可以改进包装的芯片变异体CMOS光探测。对两种变异体而言，除去微摄镜和滤色器层可能是优选的，所述滤色器通常覆盖像素以便将分子安排在光元素或像素的表面。可以制造没有附加的微摄镜/滤光层存在的CMOS或其它光探测以在本发明中直接使用，在用于移动电话时所述微摄镜/滤光层是所需的。因此，在本发明中可以使用特别改造过的CMOS图像芯片。
特别地，所述表面可以包括至少三兆像素(2048 x 1536光敏元件)或至少4、5、6、7、8、9、10、11或12兆像素。使用标准沉积工艺，沉积并探测与至少1、5、10、15、20、25、30、35或40％的光敏元件相关的分子是可能的。在图像芯片上存在的光敏元件或像素通常具有相同尺寸，虽然尺寸上的差别也可能存在。所述像素的范围可以为例如0.5 x0.5μm至10 x 10μm，例如1 x 1μm、2 x 2μm、3 x 3μm、4 x 4μm、5 x 5μm或6 x 6μm，并且特别地，所述像素可以是1.75 x 1.75μm或3.2 x 3.2μm。
可以额外地对所述表面进行改性，例如，对其图像芯片改性以帮助分子对所述表面的结合。特别地，可以用金涂覆所述图像芯片或可以对其改性以使硅烷基(silan)或抗地高辛配基(antidigoxigenin)基团附着。可能会被使用的金层的厚度并不重要，只要其不阻挡太多的光到达光敏元件。例如，金层的厚度范围可以是5-50nm。以这样的方式改性表面的方法在本领域中是公知的。可以通过真空沉积或通过在高浓度金溶液中沉积来获得金涂层。通过例如在室温下将所述表面浸渍在5％的氨基丙基三乙氧基硅烷(CAS：019-30-2)的干燥丙酮溶液中1小时，可以获得氨基硅烷改性的表面。氨基硅烷表面可以在加入所需的分子后直接使用，或可以通过加入双官能团交联剂(例如间马来酸联苯酰-N-羟基磺基-琥珀酰亚胺酯)进行进一步改性以便能够将分子结合至所述表面。抗地高辛配基改性通过以下方法实现：首先用聚-1-赖氨酸溶液(10％聚-1-赖氨酸v/v和10％PBS)在所述表面上涂底料，然后加入在Invitrogen CNB0011中的1∶100的抗地高辛配基涂层缓冲液A。
此外，本发明的表面可设置流通池，该流通池允许流体流向和流出该表面。由此，可使用所述流通池将样品或分子应用至所述表面和/或应用珠子。因此，优选地，不通过移液将样品或分子应用至所述表面。进一步，所述表面可安排有读取器，所述读取器能够探测并读取来自所述表面中或表面上的每个光敏元件的信号。通过计算机可以接收来自每个元件的输出。
可以另外或可替换地修改或改造在本发明的方法中所使用的所述表面的形状，以辅助珠子结合至附着在每个位置或像素上的分子，并使该方法灵敏和精确。因此，可以修改或改造所述表面，例如成型，以允许一个或多个珠子在每个位置上的结合。
可选择地，所述表面可以是平面以最优化分子对其的结合。
因此，可以使所述表面成型以允许一个或多个珠子与每个光敏元件关联或结合。通过每个光敏元件或光敏元件组可以关联或定位个体的凹部，所述凹部允许珠子附着并关联至表面上的单个或个体光敏元件或光敏元件组。所述凹部可使珠子被放置在仅仅覆盖单个元件的位置并防止所述珠子移动而覆盖多于一个光敏元件或光敏元件组。
可选择地，可用障碍物围住每个光敏元件或光敏元件组以使珠子能够附着并仅与某光敏元件或光敏元件组关联。因此，可将障碍物或阻碍物安排在所述表面上一个或多个光敏元件的周围。
还可以在表面上使用凹部和障碍物的组合。典型地，其上将有分子附着的光敏元件将被改造为具有与其相关的凹部或障碍物。可以改造表面上的一个或多个元件，虽然典型地，可以改造所有这些元件，例如，改造为具有与其相关的凹部和/或障碍物。
用这种方式例如凹部和/或障碍物的使用改造的表面使该方法更灵敏和精确并可有助于排除假阳性结果。
在特定的实施方式中，改造所述表面以允许单个珠子在每个位置的结合。每个光敏元件或光敏元件组以及围绕其的障碍物或凹部可因此具有适合的尺寸以结合个体珠子。可因此改造光敏元件和/或障碍物/凹部以适应在所述表面中使用的任何特定的珠子尺寸。可使用本领域中公知的技术改造所述表面，例如使用光致抗蚀剂。
在本发明的方法中，通过珠子的存在和结合来探测分子。所述珠子通常是球状的，虽然如上讨论的那样，所述珠子的尺寸并不重要，但是它们可以例如是至少0.5、1、1.5、2、2.5、3或3.5μm的直径顺序以允许单个分子的探测并且具有不大于10、8或6μm的最大直径。特别地，在本发明中可使用1或2.8或4.5或10μm的珠子。直径是指沿着珠子的最长轴或沿着球状珠子的任意轴的尺寸。
优选地，使用单分散的珠子，因为它们提供非常一致的反应再现性，单分散的珠子是指那些尺寸基本上一致的珠子(例如具有直径标准偏差小于5％的尺寸)。
适于在本发明的方法中使用的无磁性的聚合物珠子可从Invitrogen以及从Qiagen，Serotec，Merck，Promega获得，等等。可用本领域中公知的很多不同材料制造无磁性的珠子，例如，用塑料，例如，用聚苯乙烯。
然而，为了帮助操作和分离，磁性珠子(磁珠)是优选的。本文中所使用的术语“磁性”的意思是，当珠子被置于磁场中时，所述珠子能够具有给其赋予的磁矩，并且因此，其在该场的作用下是可排除的。换句话说，通过磁性聚集，磁性珠子可容易地被移除，在珠子与分子或与表面的孵化后这提供了一种快速、简单并且有效的分离任何未附着的珠子的方法。如前所述，这提供了超越在现有技术中所使用的荧光团或化学发光的此类方法的明显优点。
因此，通过应用磁场例如使用永久磁铁可以将未结合至分子而附着在表面上的磁性颗粒移除到合适的表面上。
磁性珠子包括对磁场具有响应的磁响应材料，例如，顺磁性材料、铁磁性材料和变磁性材料。因此，可以使用铁、镍和钴以及金属氧化物例如Fe3O4、BaFe12O19、CoO、NiO、Mn2O3、Cr2O3和CoMnP。磁响应材料可以仅是珠子的一种成分，珠子的其余部分可以由聚合物材料组成，磁响应材料被附着在所述聚合物材料上。珠子中磁响应材料的量不重要，并且可以在宽泛的范围内变化，例如，从整个颗粒质量的约1％至约75％。该范围可以从2％至50％、从3％至25％或从5％至15％。可将磁响应材料分散为遍及聚合物，作为涂层施加在聚合物表面或以任何其它方式结合或固定以保证磁响应材料与聚合物结合。因此，磁响应材料可以形成珠子的核心或中心。
形成珠子其余部分的聚合物材料可以是能够被形成为固体珠子的任何材料。合适的聚合物的实例为聚酯、聚醚、聚烯烃、聚烯烃氧化物、聚酰胺、聚氨酯、多糖、纤维素和聚异戊二烯。为了向珠子赋予结构完整性和刚性，在很多聚合物中交联是有用的。
还可以使用超顺磁性珠子，例如在EP-A-106873中Sintef所描述的那些，超顺磁性材料能够避免珠子的磁性聚集和成团(即使珠子具有高的导磁性)。此外，DynaBeads作为Invitrogen销售的磁性颗粒特别适于在本发明中使用。
使用磁性珠子的特别优点是，可以通过磁铁将珠子“吸引下来”到芯片的表面上，以有助于珠子的探测。对于使用此方法探测单个分子，这是个特别的优点。
根据本领域中公知的和文献中描述的技术，在将分子附着至表面之前或之后，可以直接或间接地用任何方便的方法将珠子附着至分子。
因此，可以将分子直接附着至珠子。这样的附着可以通过本领域中公知的方法(例如偶合化学)快速地实现，并且方便地，可以将分子直接结合至珠子(例如通过涂覆)。
可选择地，可以将珠子间接地附着至分子。因此可以通过可直接结合至珠子的一个或多个其它分子来将分子结合至珠子。可以将分子结合至一个或多个连接部分或间隔物，所述连接部分或间隔物被结合至珠子并且对该分子或对结合入该分子的标记具有亲和力。特别地，可以通过生物素/抗生蛋白链菌素结合或通过生物素/抗生物素蛋白结合将分子结合至珠子。因此，可使用抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白涂覆的珠子可用于结合连接到生物素基团的分子。
一方面，在将分子附着至表面之前可将分子附着至珠子。在这方面，分子的单个或多个复制品可被结合在每个珠子上。
可替换地，在被附着至珠子之前可首先使分子与表面接触。在这种情况中，珠子可方便地携带或设置有能够与分子结合的结合部分。这样的结合部分在本领域中是公知的，例如可以使用生物素/抗生蛋白链菌素，其中分子被偶合至生物素基团并且珠子涂覆有抗生蛋白链菌素或珠子可以携带与分子结合的抗体。
优选地，通过共价键将珠子附着至表面。特别地，可将珠子连接至分子或通过聚合酶反应结合入分子。
在本发明进一步的方面，彩色透明的珠子可在该方法中使用，并且可被表面探测到。可使用一种或多种不同颜色的不同珠子作为标记。因此，在本发明的方法中可使用两种、三种或四种不同的珠子颜色。特别地，一种或多种不同的珠子颜色可被同时使用并被表面探测到。在此实施方式中，探测不同的珠子颜色以及由此探测附着至表面的不同珠子标记是可能的。可使用不同的珠子颜色以探测表面上的不同分子，例如，它们的位置没有被预先确定。可通过标记生产彩色珠子，例如用染料(例如荧光染料)涂覆这样的珠子。此外，可以使用不同色彩强度的珠子。
此外，可使用不同尺寸的珠子作为标记，可同时使用2、3、4、5、6、7、8、9或10不同尺寸的珠子作为标记并通过表面探测。不同尺寸的珠子将因此还能够被用于探测表面上其位置未知的分子。
进一步通过使用不同的珠子尺寸、颜色和/或强度的组合，复合此方法是可能的。因此，在该方法中可以使用珠子的不同子群，所述子群的范围可以是颜色、颜色强度和/或尺寸。当要测量多个珠子参数时，表面包括除光敏元件之外的磁性探测元件例如霍尔(Hall)元件是更优选的。因此，在这种情况中，可以使用磁性珠子，通过磁性探测元件可以探测其尺寸并且通过光敏元件可以探测其颜色。可将所述磁性探测元件堆放在顶部或下方或可以邻近每个光敏元件。对每个尺寸的珠子使用不同的珠子颜色可以增加在该方法中能被识别的分子数量，而不需要预先确定位置。
珠子还可以是从其结合的分子上可移除的。切割位点可以位于表面和珠子之间的任意位置，即在任何分子结合至表面和/或珠子的任意位置。特别地，在珠子和分子之间可以结合限制酶位点。可以使用任何限制酶位点，并可以使用任意合适的限制酶实现该位点的切割。特别地，可应用II型限制性内切酶。可将限制或切割位点直接置于邻近分子的位置(即，在分子最接近于珠子的末端)以使珠子和任何连接子或其它可能存在的结合部分的切割成为可能，或者可将限制或切割位点直接置于邻近珠子的位置以使珠子的切割成为可能。在此方面，除去珠子以随后使用或剥去表面或成像芯片以重复利用是可能的。在进一步的方面，该分子可以在两个末端包括限制酶位点，以允许完成表面的剥落和珠子的重复利用。如果珠子通过结合被结合入分子，则可以使用切口(nicking)限制酶来释放珠子。
本文中使用的术语“分子”通常是指使用常规微阵列技术或本领域中已知的其它标准探测技术能够探测的任何分子。特别地，待探测的分子可以是核酸分子例如DNA、RNA、或其一部分、蛋白质、多肽或肽、抗体或化合物。
可以将待探测的分子定义为“靶分子”。
可以将靶分子直接或间接地附着至表面。
可以将间接附着至表面的靶分子通过附着至表面的捕获分子附着。可选择地，间接附着至表面的靶分子可被包含在附着至表面的较大的分子或实体中，即，其可以是另一分子的部分并且可通过探测分子被探测到。因此，靶分子可被包含在另一分子或实体中。
直接附着至表面的靶分子可以对其化学偶合。
“捕获物分子(capture molecule)”是靶分子的结合伙伴，其结合至并对靶分子具有亲和力(例如对其特定结合或具有对目标的高度亲和力)。捕获物和靶分子因此是结合伙伴，优选地，在特定的结合伙伴中捕获物分子将仅结合靶分子，以允许靶分子的探测和识别。一些不同的捕获物分子可以因此具有对一种靶分子类型的结合亲和力，并且对每个靶分子类型而言，表面可以具有一个或多个捕获物分子类型存在。
探测物分子(detector molecule)是可以结合靶分子(例如其可存在于较大的分子中)和此外可对靶分子具有亲和力的分子。因此，探测物可特定地结合靶分子或能够结合在分子中。
如果靶分子是核酸分子例如DNA或RNA，或其一部分，相应的捕获物分子或探测物分子可以是与靶分子的核酸序列互补的核酸序列(例如DNA、RNA或其一部分)。在这种情况中，捕获物分子或探测物分子可以是靶分子序列的互补片段，例如可以长度在1-200核苷酸之间，例如长度为至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200个核苷酸。换个角度来看，捕获物分子或探测物分子可以是单链的寡核苷酸并且可以是合成的。
如果靶分子是蛋白、多肽或肽，则捕获物分子或探测物分子可以是特定结合靶分子或其片段的抗体，或者可以是靶蛋白、多肽或肽的配体，例如细胞(细菌的、哺乳动物的或其它的细胞类型)或病毒，通过探测细胞上或病毒表面或细胞中(如果应用细胞溶胞产物)的靶蛋白可以探测到所述细胞或病毒。
此外，如果靶分子是抗体，则捕获物分子或探测物分子可以是该抗体将结合的蛋白。
在本发明的方法中可被用作结合伙伴或捕获物/探测物分子的抗体可以是任何种类、类型或亚型。而且所述抗体可以是天然的，衍生的或合成的。代表性的“抗体”因此包括：
a)任一不同类型的免疫球蛋白的亚类，例如衍生自任何动物(例如常规使用的任何动物，例如绵羊、兔、山羊或小鼠)的IgG、IgA、IgM、IgD或IgE，
b)单克隆或多克隆抗体，
c)完整的抗体或抗体片段，单克隆或多克隆，所述片段是含有该抗体的结合区的那些，例如，缺乏Fc蛋白(例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)的片段，在完整抗体中通过还原裂解连接重链组分的双硫键获得的被称为“半分子”的片段，
d)由重组DNA或其它合成技术生产或改性的抗体，包括单克隆单体、抗体的片段、“人源化抗体”、嵌合抗体或合成制备的或改变的类抗体结构。还包括抗体的功能性衍生物或“等价物”，例如单链抗体、CDR接枝的抗体、最小识别单元抗体等。
通过捕获物分子可将靶分子间接附着至表面。在这方面，可将包括该靶分子的样品应用至表面，所述表面上可安排有一个或多个捕获物分子。在这方面，捕获物分子可以是核酸分子例如DNA、RNA或蛋白、多肽或肽、抗体或其片段或化合物，并且所述核酸分子允许靶分子的结合或附着。在这方面，本发明由此提供探测附着至表面的靶分子的方法，所述表面具有一个或多个安排在其上的捕获物分子，该方法包括通过探测附着至所述靶分子的珠子来探测所述靶分子，其中所述表面设置有一个或多个光敏元件并且其中每个光敏元件被排列以探测邻近其的珠子。
特别地，该方法可以包括将含有靶分子的样品应用至表面的另外步骤。如果靶分子在被应用至表面之前没有用珠子预先标记，则可以在将含有该靶分子的样品应用至表面之后实施将珠子加入到表面中的另外附加步骤。
如前所述，可以另外实施将未结合的珠子的移除步骤。
在研究和诊断中，本发明的此特定方面具有若干不同的应用。例如，该方法可被用于基因表达研究。在这方面，将用附着的，互补的核酸捕获物分子和待分析的代表性靶分子的阵列来制备表面。通常，可使用DNA寡核苷酸捕获物分子，并且所述靶样品应当是cDNA或cRNA样品，应在高严格性的条件下用附着的捕获物分子将所述样品添加到表面中。
在这方面，每个DNA寡核苷酸应当通常在表面上具有预先确定的位置，并且应当根据在该位置处的一个或多个珠子的探测来决定靶的存在。用这种方法可以探测任何给定基因的表达水平。特别地，探测样品中单个分子的存在是可能的。在这种情况中，对单个分子的探测而言，降低环境温度和/或增加杂交碱基对的数量可能是更优选的。可替换地，对于单个DNA分子的探测，在以下实施方式中，靶对捕获物分子(或探测物分子)的结合可能是有益的，通过用具有突出部分的双链DNA标记靶(或探测)分子或通过在单链捕获物分子(或单链探测物分子)与单链靶分子的连接之间标记切口。
如上所述的方法还可被应用在比较基因组杂交分析中以探测，例如样品中的染色体缺失或非整倍性。
而且，该方法可用于探测微生物(例如细菌或病毒)的存在或探测特定细胞类型(例如来自特定组织的细胞)的存在。
还可将靶分子作为较大分子或实体的部分间接附着至表面，所述较大分子或实体被直接附着至表面。以这种方式，通过特定结合至靶分子的探测物分子的添加可以探测分子的部分。
还有可能将待探测的分子(靶分子)直接附着至表面(即，其自身被直接安排在表面上)。因此，在该实施方式中，不通过如前所述的捕获物分子将靶分子附着至表面，而是通过化学偶合，例如通过巯基或允许直接附着至表面的任何其它基团，例如通过衔接分子(adaptor molecule)。表面由此可具有一个或多个安排在其上的靶分子。在这种情况中，通过探测靶分子对探测物分子的附着来探测靶分子是可能的，所述探测分子可被加入到表面。可将这看作是一种类型的“反向阵列”。因此，探测物分子可以是珠子标记的(例如，探测物分子可以覆盖珠子表面)并通过所结合的探测物分子通过被间接结合至靶分子的珠子的存在探测靶分子。
本发明的反向阵列方面是非常有益的，并且允许使用一般的阵列表面探测单个分子，而非这样的表面：该表面被制备为具有被设计为特异结合特定靶分子的捕获物分子(或探针)。
因此，在添加含有靶分子的样品之前，通常需要制备阵列的事实是微阵列技术的普遍缺点。微阵列的制备是费力的并且要求专门的和昂贵的设备，在制备步骤时在该设备中实施用于特定靶的捕获分子的选择。此外，这样的阵列可能提供不可靠的定量结果。本发明的反向阵列的使用处理了本领域中的很多问题，特别是有关探测单个分子的方面。
因此，反向阵列方面是本发明的一个优选实施方式，除了能够探测单个靶分子之外还有很多原因。不存在制备具有预选择捕获物分子的阵列，并使用普通制备的阵列，其中探测物分子在使用时提供。在这方面，首先将存在于样品中的靶分子分散在阵列表面，并允许其任意地结合至表面。然后可以洗涤阵列表面并加入探测物分子。在附加至阵列后探测物分子可以用珠子标记，或者可在探测分子应用后随后加入珠子标记并产生结合。本文中已经描述了将珠子附着至分子的方法，这些方法和注解适用于反向阵列方面。
当要在反向阵列上探测多于一个靶分子时，可以对每个待探测的靶使用不同的珠子标记。因此，将用特定的珠子标记特定对应于特定靶的特定探测物分子。将用不同的珠子(例如不同的珠子颜色)标记特定对应于每个靶分子的每个探测物分子，从而允许在反向阵列上探测多于一个的靶分子。可选择地，对应于每个靶分子的特定探测物分子可每次一个地加入到阵列中，并在靶分子被探测到(或未被探测到)后移除。在这方面，不同的探测分子因此被分别地和按顺续地加入。
反向阵列能够探测单个分子。如前所述，通过使用与用于探测的元件尺寸对应的珠子标记可以探测单个分子。因此，在反向阵列的情况下，还要选择特定的珠子尺寸，该尺寸足够大从而探测单个分子的存在。
然而，此方面不限于通过设置有一个或多个光敏元件的表面(虽然这样的表面是优选使用的)探测，并且可以使用能够探测单个珠子以及由此的单个分子存在的任何探测方法。
对于反向阵列而言，珠子标记的探测可以是光学的、磁性的、电学的或电化学的，并且特别地，可以使用包括表面的装置来实施珠子的探测，所述表面设置有探测珠子的设备。该表面因此包括一个或多个元件，取决于珠子的存在或不存在，该元件提供输出。该表面可以提供一个或多个如前所述的光敏元件或另外提供其它代替或与光敏元件连用的元件，所述元件能够探测珠子，例如霍尔元件或巨磁阻(GMR)传感器。如前所讨论的那样，表面上的一个或多个元件能够输出珠子是否存在的信号，并且所述珠子由此直接被该表面探测到。在反向阵列方法中，为了探测单个靶分子，如前详细所述，所选择的珠子的尺寸(直径)优选地对应于由表面提供的一个或多个元件的尺寸(宽度和/或幅度或直径)。
因此，本发明提供探测附着于表面的靶分子的方法，该方法包括以下步骤：
i)将靶分子结合至表面
ii)向表面加入探测分子，其中所述探测分子加入到表面后被附着至珠子或被珠子标记
iii)探测附着至所述靶分子的所述珠子的存在，
其中所述表面设置有能够探测到珠子的一个或多个元件，其中每个元件被安排为探测其邻近的珠子，并且其中所述珠子的尺寸对应于所述一个或多个元件的尺寸或至少直径为1μm，从而允许探测附着至表面的单个靶分子。
另一方面允许表面的质量控制，所述表面上安排有一个或多个分子。在这种情况中，待探测的靶分子是被安排在表面上的那些。在随后的探测方法中使用所述表面之前，例如为了确保分子在表面上存在的目的，可以探测这些分子，通过珠子标记对分子间接地或直接地的结合，即，或通过另一靶或捕获物/探测物分子的结合或不通过另一靶或捕获物/探测物分子的结合。珠子的探测以及由此安排的分子因此允许对表面质量控制的方法。如前所述，通过切割(例如使用限制酶)可以从表面上移除珠子。
本发明因此提供探测附着至表面的靶分子的方法，所述表面具有一个或多个安排在其上的分子，该方法包括通过探测附着至捕获物/探测物或靶分子的珠子来探测所述靶分子，其中所述表面设置有一个或多个光敏元件，并且其中安排每个光敏元件以探测与其邻近的珠子。
如上述简要讨论的那样，直接附着于表面的分子可以通过硫醇、异羟洋地黄毒苷配基(digoxigen)或氨基或任何其它分子或允许结合的连接子结合至表面。通过本领域公知的技术可以将分子附着至表面，例如芯片和图像芯片。
可将一个或多个分子附着至表面，因此，取决于安排在表面上的分子的类型或数量，该方法可以用于探测一个或多个不同类型的靶分子。特别地，可以探测多余一种的分子类型，例如可以探测至少10、100、200、500、1000、5000、10000、50000、100000或更多的分子类型。如前所述，该方法能够探测每种分子类型的单个分子。典型地，可以探测的不同分子类型的最大数量为表面上存在的光敏元件数量的至少5、10、20、25、30、35、37％。当表面上安排有多于一种分子时，可将分子的阵列称为是存在的或安排的。如前所述，典型地，每个分子将与一个光敏元件关联或与一组光敏元件关联以允许通过光敏元件探测附着的珠子。
当表面上安排的分子多于一个时，可将每个分子置于单独预先确定的位置。在一方面，因此，表面上所有分子的位置是已知的。在这方面，使结合的珠子的位置与特定分子的位置相关联是可能的，并可能识别靶分子的存在或不存在。
然而，如果使用不同的珠子标记来探测特定分子，则可能没有必要预先确定分子的位置。在这方面，可以通过附着在其上的珠子类型来探测分子。如前所述，可以使用不同珠子颜色或颜色强度或尺寸来探测多余一个的不同分子并且不同尺寸和颜色或颜色强度的组合珠子可以提供探测很多不同分子的多重方法。
附着至表面的每个分子可以以单个分子或多个复制品在每个位置存在。如上所讨论，使用本发明的方法探测单个分子是可能的，并且因此，可以通过珠子的结合来探测附着至表面的单个分子。可选择地，可以在表面上的每个位置处安排多个分子。如果附着了多个分子，探测分子的数量是可能的，即，通过探测附着的珠子的数量。
所述表面还可以包括作为该方法的对照的一个或多个分子，例如，可以包括无规序列的核酸以作为非特定的结合的对照。
本发明还提供在上述方法中使用的装置。特别地，本发明提供用于探测其上附有珠子的分子的存在的装置，所述装置包括表面，所述表面设置有用于探测珠子的设备，其中将所述表面的形状构造为接收和保留珠子。
特别地，该装置可以包括表面，所述表面进一步具有附着在其上并且与用于探测所述珠子的一个或多个所述设备关联的一个或多个分子。
所述表面优选地包括一个或多个元件，取决于珠子是否存在，所述元件提供输出。在优选方面中，提供包括表面的装置，所述表面具有一个或多个光敏元件，其中将所述表面改造为在所述一个或多个光敏元件处接收珠子。
特别地，将所述表面的形状构造为能够使每个元件(特别地是每个光敏元件)接收和保留珠子并且可使凹部和/或障碍物关联或位于每个元件或元件组处以允许珠子附着并与表面上的个体元件或元件组关联。如上所述，一个或多个元件或元件组可以关联表面上的凹部和/或障碍物。
在优选的实施方式中，构造表面以允许单个珠子的附着和保留至用于探测单个分子的元件。取决于表面上待使用的珠子的尺寸和元件的尺寸，由此可设计凹部或障碍物。可对凹部/障碍物进行设计以便仅有一个单独的珠子将被附着至每个元件。
该装置可以进一步包括用于本发明的方法的修改。例如，可用金涂覆表面以使分子(例如NDA)能够结合至所述表面，或可以使所述表面经历硅烷化或异羟洋地黄毒苷配基化(digoxigenation)。
本发明的另一实施方式提供用于探测其上附有珠子的分子的存在的装置，所述装置包括表面，所述表面设置有一个或多个光敏元件，并且光源照射所述光敏元件，安排每个光敏元件，通过探测光强度的随后改变来探测其邻近的珠子。
此外，本发明提供用于探测其上附有珠子的分子的存在的装置，所述装置包括流通池和设置有一个或多个光敏元件的表面，其中安排每个光敏元件以探测与其邻近的珠子。特别地，流通池允许样品和/或珠子在表面的应用和移除。因此，流通池允许分子和/或珠子在溶液中在所述表面上沉积或流过所述表面。此实施方式在使用中可进一步安排可见光源。
可进一步如上述那样形成本发明的装置。例如，可将表面改造为使每个光敏元件能够接收珠子和/或可以用金涂覆表面。此外，本发明的装置可与读取器相联，所述读取器可以探测并读取来自个体光敏元件的信号输出。所述读取器可以由连接至计算机的电路板组成。
本发明还提供所述装置用于探测珠子的用途。
如上所述的装置还具有除了在前述特定分子探测方法中以外的很多用途。
使用所述装置用于珠子的识别是可能的，例如，用于核对珠子的质量例如核对所生产的珠子是否具有不同尺寸的光谱。在这方面，将珠子应用至装置，并可通过每个光敏元件测定所探测到的光量。在不同光敏元件处所接收到的光量的差别可能暗示着珠子群具有不一致的尺寸。最优选地，使用被改造为在每个光敏元件处接收单个珠子的装置实施此用途。
此外，使用上述装置可以识别附着至珠子的荧光团。这可以利用附着至珠子的分子的识别，所述珠子与荧光团偶合。在这方面，可以探测附着至珠子的不同荧光团，例如可探测1、2、3或4个不同的荧光团。在该用途中，可使用聚合物(例如核酸分子)将珠子束缚至表面。
此外，可使用所述装置测定分子的特性。例如可将DNA分子束缚至表面并可通过接收结合珠子的信号来测定DNA的长度。短的DNA分子应当得出珠子与表面紧密地关联，而长的DNA分子应当得出珠子是离表面更远的，其应当反过来影响通过表面产生的输出。此外，在沿着表面的方向可应用磁场梯度。在此方式中，可通过所覆盖的光敏元件的数量来测量长的DNA分子。
本发明还提供包括表面的装置的用途，所述表面设置有用于探测珠子的一个或多个光敏元件。
更特别地，本发明提供包括表面的装置的用途，所述表面设置有用于探测单个分子的一个或多个光敏元件，其中所述单个分子被附着至所述表面并用珠子标记，所述珠子的尺寸对应于所述一个或多个光敏元件的尺寸，并且通过探测所述珠子来探测所述单个分子。
还包含含有如上所定义的装置的成套工具。该成套工具进一步包括适用于所述装置的珠子，即，所述珠子能够结合至表面。可选择地，该成套工具可以包括i)设置有一个或多个光敏元件的表面，和ii)能被所述表面探测到的一个或多个珠子。所述珠子的尺寸还可优选地对应于一个或多个光敏元件的尺寸。所述成套工具可进一步包括酶，例如用于切割珠子和/或寡核苷酸的限制酶。
附图说明
现在将参照附图仅通过例举的方式来描述本发明的实施方式：
图1显示了实践中本发明的方法的示意图。
图2显示了使用本发明的构造表面的方法的示意图。
图3显示了其中将捕获分子附着至表面的方法的示意图。
图4显示了其中将靶分子附着至表面的方法的示意图。
图5显示了将被置于封装的图像芯片上的用于生产流通池的“3d-打印”单元。
图6显示了整个系统的示意图。
图7显示了置于胶合并结合至印刷电路板的“裸模”图像芯片上的流通池的横截面。
参照图，在图1中可见本发明的方法的示意图。因此，将待探测的分子2(DNA)附着至表面4，所述表面4是Micron MT9T001(Aptina)三兆像素CMOS数字图像传感器。该传感器通过如下所讨论的方法制备：焊接在印刷电路板上并用金刚石刀具从所述图像传感器上除去保护玻璃。
使用下文中进一步详细讨论的操作法将DNA分子2附着至图像传感器4。
通过3D打印由塑料生产流通池(参见图5)，所述流通池适合图像传感器的尺寸并允许流体通过入口和出口10流向和流出活性表面，可通过柔韧的塑料管来连接所述入口和出口10。通过将环氧树脂胶黏剂薄层施加到图像传感器边缘并将流通池放置在传感器4上，将流通池附着至图像传感器。将玻璃盖片放置在流通池顶部和填有环氧树脂胶黏剂的流通池的外部隔室以密封内部隔室并保护外部隔室和线路。
Micron MT9T001(Aptina)三兆像素CMOS数字图像传感器设置有大量的光敏元件3。使附着至所述Micron MT9T001(Aptina)三兆像素CMOS数字图像传感器4的DNA分子2与光敏元件关联。在图1中，仅有一个DNA分子2与每个光敏元件3关联，但是如前所述，可以存在多于一个的分子。
将珠子1(购自Dynal的M280抗生蛋白链菌素珠子)附着至分子(DNA)2(将在下文中进一步详细讨论所使用的操作法)，并可通过该分子结合至相应光敏元件3来探测珠子1。因此，通过流通池将珠子提供至图像传感器表面，并且珠子将结合至附着的DNA分子(在这种情况中，通过在珠子表面的抗生蛋白链菌素结合在附着的DNA分子上的生物素)。结合的珠子1将投下阴影或阻挡到达光敏元件3的光，并由此被光敏元件探测到。这将获得不同于珠子不存在时的输出的来自光敏元件的信号输出。
通过计算机或数据处理器接收来自每个光敏元件的信号，所述计算机或数据处理器能通过Blackfin控制单元处理和存储数据(参见下文中讨论的图6)。由此产生来自每个光敏元件的结果。如在图1中所见的那样，在该方法期间，使用光源9(例如灯)来照射装置。因此，通过珠子在由表面4提供的光敏元件3上产生的阴影，通过探测附着至分子的珠子1来探测分子2。
图2中，再次显示了上述方法，其中DNA分子2被附着至提供了大量光敏元件3的表面4(Micron MT9T001(Aptina)三兆像素CMOS数字图像传感器)。使待探测的分子与Micron MT9T001(Aptina)三兆像素CMOS数字图像传感器提供的光敏元件3关联，并将珠子1(购自Dynal的M280抗生蛋白链菌素珠子)附着至待探测的分子。再次，珠子被探测到，因为珠子将阻挡到达光敏元件的光，这将导致与珠子不存在时所产生的输出不同的来自元件的输出。在此实施方式中，将表面构造为接收和保留珠子并且在种种情况中，表面含有凹部5。每个凹部5与光敏元件相关联，并且允许结合至分子2的珠子1仅与分子或附着的光敏元件特定关联。这防止了珠子被邻近的光敏元件探测到，并允许使用更多的灵敏方法。在如前所述的可选择的实施方式中，可通过使用表面上的障碍物将表面构造为接收和保留珠子，即，障碍物围绕或与每个光敏元件关联。
图3证明了本发明的方法，其中将待探测的分子或靶分子6(DNA分子)间接地附着至表面4(Micron MT9T001(Aptina)三兆像素CMOS数字图像传感器)。在此实施方式中，设置有大量光敏元件3的MicronMT9T001(Aptina)三兆像素CMOS数字图像传感器具有附着至该表面的捕获物分子7(互补DNA分子)，所述捕获物分子7是靶分子6的特异结合伴侣。使捕获分子7与表面4上的光敏元件关联，图3中显示了与每个光敏元件3相关联的单个捕获物分子7。然而，在任何特定的光敏元件处可以存在多于一个的捕获物分子。将含有靶分子的样品应用至表面4，所述靶分子将特定结合捕获物分子7。在被加入到表面上之前或之后，可用珠子1(M280抗生蛋白链菌素珠子)标记靶分子。通过使用例如磁铁(如果珠子是磁性的)可将未附着的珠子从表面上除去。附着至靶分子的珠子可通过光敏元件探测到，其通过在该光敏元件上投下阴影从而与所述光敏元件相关联。如前所讨论的那样，可用光源9照射表面，并可通过计算机或数据处理器读取由每个光敏元件输出的信号，所述信号取决于珠子的存在或不存在。在每个位置处的捕获分子可以是相同的或不同的，并由此通过如上所述的方法可探测不同的靶分子。
图4中的实施方式显示了具有待探测的靶分子6(例如附着并与单个光敏元件3相关的DNA)的表面4(Micron MT9T001(Aptina)三兆像素CMOS数字图像传感器)。为了探测靶分子6，结合至靶分子的探测物分子8(例如互补的DNA分子)被应用至表面4。在将探测分子加入表面之前或之后，将探测分子8附着至珠子1(M280抗生蛋白链菌素珠子)，并通过珠子在与靶分子相关的光敏元件3上的投影来探测靶分子6的存在。取决于元件接收到的光量，由光敏元件输出的信号将不同，珠子的存在或不存在影响所述光量。如前所述，将通过光源9照射表面，由计算机或数据处理器接收来自每个光敏元件的信号，所述计算机或数据处理器能处理数据并产生指示在每个光敏元件处珠子以及靶分子是否存在的结果。
装置的制备
基于PLCC封装芯片的芯片设备
将Micron MT9T001(Aptina)三兆像素CMOS数字图像传感器焊接在印刷电路板(PCB)上并通过对Blackfin微控制器的连接来测试其功能，所述Blackfin微控制器来自使用PPI(平行外围接口)的模拟设备微控制器。
图像芯片的制备：
焊接至PCB后，用金刚石刀具从CMOS数字图像传感器上小心地除去保护玻璃，并通过用纯乙醇清洗来清洁芯片表面。通过“3D打印”由塑料制备流通池(图5)以便其适合MT9T001 CMOS数字图像传感器的尺寸并允许流体通过入口和出口(10)流向和流出活性表面，所述入口和出口可通过柔韧的塑料管连接。
将环氧树脂胶黏剂薄层分布在边缘，例如使其朝向液体胶黏剂薄层进行冲压。然后将其置于芯片上，并使环氧树脂硬化。对一些芯片而言，在此步骤中除去微摄镜和Bayer滤色器。将盖玻片放置在顶部，覆盖内部和外部隔室，并通过吸入孔12用环氧树脂胶黏剂装满外部隔室，使空气通过排出孔13排出。藉此密封内部隔室，并保护芯片的外部区域和所有开放的连接导线。任选地，在放置盖玻片之前，可将用作温度传感器的具有NTC电阻的电阻网络装入隔室。与控制电路的电连接将通过连接器，所述连接器通过流通池中的切口伸出。
除去微摄镜和Bayer滤色器：
通过将内室暴露至丙酮15分钟除去微摄镜和Bayer滤色器。其后通过用塑料牙签小心地刮除上层。
成像设备对控制和图像采集单元的连接：
如图6中所示那样连接成像设备17。使用硬件加速(从图像芯片到RAM的直接存储器存取)在Blackfin控制单元18中捕捉图像是可能的。对图像芯片的时钟信号可以通过晶体产生或通过Blackfin产生。通过使用uClinux分布(分布在程序包中的测试程序ppifcd_test)，捕捉至RAM-磁盘文件是可能的。在以下链接中找到的uClinux wiki中对此进行了描述：http://docs.blackfin.uclinux.org/doku.php？id＝frame_capture_device。附件1为在此链接中的复制文本。
然后可将此文件在网络上通过使用NFS、tftp、ftp等或使用USB传送至计算机19。
成像设备对流体供应单元的连接：
如图6中所示的那样，将成像设备17进一步连接至流体供应单元。所述流体供应单元由许多独立的流体容器20组成，每个流体容器设置有其自己的泵或注射器以驱动流体通过管道21流至歧管22并进一步流至成像设备。排出所使用的流体，例如，排入容器。
基于晶片的单或多芯片设备(裸模)
在装备Bayer滤色器和任何其它滤色器之前，从常规生产线上除去晶片。现在可以方便地实施增强聚合物固定的任何制备，例如，使用保护连接岛的掩模喷涂金属。测试晶片，并用常规方法将其切割为芯片(裸模)。图7显示了单芯片设备，但是，使用已被置于板16上的准确装入的桩(例如匹配孔或在反应室单元角落中的“耳”)，通过将芯片粘合入板上它们准确的位置，可将任意数量的芯片4装入反应室单元中。用金线通过结合15将芯片连接至板。由桩导引，将反应室单元置于芯片顶部。然后首先将其粘合至一个芯片或多个芯片，然后通过入口12用环氧树脂装填含有结合的连接器的封闭的体积，而使空气从图7中的出口13排出。在多芯片设备中，所有结合的连接器体积是互相关联的。
在单芯片设备中，通过塑料管(图7中的11)将单个反应体积连接至流体供应和排出单元。在多芯片单元中，这些体积可以以系列和/或平行的不同的方式联通，或通过外部管道或通过单元中的通道。对于小批生产，这可在一个单元中通过透明塑料“3D打印”生产，而对于大批生产，可以例如用两面都具有洞的一个塑料板和平坦、透明的板生产。前者可以通过铣削或通过模制由平板生产。
通过DNA将珠子结合至图像芯片的实验方案
DNA制备
来自具有插入片段的pUC128质粒，使用以下引物通过PCR扩增1574bp的扩增子以制备以下扩增子：
Figure BDA0000087090600000261
在100mM Tris-HCl pH 7.5或NaPi缓冲液(0.1M NaH2PO4 pH 6.50.15M NaCl)中的10mM还原剂三(2-羧乙基)膦(TCEP)中孵育纯化过的扩增子，并孵育2小时。然后根据使用手册通过biospin30(bio-rad)柱，通过用NaPi缓冲液洗涤DNA以纯化扩增子。然后在NaPi缓冲液中洗涤DNA至终浓度为10μg/ul。如下所述的那样，将纯化的扩增子立即应用至图像芯片。
图像芯片功能化：
1.用5％体积/体积的以下溶液覆盖图像芯片：在干燥丙酮中的(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(CAS：919-30-2)，室温1小时。
2.然后用丙酮清洗图像芯片并孵育5分钟。该丙酮清洗总共重复3次。然后该芯片在乙醇中漂洗并在N2气氛下干燥。
3.在溶解在PBS(0，1M HaH2PO4，0，15M NaCl，pH7.2)中的异双官能连接子间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(s-MBS)的20mM溶液中孵育该图像芯片5小时，并孵育5小时。
4.然后用PBS清洗该图像芯片，然后将其浸入去离子水中，然后用乙醇漂洗，并最终干燥。
DNA的附着
1.将上述来自“DNA制备”实验的DNA添加到图像芯片，并孵育5小时。
2.用NaPi缓冲液清洗该图像芯片2次，每次在摇动器上摇动5分钟。
3.用10mM在NaPi缓冲液中的巯基乙醇(Mecaptoethanol)溶液孵育该图像芯片1小时。
4.然后用NaPi缓冲液清洗该图像芯片5分钟。
5.用1.5M NaCl在10mM NaH2PO4 pH 7中的溶液孵育该图像芯片10分钟。
6.用具有0.1％吐温-20的5 x SSC缓冲液(0.075M柠檬酸钠，0.75MNaCl pH7.0)清洗该图像芯片。
8.用5 x SSC缓冲液漂洗该图像芯片。
9.将该图像芯片保存在TE-缓冲液pH7.5(10mM Tris-HCl，1mMEDTA二钠)中。
来自DYNAL的M-280链球菌抗生物素蛋白珠子的孵育
1.如使用手册中所述那样在TE-缓冲液中制备珠子。
2.将珠子稀释至1μg/μl的终浓度。
3.将10μl的1μg/μl珠子加入图像芯片并孵育30分钟。
附录1
PPI帧捕获设备
PPI帧捕获设备(PPIFCD)是通过平行外围接口连接至Blackfin的CMOS摄像机。其意在仅仅捕获单独的帧。目前支持两种摄像机传感器。
参见此处：v4l_blackfin_camera用于支持某些传感器的v4l视频驱动器。
Micron MT9T001
如此处所述，使用Micron MT9TQ01(数据表)可以构建PPIFCD。其使用标准Inter-IC Bus(简介)和可编程标志来控制摄像机(例如，取出备用方式等)。
使用PPIFCD的程序
ppifcd_test
如此处所述，PPIFCD帧捕获设备测试应用目的以观察数字图像传感器是否能够有效地获取通过PPI端口连接至目标板的画面。其记录row_time、total_frame_time、total_frame_caprure_time和获得的画面。如果打印的数据是预期的，则该情况通过，否则不合格。
fcd
该程序用于基于CGI的网页，该网页允许使用者指定设置、捕获帧和证实摄像机的全面操作。
构造uClinux核心
Blackfin PPI支持很多子卡，PPIFCD是其中之一。然而，PPI驱动将和PPI摄像机帧捕获驱动冲突，如果二者都使用的话。当PPI驱动尝试注册用于char device的相同主号码(major number)时，你将在内核语言(即，dmesg)中看到这种冲突。
以下是用于BF533和BF537STAMP板的一些配置设定。
为了获得上述构建的程序中的任何一个，详细说明如下：
在定制计算机销售商/用户设置下
＝＝选择Blackfin测试程序＝＝
启动PPIFCD测试程序
＝＝选择Blackfin app程序＝＝
启动基于CGI的测试应用以用于PPI帧捕获驱动
BF533-STAMP板
如此处所述，已知BF533-STAMP板以以下设置用PPIFCD运行：
在定制的内核设置下
＝＝选择设备驱动程序＝＝
＝＝选择字符设备＝＝
启动[*]Blackfin BF53x可编程标记驱动程序
启动[*]Blackfin BF5xx PPI摄像机帧捕获驱动程序
[]Blackfin BF5xx PPI驱动程序
＝＝选择I2C支持＝＝
启动I2C支持
启动I2C设备接口
选择I2C硬件总线支持
启动一般的Blackfin和HHBF533/561开发板I2C支持
选择BFIN I2C SDA/SCL选项
设定(2)SDA为PF[0:15]
设定(1)SCL为PF[0:15]
BF537-STAMP板
BF537具有内置的双线接口外围并且不像BF333不需要此处中所述的一般I2C支持。
在定制的内核设置下
＝＝选择设备驱动程序＝＝
＝＝选择字符设备＝＝
启动[*]Blackfin BF53x可编程标记驱动程序
启动[*]Blackfin BF5xx PPI摄像机帧捕获驱动程序
[]Blackfin BF5xx PPI驱动程序
＝＝选择I2C支持＝＝
启动I2C支持
启动I2C设备接口
选择I2C硬件总线支持
启动Blackfin TWI I2C支持

Claims (15)

1.一种探测附着至表面的分子的方法，所述方法包括探测附着至所述分子的珠子，其中所述表面设置有一个或多个光敏元件，其中每个光敏元件被安排成探测与其邻近的珠子，并且其中所述珠子(i)尺寸对应于所述一个或多个光敏元件的尺寸或(ii)直径至少为1μm，以允许探测附着至所述表面的单个分子。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括用光源照射所述光敏元件并通过探测由其邻近的珠子的存在而导致的落在所述光敏元件上的光量的变化来探测珠子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述分子与所述存在于所述表面中或表面上的一个或多个光敏元件关联。
4.根据权利要求3所述的方法，其中一种分子类型与光敏元件关联。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述表面是图像芯片。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述表面用金层涂覆。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述珠子是磁性珠子。
8.一种探测附着至表面的靶分子的方法，所述方法包括以下步骤：
i)将靶分子结合至表面，
ii)向表面加入探测分子，其中所述探测分子在加入到表面后被附着至珠子或用珠子标记，以及
iii)探测附着至所述靶分子的所述珠子的存在，
其中，所述表面设置有能够探测珠子的一个或多个元件，其中每个元件被安排为探测其邻近的珠子，并且其中所述珠子的尺寸对应于所述一个或多个元件的尺寸或至少直径为1μm，从而允许探测附着至所述表面的单个靶分子。
9.一种用于探测其上附有珠子的分子的存在的装置，所述装置包括表面，所述表面设置有用于探测珠子的设备，其中将所述表面的形状构造为接收和保留珠子。
10.根据权利要求9所述的装置，其中所述表面包括用于探测所述珠子的一个或多个光敏元件。
11.一种用于探测其上附有珠子的分子的存在的装置，所述装置包括流通池和表面，所述表面设置有一个或多个光敏元件，其中每个光敏元件被安排为探测珠子。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的装置，其中所述表面进一步包括附着于其上并与用于探测珠子的所述设备或所述光敏元件相关联的一个或多个分子。
13.根据权利要求11-12中任一项所述的装置，其中所述表面用金层涂覆。
14.一种包括在表面上设置有一个或多个光敏元件的装置在探测单个分子中的应用，其中所述单个分子被附着至所述表面并用珠子标记，所述珠子的尺寸对应于所述一个或多个光敏元件的尺寸并通过探测所述珠子来探测所述单个分子。
15.一种成套工具，包括a)(i)设置有一个或多个光敏元件的表面，和
ii)能够被所述表面探测到并且尺寸对应于所述一个或多个光敏元件的尺寸的一个或多个珠子，或b)如权利要求11-13中任一项所述定义的装置。
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