CN102369292B - 生物素酰胺酶测定 - Google Patents
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Abstract
本技术公开了生物素酰胺酶测定,生物素酰胺酶底物(I)和试剂盒,其中生物素酰胺酶底物包括通过长于约但短于约的连接子X而与生物素氨基甲酰基团相隔开的标记分子。
Description
发明领域
本申请记载的技术涉及测量样品中生物素酰胺酶(biotinidase)水平的测定。
背景技术
生物素酰胺酶缺乏(biotinidase deficiency)是由被称为生物素酰胺酶的酶的功能紊乱所引起的疾病。患有生物素酰胺酶缺乏的患者经历严重的临床症状,包括不可逆的神经学损伤或者甚至死亡。生物素酰胺酶缺乏的基因缺陷是遗传的,并且当两个携带者将其传递给他们的后代时,该疾病往往出现。对于两个这样的携带者的每次怀孕而言,孩子将患有该疾病而出生的几率为25%,而孩子将是该基因缺陷的携带者的几率为50%。研究显示,大约每60,000活产中有1例将患有生物素酰胺酶缺乏。患有生物素酰胺酶缺乏的婴儿在出生时表现正常,但是在生命的最初几周或几个月之后发展出危险的症状。利用早期诊断和治疗,该疾病的所有症状都能被预防。
在细胞中,生物素酰胺酶具有从生物胞素和短生物素化肽链释放生物素以用于生物素再循环的功能。当前有几种可利用的、用于测量血液样品中生物素酰胺酶活性的测定法,尽管这些测定法并不总是适合临床检测。
已经公开了利用耦联至荧光铕螯合物的生物素来测量生物素酰胺酶活性的方法(Curr.Trends Infant Screening 1989,265)。生物素和铕螯合物之间的酰胺键的断裂,导致了荧光强度的降低。虽然该方法可能适合于定量均匀测量来自血清的生物素酰胺酶活性,然而,该公开的方法苦于相对高的背景信号和长的温育时间。
发明概述
在本申请记载的此技术中,观察到了当生物素酰胺酶的底物为生物素的衍生物时(其中生物素部分的氨基甲酰基与标记通过长于约但短于约长度的连接子被相互隔开),能够进行生物素酰胺酶测定。
根据一个方面,此技术涉及测定样品中的生物素酰胺酶活性的方法,所述方法包括使所述样品与式(I)的生物素酰胺酶底物接触:
其中X是连接子,并且其中所述连接子的长度为约至约
另一方面,此技术涉及式(I)的生物素酰胺酶底物:
其中X为包含3-15个部分的连接子,其中每个部分独立地选自:亚苯基,含有1-15个碳原子的亚烷基,乙炔二基(-C≡C-),乙烯二基(-C=C-),醚(-O-),硫醚(-S-),酰胺(-CO-NH-,-CO-NR′-,-NH-CO-和-NR′-CO-),羰基(-CO-),硫代羰基(C=S),酯(-COO-和-OOC-),羧基(-COOH和-COO-),酰胺(-CONH2),二硫基(-SS-),砜基(-SO2-),二氮基(-N=N-),仲胺和叔胺,其中R′代表含有少于5个碳原子的烷基,2-羟基-1,3,5-三嗪基,6-羟基-1,3,5-三嗪基,以及1H-1,2,3-三唑-4-基,条件是该连接子的长度为约至约而且其中所述标记为发光或不发光的镧系元素(III)螯合物。
另一方面,此技术涉及用于测定生物素酰胺酶活性的试剂盒,所述试剂盒包括微量滴定板和根据式(I)的生物素酰胺酶底物:
其中X为包括3-15个部分的连接子,其中每个部分独立地选自:亚苯基,含有1-15个碳原子的亚烷基,乙炔二基(-C≡C-),乙烯二基(-C=C-),醚(-O-),硫醚(-S-),酰胺(-CO-NH-,-CO-NR′-,-NH-CO-和-NR′-CO-),羰基(-CO-),硫代羰基(C=S),酯(-COO-和-OOC-),羧基(-COOH和-COO-),酰胺(-CONH2),二硫基(-SS-),砜基(-SO2-),二氮基(-N=N-),仲胺和叔胺,其中R′代表含有少于5个碳原子的烷基,2-羟基-1,3,5-三嗪基,6-羟基-1,3,5-三嗪基,以及1H-1,2,3-三唑-4-基,条件是该连接子的长度为约至约而且其中所述标记为发光或不发光的镧系元素(III)螯合物,以及其中所述镧系元素选自铕,铽,钐和镝。
附图简述
图1.用生物素衍生物3作为底物进行的生物素酰胺酶测定,其中在生物素的戊酰羰基(valeroyl carbonyl)与所述标记之间没有连接子。在生物素酰胺酶测定中,化合物3不作为酶的底物起作用。
图2.用生物素衍生物5作为底物进行的生物素酰胺酶测定,其中连接子的长度为约在生物素酰胺酶测定中,化合物5作为酶的有利底物起作用。
图3.用生物素衍生物7作为底物进行的生物素酰胺酶测定,其中连接子的长度为约在生物素酰胺酶测定中,化合物7中度地作为酶的底物起作用。
图4.用生物素衍生物10作为底物进行的生物素酰胺酶测定,其中连接子的长度为约交叉:正常的人血液斑点(高生物素酰胺酶活性);方块:最低的标准(猪血);菱形:异常的人对照(低生物素酰胺酶活性)。
图5.用生物素衍生物15进行的生物素酰胺酶测定(连接子长度约)。在不存在DELFIA诱导剂的情形下进行该测定。
图6.用生物素衍生物15进行的生物素酰胺酶测定。在存在DELFIA诱导剂的情形下进行该测定。
发明详述
本申请中所定义的术语“标记”,是指能够用于提供可检测的(优选定量的)信号的任何原子或分子,并且其能够直接地或经由连接子与生物素或其衍生物共价连接。所述标记可通过荧光、放射性、比色法、X-射线衍射或吸收、酶活性等来提供可检测的信号。
如本申请中所定义的,术语“非发光镧系元素(III)螯合物”,是指不包括会吸收激发能的芳香族结构的镧系元素(III)螯合物。
如本申请中所定义的,术语“光发镧系元素(III)螯合物”,是包括芳香族结构的镧系元素(III)螯合物,所述芳香族结构吸收激发能并且将其转移至镧系元素(III)离子。
如本申请中所定义的,术语“有机生色团”,是包括能够吸收光的芳香族亚基的荧光或非荧光标记分子。
如本申请中所定义的,″猝灭剂”分子,是指能够从供体分子接受能量的荧光或非荧光分子。
如本申请中所定义的,“受体”分子,是指能够从供体分子接受能量的荧光分子。
如本申请中所定义的,术语“连接子”,是指生物素戊酸的氨基甲酰基与标记分子之间的间隔子。连接子的长度可以用元素的键长度来估算。典型的键长度在表1中公开。
表1平均键长度a
a.数据源自化学和物理CRC手册,第50版。
根据一个实施方式,本公开涉及测定含有生物素酰胺酶的样品中生物素酰胺酶活性的方法,所述方法包括使样品与式(I)的生物素酰胺酶底物接触:
其中X为连接子。根据此公开,连接子的长度为约至约在一个实施方式中,连接子的长度为约至约在特定的实施方式中,连接子的长度为约至约示例性的连接子长度为约和约
根据特定的实施方式,标记选自有机生色团,发光的镧系元素(III)螯合物,和不发光的镧系元素(III)螯合物。示例性的有机生色团是,可获得自Invitrogen的Alexa,QSY和BODIPY染料(www.invitrogen.com),来自GEHealthcare的青蓝染料(www.gelifesciences.com),dabcyl,dancyl,荧光素,若丹明,四甲基若丹明,TAMRA;来自AnaSpec的HiLyte Fluors(www.anaspec.com),来自Serotec的DyLight染料(www.serotec),来自Biosearch Technologies的BHQ染料(www.biosearch.com),来自DenovoBiolabels的Oyster染料(www.denovo.com)以及来自Atto-tec的Atto染料(www.atto-tec.de)。
根据另一个实施方式,镧系元素(III)螯合物是不发光的。示例性的不发光螯合物包括选自DTPA,EDTA,吡啶-2,6-二基-双(亚甲基次氮基)四(乙酸)和二亚乙基三胺四乙酸的配体,和选自铕,铽,镝和钐的镧系元素(III)离子。在全血中进行的测定中,优选的不发光镧系元素(III)螯合物是基于DTPA的。示例性的基于DTPA的螯合物是1-(4-氨基苄基)二亚乙基三胺-N,N,N′,N″,N″-五乙酸镧系元素(III)。该螯合物可以通过其氨基连接至生物素或其衍生物。
根据另一个实施方式,镧系元素(III)螯合物是发光的。在本技术中有用的示例性的发光镧系元素(III)螯合物是那些公开在现有技术中被分类为:a)吡啶类似物及其多聚形式(US 4,920,195,US 4,801,722,US 4,761,481,US4,459,186,EP 0770610,US 5,216,134,US 4,859,777,US 5,202,423,US5,324,825,US专利申请11/004,061;US专利申请10/928,143,PCT/FI2008/050494);b)带有光吸收基团的DTPA缀合物;c)多聚大环的笼型复合物,例如穴状化合物(US 4,927,923,EP 493745A),d)以及其他,例如杯芳烃,podants,螺旋体和环状席夫碱(EP 0369000)。根据特定的实施方式,对于本技术有用的发光镧系元素(III)螯合物包括氮杂环烷骨架。包括氮杂环烷骨架的示例性的镧系元素(III)螯合物显示如下:
根据一个实施方式,连接子X包括3-15个部分,每个部分独立地选自:亚苯基,含有1-15个碳原子的亚烷基,乙炔二基(-C≡C-),乙烯二基(-C=C-),醚(-O-),硫醚(-S-),酰胺(-CO-NH-,-CO-NR′-,-NH-CO-和-NR′-CO-),羰基(-CO-),硫代羰基(C=S),酯(-COO-和-OOC-),羧基(-COOH,和-COO-),酰胺(-CONH2),二硫基(-SS-),砜基(-SO2-),二氮基(-N=N-),仲胺和叔胺,其中R′代表含有少于5个碳原子的烷基,2-羟基-1,3,5-三嗪基,6-羟基-1,3,5-三嗪基,以及1H-1,2,3-三唑-4-基,条件是该连接子的长度为约至约在一个实施方式中,连接子的长度为约至约在特定的实施方式中,连接子的长度为约至约示例性的连接子长度为约和约
根据特定的实施方式,根据本技术的生物素酰胺酶底物包括不发光的镧系元素(III)螯合物,其选自由式(II)至(IV)组成的组:
其中Ln选自铕,铽,钐和镝。生物素氨基甲酰基与DTPA苄基之间的连接子的长度对于式(II),式(III)和式(IV)的底物分别为约和根据特定的实施方式,生物素酰胺酶底物具有式(II):
其中镧系元素(III)离子选自铕,铽,钐和镝。优选的镧系元素离子为铕。
根据另一个实施方式,根据本技术的生物素酰胺酶底物包括发光的镧系元素(III)螯合物。包括发光镧系元素(III)螯合物作为标记的示例性生物素酰胺酶底物具有式(V),其中生物素的氨基甲酰基与标记的呋喃基之间的连接子的长度为约
本申请中记载的生物素酰胺酶底物,可以用于多种测定形式中。根据一个实施方式,信号检测是基于时间分辨的分离荧光增强。为了提供背景,在分离荧光增强测定(DELFIA)中,将基于聚羧酸酯的非荧光镧系元素(III)螯合物用作标记。在测定过程中,这些螯合物被用作镧系元素(III)离子的载体。在进行测定之后,通过分离螯合的离子并且在溶液中产生新的荧光螯合物而产生荧光。这是通过降低pH而降低氨羧络合剂的条件稳定性来实现的。过量存在的氟化β-二酮,能够在所用的pH下迅速形成镧系元素复合物。一个镧系元素结合三个二酮,以在螯合物中形成捕光基团。用增效剂例如TOPO将剩余的水分子去除,然后用去污剂将新形成的复合物溶解。最后,荧光测量镧系元素(III)的含量。
在特定的实施方式中,将包括发光或不发光镧系元素(III)螯合物作为标记的式(I)的生物素酰胺酶底物在样品孔中与其他组分进行温育。样品孔被链霉亲和素结合材料(例如用抗-链霉亲和素抗体)包被。在温育之后,将链霉亲和素(SA)加至反应中。链霉亲和素与抗-SA抗体和生物素酰胺酶底物的生物素部分结合。链霉亲和素与生物素酰胺酶底物的结合终止酶反应。在温育之后,用洗涤溶液洗涤样品孔。加入强化溶液,并且在温育之后测量未反应的生物素酰胺酶底物的镧系元素信号。该酶活性与样品中未反应的生物素酰胺酶底物的量成反比,由此产生递减的信号。当标记为发光的镧系元素(III)螯合物时,强化溶液的添加可以省略。
本申请中记载的用于测定生物素酰胺酶活性的方法可以应用于包含或怀疑包含生物素酰胺酶的任何样品。因此,该样品可以是获自动物、细胞培养物、生物体、及其液体和细胞的生物学样品。通常就生物素酰胺酶活性测试血液样品以检测新生婴儿的代谢紊乱。任何类型的血液样品(包括全血、血液级分、以及当前流行的血液斑点制备物)都可以用于本申请记载的方法中。
根据另一个实施方式,根据本技术的底物包括发光的镧系元素(III)螯合物,并且信号检测是基于时间分辨的荧光能量转移(TR-FRET),或者基于时间分辨的荧光能量猝灭(TR-FQ)。为了提供背景,在基于TR-FRET的测定中,非放射性的能量转移由被称为供体的经激发的分子(在此为发光的镧系元素(III)螯合物)至被称为受体的另一分子(有机生色团)而发生。如果受体是荧光性的,那么可以通过受体信号的消失或者供体信号的增加来跟踪酶活性。如果受体是能从供体接受能量的非荧光性猝灭剂,那么当断裂后供体信号出现时跟踪酶活性。示例性的供体分子为有机生色团,其选自alexa染料,青蓝染料,dabcyl,dancyl,荧光素,若丹明,TAMRA,bodiby,HiLyte Fluor647,DyLight649,QSY7,四甲基若丹明,BHQ染料,和Oyster 650。
根据一个实施方式,用荧光团标记生物素酰胺酶底物,并且用猝灭剂标记SA,所述猝灭剂在生物素酰胺酶底物完整时猝灭荧光。当生物素酰胺酶从底物裂解掉生物素时,可以检测到荧光信号。酶活性引起增加的信号,该信号与样品中的生物素酰胺酶活性成正比。
根据一个实施方式,用猝灭剂标记生物素酰胺酶底物,并且用荧光团标记SA。酶活性与荧光信号的增加成正比。当用受体标记生物素酰胺酶底物并且用供体标记SA时,酶活性与受体信号的降低成正比。
根据一个实施方式,用供体标记生物素酰胺酶底物并且用受体标记SA。根据测量,酶活性与供体或受体信号的增加或降低成正比。
通过使用合适的校正算法或者通过稀释样品,可以减少来自血液成分的可能干扰。
根据特定的实施方式,本技术包括测定含有生物素酰胺酶的血液样品中生物素酰胺酶活性的方法,所述方法包括:
a.将下列物质置于抗-链霉亲和素包被的样品孔中:
(i)含有生物素酰胺酶的血液样品,
(ii)根据本技术的生物素酰胺酶底物,其中标记为发光或不发光的镧系元素(III)螯合物,
b.在足够的温度下温育样品孔中的物质足够的时间,
c.将链霉亲和素添加至样品孔,并且在足够的温度下温育所述孔内的物质足够的时间,
d.用洗涤溶液洗涤样品孔,
e.将强化溶液添加至样品孔,并且在足够的温度下温育孔内物质足够的时间,
f.测量镧系元素的信号,和
g.基于镧系元素的信号计算生物素酰胺酶的活性。
当生物素酰胺酶底物包括发光的镧系元素(III)螯合物作为标记时,步骤e.可以省略。
根据特定的实施方式,本技术包括测定含有生物素酰胺酶的血液样品中生物素酰胺酶活性的方法,所述方法包括:
a.将下列物质置于样品孔中:
(i)含有生物素酰胺酶的血液样品,
(ii)根据本技术的生物素酰胺酶底物,其中标记为发光或不发光的镧系元素(III)螯合物,
b.在足够的温度下温育所述样品孔中的物质足够的时间,
c.将样品孔中的全部或部分物质转移至另一个用链霉亲和素包被的样品孔中,
d.在足够的温度下温育样品孔中的物质足够的时间,
e.用洗涤溶液洗涤样品孔,
f.将强化溶液添加至样品孔,并且在足够的温度下温育孔内物质足够的时间,
g.测量镧系元素的信号,和
h.基于镧系元素的信号计算生物素酰胺酶的活性。
当生物素酰胺酶底物包括发光的镧系元素(III)螯合物作为标记时,步骤f.可以省略。
根据特定的实施方式,本技术涉及测定含有生物素酰胺酶和根据式(II)-(V)的生物素酰胺酶底物的样品中生物素酰胺酶活性的方法。在特定的实施方式中,所述样品是血液。
根据另一个实施方式,本技术包括测定含有生物素酰胺酶的血液样品中生物素酰胺酶活性的方法,所述方法包括:
a.将下列物质置于样品孔中:
(i)含有生物素酰胺酶的血液样品,
(ii)根据本技术的生物素酰胺酶底物,其中标记为选自发光镧系元素(III)螯合物和有机生色团的供体分子,
b.在足够的温度下温育样品孔中的物质足够的时间,
c.添加用受体分子(优选猝灭分子)标记的链霉亲和素,
d.在足够的温度下温育样品孔中的物质足够的时间,
e.测量荧光信号,和
f.基于荧光信号计算生物素酰胺酶的活性。
根据另一个实施方式,本技术包括测定含有生物素酰胺酶的血液样品中的生物素酰胺酶活性的方法,所述方法包括:
a.将下列物质置于样品孔中:
(i)含有生物素酰胺酶的血液样品,
(ii)根据本技术的生物素酰胺酶底物,其中标记是受体分子,例如猝灭分子,
b.在足够的温度下温育样品孔中的物质足够的时间,
c.添加用供体分子标记的链霉亲和素,所述供体分子选自发光的镧系元素(III)螯合物和有机生色团,
d.在足够的温度下温育样品孔中的物质足够的时间,
e.测量荧光信号,和
f.基于荧光信号计算生物素酰胺酶的活性。
根据另一个实施方式,本技术涉及式(I)的生物素酰胺酶底物:
其中X为包括3-15个部分的连接子,其中每个部分独立地选自:亚苯基,含有1-15个碳原子的亚烷基,乙炔二基(-C≡C-),乙烯二基(-C=C-),醚(-O-),硫醚(-S-),酰胺(-CO-NH-,-CO-NR′-,-NH-CO-和-NR′-CO-),羰基(-CO-),硫代羰基(C=S),酯(-COO-和-OOC-),羧基(-COOH和-COO-),甲酰胺基(-CONH2),二硫基(-SS-),砜基(-SO2-),二氮基(-N=N-),仲胺和叔胺,其中R′代表含有少于5个碳原子的烷基,2-羟基-1,3,5-三嗪基,6-羟基-1,3,5-三嗪基,以及1H-1,2,3-三唑-4-基,条件是该连接子的长度为约至约而且其中所述标记为发光或不发光的镧系元素(III)螯合物,以及所述镧系元素选自铕,铽,钐和镝。在一个实施方式中,连接子的长度为约至约在特定的实施方式中,连接子的长度为约至约示例性的连接子长度为约和约示例性的生物素酰胺酶底物为式(II),(III)和(IV)的底物(其中不发光的镧系元素(III)螯合物被用作标记)和式(V)的生物素酰胺酶底物(其中发光的镧系元素(III)螯合物被用作标记):
根据另一个实施方式,本技术涉及用于测定生物素酰胺酶活性的试剂盒,其包括:微量滴定板和根据式(I)的生物素酰胺酶底物的生物素酰胺酶底物:
其中X为包括3-15个部分的连接子,其中每个部分独立地选自:亚苯基,含有1-15个碳原子的亚烷基,乙炔二基(-C≡C-),乙烯二基(-C=C-),醚(-O-),硫醚(-S-),酰胺(-CO-NH-,-CO-NR′-,-NH-CO-和-NR′-CO-),羰基(-CO-),硫代羰基(C=S),酯(-COO-和-OOC-),羧基(-COOH和-COO-),甲酰胺基(-CONH2),二硫基(-SS-),砜基(-SO2-),二氮基(-N=N-),仲胺和叔胺,其中R′代表含有少于5个碳原子的烷基,2-羟基-1,3,5-三嗪基,6-羟基-1,3,5-三嗪基,以及1H-1,2,3-三唑-4-基,条件是该连接子的长度为约至约并且其中所述标记为发光或不发光的镧系元素(III)螯合物。用能够结合生物素的材料包被根据本技术的微量滴定板。优选的结合基质/成分是直接地或经由抗-SA而包被至微量滴定孔的SA。根据优选的实施方式,该试剂盒进一步包括一种或多种:测定缓冲液,洗涤缓冲液,增效缓冲液,校正剂和对照。
实施例
实施例1.连接至DTPA的生物素(3)的合成
将(+)-生物素(5.0mg,20.4μmol)溶解于干DMF(500μL)中。加入N-羟基琥珀酰亚胺(2.9mg,24.4μmol)和DCC(5.0mg,24.4μmol),将该混合物在室温下搅拌过夜,之后蒸发干燥。将包含1的残余物悬浮于吡啶/水/TEA(9/1.5/0.1;v/v/v;(800μL)的混合物中,并且加入预先溶解于水中(400μL)的1-(4-氨基苄基)二亚乙基三胺-N,N,N′,N″,N″-五乙酸的铕螯合物(2;21.2mg,30.6μmol)。将该混合物在室温下搅拌过夜,之后浓缩至约150μL。加入丙酮(4.0mL),通过离心收集所形成的沉淀,用丙酮(4mL)洗涤并干燥。用装备有二极管阵列检测器、级分收集器和逆相柱(LiChrocart 125-3 PurospherRP-18e 5μm)的Shimadzu LC 10AT仪、在HPLC上对粗制产物进行纯化。移动相:(缓冲液A):0.02M醋酸三乙铵(pH 7.0);(缓冲液B):50%(v/v)乙腈中的A。梯度:0至1min 95%A,1至31min 95%A至100%B。流速为0.6mLmin-1。化合物3:ESI-TOF-MS[M-H]-:计算值873.16,实验值873.12。
实施例2.连接至DTPA的生物素-X(5)的合成
如实施例1中所公开的进行合成,但是使用生物素氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(4;生物素-X-NHS)。化合物5:ESI-TOF-MS[M-2H]2-:计算值492.62,实验值492.58。
实施例3.连接至DTPA的生物素-XX(7)的合成
如实施例1中所公开的进行合成,但是使用生物素氨基己酰基-6-氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(6;生物素-XX-NHS)。化合物7:ESI-TOF-MS[M-2H]2-:计算值549.16,实验值549.15。
实施例4.连接至发光镧系元素(III)螯合物的生物胞素(10)的合成
如US 4,920,195中所公开的合成生物胞素(8,5mg,13μmol)和异硫氰酸酯螯合物9(23mg,33μmol),将其溶解于吡啶,水和三乙胺(9∶1.5∶01,v/v/v;250μL)的混合物中,将该混合物在室温下搅拌过夜。通过用丙酮沉淀而分离产物并用HPLC纯化。化合物10:ESI-TOF MS实验值,1047.13;C40H46EuN8O12S-的计算值1047.18。该产物在环境温度长期储存时倾向于Edman降解。
实施例5.在其氨基处标记有发光铕(III)螯合物的生物胞素氨基己胺(12)的合成。
将生物胞素(85mg,0.013mmol)和Fmoc-氨基己酸-NHS(预先溶解于150μL二噁烷中)溶解于0.1M NaHCO3(200μL)和DMSO的混合物中。将该混合物在室温下搅拌过夜。加入哌啶(50μL),并且将混合物再搅拌1h,之后浓缩以得到化合物11。ESI-TOF MS的实验值为484.22;C22H38N5O5S-的计算值为484.26。如实施例4中所描述的,化合物11(0.013mmol)与化合物9(0.04mmol)的反应产生了化合物12。ESI-TOF MS的实验值为1160.21;C46H57EuN9O13S-的计算值为1160.27。
实施例6.用发光镧系元素(III)螯合物标记的生物素15的合成
将(+)-生物素(5.0mg,20.4μmol)溶解于干DMF(500μL)中。加入N-羟基琥珀酰亚胺(2.8mg,24.4μmol)和DCC(5.0mg,24.4μmol),将该混合物搅拌过夜,之后蒸发干燥。将2-{4,7-二{[4-(4-羧基-3,5-二甲基呋喃-2-基)]-6-羧基吡啶-2-基甲基}-1,4,7-三氮杂环壬烷-1-基甲基}-4-[4-(6-氨基己基)氨基羰基-3,5-二甲基呋喃-2-基]吡啶-2-羧酸铕(III)(13;24.4mg,20.4μmol)悬浮于吡啶/水/TEA(9/1.5/0.1;v/v/v)(800μL)的混合物中,之后加入水(400μL)。加入化合物14,将该混合物在室温下搅拌过夜。加入水(1.0ml),用2M HCl调节pH至4。通过离心收集所形成的沉淀,用丙酮(2mL)洗涤。通过制备性HPLC进行纯化。ESI-TOF-MS[M-2H]2-:计算值710.20,实验值710.19。
实施例7.异质的生物素酰胺酶测定(DELFIA)
基于使用链霉亲和素-特异性抗体、链霉亲和素和生物素酰胺酶底物(化合物3,5和7)进行异质测定。因此,将200μL抗-链霉亲和素抗体(1μg/孔,Novus Biologicals cat.No.NB200-448)吸移至微量滴定板孔中的包被缓冲液中(50mM TRIS pH 7.4+50mM NaCl)。将板在室温下温育3h。之后,用Delfia洗涤溶液将板洗涤2次。将血液斑点(直径3.2mm)冲加(punch)至孔中。将10nM生物素酰胺酶底物加至孔中的反应缓冲液中(50mM MES pH 6,0.05%BSA,0.01%TWEEN,50mM NaCl)。伴随缓慢振荡,将板在+37℃下温育2小时。将100μL 20nM的、反应缓冲液中的链霉亲和素加至孔内。将板在室温下温育1小时,伴随缓慢振荡。用Delfia洗涤溶液将板洗涤4次。将200μL Delfia诱导剂加至孔中,在室温下温育15分钟。用时间分辨荧光计测量Eu信号。样品中的生物素酰胺酶越多,Eu信号越低。
实施例8.基于猝灭(TR-FQ)的同质测定
生物素酰胺酶活性检测的同质测定是基于经铕标记的底物和经猝灭剂标记的链霉亲和素。将血液斑点(直径3.2mm)、校正剂及样品冲加至微量滴定板的孔中。将铕-标记的生物素酰胺酶底物(化合物10,10nM)添加至100μL的反应缓冲液中(50mM TRIS pH 7,0.2%BSA,0.01%TWEEN,50mM NaCl)。将板在+37℃下温育3小时,伴随缓慢振荡。将10nM经猝灭分子标记的链霉亲和素加至100μL反应缓冲液中。将板在室温下温育30分钟,伴随避光的缓慢振荡。用时间分辨荧光计测量铕信号。样品中的生物素酰胺酶越多,铕信号越高。结果显示于图4中。可以从具有高生物素酰胺酶活性的样品中容易地鉴别出具有低生物素酰胺酶活性的异常样品。下列染料被用作猝灭剂:
HiLyte Fluor 647(AnaSpec,cat 81256)
DyLight 649(Pierce,cat 46415)
Cy5(Amersham GE Healthcare;PA25001)
Oyster 650(Denovo biolabels;Oy-650-P-1-N-1)
实施例9.基于直接测量经发光的镧系元素(III)螯合物标记的生物素酰胺酶底物的荧光的异质测定。
将血液斑点(直径3.2mm)、校正剂及样品冲加至微量滴定板的孔中。将铕-标记的生物素酰胺酶底物(化合物15,10nM)添加至100μL反应缓冲液中(50mM TRIS pH 7,0.2%BSA,0.01%TWEEN,50mM NaCl)。将板在+37℃温育3小时,未振荡。将链霉亲和素(10nM/孔)添加至100μL反应缓冲液中。伴随缓慢振荡将板在室温下温育15分钟,之后洗涤。在存在和不存在DELFIA诱导剂(200μL/孔)的情形下,在时间分辨荧光计上测量铕信号。观察到通过添加诱导剂改善了测定表现。
实施例10.连接子X长度的估算
根据本技术的生物素酰胺酶底物的连接子长度的估算,对于化合物5以如下所示进行:
因此,连接子X的长度是键1-8长度的总和,即约
Claims (15)
1.式(I)的生物素酰胺酶底物在制备药剂中的用途,所述药剂用于测量样品中生物素酰胺酶活性的测定,所述测定通过使所述样品与式(I)的生物素酰胺酶底物接触进行:
其中X为连接子,并且其中所述连接子的长度为约至约
其中所述标记为镧系元素(III)螯合物。
2.根据权利要求1的用途,其中所述连接子的长度为约至约
3.根据权利要求1或2的用途,其中所述连接子的长度为约至约
4.根据权利要求1的用途,其中所述连接子包含3-15个部分,其中每个部分独立地选自:亚苯基,含有1-15个碳原子的亚烷基,乙炔二基(-C≡C-),乙烯二基(-C=C-),醚(-O-),硫醚(-S-),酰胺(-CO-NH-,-CO-NR′-,-NH-CO-和-NR′-CO-),羰基(-CO-),硫代羰基(C=S),酯(-COO-和-OOC-),羧基(-COOH和-COO-),甲酰胺基(-CONH2),二硫基(-SS-),砜基(-SO2-),二氮基(-N=N-),仲胺和叔胺,其中R′代表含有少于5个碳原子的烷基,2-羟基-1,3,5-三嗪基,6-羟基-1,3,5-三嗪基,以及1H-1,2,3-三唑-4-基。
5.根据权利要求1的用途,其中所述镧系元素(III)螯合物包含配体,所述配体选自DTPA,EDTA,吡啶-2,6-二基-双(亚甲基次氮基)四(乙酸)和二亚乙基三胺四乙酸,以及选自铕,铽,镝和钐的镧系元素(III)离子。
6.根据权利要求1的用途,其中所述生物素酰胺酶底物选自:
其中所述镧系元素(III)离子选自铕,铽,钐和镝。
7.根据权利要求6的用途,其中所述生物素酰胺酶底物具有下式:
8.根据权利要求1的用途,其中所述镧系元素(III)螯合物是发光的。
9.根据权利要求8的用途,其中所述发光的镧系元素(III)螯合物包含氮杂环烷骨架。
10.根据权利要求1或9的用途,其中所述镧系元素(III)螯合物具有下列结构:
并且其中氢原子之一被根据权利要求4的连接子L所取代。
11.式(I)的生物素酰胺酶底物:
其中X为包含3-15个部分的连接子,其中每个部分独立地选自:亚苯基,含有1-15个碳原子的亚烷基,乙炔二基(-C≡C-),乙烯二基(-C=C-),醚(-O-),硫醚(-S-),酰胺(-CO-NH-,-CO-NR′-,-NH-CO-和-NR′-CO-),羰基(-CO-),硫代羰基(C=S),酯(-COO-和-OOC-),羧基(-COOH和-COO-),甲酰胺基(-CONH2),二硫基(-SS-),砜基(-SO2-),二氮基(-N=N-),仲胺和叔胺,其中R′代表含有少于5个碳原子的烷基,2-羟基-1,3,5-三嗪基,6-羟基-1,3,5-三嗪基,以及1H-1,2,3-三唑-4-基,条件是所述连接子的长度为约至约且所述标记为发光的镧系元素(III)螯合物或不发光的镧系元素(III)螯合物,所述螯合物包含选自DTPA,EDTA,吡啶-2,6-二基-双(亚甲基次氮基)四(乙酸)和二亚乙基三胺四乙酸的配体,其中所述镧系元素选自铕,铽,镝和钐。
12.用于测定生物素酰胺酶活性的试剂盒,其包括:微量滴定板和根据权利要求11的生物素酰胺酶底物。
13.根据权利要求12的试剂盒,其中所述板用抗一链霉亲和素包被。
14.根据权利要求12的试剂盒,其中所述板用链霉亲和素包被。
15.根据权利要求12-14的试剂盒,进一步包括:选自测定缓冲液、洗涤缓冲液、增效缓冲液、校正剂和对照样品的一种或多种组分。
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