CN117964548A

CN117964548A - 一种用于筛选单胺氧化酶b抑制剂的荧光探针的制备方法及应用

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Publication number: CN117964548A
Application number: CN202311806288.7A
Authority: CN
Inventors: 王小明; 唐志新; 王旭妹; 吴可; 蒋海强
Original assignee: Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2023-12-26
Filing date: 2023-12-26
Publication date: 2024-05-03

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于筛选单胺氧化酶B抑制剂的荧光探针的制备方法及应用。本发明所述荧光探针的制备方法简单便捷，合成成本低；采用该方法制备出的荧光探针具有较好的特异性和高灵敏度的特点；该探针荧光发射波长大，可以有效规避中药化学成分中的荧光干扰，提高检测的灵敏度；在中药中单胺氧化酶B抑制剂的筛选方面具有良好的应用前景。

Description

一种用于筛选单胺氧化酶B抑制剂的荧光探针的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于筛选单胺氧化酶B抑制剂的荧光探针的制备方法及应用。

背景技术

单胺氧化酶(Monoamine Oxidase，MAO，EC1.4.3.4)是一种膜结合线粒体酶，它主要存在于脊椎动物几乎所有的生物组织中，在神经递质代谢中起着重要的作用，单胺氧化酶有两种亚型MAO-A和MAO-B，其中MAO-B是一种降解单胺类神经递质的重要酶类，主要作用于苯乙胺，多巴胺和苄胺等单胺类。MAO-B功能障碍可引起帕金森病(PD)等多种神经和精神疾病。因此寻找有效的MAO-B的检测方法对于深入理解单胺氧化酶在生物系统中的功能及单胺氧化酶相关疾病的临床诊断和治疗都具有重要意义。

目前，针对单胺氧化酶B的检测方法在国内外已有许多报道，包括分光光度法、紫外法、酶联免疫分析法以及放射性标记法等。这些方法大多存在灵敏度不高、选择性低的问题，其中酶联免疫分析法虽然检测速度快、灵敏度高，但操作步骤较为繁琐、特异性较低；而放射性标记法操作时还存在着一定的危险性。

荧光探针是一种生物信号分子传感器，其与待测物质特异性结合后，选择性的将化学信号转化为光学信号，从而通过分析荧光强度的变化而达到检测目的。该方法与上述方法比较，具有操作简单方便，合成成本低，选择性高，特异性强，生物相容性好等优点，广泛应用于医学，环境科学，生命科学等方面。近些年来，大量的用于单胺氧化酶检测的荧光探针被开发。然而，许多荧光探针存在着水溶性差，灵敏度低，发射波长短等原因。因此，开发一种简单有效的用于筛选单胺氧化酶B抑制剂的荧光探针是十分有必要的。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种用于筛选单胺氧化酶B抑制剂的荧光探针的制备方法及应用，该探针合成方便，特异性好，灵敏度高而且具有合适的发射波长。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面在于提供一种用于筛选单胺氧化酶B抑制剂的荧光探针，所述荧光探针的结构式为：

本发明第二方面在于提供一种如上所述的用于筛选单胺氧化酶B抑制剂的荧光探针的制备方法，具体步骤如下：

(1)将异佛尔酮溶于乙醇中，依次加入丙二腈和催化剂，在氮气保护下回流，冷却至室温，静置一夜，过滤，干燥，得化合物1；

(2)将化合物1、对羟基苯甲醛、哌啶溶于乙醇中，在氮气保护下回流，反应结束后，进行硅胶柱色谱纯化，得化合物2；

(3)将4-溴吡啶溶于二氯甲烷中，再滴加碘甲烷，室温下搅拌，洗涤，得化合物3；

(4)将化合物2、乙醇钠溶于二氯甲烷中，搅拌后逐滴加入化合物3，室温下搅拌，反应结束后，进行硅胶柱色谱纯化，得荧光探针粗品；

(5)将荧光探针粗品溶于二氯甲烷中，再加入硼氢化钠，室温下搅拌，反应结束后，进行硅胶柱色谱纯化，干燥得荧光探针。

优选地，所述步骤(1)中，所述催化剂为吡啶和冰醋酸的混合溶剂，以摩尔比计，吡啶：冰醋酸＝1：1；冰醋酸可催化反应效率，加快反应速度。

优选地，所述步骤(2)中，以摩尔比计，化合物1：对羟基苯甲醛＝1：1。

优选地，所述步骤(3)中，以摩尔比计，4-溴吡啶：碘甲烷＝1：2。

优选地，所述步骤(4)中，以摩尔比计，化合物2：乙醇钠：化合物3＝5：6：6。

优选地，所述步骤(5)中，以体积比计，荧光探针粗品：硼氢化钠＝1：4。

优选地，所述步骤(2)、步骤(4)、步骤(5)中，均采用乙醇与二氯甲烷的混合溶剂为洗脱剂；其中，在步骤(2)、步骤(4)中，以体积比计，乙醇：二氯甲烷＝1：100；在步骤(5)中，以体积比计，乙醇：二氯甲烷＝1：50。

本发明第三方面在于提供如上所述的用于筛选单胺氧化酶B抑制剂的荧光探针在筛选单胺氧化酶B抑制剂中的应用。

优选地，本发明第三方面在于提供如上所述的用于筛选单胺氧化酶B抑制剂的荧光探针在筛选中药中单胺氧化酶B抑制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明有益效果如下：

(1)本发明的荧光探针具有较好的特异性，良好的化学稳定性和光稳定性，高灵敏度，荧光探针具有较好的细胞和组织穿透性，对细胞副作用较小；

(2)本发明荧光探针荧光发射光谱波长大，可以有效规避中药化学成分中的荧光干扰，提高检测的灵敏度，在中药有效物质筛选方面具有独特优势；

(3)本发明提供的荧光探针原料易得，操作过程简便，具有实际应用意义。

附图说明

图1为本发明荧光探针的化学结构图；

图2为本发明荧光探针的核磁氢谱图；

图3为本发明荧光探针的质谱图；

图4(A)(B)为本发明荧光探针与MAO-B作用的荧光发射图；

图4(C)为本发明荧光探针与MAO-B及其他活性物质作用的荧光柱状图，其中，1、谷胱甘肽；2、半胱氨酸；3、谷氨酸；4、钠离子；5、锰离子；6、铜离子；7、钾离子；8、铁离子；9、铝离子；10、丙氨酸；11、天冬氨酸；12、羟脯氨酸；13、蛋氨酸；14、苯丙氨酸；15、脯氨酸；16、苏氨酸；17、犬尿氨酸18、氯离子；19、溴离子；20、硝酸根离子；21、硫酸根离子；22、过氧亚硝酸；23、超氧根离子；24、次氯酸；25、过氧化氢；26、丁酰胆碱酯酶；27、乙酰胆碱酯酶；28、单胺氧化酶A；29、单胺氧化酶B；

图4(D)为不同pH值缓冲溶液中荧光探针对MAO-B的荧光响应图；

图5(A)为本发明荧光探针筛选中药肉苁蓉中不同单体的单胺氧化酶B抑制活性的荧光柱状图。M(图中从左至右第一个M)、模型组；Y、阳性药组(雷沙吉兰)；2’、2’-乙酰毛蕊花糖苷；A、管花苷A；B、管花苷B；F、管花苷F；S、松果菊苷；M(图中从左至右第二个M)、毛蕊花糖苷；T、红景天苷；Y、异毛蕊花糖苷；DE、Decaffeoyl acteosid；

图5(B)为松果菊苷单体对单胺氧化酶B的酶抑制率；

图6(A)为本发明不同浓度的荧光探针的细胞毒性；

图6(B)为细胞共聚焦成像图像。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1荧光探针的合成

(1)将异佛尔酮(6.22g，45mM)溶于90mL乙醇中，依次加入丙二腈(3.30g，50mM)，哌啶(0.4mL，4mM)和冰醋酸(0.24g，4mM)，混合物在氮气保护下回流6h，冷却至室温，静置一夜，过滤后用乙醇重结晶，得白色沉淀化合物1；

(2)将化合物1(188mg，1mM)，对羟基苯甲醛(122mg，1mM)，哌啶200μL溶于20mL乙醇中，在氮气保护下回流4h，反应结束后，过硅胶柱(乙醇：二氯甲烷＝1：100，V/V)，得橙红色固体化合物2；

(3)将4-溴吡啶(1.12g，7.09mM)溶于5mL二氯甲烷中，0℃搅拌下，加入碘甲烷(2.01g，14.18mM)，室温下搅拌24h，用石油醚洗涤，得棕色固体化合物3；

(4)将荧光团(145mg，0.5mM)，乙醇钠(40.83mg，0.6mM)溶于20mL二氯甲烷中，将混合物搅拌10min，逐滴加入化合物3(72.6mg，0.6mM)，并将混合物在室温下搅拌24h，过硅胶柱(乙醇：二氯甲烷＝1：100，V/V)，得荧光探针粗品；

(5)将荧光探针粗品(192mg，0.5mM)溶于10mL二氯甲烷中，再加入硼氢化钠(76mg，2mM)，室温下搅拌过夜，过硅胶柱(乙醇：二氯甲烷＝1：50，V/V)，干燥得荧光探针。

荧光探针的化学结构见图1，荧光探针的核磁氢谱图见图2，质谱图见图3。

实施例2荧光探针对单胺氧化酶B的光物理检测研究

(1)配制pH＝7.4、浓度为10mM的20％DMSO/PBS缓冲溶液，并用DMSO配置10mM的荧光探针溶液。取500μL 20％DMSO/PBS缓冲溶液，先加入最终浓度为10μM荧光探针的DMSO溶液，再加入不同梯度的MAO-B，混合溶液置于2mL EP管中；37℃振摇5h，反应之后的溶液加入到荧光比色皿中，在荧光光谱仪上检测，随着MAO-B含量的增加，荧光强度逐渐增强，见图4(A)(B)。

(2)配制pH＝7.4、浓度为10mM的20％DMSO/PBS缓冲溶液，并用DMSO配置10mM的荧光探针溶液，加入最终稀释浓度为10μM荧光探针的DMSO溶液，以及最终浓度为50μM各种分析物：GSH，Cys，Glu，Ala，Asp，Hyd，Met，Thr，Phe，Pro，Kyn，Na⁺，Mn²⁺，Fe²⁺，Cu²⁺，K⁺，Al³⁺和Cl^-，Br^-，NO^3-，SO₄ ^2-，ONOO^-，H₂O₂，HClO，O₂ ^-，AChE，BChE，MAO-A，MAO-B。分别置于EP管中，37℃振摇5h，反应之后的溶液加入到荧光比色皿中，在荧光光谱仪上检测，MAO-B使得560nm处荧光强度明显增加，MAO-A使得荧光强度略有增加，其他分析物基本没有引起荧光强度的变化，见图4(C)。

(3)在不同pH值的20％DMSO/PBS缓冲溶液，加入终浓度为10μM的荧光探针溶液与终浓度为50μg/mL的MAO-B，充分混匀之后，加入恒温混匀仪孵育5h。反应结束之后，进行荧光光谱扫描。荧光光谱仪激发波长λ_ex＝486nm，波长范围λ_em＝500-700nm，见图4(D)。

实施例3荧光探针筛选单胺氧化酶B抑制剂实验

(1)本实施例以中药肉苁蓉为例进行筛选单胺氧化酶B抑制剂的研究

精密称取肉苁蓉中各单体(2’-乙酰毛蕊花糖苷；管花苷A；管花苷B；管花苷F；松果菊苷；毛蕊花糖苷；红景天苷；异毛蕊花糖苷；Decaffeoyl acteosid)，用50％乙醇水溶解，分别配置成10mM的待测溶液。配制pH＝7.4、浓度为10mM的20％DMSO/PBS缓冲溶液，并用DMSO配置10mM的荧光探针溶液。

(A)EP管中加入荧光探针(终浓度为10μM，下同)，再加入490μL 20％DMSO/PBS缓冲溶液(pH＝7.4，浓度为10mM，下同)，作为空白对照，反应体系为0.5mL(下同)；

(B)EP管中加入荧光探针、MAO-B(终浓度为50μg/mL，下同)，再加入480μL 20％DMSO/PBS缓冲溶液做模型对照组；

(C)EP管中加入荧光探针，再加入雷沙吉兰缓冲溶液10μL(终浓度为100μM)，最后加入475μL 20％DMSO/PBS缓冲溶液，做阳性药对照组；

(D)分别取不同单体待测溶液10μL于EP管中，分别加入荧光探针、MAO-B，再加入475μL 20％DMSO/PBS缓冲溶液；

(E)将上述配制好的样品置于温度为37℃振摇5h，使用荧光分光光度计测定各溶液的荧光强度。

相比于其他单体，松果菊苷抑制活性最好。见图5(A)(已扣除空白)。

(2)在本实施例中还考察了松果菊苷抑制MAO-B活性的水平

反应体系溶液的总体积为500μL，加入终浓度为100μM，150μM，200μM，300μM，400μM,，500μM，600μM，700μM的松果菊苷溶液，加入终浓度为50μg/mL的MAO-B，充分混匀之后，37℃孵育30min，之后加入终浓度为10μM的荧光探针溶液，充分混匀之后，加入恒温混匀仪，孵育5h。反应结束之后，进行荧光光谱扫描λ_ex＝486nm，λ_em＝500-700nm。实验结果所示，随着松果菊苷浓度的不断升高，MAO-B的活性不断降低，其中IC50值为0.15mM。见图5(B)。

实施例4探针对细胞的毒性及细胞共聚焦成像

(1)CCK-8法检测荧光探针细胞毒性

细胞消化、离心、重悬后，进行细胞计数，调整细胞密度至1×10⁵个/mL，96孔板每孔接种100μL细胞悬液，37℃、5％CO₂培养箱内孵育过夜，次日观察细胞生长状态良好，分别加入不同浓度的荧光探针共孵育24h。结束后，配制10％CCK-8溶液，吸掉孔内原有干预培养基，每孔加入CCK-8溶液100μL。37℃孵育2h，用酶标仪检测其在450nm处的吸光度，计算细胞存活率。如图6(A)所示，在不同浓度下细胞存活率基本都超过了75％，证明该探针毒副性小。

(2)细胞共聚焦成像

将PC12细胞接种到共聚焦培养皿中，激光共聚焦显微镜选用激发波长λ_ex＝488nm，发射波长收集范围λ_em＝500-700nm。

(A)空白对照组：培养基中只含10μM荧光探针及其他化合物，细胞不做任何处理；

(B)模型组：PC12细胞用含500μM MPP⁺的培养基预孵育12h，用PBS洗涤三次，将含有10μM荧光探针的培养基加入到培养皿中，37℃培养4h，之后用PBS洗涤三次，加入无酚红培养基；如图6(B)所示，当造模成功以后，加入探针，共聚焦成像时会显示红色荧光，证明该探针水溶性好。

对比例1

本对比例与实施例1不同之处在于，在制备方法中第(3)步使用DMF代替二氯甲烷，其他条件不变。

实验结果表明，使用DMF作为制备方法中第(3)步的溶剂会生成黑色杂质，难以除去，不能得到最终产物。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.一种用于筛选单胺氧化酶B抑制剂的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式为：

2.权利要求1所述的用于筛选单胺氧化酶B抑制剂的荧光探针的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

3.根据权利要求2所述的用于筛选单胺氧化酶B抑制剂的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述催化剂为吡啶和冰醋酸的混合溶剂，以摩尔比计，吡啶：冰醋酸＝1：1。

4.根据权利要求2所述的用于筛选单胺氧化酶B抑制剂的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，以摩尔比计，化合物1：对羟基苯甲醛＝1：1。

5.根据权利要求2所述的用于筛选单胺氧化酶B抑制剂的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，以摩尔比计，4-溴吡啶：碘甲烷＝1：2。

6.根据权利要求2所述的用于筛选单胺氧化酶B抑制剂的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，以摩尔比计，化合物2：乙醇钠：化合物3＝5：6：6。

7.根据权利要求2所述的用于筛选单胺氧化酶B抑制剂的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，以体积比计，荧光探针粗品：硼氢化钠＝1：4。

8.根据权利要求2所述的用于筛选单胺氧化酶B抑制剂的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)、步骤(4)、步骤(5)中，均采用乙醇与二氯甲烷的混合溶剂为洗脱剂；其中，在步骤(2)、步骤(4)中，以体积比计，乙醇：二氯甲烷＝1：100；在步骤(5)中，以体积比计，乙醇：二氯甲烷＝1：50。

9.权利要求1所述的用于筛选单胺氧化酶B抑制剂的荧光探针在筛选单胺氧化酶B抑制剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的用于筛选单胺氧化酶B抑制剂的荧光探针在筛选中药中单胺氧化酶B抑制剂中的应用。