CN102367275B - 植物抗性相关蛋白mag及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物抗性相关蛋白MAG其编码基因和应用。本发明提供的蛋白，命名为MAG蛋白，来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)，是如下任意一种：(a)序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有如下任一功能的由序列1衍生的蛋白质：诱导ICS1基因启动子启动功能、诱导PR1基因启动子启动功能、与植物中的水杨酸合成相关、与植物抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明提供的MAG蛋白可以通过调控植物中水杨酸的合成，增强植物的抗病性。本发明对于培育抗病植物均有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物抗性相关蛋白MAG及其编码基因和应用。
背景技术
植物在栽培生产过程中常发生各种病害，一些病害对植物生长构成极大威胁，严重损害农作物其产量和质量。对于植物病害，目前主要采用药物措施防治。最近人们开始应用非生物诱导剂诱导植物抗病性，并已广泛应用于烟草、马铃薯、番茄、黄瓜、菜豆、水稻等多种重要农作物。这种措施的效果虽然理想，但成本较高，并污染环境。因此，迫切需要开发新的生物学手段以提高植物自身的抗病性。
系统获得性抗性是植物的一种防御反应，当植物遭受病原体和害虫攻击时，这种反应会被诱导，并且能够迅速扩散到植株的其它部位以保护植物。
病程相关蛋白PR是一类逆境蛋白，被认为在植物的抗病中起重要作用，其中编码PR1蛋白的基因常被用作植物抗病反应和系统获得抗性中的指示基因，PR1基因的表达在植物抗病反应中起重要作用。PR1基因在正常生长条件下，本底表达量很低，也就是说PR1基因启动子在正常生长条件下基本不发挥启动功能，受逆境诱导(遭受病害侵袭时启动基因的表达。
水杨酸是广泛存在于植物体内的酚类物质，被认为是诱发系统获得性抗性的信号，可以诱导对病毒、细菌、真菌等多种病原体的抗性。研究表明，外施水杨酸后，PR1基因的转录被显著激活。研究还发现，当植物某部位遭受病原体攻击之后，植物体内水杨酸含量会增加，而且水杨酸的增加出现在PR1基因表达之前。植物中水杨酸的合成在很大程度上是通过异分支酸合成酶(ICS，isochorismate synthase)ICS1作用于底物异分支酸(isochorismate)从而合成水杨酸。ICS1基因在正常生长条件下，本底表达量很低，也就是说ICS1基因启动子在正常生长条件下基本不发挥启动功能，受逆境诱导(病原菌侵染和紫外线照射)启动基因的表达。到目前为止，仅仅发现ETHYLENEINSENSITIVE3(EIN3)和EIN3-LIKE1能够与SA生物合成关键基因ICS1启动子直接结合，并且负调节SA的合成水平，尚未发现能通过正向诱导ICS1启动子启动ICS1基因表达，从而增加水杨酸合成水平的蛋白。另外研究发现SAR Deficient 1(SARD1)和CBP60g蛋白是诱导ICS1基因表达和SA合成的重要因子，但未能发现更多地通过正向诱导ICS1启动子启动ICS1基因表达，从而增加水杨酸合成水平的蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物抗性相关蛋白MAG及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白，命名为MAG蛋白，来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)，是如下(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的任意一种：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有诱导ICS1基因启动子启动功能的由序列1衍生的蛋白质；
(c)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有诱导PR1基因启动子启动功能的由序列1衍生的蛋白质；
(d)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物中的水杨酸合成相关的由序列1衍生的蛋白质；
(e)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述(b)、(c)、(d)或(e)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)、(c)、(d)或(e)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述蛋白的基因(MAG基因)也属于本发明的保护范围。
所述基因可为如下1)至10)中任一所述的DNA分子：
1)序列表的序列2自5’末端第53至814位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表的序列2所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有诱导ICS1基因启动子启动功能的蛋白的DNA分子；
4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有诱导ICS1基因启动子启动功能的蛋白的DNA分子；
5)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有诱导PR1基因启动子启动功能的蛋白的DNA分子；
6)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有诱导PR1基因启动子启动功能的蛋白的DNA分子；
7)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物水杨酸合成相关蛋白的DNA分子；
8)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物水杨酸合成相关蛋白的DNA分子；
9)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子；
10)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子。
“严格杂交条件”通常指盐浓度低于约1.5M，通常为约0.01-1.0M，pH在约7.0-8.3之间，温度在约30-60摄氏度之间。也可以通过添加去稳定剂，例如甲酰胺，来实现严格杂交条件。上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
所述ICS1基因启动子的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
所述PR1基因启动子的核苷酸序列如序列表的序列4所示。
含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。
所述重组表达载体具体可为在326-FLAG表达载体的多克隆位点插入序列表的序列2所示DNA片段得到的重组质粒；所述326-FLAG表达载体为在pUC19载体的多克隆位点(如PstI和EcoRI酶切位点之间)插入序列表的序列6所示DNA得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为：在所述326-FLAG表达载体的XbaI和BamHI酶切位点之间插入序列表的序列2所示的MAG基因得到的重组质粒。
扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明还保护所述蛋白或所述基因在诱导ICS1基因启动子的启动功能中的应用；所述ICS1基因启动子的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述应用具体可为在拟南芥中诱导重组质粒326-ProAtICS1::GFP中的所述ICS1基因启动子启动GFP基因的表达；所述重组质粒326-ProAtICS1::GFP为将326-GFP表达载体PstI和BamHI酶切位点间的小片段(35S组成型启动子)取代为了序列表的序列3所示的ICS1基因启动子(ProAtICS1)得到的重组质粒；所述326-GFP表达载体为在pUC19载体的PstI和EcoRI酶切位点之间插入序列表的序列7所示DNA得到的重组质粒。所述GFP基因如序列表的序列7自5’末端第862-1578位核苷酸所示。
本发明还保护所述蛋白或所述基因在诱导PR1基因启动子的启动功能中的应用；所述PR1基因启动子的核苷酸序列如序列表的序列4所示。所述应用具体可为在拟南芥中诱导重组质粒326-ProAtPR1::GFP中的所述PR1基因启动子启动GFP基因的表达；所述重组质粒326-ProAtPR1::GFP为将326-GFP表达载体PstI和XhoI酶切位点间的小片段(35S组成型启动子)取代为了序列表的序列4所示的PR1基因启动子(ProAtPR1)得到的重组质粒；所述326-GFP表达载体为在pUC19载体的PstI和EcoRI酶切位点之间插入序列表的序列7所示DNA得到的重组质粒。所述GFP基因如序列表的序列7自5’末端第862-1578位核苷酸所示。
本发明还保护所述蛋白或所述基因在培育抗性植物中的应用。所述抗性体现为水杨酸合成能力增加和/或抗病害能力增加。所述植物为双子叶植物或单子叶植物，如拟南芥。所述病害的致病菌可为丁香假单胞杆菌番茄致病变种(细菌)和/或芸苔霜霉菌(真菌)，该两种微生物均危害叶片。所述病害的致病菌还可为根际萎凋病菌。
所述拟南芥具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。
在本发明的一个实施例中，将MAG基因融合到含有FLAG报告基因的转化表达载体中，通过与连接有ICS1基因启动子的GFP报告基因的转化表达载体共同瞬时转化植物原生质体，根据荧光显微镜观察植物原生质体是否产生绿色荧光，并提取原生质体总蛋白，分别用GFP和FLAG的抗体进行Western Blotting试验。结果表明，MAG基因可以诱导ICS1基因启动子的启动功能，从而促使GFP报告基因表达。
在本发明的另一个实施例中，将MAG基因融合到含有FLAG报告基因的转化表达载体中，通过与连接有PR1基因启动子的GFP报告基因的转化表达载体共同瞬时转化植物原生质体，根据荧光显微镜观察植物原生质体是否产生绿色荧光，并提取原生质体总蛋白，分别用GFP和FLAG的抗体进行Western Blotting试验。结果表明，MAG基因可以诱导PR1基因启动子的启动功能，从而促使GFP报告基因表达。
本发明提供的MAG蛋白可以通过调控植物中水杨酸的合成，增强植物的抗病性。本发明对于培育抗病植物均有重大价值。
附图说明
图1为PCR扩增获得MAG基因的电泳图。
图2为重组质粒326-MAG-FLAG的结构示意图。
图3为PCR扩增获得ICS1基因启动子的电泳图。
图4为重组质粒326-ProAtICS1::GFP的结构示意图。
图5为PCR扩增获得PR1基因启动子的电泳图。
图6为重组质粒326-ProAtPR1::GFP的结构示意图。
图7为重组质粒326-MAG-FLAG和重组质粒326-ProAtICS1::GFP共同转化原生质体后，GFP荧光蛋白的显微镜观测结果。
图8为重组质粒326-MAG-FLAG和重组质粒326-ProAtICS1::GFP共同转化原生质体后，GFP荧光蛋白的Western Blotting结果(内参蛋白为Rubisco大亚基)。
图9为重组质粒326-MAG-FLAG和重组质粒326-ProAtICS1::GFP共同转化原生质体后，FLAG蛋白的Western Blotting结果(内参蛋白为Rubisco大亚基)。
图10为重组质粒326-MAG-FLAG和重组质粒326-ProAtPR1::GFP共同转化原生质体后，GFP荧光蛋白的显微镜观测结果。
图11为重组质粒326-MAG-FLAG和重组质粒326-ProAtPR1::GFP共同转化原生质体后，GFP荧光蛋白的Western Blotting结果(内参蛋白为Rubisco大亚基)。
图12为重组质粒326-MAG-FLAG和重组质粒326-ProAtPR1::GFP共同转化原生质体后，FLAG蛋白的Western Blotting结果(内参蛋白为Rubisco大亚基)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：ALaboratory Manual》(Sambrook J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中所用引物的合成及DNA序列的测定，均由北京英骏生物有限公司进行。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
哥伦比亚生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana)，又称拟南芥或拟南芥Col-0：参考文献：Jin JB，Kim YA，Kim SJ，Lee SH，Kim DH，Cheong GW，Hwang I.2001.Anewdynamin-like protein，ADL6，is involved in traffickingfrom the trans-Golginetwork to the central vacuole in Arabidopsis.Plant Cell 13：1511-1526.；公众可以从美国拟南芥生物资源中心(ABRC)购买得到。
pUC19载体：购自NEB公司，商品目录号为N3041S。
326-FLAG表达载体：在pUC19载体的PstI和EcoRI酶切位点之间插入序列表的序列6所示DNA得到的重组质粒；序列表的序列6所示DNA中，自5’末端第1至835位核苷酸为35S组成型启动子，第862-933位核苷酸为3×FLAG基因，第934-1192位核苷酸为Nos终止子。
326-GFP表达载体：在pUC19载体的PstI和EcoRI酶切位点之间插入序列表的序列7所示DNA得到的重组质粒；序列表的序列7所示DNA中，自5’末端第1至835位核苷酸为35S组成型启动子，第862-1578位核苷酸为GFP基因，第1579-1837位核苷酸为Nos终止子。
实施例中所用的Anti-GFP抗体为Clontech公司的GFP Living Colors A.V.Monoclonal Antibody(货号632381)。
实施例中所以那个的Anti-FLAG抗体为Sigma公司的Anti-FLAG M2 MonoclonalAntibody(货号F3165)。
实施例1、MAG蛋白及其编码基因的获得
1、根据现有的NCBI数据库及文献，设置一对引物如下：
F1(正向引物)：5’-TCTAGAGTCAACGTCGCATACTTTTGAA-3’(下划线标注XbaI酶切识别序列)；
R1(反向引物)：5’-GGATCCCGAGAGGTTTAAGAGTGTTCTTA-3’(下划线标注BamHI酶切识别序列)。
2、提取哥伦比亚生态型拟南芥叶片的基因组DNA。
3、以基因组DNA为模板，采用步骤1设计的引物对，用TaKaRa公司PrimeSTAR HS高保真酶进行PCR扩增。
4、将PCR扩增产物进行测序，如序列表的序列2所示。
将序列表的序列1所示的蛋白命名为MAG蛋白。将MAG蛋白的编码基因命名为MAG基因，其基因组DNA如序列表的序列2所示(自5’末端第53至55位核苷酸为起始密码子)。
实施例2、各个基因的克隆及其重组表达载体的构建
一、MAG基因的获得和重组质粒326-MAG-FLAG的构建
1、提取哥伦比亚生态型拟南芥叶片的基因组DNA。
2、以步骤1的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对，在TaKaRa公司PrimeSTAR HS高保真酶的作用下进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1(M代表核苷酸的marker，为TaKaRa公司的DL2000)。
3、用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切326-FLAG表达载体，回收约3827bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒326-MAG-FLAG(结构示意图见图2)。根据测序结果，对重组质粒326-MAG-FLAG进行结果描述如下：在326-FLAG表达载体的XbaI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的MAG基因。
二、ICS1基因启动子(ProAtICS1)的获得和重组质粒326-ProAtICS1::GFP的构建
1、检索NCBI数据库及文献，获得异分支酸合成酶基因的序列(登录号：AT1G74710)，根据序列设计一对靶向启动子的引物如下：
F2(正向引物)：5’-AACTGCAGTTATCCACGCTTTGTCACACA-3’(下划线标注PstI酶切识别序列)；
R2(反向引物)：5’-CGGGATCCCCATTGCAGAAATTCGTAAAGT-3’(下划线标注BamHI酶切识别序列)。
2、提取哥伦比亚生态型拟南芥叶片的基因组DNA。
3、以步骤2的基因组DNA为模板，用F2和R2组成的引物对，在TaKaRa公司PrimeSTAR HS高保真酶的作用下进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图3(M代表核苷酸的marker，为TaKaRa公司的DL2000)。
4、用限制性内切酶PstI和BamHI双酶切步骤3的PCR扩增产物，回收酶切产物。
5、用限制性内切酶PstI和BamHI双酶切326-GFP表达载体，回收约3635bp的载体骨架(去除了326-GFP表达载体中的35S组成型启动子)。
6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒326-ProAtICS1::GFP(结构示意图见图4)。根据测序结果，对重组质粒326-ProAtICS1::GFP进行结构描述如下：将326-GFP表达载体PstI和BamHI酶切位点间的小片段(35S组成型启动子)取代为了序列表的序列3所示的ICS1基因启动子(ProAtICS1)。
三、PR1基因启动子(ProAtPR1)的获得和重组质粒326-ProAtPR1::GFP的构建
1、检索NCBI数据库及文献，获得AtPR1的序列(登录号：AT2G14610)，根据序列设计一对靶向启动子的引物如下：
F3(正向引物)：5’-AACTGCAGTGGCAAATAAACAACGGACA-3’(下划线标注PstI酶切识别序列)；
R3(反向引物)：5’-CCGCTCGAGTAAAATTCATTTTTCTAAGTTGA-3’(下划线标注XhoI酶切识别序列)。
2、提取哥伦比亚生态型拟南芥叶片的基因组DNA。
3、以步骤2的基因组DNA为模板，用F3和R3组成的引物对，在TaKaRa公司PrimeSTAR HS高保真酶的作用下进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图5(M代表核苷酸的marker，为TaKaRa公司的DL2000)。
4、用限制性内切酶PstI和XhoI双酶切步骤3的PCR扩增产物，回收酶切产物。
5、用限制性内切酶PstI和XhoI双酶切326-GFP表达载体，回收约3641bp的载体骨架。
6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒326-ProAtPR1::GFP(结构示意图见图6)。根据测序结果，对重组质粒326-ProAtPR1::GFP进行结构描述如下：将326-GFP表达载体PstI和XhoI酶切位点间的小片段(35S组成型启动子)取代为了序列表的序列4所示的PR1基因启动子(ProAtPR1)。
四、重组质粒326-T7-FLC的构建
合成序列表的序列的序列5所示的T7-FLC基因(自5’末端第1至33位核苷酸为T7标签、第34至660位核苷酸为FLC基因)，插入326-FLAG表达载体的SpeI和BamHI酶切位点之间，得到重组质粒326-T7-FLC。FLC基因是一个已知不与ProAtICS1和ProAtPR1作用的基因。
实施例3、MAG基因在诱导ICS1基因启动子(ProAtICS1)启动基因表达中的应用
一、重组质粒在拟南芥叶片原生质体中的瞬时表达
将实施例2构建的重组质粒326-MAG-FLAG和重组质粒326-ProAtICS1::GFP共同转化拟南芥原生质体(将重组质粒326-T7-FLC作为重组质粒326-MAG-FLAG的一个负对照；将326-FLAG表达载体作为重组质粒326-MAG-FLAG的另一个负对照)，具体步骤如下：
1、在MS培养基上萌发哥伦比亚生态型拟南芥种子，待根长至1-3厘米时移栽到土里，23℃温室培养(每天光照12h，光照强度为150μE)。
2、在90mm培养皿中加入20ml双蒸水，再加入1.82g D-甘露醇并使其溶解。
3、取步骤1中培养4周未抽薹的叶片(约90片)，切成1mm宽的长条，置于步骤2的甘露醇溶液中0.5小时。
4、在100ml三角瓶配置15ml酶解体系：Cellulase R-10(购自YAKULT HONSHA)150mg、Marcerozyme R-10(购自YAKULT HONSHA)37.5mg、MES(购自USB)30mg、BSA(购自AMRESCO)15mg、Mannitol(购自Sigma，货号M1902，为1M Mannitol母液)7.5ml、CaCl2(购自Sigma，货号C-2536，为200mM母液)0.075ml，其余为水，用1M KOH调pH为5.6。
5、将步骤3的将细条捞出，置于步骤4的酶解体系中，在黑暗条件下酶解3小时(23℃、40-50rpm)。
6、将进行完步骤5的酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物置于15ml离心管(直径约1cm)中，均分为两管。
7、将步骤6的离心管离心(4℃、60g)15分钟收集沉淀，每管加入4ml冰冷的W5溶液轻柔洗涤，然后离心(4℃、100g)1分钟收集沉淀，每管加入4ml冰冷的W5溶液轻柔洗涤；冰上放置30分钟，然后离心(23℃、100g)1分钟收集沉淀，每管沉淀用0.5ml MaMg溶液重悬，即为原生质体溶液。
W5溶液：NaCl(购自Junsei)9g、CaCl2(购自Sigma，货号C-2661)13.88g、MES(购自USB)0.292mg、KCl(购自AMRESCO)0.372mg、Glucose(购自AMRESCO)0.902g，用水定容至1L，用1M KOH调pH为5.6。
MaMg溶液：Mannitol(购自Sigma，货号M1902)7.288g、MgCl2(购自AMRESCO，货号0288-500G)0.305g、MES(购自USB)100mg，用水定容至100ml，用1M KOH调pH为5.6。
8、将重组质粒326-MAG-FLAG(或重组质粒326-T7-FLC或326-FLAG表达载体)和重组质粒326-ProAtICS1::GFP各取15ug于10ml管中，加300ul原生质体溶液，用200ul枪头(剪去前端)轻柔混匀；然后加入310ul PEG4000/Ca(NO3)2溶液，轻柔混匀；放置30分钟(20-30分钟均可)，然后加入1ml W5溶液来回颠倒混匀，然后离心(23℃、100g)1分钟收集沉淀；加入100ul W5溶液混匀，然后再加900ul W5溶液混匀。设置只转染326-GFP表达载体的正对照。
PEG4000/Ca(NO3)2溶液：PEG4000 4g、Mannitol(购自Sigma，货号M1902，为1MMannitol母液)4ml、Ca(NO3)2 1mg、dH2O 1.8ml，用水定容至10ml。
9、将步骤8得到的混合液置于六孔板内，23℃孵育12小时。
二、荧光显微镜观察
吸取30ul步骤一的9中孵育完成的混合液，置于载玻片上，轻轻盖上盖玻片后，放于ZEISS AXIOSKOP荧光显微镜下进行观察和拍照。
结果见图7。在荧光观测下：共同转化重组质粒326-ProAtICS1::GFP和重组质粒326-MAG-FLAG的原生质体中，出现了与转化326-GFP载体的正对照相同的绿色荧光；共同转化重组质粒326-ProAtICS1::GFP和重组质粒326-T7-FLC(或326-FLAG表达载体)的原生质体并不能观察到明显的绿色荧光。结果表明，MAG蛋白可以与ICS1启动子区作用，促使其后续GFP基因表达，MAG基因在正调控水杨酸合成关键酶ICS1的启动子上，起到了促进的作用。
三、Western Blotting检测
吸取30ul步骤一的9中孵育完成的混合液，进行SDS-PAGE电泳(分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为4％、长度为1cm；电流采用20mA)，然后采用Anti-GFP抗体(或Anti-FLAG抗体)和羊抗鼠的辣根过氧化物酶HRP抗体进行Western Blotting。
采用Anti-GFP抗体杂交的结果见图8。在共同转化了重组质粒326-ProAtICS1::GFP和重组质粒326-MAG-FLAG的原生质体中，出现了与转化326-GFP载体的正对照相同的条带，可以确定为GFP条带。共同转化重组质粒326-ProAtICS1::GFP和重组质粒326-T7-FLC(或326-FLAG表达载体)，基本没有GFP蛋白信号。
采用Anti-FLAG抗体杂交的结果见图9。在共同转化了重组质粒326-ProAtICS1::GFP和重组质粒326-MAG-FLAG的原生质体中，MAG基因确实得到了表达，这就进一步从蛋白水平说明了MAG基因所表达的蛋白可以与ICS1的启动子区作用，并且促使其后续GFP基因的表达。因此可以判断，MAG基因在正调控水杨酸合成关键酶基因ICS1的启动子上，起到了促进的作用。
实施例4、MAG基因在诱导PR1基因启动子(ProAtPR1)启动基因表达中的应用
一、重组质粒在拟南芥叶片原生质体中的瞬时表达
用重组质粒326-ProAtPR1::GFP代替重组质粒326-ProAtICS1::GFP，其它同实施例3的步骤一。
二、荧光显微镜观察
同实施例3的步骤二。
结果见图10。在荧光观测下，在共同转化了重组质粒326-ProAtPR1::GFP和重组质粒326-MAG-FLAG的原生质体中，出现了与转化326-GFP载体的正对照相同的绿色荧光；共同转化重组质粒326-ProAtPR1::GFP和重组质粒326-T7-FLC(或326-FLAG表达载体)的原生质体并不能观察到明显的绿色荧光。结果表明，MAG蛋白促进了抗病基因PR1启动子起始转录，并且促使其后续GFP基因的表达。MAG基因可能是通过调控植物水杨酸的合成促进了抗病基因PR1启动子的起始转录。
三、Western Blotting检测
同实施例3的步骤三。
采用Anti-GFP抗体杂交的结果见图11。在共同转化了重组质粒326-ProAtPR1::GFP和重组质粒326-MAG-FLAG的原生质体中，出现了与转化326-GFP的正对照相同条带，可以确定为GFP条带。共同转化重组质粒326-ProAtPR1::GFP和重组质粒326-T7-FLC(或326-FLAG表达载体)的原生质体中，并没有GFP蛋白信号。
采用Anti-FLAG抗体杂交的结果见图12。在共同转化重组质粒326-ProAtPR1::GFP和重组质粒326-MAG-FLAG的原生质体中，MAG基因确实得到了表达，这也进一步说明了MAG蛋白诱导了抗病基因PR1启动子起始转录，促使了后续GFP基因的表达。MAG基因可能通过调控植物水杨酸的合成促进了抗病基因PR1启动子的表达。
Claims (4)
1.序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质在诱导ICS1基因启动子的启动功能中的应用；所述ICS1基因启动子的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
2.序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质在诱导PR1基因启动子的启动功能中的应用；所述PR1基因启动子的核苷酸序列如序列表的序列4所示。
3.序列表的序列2自5’末端第53至814位核苷酸所示的DNA分子或序列表的序列2所示的DNA分子在诱导ICS1基因启动子的启动功能中的应用；所述ICS1基因启动子的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
4.序列表的序列2自5’末端第53至814位核苷酸所示的DNA分子或序列表的序列2所示的DNA分子在诱导PR1基因启动子的启动功能中的应用；所述PR1基因启动子的核苷酸序列如序列表的序列4所示。
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| Cindy Fragnière et al.Salicylic acid and its location in response to biotic and abiotic stress.《FEBS Letters》.2011,第585卷1847－1852. |
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| NM_112038;NCBI;《GenBank》;20110528 * |
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