CN102363807A

CN102363807A - 低甲基化基因poteh的应用方法

Info

Publication number: CN102363807A
Application number: CN2011103459400A
Authority: CN
Inventors: 武明花; 刘晓萍; 李桂源; 唐海林; 王泽友; 余志斌; 卞艳慧
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2011-11-04
Filing date: 2011-11-04
Publication date: 2012-02-29

Abstract

本发明涉及低甲基化基因POTEH的应用，即用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂。特别是用于制备亚硫酸氢盐直接测序法预测脑胶质瘤预后的制剂。通过研究证实POTEH在胶质瘤组织中因启动子发生低甲基化而高表达，将检测POTEH基因低甲基化应用于胶质瘤预后预测，为预测胶质瘤病人的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和推广性。

Description

低甲基化基因POTEH的应用方法

技术领域

本发明涉及低甲基化基因POTEH在制备脑胶质瘤病人预后预测试剂中的应用。

背景技术

目前的研究将表观遗传学定义为DNA序列不发生改变的可遗传性的基因表达变化。表观遗传调控机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰及microRNAs。至今，大量的研究发现表观遗传机制在多种肿瘤(包括胶质瘤)的发生发展中发挥着重要作用。现有的研究显示，全基因组低甲基化在胶质瘤母细胞瘤中发生率约为80％，而且单拷贝基因与重复序列在胶质瘤中也能发生低甲基化。

胶质瘤是人类最常见且恶性程度非常高的中枢神经肿瘤，随着医疗水平的不断提高，许多肿瘤病人的5年或10生存率明显提高，但是胶质瘤病人的预后仍未得到明显改善，其5年生存率低于25％，而胶质瘤母细胞瘤的病人总生存时间平均为12.3个月。目前，对脑胶质瘤的预后判定没有参考标准，也没有特异性的指标，远远不能适应对人脑胶质瘤进行预后判定的需求。因此，对人脑胶质瘤进行预后判定，以便选择最佳治疗方案，显著提高患者生存率，成为科学研究亟待解决的重要课题。

POTEH基因(POTE ankyrin domain family，member H)定位于染色体22q11.1，GeneBank登录号：NM_001136213，又称A26C3(ANKRD26-like family C member 3)，是POTE家族成员，包含7个ANK重复序列。多项研究表明，POTE家族表达仅限于少数组织，如前列腺、睾丸、卵巢及胎盘等。但是该家族成员在乳腺癌、前列腺癌及多种恶性肿瘤中高表达。申请人用免疫组织化学法检测POTEH蛋白在正常脑组织及脑胶质瘤组织中的表达，结果显示POTEH在胶质瘤中表达增加(p＜0.05，图1)，高级别胶质瘤组织(III级、IV级)中POTEH的表达较低级别(I级、II级)增加，差异有统计学意义(p＝0.008)。亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)证实，POTEH在胶质瘤中发生低甲基化(p＜0.001)。然后用SPSS 13.0软件对POTEH蛋白表达与POTEH基因低甲基化进行相关性分析，结果表明两者间存在相关性(p＜0.05)，说明表观遗传学可能参与了POTEH基因的表达调控。

利用亚硫酸氢盐测序PCR法(BSP)分析所获得的肿瘤特异性甲基化状态，是甲基化分析的金标准，它能明确所测区域每一个CG位点的甲基化状态。

发明内容

本发明的目的是提供一种低甲基化基因POTEH的应用方法，对于脑胶质瘤的预后预测具有重要意义。

低甲基化基因POTEH用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂；特别是用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查的试剂盒。

如：用于制备亚硫酸氢盐直接测序法预测脑胶质瘤的制剂；所述的制剂中包括：根据POTEH基因启动子区CpG岛设计的，采用亚硫酸氢盐直接测序法的引物序列为：

F：5′TGATATTTGTGGTTTTAAGATTTATGTAG 3′，

R：5′ATTACAAACCAACCAAACCATTAC 3′。

一种用于人脑胶质瘤预后预测的POTEH基因启动子区甲基化检测试剂盒，包括以下引物：

F：5′TGATATTTGTGGTTTTAAGATTTATGTAG 3′，

R：5′ATTACAAACCAACCAAACCATTAC 3′。

申请人发现POTEH基因在脑胶质瘤组织中表达上调(图1)。POTEH转录起始位点上游-854bp至-353bp为一典型的CpG岛(图2)，该CpG岛中CG位点在正常的脑组织中均处于高甲基化状态，而在POTEH表达上调的脑胶质瘤组织中其甲基化程度降低(部分结果见图3)。POTEH低甲基化的胶质瘤病人总生存率明显低于高甲基化的病人(图4)，提示POTEH基因是胶质瘤中的低甲基化基因，是预测胶质瘤预后的分子标志。本发明为脑胶质瘤预后预测提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。

附图说明

图1 POTEH蛋白在正常脑组织及不同病理分级胶质瘤中的表达；

A：正常脑组织；B：胶质瘤WHO I级；C：胶质瘤WHO II级；D：胶质瘤WHO III级；E：胶质瘤WHO IV级；

图2 POTEH基因启动子的活性区域-854bp至-353bp为一典型的CpG岛；

浅蓝色区域为CpG岛，横坐标下红色竖线表示CG位点；

图3 BSP检测正常脑组织和胶质瘤组织中POTEH基因启动子区甲基化状态；

图中所示为部分结果，N2：第2例正常脑组织；N6：第6例正常脑组织；T9：第9例胶质瘤组织；T12：第12例胶质瘤组织；T18：第18例胶质瘤组织；T24：第24例胶质瘤组织。○表示非甲基化位点，●表示甲基化位点，每一行表示一个克隆中所有CG位点的甲基化状态，计算5个克隆中的非甲基化位点比率进行比较。结果表明，正常脑组织中POTEH基因启动子区CpG岛为高甲基化状态，而胶质瘤组织中该CpG岛发生低甲基化；

图4 POTEH启动子低甲基化与胶质瘤病人预后的关系。

绿色曲线表示POTEH基因启动子甲基化的胶质瘤病人的生存状况及时间，蓝色曲线表示POTEH基因启动子发生低甲基化的胶质瘤病人的生存状况及时间。用SPSS 13.0软件进行Kaplan-Meier检验，差异有统计学意义(p＝0.034)，说明POTEH低甲基化的病人预后较高甲基化的病人差。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1：

采用Promoterscan，Genomatix Promoter Inspector及CpGplot等生物信息学软件对POTEH基因5’端序列进行生物信息学分析，结果表明POTEH基因的启动子区域可能位于-817bp至-315bp处(以起始密码子ATG中A为+1)。Methl primer express软件和在线软件Methprimer分析POTEH启动子预测区域，结果显示存在一CpG岛，设计并合成POTEH启动子区的甲基化引物，5′TGATATTTGTGGTTTTAAGATTTATGTAG 3′(F)，5′ATTACAAACCAACCAAACCATTAC 3′(R)。对10例正常脑组织进行经亚硫酸盐处理后的基因组测序(BSP)，发现POTEH基因启动子CpG岛中CpG位点在正常的脑组织均处于甲基化状态。同时对不同级别脑胶质瘤组织标本(I级14例，II级48例，III级28例，IV级12例)96例，进行了POTEH启动子区甲基化状态的检测，发现81.3％的脑胶质瘤组织中POTEH的启动子区发生低甲基化，与正常脑组织比较，差异有统计学意义(p＜0.05)，各级胶质瘤的POTEH启动子区甲基化水平没有明显的差异(p＞0.05)。POTEH启动子区低甲基化的病人预后较甲基化病人的差，差异有统计学意义(p＝0.034)。以上研究结果提示，POTEH基因是一个新发现的脑胶质瘤甲基化基因，是一个胶质瘤预后预测标志。

操作步骤：

(一)亚硫酸氢盐修饰样品gDNA制备

选择已商品化的亚硫酸氢盐修饰试剂盒。

(二)亚硫酸氢盐直接测序PCR(BSP)试剂盒的使用

内容：该试剂盒包括：

用于检测POTEH基因启动子区甲基化的PCR引物：

F：5′TGATATTTGTGGTTTTAAGATTTATGTAG 3′，

R：5′ATTACAAACCAACCAAACCATTAC 3′。

PCR扩增体系(-20℃保存)。

原理：利用甲基化引物进行PCR扩增POTEH启动子区CpG岛。

步骤：

1取经亚硫酸氢盐修饰后的样品gDNA 4μl(总量约100ng)，加入含甲基化引物2μl的PCR扩增体系(50μl)，使用Takara公司的EmeraldAmp^TM PCR Master Mix(含DNA聚合酶、缓冲液及dNTP混合物)进行扩增。

PCR扩增体系为：

2加样后，置PCR仪进行PCR扩增，反应条件如下：

(三)琼脂糖电泳，胶回收PCR产物

将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳45min，经溴乙啶染色，紫外光下切胶，产物为391bp，胶回收试剂盒回收PCR产物

(四)连接胶回收产物至pGEM-T载体

使用Promega公司的pGEM-T easy载体体系(货号：A1360)

除步骤(三)的产物外，其他试剂均包含在pGEM-T easy载体体系中

(五)转化感受态

1 将步骤3的混合物3-5μl加入大肠杆菌JM109 50μl，置冰上15-30min；

2 42℃ 1min(不能超过90s)；

3 置冰上3-5min；

4 向混合物中加入1ml无氨苄的LB液体培基，180rpm，37℃摇菌1h(可适当延长)；

5 3500rpm，3min；

6 将适量X-gal及IPTG涂于LB固体培基上，待液体干燥后备用；

7 弃700μl上清，将剩下的液体重悬细菌，涂于加有氨苄的LB固体培基上，37℃培养12-16h。

(六)挑单克隆测序

1 将长有细菌的LB固体培基置于4℃显色4-6h；

2 挑取5个步骤(五)培育的阳性细菌单克隆(白色)加入至3ml的加有氨苄的LB液体培基中；

3 230rpm，37℃摇菌12-16h；

4 收细菌送测序；

5 分析测序结果，计算样本甲基化频率，与正常脑组织中甲基化频率进行比较，确定样本中POTEH基因启动子区CpG岛的甲基化状态；

将10例正常脑组织及96例胶质瘤组织的亚硫酸氢盐直接测序PCR测序结果进行分析，计算每例病人POTEH启动子区CpG岛甲基化频率(见表1)，正常脑组织中的去甲基化频率为(19.2±4.2)％，胶质瘤组织中的去甲基化频率为(38.6±9.8)％，经SPSS 13.0软件用独立样本T检验分析，差异有统计学意义，p＜0.05。

(七)预后判定

与正常组织比较，认为去甲基化频率低于等于27.0％为POTEH低甲基化，在96例胶质瘤病人中有78人的POTEH基因启动子发生低甲基化，这组病人的生存期较POTEH基因启动子甲基化病人的短(p＝0.034)。因此，发明人认为POTEH基因启动子区CpG岛低甲基化的胶质瘤病人可判定为预后较差。

表1 POTEH基因启动子区CpG岛在正常脑组织及胶质瘤组织中的甲基化状态及临床参数

N表示正常脑组织，T表示胶质瘤组织，p＜0.05 。

Claims

1.低甲基化基因POTEH的应用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因POTEH用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂。

2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因POTEH用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查的试剂盒。

3.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因POTEH用于制备亚硫酸氢盐直接测序法预测脑胶质瘤的制剂。

4.根据权利要求1或3所述的应用方法，其特征在于，所述的制剂中包括：根据POTEH基因启动子区CpG岛设计的，采用亚硫酸氢盐直接测序法的引物序列为：

F：5′TGATATTTGTGGTTTTAAGATTTATGTAG 3′，

R：5′ATTACAAACCAACCAAACCATTAC 3′。

5.一种用于人脑胶质瘤预后预测的POTEH基因启动子区甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括以下引物：

F：5′TGATATTTGTGGTTTTAAGATTTATGTAG 3′，

R：5′ATTACAAACCAACCAAACCATTAC 3′。