CN102352412B - 低甲基化基因elfn2的应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及低甲基化基因ELFN2的应用，即用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂。特别是用于制备亚硫酸氢盐直接测序法预测脑胶质瘤预后的制剂。通过研究证实ELFN2在胶质瘤组织中因启动子发生低甲基化而高表达，将检测ELFN2基因低甲基化应用于胶质瘤预后预测，为预测胶质瘤病人的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和推广性。
Description
技术领域
本发明涉及低甲基化基因ELFN2在制备脑胶质瘤病人预后预测试剂中的应用。
背景技术
脑胶质瘤是人类中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，约占神经系统肿瘤的40.49％。尽管目前采用手术治疗联合化疗和放疗的方法，胶质瘤病人的预后仍非常差。据报道，胶质瘤病人的5年生存率低于25％，而胶质瘤母细胞瘤的病人总生存时间平均为12.3个月。目前，对脑胶质瘤的预后判定没有参考标准，也没有特异性的指标，远远不能适应对人脑胶质瘤进行预后判定的需求。因此，对人脑胶质瘤进行预后判定，以便选择最佳治疗方案，显著提高患者生存率，一直是科学研究亟待解决的重要课题。
表观遗传机制，包括高/低甲基化、组蛋白修饰或非编码RNA表达在肿瘤的形成过程中发挥着重要作用。DNA甲基化状态的改变是肿瘤发生发展过程中的重要标志，而低甲基化在多种肿瘤形成中起着非常重要的作用，其中包括脑胶质瘤。DNA低甲基化可导致基因表达增加，从而促进肿瘤的发生和发展，如：胃癌中R-Ras、cyclin D2及maspin；黑色素瘤中MAGE；结肠癌中S100A4等基因。近年来，以DNA甲基化为代表的肿瘤表观遗传学及其在临床诊断、化疗敏感性和预后评价等方面的应用价值，已经愈来愈受到研究者的重视。FEN1基因启动子低甲基化导致其在乳腺癌中高表达，并且其低甲基化状态与预后相关。PRAME基因在神经母细胞瘤、乳腺癌及卵巢腺癌中因低甲基化而高表达，PRAME低甲基化病人预后更差。L1CAM CpG岛低甲基化致其在结直肠癌中表达增加，且与肿瘤进展相关。CDH3基因在结直肠癌中低甲基化，与肿瘤分级相关。由此可见，基因低甲基化在探寻肿瘤分子标志物方面具有巨大潜力。
利用亚硫酸氢盐测序PCR法(BSP)分析所获得的肿瘤特异性甲基化状态，是甲基化分析的金标准，它能明确所测区域每一个CG位点的甲基化状态。
ELFN2基因(Extracellular leucine-rich repeat and fibronectin type III domain containing2)定位于染色体22q13.1，GeneBank登录号：NM_052906。ELFN2在脑组织各个区域的轴突中有表达。申请人的研究表明该基因在脑组织、肝组织中表达，在脑胶质瘤、肝细胞癌中表达上调，在部分纤维结缔组织中表达，而在肺组织和结肠粘膜及其来源的肿瘤中不表达(见图1)。免疫组织化学法检测ELFN2蛋白在正常脑组织及脑胶质瘤组织中的表达，结果显示ELFN2在胶质瘤中表达增加(图1)。亚硫酸氢盐测序PCR结果显示，ELFN2在胶质瘤中发生低甲基化。并用SPSS 13.0软件对ELFN2蛋白表达与ELFN2基因低甲基化进行相关性分析，结果表明两者间存在相关性(P＜0.01)，说明表观遗传学可能参与了ELFN2基因的表达调控。
发明内容
本发明的目的是提供一种低甲基化基因ELFN2的应用方法，对于脑胶质瘤的预后预测具有重要意义。
低甲基化基因ELFN2用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂；特别是用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查的试剂盒。
如：用于制备亚硫酸氢盐直接测序法预测脑胶质瘤的制剂；所述的制剂中包括：根据ELFN2基因启动子区CpG岛设计的，采用亚硫酸氢盐直接测序法的引物序列为：
F：5′AAGTTTGTTTTTAGTTGTTGAATG 3′，
R：5′AACAACTCCTCACCCAAATC 3′。
一种用于人脑胶质瘤预后预测的ELFN2基因启动子区甲基化检测试剂盒，包括以下引物：
F：5′AAGTTTGTTTTTAGTTGTTGAATG 3′，
R：5′AACAACTCCTCACCCAAATC 3′。
申请人发现ELFN2基因在脑胶质瘤组织中表达上调(图1)。ELFN2转录起始位点上游-788至-114bp为一典型的CpG岛(图2)，该CpG岛中CG位点在正常的脑组织中均处于高甲基化状态，而在ELFN2表达上调的脑胶质瘤组织中其甲基化程度降低(部分结果见图3)。ELFN2低甲基化的胶质瘤病人总生存率明显低于高甲基化的病人(图4)，提示ELFN2基因是胶质瘤中的低甲基化基因，是预测胶质瘤预后的分子标志。本发明为脑胶质瘤预后预测提供了强有力的技术支持和分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。
申请人在上述研究基础上，制备了用于人脑胶质瘤预后预测的ELFN2基因启动子区甲基化检测试剂盒。该试剂盒包括ELFN2启动子区亚硫酸氢盐测序PCR试剂盒及用于检测ELFN2基因启动子区甲基化状态的引物。
附图说明
图1为ELFN2蛋白在多种组织及肿瘤中的表达；
A：结肠粘膜；B：结肠腺癌；C：肺组织；D：肺癌；E：肝组织；F：肝细胞癌；G：脑组织；H：胶质瘤(I级)。其中A-F的放大倍数为10×20，G和H的放大倍数为10×40；
图2为ELFN2基因启动子区-788bp至-114bp为一典型的CpG岛；
浅蓝色区域为CpG岛，横坐标下红色竖线为CG位点；
图3为正常脑组织和胶质瘤组织中ELFN2基因启动子区甲基化状态的检测结果；
图中所示为部分结果，N2：第2例正常脑组织；N4：第4例正常脑组织；T2：第2例胶质瘤组织；T6：第6例胶质瘤组织。○表示非甲基化位点，●表示甲基化位点，每一行表示一个克隆中所有CG位点的甲基化状态，计算5个克隆中的甲基化比率进行比较。结果表明，正常脑组织中ELFN2基因启动子区CpG岛为高甲基化状态，而胶质瘤组织中该CpG岛发生低甲基化；
图4ELFN2启动子低甲基化与胶质瘤病人预后的关系图。
绿色曲线表示ELFN2基因启动子甲基化的胶质瘤病人的生存状况及时间，蓝色曲线表示ELFN2基因启动子发生低甲基化的胶质瘤病人的生存状况及时间。用SPSS 13.0软件进行Kaplan-Meier检验，差异有统计学意义(p＝0.030)，说明ELFN2低甲基化的病人预后较高甲基化的病人差。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1：
采用Promoterscan，Genomatix Promoter Inspector及CpGplot等生物信息学软件对ELFN2基因5’端序列进行生物信息学分析，结果表明ELFN2基因的启动子区域可能位于-1037bp至-219bp处(以起始密码子ATG中A为+1)。Methl primer express软件和在线软件Methprimer分析ELFN2启动子预测区域-1037bp至-219bp，结果显示为一CpG岛，设计并合成ELFN2启动子区的甲基化引物，5′AAGTTTGTTTTTAGTTGTTGAATG 3′(F)，5′AACAACTCCTCACCCAAATC 3′(R)，对10例正常脑组织进行经亚硫酸盐处理后的基因组测序(BSP)，发现ELFN2基因启动子CpG岛中CpG位点在正常的脑组织均处于甲基化状态。同时对不同级别脑胶质瘤组织标本(I级6例，II级20例，III级12例，IV级12例)50例，进行了ELFN2启动子区甲基化状态的检测，发现82％的脑胶质瘤组织中ELFN2的启动子区发生低甲基化，与正常脑组织比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，各级胶质瘤的ELFN2启动子区甲基化水平没有明显的差异(p＞0.05)(见表1)。ELFN2启动子区低甲基化的病人预后较甲基化病人的差，差异有统计学意义(p＝0.030)。以上研究结果提示，ELFN2基因是一个新发现的脑胶质瘤甲基化基因，是一个胶质瘤预后预测标志。
操作步骤：
(一)亚硫酸氢盐修饰样品gDNA制备
选择已商品化的亚硫酸氢盐修饰试剂盒。
(二)亚硫酸氢盐直接测序PCR(BSP)试剂盒的使用
内容：该试剂盒包括：
用于检测ELFN2基因启动子区甲基化的PCR引物：
5′AAGTTTGTTTTTAGTTGTTGAATG 3′(F)
5′AACAACTCCTCACCCAAATC 3′(R)
PCR扩增体系(-20℃保存)
原理：利用BSP引物进行PCR扩增ELFN2启动子区CpG岛。
步骤：
1 取经亚硫酸氢盐修饰后的样品gDNA4μl(总量约100ng)，加入含甲基化引物2μl的PCR扩增体系(50μl)，使用Takara公司的EmeraldAmpTM PCR Master Mix(含DNA聚合酶、缓冲液及dNTP混合物)进行扩增。
PCR扩增体系为：
2 加样后，置PCR仪进行PCR扩增，反应条件如下：
(三)琼脂糖电泳，胶回收PCR产物
将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳45min，经溴乙啶染色，紫外光下切胶，产物为653bp，胶回收试剂盒回收PCR产物
(四)连接胶回收产物至pGEM-T载体
使用普洛麦格(北京)生物技术有限公司的pGEM-T easy载体体系(货号：A1360)
除步骤(三)的产物外，其他试剂均包含在pGEM-T easy载体体系中
(五)转化感受态
1 将步骤3的混合物3-5μl加入大肠杆菌JM10950μl，置冰上15-30min；
2 42℃1min(不能超过90s)；
3 置冰上3-5min；
4 向混合物中加入1ml LB液体培基，180rpm，37℃摇菌1h(可适当延长)；
5 3500rpm，3min；
6 将适量X-gal及IPTG涂于LB固体培基上，待液体干燥后备用；
7 弃700μl上清，将剩下的液体重悬细菌，涂于加有氨苄青霉素(0.1μg/μl)的LB固体培基上，37℃培养12-16h。
(六)挑单克隆测序
1 将长有细菌克隆的LB固体培基置于4℃显色4-6h；
2 挑取5个步骤(五)培育的阳性细菌单克隆(白色)加入至3ml的加有氨苄的LB液体培基中；
3 230rpm，37℃摇菌12-16h；
4 收细菌测序(交予测序公司进行)；
5 分析测序结果，计算样本甲基化频率，与正常脑组织中甲基化频率进行比较，确定样本中ELFN2基因启动子区CpG岛的甲基化状态；
将10例正常脑组织及50例胶质瘤组织的亚硫酸氢盐直接测序PCR测序结果进行分析，计算每例病人ELFN2启动子区CpG岛甲基化频率(见表1)，正常脑组织中的甲基化频率为(77.3±6.6)％，胶质瘤组织中的甲基化频率为(29.8±18.7)％，经SPSS 13.0软件用独立样本T检验分析，差异有统计学意义，p＜0.05。
(七)预后判定
与正常组织比较，认为甲基化频率低于等于48.5％为ELFN2低甲基化，在50例胶质瘤病人中有41人的ELFN2基因启动子发生低甲基化，这组病人的生存期较ELFN2基因启动子甲基化病人的短(p＝0.030)。因此，发明人认为ELFN2基因启动子区CpG岛低甲基化的胶质瘤病人可判定为预后较差。
表1 ELFN2基因启动子区CpG岛在正常脑组织及胶质瘤组织中的甲基化状态及临床参数
N表示正常脑组织，T表示胶质瘤组织，p＜0.05
Claims (1)
1.一种用于人脑胶质瘤预后预测的ELFN2基因启动子区甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括以下引物：
F：5′AAGTTTGTTTTTAGTTGTTGAATG 3′，
R：5′AACAACTCCTCACCCAAATC 3′。
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