CN102361881A

CN102361881A - 产生c4二羧酸的方法

Info

Publication number: CN102361881A
Application number: CN2010800129633A
Authority: CN
Inventors: 贝丝·范特兰德-布鲁姆; 约翰·拉雅帕蒂
Original assignee: Archer Daniels Midland Co
Current assignee: Archer Daniels Midland Co
Priority date: 2009-03-23
Filing date: 2010-03-23
Publication date: 2012-02-22
Also published as: US8431377B2; US20120003708A1; EP2411403A4; BRPI1006281A2; CA2755970A1; WO2010111206A1; CA2755970C; EP2411403A1

Abstract

公开了产生C4二羧酸的方法。还公开了编码丙酮酸羧化酶的核苷酸序列和该核苷酸序列在C4二羧酸产生中的用途。

Description

产生C4二羧酸的方法

发明人

贝丝·范特兰德-布鲁姆

约翰·拉雅帕蒂

技术领域

本发明大体上涉及C4二羧酸的产生。

背景

二羧酸包括两个羧酸基团并具有很多用途，包括但不限于，食品添加剂、聚合物增塑剂、溶剂、润滑剂、工程塑料、环氧树脂固化剂、粘合剂和粉末涂料、腐蚀抑制剂、化妆品、药物和电解质。二羧酸还可转化为它们的酯形式以用于多种不同的用途。

二羧酸诸如苹果酸、延胡索酸和琥珀酸可通过化学合成或发酵来产生。因为通过化学合成产生二羧酸可能导致有害的废弃副产物，存在通过发酵产生二羧酸的需要。

苹果酸是在食品生产工业中具有用途的有机酸，且用于制造化妆品。苹果酸还作为表面活性剂或生物可降解聚合物用于化学工业中。还可对苹果酸进行多种加工以产生羟基丁内酯和羟基琥珀酸衍生物，马来酸酐和1，4-丁二醇。

延胡索酸是自然界中广泛存在的有机酸。在人类和其它哺乳动物中，延胡索酸是用于有机酸生物合成的三羧酸循环(也称作Krebs循环或柠檬酸循环)中的关键中间物。延胡索酸还是植物生命中的必需成分，并可在食品工业中具有用途；在苹果酸和天冬氨酸的产生中作为化学中间物；在聚酯树脂或多元醇的制造中作为工业化学物；作为染料的媒染剂；或可用于多种工业化学物的产生。

琥珀酸是可用作表面活性剂、去垢剂、增充剂或发泡剂的有机酸。琥珀酸还可作为铁螯合剂，用于食品或饲料工业、用于药品或保健用品市场或作为植物兴奋剂(plant stimulant)。如苹果酸和延胡索酸一样，琥珀酸还可在诸如己二酸、4-氨基丁酸、天冬氨酸、1，4-丁二醇、琥珀酸二乙酯、乙二胺二琥珀酸、延胡索酸、γ-丁内酯、羟基琥珀酰亚胺、衣康酸、马来酸、马来酸酐、马来酰亚胺、苹果酸、N-甲基吡咯烷酮、2-吡咯烷酮、琥珀酰亚胺、四氢呋喃或其它4-碳化合物的产生中用作工业化学物。琥珀酸还可用于产生生物可降解聚合物。

概述

本发明满足了这些需要，并公开了通过发酵产生C4二羧酸的方法。

在一个实施方案中，分离的或重组的多核苷酸包括选自由以下组成的组的序列：编码包括SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列；与编码包括SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列完全互补的核苷酸序列；和在严格条件下与和编码包括SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列完全互补的核苷酸序列杂交的序列，所述严格条件包括65℃下0.2×SSC。

在另一个实施方案中，载体包括启动子和用于表达根霉属(Rhizopus)来源的丙酮酸羧化酶蛋白的元件(means)。

在又一个实施方案中，产生C4二羧酸的方法，包括在培养基中培养用选自由以下组成的组的序列转化的重组细胞：SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：1的全长互补序列(complement)；与SEQ ID NO：1具有至少95％序列同一性且编码具有丙酮酸羧化酶活性的多肽的序列；编码包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的序列；和编码具有丙酮酸羧化酶活性的多肽的多核苷酸序列，其中该多核苷酸与多核苷酸SEQ ID NO：1的全长互补序列在严格条件下杂交，所述严格条件包括65℃下0.2×SSC；和从培养基回收C4二羧酸。

附图简述

图1是米根霉(R.oryzae)中常见代谢途径的图解。

图2显示米根霉、酿酒酵母(S.cerevisiae)、黑曲霉(A.niger)、土曲霉(A.terreus)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)和粟酒裂殖酵母(S.pombe)丙酮酸羧化酶蛋白之间保守的结构域。在这些真菌蛋白之间，两个ATP结合结构域和生物素结合结构域是100％保守的，而丙酮酸结合结构域为89％保守的。

图3A-C显示米根霉1526丙酮酸羧化酶的cDNA序列(SEQ ID NO：1)(图3A-B)和蛋白序列(SEQ ID NO：2)(图3C)。开放阅读框编码1179个氨基酸的蛋白。

图4显示利用限制性酶PstI、BamHI或EcoRI消化的来自米根霉的总基因组DNA的DNA印迹，显示含有丙酮酸羧化酶(pyrC)的质粒的相关拷贝数。

图5是Ptef:pyrC:Tpgk pyr225b质粒图谱。

图6是pyrC fum pyrG YEM7质粒图谱。

发明详述

在一个实施方案中，使利用丙酮酸羧化酶转化的重组宿主细胞发酵以产生C4二羧酸。丙酮酸羧化酶可以来自根霉属来源。重组宿主细胞是顺从遗传操作并能够大规模生长的任何多种宿主细胞。

如本文所用的，术语“宿主细胞”包括任何原核或真核细胞，其中细胞中已导入了所需的核酸序列。该宿主细胞的代谢过程和途径能维持、复制、和/或表达含有外源基因或DNA分子的载体。存在多种适宜的宿主细胞，包括但不限于细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物细胞，其可以多种方式来应用(例如，作为载体来维持包括所需序列的质粒)。代表性的微生物宿主细胞包括但不限于，真菌细胞，比如根霉属(Rhizopus ssp.)、酵母属(Saccharomyces ssp.)、链霉菌属(Streptomycesssp.)、毕赤酵母属(Pichia ssp.)、曲霉属(Aspergillus ssp.)，和细菌细胞，诸如乳杆菌属(Lactobacillus ssp.)、埃希氏菌属(Escherichia ssp.)、棒状菌属(Corynebacterium ssp.)、短杆菌属(Brevibacterium ssp.)、假单胞菌属(Pseudomonas ssp.)、变形菌属(Proteus ssp.)、肠杆菌属(Enterobacterssp.)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter ssp.)、欧文氏菌属(Erwinia ssp.)、黄单胞菌属(Xanthomonas ssp.)、黄杆菌属(Flavobacterium ssp.)、链球菌属(Streptococcus ssp.)、乳球菌属(Lactococcus ssp.)、明串珠菌属(Leuconostoc ssp.)和肠球菌属(Enterococcus ssp.)。在某些实施方案中，宿主细胞可以是米根霉。在某些另外的实施方案中，宿主细胞可以是大肠杆菌(Escherichia coli)。

在另一个实施方案中，宿主细胞可以是以下属的酵母细胞：酵母属、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、德巴利酵母属(Debaromyces)、拿逊酵母属(Nadsonia)、油脂酵母属(Lipomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)、克勒克酵母属(Kloeckera)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、三角酵母属(Trigonopsis)、酒香酵母属(Brettanomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、毛孢子菌属(Trichosporon)、短梗霉属(Aureobasidium)、油脂酵母属(Lipomyces)、法夫酵母属(Phaffia)、红酵母属(Rhodotorula)、耶罗威亚酵母属(Yarrowia)或许旺酵母属(Schwanniomyces)。

当宿主细胞是真菌细胞时，真菌细胞可以是以下属：酵母属、接合酵母属、耶罗威亚酵母属、克鲁维酵母菌属、曲霉菌或毕赤酵母属。真菌细胞还可以是丝状真菌来源的。

宿主细胞可以是以下属的细菌细胞：乳杆菌属、埃希氏菌属、棒状菌属、短杆菌属、假单胞菌属、变形菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、欧文氏菌属、黄单胞菌属、黄杆菌属、链球菌属、乳球菌属、明串珠菌属和肠球菌属。

如本文所公开的，提供了编码丙酮酸羧化酶的核酸和蛋白序列。并且，公开了利用具有包括所述序列的载体的宿主细胞产生乳酸、甘油、苹果酸、琥珀酸或延胡索酸的方法。

应理解本发明的某些描述已被简化以仅示出与清楚理解本发明有关的那些要素，而为了清楚的目的省略了其它的要素。本领域技术人员在理解本发明的描述后将认识到其它要素可能是实现本发明所需要的。然而，因为本领域技术人员在考虑本发明的描述后易于确定所述其它要素，且这些要素并非完全理解本发明所必需的，这些要素的讨论可能不会在本文提供。这样，应理解本文所列的描述仅是示例性的而非对权利要求书的范围的限制。

在说明书的以下部分和所附权利要求书中，除了本文的例子中的，或除非另有明确表示，否则所有数值范围、量、值和百分比，比如用于反应的材料、要素含量、时间和温度的量、量的比例和其它的那些，可被理解为视作其前面具有单词“大约”，即使术语“大约”可能没有与数值、量或范围一起明确出现。因此，除另外相反地指明外，以下说明书和所附权利要求书中所列的数值参数是近似值，其可根据试图通过本发明获得的所需属性而不同。至少，并不试图限制权利要求书的范围的等效形式原则的应用，每个数值参数应至少根据所记录的有效数字的数目和通过应用一般的四舍五入术来理解。

尽管列出本发明的宽泛范围的数值范围和参数是近似值，特定实施例中列出的数值是尽可能精确地记录的。然而，任何数值可含有误差，该误差由其基本的相应检验测量中发现的标准偏差所必然导致。并且，当数值在本文列出时，这些范围包括所列的范围终点(终点可被应用)。当本文使用重量百分比时，所记录的数值与总重量有关。本领域技术人员将认识到，重量百分比和实际重量是可互相转换的。

而且，应理解本文所列的任何数值范围意在包括其中所包含的所有亚范围。例如，“1到10”的范围意在包括所列的最小值1和所列的最大值10之间(且包括1和10)的所有亚范围，即，具有等于或大于1的最小值和等于或小于10的最大值。除非另外指明，否则如本文所用的术语“一个”、“一(a)”或“一(an)”，意在包括“至少一个”或“一个或多个”。

所有参考的专利、专利申请、出版物、序列表、序列表的电子拷贝或其它公开材料以其整体通过引用并入，但仅至所并入的材料不与现有的定义、陈述或本公开所列的其它公开材料相冲突的程度。这样，至所需的程度，本文所清楚列出的公开内容取代了通过引用并入本文的任何冲突的材料。任何材料、或其部分，据称在本文中通过引用并入的，但与现有的定义、陈述或本文所列出的其它公开材料冲突的，将仅在所并入的材料和现有的公开材料之间无冲突发生的程度上并入。

如本文所用的，术语“延胡索酸”包括游离酸或盐形式的延胡索酸。如本文所用的，术语“苹果酸”包括游离酸或盐形式的苹果酸。如本文所用的，术语“琥珀酸”包括游离酸或盐形式的琥珀酸。

如本文所用的，术语“基因”包括核酸、DNA或RNA的区段，其编码并能够表达特定的基因产物。基因通常产生蛋白或多肽作为其基因产物，但在其较宽泛的含义，基因能够产生任何所需的产物，无论产物是蛋白、多肽或核酸。功能性或结构性核酸，例如但不限于rRNA、核酶、反义RNA或干扰RNA(例如，siRNA)也可认为是“基因产物”。“基因”还可含有含调控元件的序列，例如但不限于，启动子、增强子和终止子；所述调控元件可以是“可操作地连接”的，更通常彼此适当地靠近。所述启动子以顺式(在同一核酸分子上彼此连接)发挥作用以导致“基因产物”的表达。基因组成的选择，比如调控元件和表达的序列的特定组合，将决定表达的条件。例如，组成型启动子，比如与表达的序列连接的CMV(巨细胞病毒)启动子，当其被转移到适宜的宿主细胞中时将导致表达的序列的组成型表达。如果启动子在正常生长条件下发挥作用以促进基因的转录则认为该启动子是组成型的。组成型启动子不是组织特异性的或发育特异性的，具有宽泛的跨物种趋向，且在正常生长条件下其表达通常基本上没有显著差别。

“基因”还可包括内含子或可从最终RNA转录本剪接的其它DNA序列。编码蛋白或肽的表达的DNA序列(“蛋白编码序列”)包括开放阅读框(ORF)。蛋白编码序列可包括间插内含子。此外，术语“基因”包括表达的序列以及非表达的序列。除另外指明，否则本文所提供的所有DNA序列理解为包括互补链。并且，RNA序列可通过用尿嘧啶代替胸腺嘧啶而从DNA序列来制备，该RNA序列和从细胞分离的本发明的DNA序列的RNA拷贝一起包括于该定义和本发明的范围中。

如本文所用的，术语“寡核苷酸”包括从约7个到约50个碱基的核酸，虽然它们更通常为从约15个到约35个碱基。寡核苷酸作为探针或引物用于杂交或扩增测定是有用的，所述杂交或扩增测定比如DNA印迹或RNA印迹；分子信标(molecular beacon)；聚合酶链式反应(PCR)；逆转录PCR(RT-PCR)；定量RT-PCR(QRT-PCR)，例如，TAQMAN；等温扩增方法，比如NASBA(基于核酸序列的扩增)；和滚环扩增，包括锁式(padlock)探针的使用。本发明的寡核苷酸可通过添加肽、标记(包括荧光、量子点或酶标签)和其它化学基团来修饰，且理解为包括在该定义和本发明的范围中。

如本文所用的，在本文所描述的新颖核苷酸序列的情况下，如果核酸能够在严格条件下或在PCR反应中典型反应(退火)温度下与给定序列特异性地杂交，则该核酸对于给定序列是“特异性的”，所述给定的序列比如所提供的丙酮酸羧化酶cDNA和基因组序列，所述严格条件例如但不限于，65℃下0.2×SSC。通常，如果核酸与参考序列具有90％到100％的同源性(序列同一性)则该序列对于参考序列是“特异性的”。

以下的术语用来描述两条或多条核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参考序列”，(b)“比较窗口(comparison window)”，(c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分比”和(e)“基本同一性”。如本文所用的，“参考序列”是用作序列比较的基础的限定序列。参考序列可以是指定序列的全部或子部分(subset)；例如，全长cDNA或基因序列的区段，或完整的cDNA或基因序列。如本文所用的，“比较窗口”涉及多核苷酸序列的连续的和指定的区段，其中，比较窗口中的多核苷酸序列可包括与参考序列(其不包括添加或缺失)相比的添加或缺失(即空位)，以用于这两条序列的最优比对。一般，比较窗口的长度为至少20个连续核苷酸，并且任选地可以是30、40、50、100或更长。本领域技术人员理解，为避免由于多核苷酸序列中包含空位而导致与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚值(gap penalty)并从匹配的数目减去该空位罚值。用于比较的序列比对方法是已知的。因此，任何两条序列间的序列同一性百分比的确定可利用数学算法来完成。所述数学算法的非限制性的例子为Myers和Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法；Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部比对算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的总体比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的局部搜寻比对方法；Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264的算法，修改于Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877中。

这些数学算法的计算机实现可用于序列的比较以确定序列同一性。所述实现包括但不限于：PC/Gene程序(可从Intelligenetics，Mountain View，Calif.获得)中的CLUSTAL；ALIGN程序(版本2.0)和GCG Wisconsin遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)版本10(可从AccelrysInc.，9685Scranton Road，San Diego，Calif.，USA获得)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。

如本文所用的，在两条核酸序列或多肽序列的情况中，“序列同一性”或“同一性”涉及当跨指定的比较窗口进行最大一致的比对时两条序列中相同的残基。当序列同一性的百分比用来指蛋白时，公认的是，不相同的残基位置通常由保守性氨基酸置换而不同，其中的氨基酸残基被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其它氨基酸残基所置换且因此没有改变分子的功能性质。当序列的保守性置换不同时，可上调序列同一性百分比以校正置换的保守性性质。通过该保守性置换而不同的序列被称作具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行这种调整的方法是本领域技术人员所熟知的。通常，这包括将保守性置换评分为部分而非完全错配，从而提高序列同一性百分比。因此，例如，当给相同的氨基酸1的评分，且给非保守性置换0的评分时，给保守性置换0和1之间的评分。计算保守性置换的评分，例如，如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，Calif.)中实现的。

如本文所用的，“序列同一性百分比”意为通过跨比较窗口比较两条最佳比对的序列来确定的值，其中多核苷酸序列在所述比较窗口中的部分可包括相比于参考序列(其不包括添加或缺失)的添加或缺失(即空位)，以用于这两条序列的最优比对。该百分比可通过以下方式计算：确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得出匹配的位置的数目，用匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，并且将结果乘以100以得出序列同一性百分比。

术语多核苷酸序列的“基本同一性”意为包括利用标准参数，利用所描述的比对程序之一，与参考序列相比多核苷酸具有至少70％序列同一性，至少80％、至少90％和至少95％序列同一性的序列。

如本文所用的，用于检测特定核酸物质的“引物”或“探针”包括可用来检测和/或定量特定核酸物类(species)的任何引物、引物组和/或探针。“核酸物类”可以是对应于单基因的单种核酸物类，或可以是由单种共同引物和/或探针组合所检测的核酸。

如本文所用的，术语“多核苷酸”包括由磷酸二酯键连接的任何单链序列的核苷酸，或包括由氢键连在一起的两条这样的互补单链序列的任何双链序列。除非另外指明，否则本文所列的每条多核苷酸序列以脱氧核糖核苷酸(缩写为A、G、C和T)的序列来呈现。术语“多核苷酸”包括DNA分子或多核苷酸，脱氧核糖核苷酸的序列，和RNA分子或多核糖核苷酸和它们的组合。

如本文所用的，术语“启动子”包括较大DNA序列中提供或限定RNA聚合酶能够结合并起始转录的位点的DNA序列。本文所描述的启动子可用来过表达或上调，例如但不限于，编码在发酵条件改变期间增加向苹果酸、延胡索酸、琥珀酸和/或其它所需的代谢物的碳通量的酶的基因。

给定参考核苷酸序列或其中所含的元件的“等价形式”包括与参考核苷酸序列相比，含有该参考核苷酸序列的所有元件的核苷酸序列，从而保留参考核酸或肽的特征性功能。本领域技术人员将理解由于遗传密码的简并性，功能蛋白可由等价的DNA序列来编码。例如，一个密码子可置换另一个，仍编码相同的氨基酸，比如，例如但不限于，对于Ala密码子，GCC或GCG置换GCA。在蛋白的情况下，序列可含有代表保守性氨基酸置换的氨基酸，包括但不限于，保守性置换组：Ser和Thr；Leu、Ile和Val；Glu和Asp；以及Gln和Asn。因此由于遗传密码的简并性本文所要求保护的序列包括所指的序列以及其等价形式。保守性置换还可通过其它方法来确定，例如但不限于，通过BLAST(基本局部比对搜索工具)算法、BLOSUM置换评分矩阵和BLOSUM 62矩阵(还参见，例如，Altschul等人，Methods in Enzymology 266：460-479(1996))所用的那些方法。重要地，参考核酸或肽/蛋白的“等价形式”和“保守的等价形式”基本上保留或增强参考核酸或肽/蛋白的功能。

如本文所用的，术语“载体”包括用于将外源核苷酸序列导入到细胞中的工具，包括但不限于质粒或病毒。所述载体可在宿主细胞的基因表达机制的控制下作用。载体含有便于在宿主细胞中复制和/或维持外源核酸的区段的序列。一般，将载体导入到宿主细胞中以用于外源DNA的区段的复制和/或表达，或用于将外源DNA递送到宿主基因组中。典型的质粒载体含有：(i)复制起点，以使载体可在宿主细胞中维持和/或复制；(ii)选择标记，比如抗生素抗性基因，以协助质粒的增殖；和(iii)含有若干不同的限制性核酸内切酶识别和切割位点的多接头位点以协助克隆外源DNA序列。

RNA干扰(RNAi)是用于破坏基因表达的有力的和可靠的方法。其基于高度保守的基因沉默方法，该方法使用双链RNA(dsRNA)或单链RNA(ssRNA，参见，例如，Martinez J，等人，Cell 110(5)：563-74(2002))作为信号以触发同源性的细胞RNA的降解。序列特异性降解的调节物是21-至23-核苷酸(nt)的dsRNA小干扰RNA(siRNA)。适当的siRNA序列的选择和siRNA的制备在Elbashir，S.M.等人，Methods 26：199-213(2002)中和美国专利申请第2002/0173478号、第2002/0182223号、第2002/0183276号、第2002/0160393号和第2002/0162126号中被详细讨论。

Xia等人描述了含有用于siRNA表达的基因的适宜的质粒的构建。该参考文献还描述了重组的病毒载体和递送系统。该参考文献描述了siRNA发夹的适当的表达，其在小鼠脑和肝中下调靶标的β-葡糖醛酸酶基因的表达，从而提供了siRNA技术作为人类疾病的基因疗法的有用性的概念的证据(Xia等人，Nature Biotechnology，20：1006-1010(2002))。还参见，例如，美国专利申请第2004/0241854号和第2004/0053876号。用于siRNA产生的载体是可从商业来源广泛获得的，例如但不限于，Austin TX的Ambion，Inc.，San Diego，CA的Invivogen和Piscataway，NJ.的GenScript Corporation。含有适当的启动子的载体，比如Pol III启动子，包括例如但不限于，H1和U6启动子，并已证实在产生足量siRNA中特别有用。因此典型的siRNA“基因”将包括与编码siRNA的序列可操作地连接的适当的启动子。Ambion′s Technical Bulletin#506(Ambion技术通报#506)(“siRNA DesignGuidelines(siRNA设计指南)”)提供了siRNA设计注意事项的非限制性例子。用于例如且非限制性地从cDNA或ORF序列生成适宜的siRNA序列的计算机软件也是商业上可获得的。

利用用于确定有效的siRNA序列的成熟建立的方法，可生成siRNA序列以使米根霉丙酮酸脱氢酶、丙酮酸羧化酶和丙酮酸脱羧酶沉默。所设计的使来自米根霉的丙酮酸脱氢酶序列沉默的siRNA序列的一个非限制性例子(图4)是：有义5′-CAGACGAUGACCUUCCUUA(SEQ ID NO：3)；反义5′-UAAGGAAGGUCAUCGUCUG(SEQ ID NO：4)。

所设计的使来自米根霉的丙酮酸脱羧酶(GenBank登录号AF282846和AF282847)沉默的siRNA序列的一个非限制性例子是：有义：

5′-CUUUGAUGUGUUCUUCAAC(SEQ ID NO：5)；反义

5′-GUUGAAGAACACAUCAAAG(SEQ ID NO：6)。

所设计的使来自米根霉的丙酮酸羧化酶沉默的siRNA序列的一个非限制性例子是：有义5′-UUGGCCACUCGUGUGAG(SEQ ID NO：7)；反义5′-CUCACACGAGUGGCCAA(SEQ ID NO：8)。

在一个例子中，本文所公开的有义/反义对可在载体构建体中，比如例如且不限于在含有用于选择的pyrG基因的pPYR225b中，在PTEF启动子或rRNA簇启动子的控制下表达。

在RNAi以外，反义RNA是干扰基因功能的另一种方法。在反义技术中，与mRNA的部分互补的RNA被导入到细胞中，由此下调mRNA的蛋白产物的产生。与RNAi技术不同，在大多数情况下反义并不完全使靶基因沉默。有用的反义构建体和试剂的产生在本领域技术人员的能力范围之内。

在一个实施方案中，用于产生C4二羧酸的方法包括：在培养基中对用选自以下组成的组的序列转化的重组宿主细胞进行培养：SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：1的全长互补序列；与SEQ ID NO：1具有至少95％序列同一性且编码具有丙酮酸羧化酶活性的多肽的序列；编码包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的序列；和编码具有丙酮酸羧化酶活性的多肽的多核苷酸的序列，其中所述多核苷酸与多核苷酸SEQ ID NO：1的全长互补序列在严格条件下杂交，所述严格条件包括65℃下0.2×SSC；和从培养基回收C4二羧酸。C4二羧酸可选自由延胡索酸、琥珀酸或苹果酸组成的组。在另一个实施方案中，C4二羧酸是苹果酸或琥珀酸。

在一个实施方案中，与SEQ ID NO：1具有至少95％序列同一性的序列是美国专利第7,435,168号中公开的丙酮酸羧化酶基因。

在另一个实施方案中，公开了编码包括SEQ ID NO：2的丙酮酸羧化酶蛋白的多核苷酸序列。在另外某些实施方案中，可能公开了与编码包括SEQ ID NO：2的蛋白的多核苷酸序列完全互补的核苷酸序列。在另一些实施方案中，可能公开了在严格条件下与和编码包括SEQ ID NO：2的蛋白的多核苷酸序列完全互补的核苷酸序列杂交的序列，所述严格条件包括65℃下0.2×SSC。例如，非限制性地，序列可以编码丙酮酸羧化酶(例如，SEQ ID NO：1)。

在另一个实施方案中，载体包括启动子和用于表达根霉属来源的丙酮酸羧化酶蛋白的元件。在某些实施方案中，用于表达根霉属来源的丙酮酸羧化酶蛋白的元件是编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸，或是SEQ ID NO：1。

在本公开的某些实施方案中，多核苷酸可以是分离的或重组的。在另外某些实施方案中，多核苷酸可以进一步包括与多核苷酸序列可操作地连接的启动子。

在本公开的某些实施方案中，公开了包括多核苷酸的载体。在另外某些实施方案中，载体可包括SEQ ID NO：1。在另一些实施方案中，载体可包括开放阅读框或带有或不带有内含子的编码序列，以用于表达丙酮酸羧化酶。在特定的实施方案中，丙酮酸羧化酶可以是米根霉来源的。

在某些实施方案中，载体可包括启动子和用于表达根霉属来源的丙酮酸羧化酶蛋白的元件。在另外某些实施方案中，用于表达丙酮酸羧化酶蛋白的元件包括SEQ ID NO：1。在另一些实施方案中，用于表达丙酮酸羧化酶蛋白的元件包括编码SEQ ID NO：2的多核苷酸序列。

可根据标准方法将核酸导入到宿主细胞中，所述方法包括电穿孔或本领域已知的任何其它转化或核酸转移方法。例如，可通过电穿孔来转染米根霉。可通过电穿孔将感兴趣的基因插入到细胞中来永久性地转化米根霉细胞，只要导入的DNA整合入宿主细胞基因组中。无任何意图拘泥于该理论地，这通过所导入的DNA与基因组DNA通过单链交换或双链交换的同源重组或所导入的DNA的随机整合来实现。当导入的DNA是线性化的且含有非互补末端时转化效率提高，因为该情况下当利用两种不同的限制性核酸内切酶将含有基因的DNA片段从质粒上切除时产生了非互补性末端。在该情况中，可在转染前从质粒骨架纯化序列。环化的DNA倾向于在米根霉中串联体化，产生大的环状的染色体外元件，其最终在被转染的细胞系的连续传代期间从宿主细胞丢失。具有互补末端的线性化的DNA也可以再环化和串联体化(不必按照该顺序)且以相同的方式在转染的宿主细胞系的连续传代期间作为染色体外元件而丢失。

可在任何条件下培养宿主细胞，比如本领域中已知的那些条件。如前所述，发酵条件可影响生物体中碳的通量。例如，在产乳酸细菌中，强通气使碳的通量转向乙酸和乙偶姻产生，而远离乳酸产生。发酵条件包括但不限于：通气水平、pH和培养基的氧饱和水平，以及培养基中可得的碳和其它生长因子的量。碳源可以是，例如且不限于，多种糖醇、多元醇、羟醛糖(aldol sugar)或酮糖，包括但不限于阿拉伯糖、纤维二糖、果糖、葡萄糖、甘油、肌醇、乳糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、山梨糖、蔗糖、海藻糖、丙酮酸、琥珀酸或甲胺或可由本领域技术人员确定的其它底物。如本文所描述的，许多生物体可在普通生长培养基上旺盛生长。例如且不限于，米根霉可在LB(Luria-Bertani)肉汤中生长。

在另一个例子中，反义或RNAi技术可单独使用或与丙酮酸羧化酶的增高的基因表达相组合使用以进一步使碳从一个代谢途径转移到另一个。注意地是，在一些条件下，除非培养基中提供了特定的代谢物(营养缺陷型)，否则完全的基因沉默可防止显著的细胞培养物生长。如本文所用的，术语“营养缺陷型”包括其生长需要特定生长因子(例如，氨基酸或糖)的生物体。

因此，在许多情况下可利用反义技术或RNAi技术来优化缓慢生长型(bradytroph)的产生。如本文所用的，术语“缓慢生长型”包括其生长不必需要特定生长因子的生物体，但其产生比野生型(w.t.)生物体较低的量的某些生长因子。

在一些实施方案中，公开了利用用于过表达丙酮酸羧化酶和用于下调其它已知基因的基因共转染的细胞。在一个实施方案中，丙酮酸羧化酶的过表达催化丙酮酸到草酰乙酸的转化，草酰乙酸是苹果酸、延胡索酸和琥珀酸的前体。因此，丙酮酸羧化酶的过表达将丙酮酸转化为草酰乙酸。在另一个实施方案中，可过表达编码苹果酸脱氢酶的基因以将草酰乙酸转化为苹果酸。在另一个实施方案中，可过表达编码延胡索酸酶的基因以将苹果酸转化为延胡索酸。在又一个实施方案中，可过表达编码延胡索酸还原酶的基因以将延胡索酸转化为琥珀酸。

在本公开的某些实施方案中，公开了产生乳酸、甘油、苹果酸、延胡索酸或琥珀酸的方法。在另外某些实施方案中，方法可包括在培养基中培养具有载体的细胞，其中所述载体包括启动子和与启动子可操作地连接的用于表达SEQ ID NO：2的元件。在另一些实施方案中，方法可进一步包括从培养基回收乳酸、甘油、延胡索酸、苹果酸或琥珀酸的至少一种。

在另一个实施方案中，本公开提供了分离的或重组的多核苷酸，该多核苷酸包括选自由以下组成的组的序列：编码包括SEQ ID NO：2的蛋白的多核苷酸序列；与编码包括SEQ ID NO：2的蛋白的多核苷酸序列完全互补的核苷酸序列；和在严格条件下与和编码包括SEQ ID NO：2的蛋白的多核苷酸序列完全互补的核苷酸序列杂交的序列，所述严格条件包括65℃下0.2×SSC。

在另一个实施方案中，本公开提供了包括启动子和用于表达米根霉来源的丙酮酸羧化酶蛋白的元件的载体。

在另一个实施方案中，本公开提供了产生乳酸、甘油、苹果酸、延胡索酸或琥珀酸的方法，包括：在培养基中培养具有载体的细胞，载体包括：启动子；和与启动子可操作地连接的用于表达SEQ ID NO：2的元件。

本公开的多个实施方案将在与以下实施例结合理解时被更好地理解。

实施例

以下的实施例示出本公开的编码根霉属的丙酮酸羧化酶的核酸和蛋白质序列的多个非限制性实施方案，且如本文所另外描述的并不限制本发明。

实施例1：米根霉丙酮酸羧化酶

本文描述了米根霉基因组和cDNA的分离和表征。提供了核酸分子和所编码的丙酮酸羧化酶蛋白。讨论了该酶的属性和对于C4二羧酸产生的可能应用。

作为尝试表征编码发酵期间导致乳酸、C4二羧酸、乙醇和甘油的合成的途径中的酶的基因的一部分，从米根霉分离丙酮酸羧化酶基因并研究其推测的蛋白与其它已知直向同源物的相关性。以双孢蘑菇(A.bisporus)(GenBank登录号：AJ276430)、土曲霉(GenBank登录号：AF097728)、巴斯德毕赤酵母(GenBank登录号：Y11106)和粟酒裂殖酵母(GenBank登录号：D78170)的丙酮酸羧化酶相关氨基酸序列的保守区域为基础合成两个简并的寡核苷酸引物。利用米根霉基因组DNA作为模板通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生了预测大小的产物(648bp)。利用基因特异性的且简并的引物利用另外的PCR反应从米根霉分离了丙酮酸羧化酶基因和cDNA片段。描述了cDNA、基因组DNA和蛋白的编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：1-2)(图3A-C)。

在YM琼脂平板(每升：3g酵母提取物，3g麦芽提取物，5g蛋白胨，10g右旋糖和20g琼脂)上维持米根霉菌株1526。在室温下伴随振荡(100到150rpm)在YML液体培养基(每升：3g酵母提取物，3g麦芽提取物，5g蛋白胨和10g右旋糖)中培养真菌或在30℃下在YM琼脂平板上培养真菌。

从米根霉的冷冻的孢子(-80℃)提取DNA和总RNA。利用Omniprep^TM纯化系统(Omniprep^TMpurification system，Geno Technology，Inc.，St.Louis，MO)或通过CTAB缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 7.5，1％混合的烷基三甲基溴化铵(Sigma，St.Louis，MO)，0.7M NaCl，10mM EDTA 1％β-巯基乙醇(v/v))加0.03％的蛋白酶K分离基因组DNA。用研钵和研棒研磨冷冻的孢子，并在CTAB缓冲液中进行提取，然后在65℃下孵育30分钟。加入一体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，轻轻混合5分钟，并在3,000rpm下离心20分钟。移去上清液并添加2/3体积的2-丙醇并如上再次离心。用75％乙醇洗涤沉淀的DNA并悬浮于0.5ml无菌水中。通过添加5μl的10mg/ml的RNA酶A并在37℃下孵育约30分钟而除去污染RNA。

利用RNAqueous^TM试剂盒(Ambion，Inc.，Austin，TX)分离总RNA，并利用PolyATtract^TM mRNA分离系统(PolyATtract^TM mRNA IsolationSystems，Promega Corporation，Madison，WI)从总RNA纯化mRNA。用于DNA和RNA电泳的方法已在其它地方被描述(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.，于Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验手册).Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，第1、2、3卷(1989))。

利用Taq DNA聚合酶(Life Technologies，Gaithersburg，MD)和基于来自Aspergillus agricarus、土曲霉、巴斯德毕赤酵母和粟酒裂殖酵母的丙酮酸羧化酶同源物的保守氨基酸序列的两个简并引物在GeneAmp PCRSystem 9700^TM(Applied Biosystems，Foster City，CA)中进行PCR。正向引物5′CARAGRAGRCAYCARAARGT 3′(SEQ ID NO：9)基于氨基酸序列“QRRHQKV”，反向引物5′TCRTCDATRAANGTNGTCCA 3′(SEQ IDNO：10)基于氨基酸序列“WTTFIDD”(其中Y＝T或C；R＝G或A；D＝A、G或T；N＝A、T、G或C)(SEQ ID NO：11)。简并引物用于TouchdownPCR中(Don，R.H.，等人，Nucleic Acids Res.19：4008(1991))以从米根霉基因组DNA扩增648-bp片段。Touchdown PCR在以下条件下进行：起始变性，94℃持续3分钟；38个循环的：变性，94℃持续30秒；退火持续30秒；和聚合作用，72℃持续2分钟。退火温度的范围从55℃到45℃，每三个循环降低1℃。然后进行14个循环的：94℃持续1分钟的变性；在45℃持续30秒的退火；和在72℃下持续2分钟的聚合作用。将PCR产物克隆到pGEM T-easy^TM载体中(Promega，Madison，WI)。利用丙酮酸羧化酶(PYC)基因特异性引物、基因组DNA或cDNA和其它简并引物分离另外的PCR产物。

按照生产商的说明(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)，利用GeneRacer^TM试剂盒确定丙酮酸羧化酶(PYC)cDNA的5′末端。使用PYC特异性寡核苷酸序列5′-CCAATACGACCGAGTTGATAGGATTCAT-3′(SEQID NO：12)引导第一链cDNA合成，然后利用序列5′-GCATAGATAATGTATCTTCATGA-3′(SEQ ID NO：13)的巢式引物通过PCR进行扩增。

自动化的荧光DNA测序在伊利诺斯大学厄巴纳-香槟分校，比较和功能基因组学W.M.Keck研究中心(W.M.Keck Center for Comparative andFunctional Genomics Facility，University of Illinois at Urbana-Champaign)进行。利用DNASTAR^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)对序列数据进行分析。

PYC的产物的开放阅读框，PYCp，为1178个氨基酸并具有130kD的分子量。PYCp与以下的丙酮酸羧化酶蛋白具有～61％到67％的总体同一性：酿酒酵母(Morris，C.P，等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.145：390-396(1987))；黑曲霉(Panneman，H.，Ruijter，GJ.G，Van den Broeck，H.C.和Visser，J.，未发表)；土曲霉(Li，Y.F.，Chen，M.C.，Lin，Y.H.，Hsu，C.C.和Tsai，Y.C.，未发表)；巴斯德毕赤酵母(Menendez，J.，等人，Yeast 14：647-654(1998))；和粟酒裂殖酵母(Saito，A.，等人，未发表)。遍及蛋白序列的相似性非常强(图2)。如同它们的酵母同源物一样(Lim，F.，等人，Arch.Biochem.Biophys.258：259-264(1987))，这些真菌蛋白之间的两个ATP结合结构域和生物素结合结构域是100％保守的，而丙酮酸结合结构域是89％保守的(图2)。PSORT程序(Nakai，K.，等人，Genomics 14：897-911(1992))强烈预测了米根霉丙酮酸羧化酶到细胞质的亚细胞定位。具有细胞质定位的PYCp的计算机计算概率为78％。PYC探针与利用不同的限制性酶(PstI、BamHI或EcoRI)消化的米根霉基因组DNA的印迹的杂交在一种情况下导致了单一条带，在其它情况下导致了多个条带。初步数据显示米根霉中可能存在该丙酮酸羧化酶基因的单一拷贝(图4)。

已显示通过米根霉进行的延胡索酸的产生由胞浆途径引起，在该途径中通过丙酮酸羧化酶将丙酮酸转化为草酰乙酸(Osmani和Scrutton，Ann NYAcad Sci 447：56-71(1985))。因此，该基因表达可通过导入多个拷贝或从强启动子来表达而增强，以提高C4二羧酸的产量。并且，该基因的破坏还可能导致米根霉产生乳酸期间产生的C4二羧酸减少。

实施例2：从米根霉NRRL菌株1526克隆丙酮酸羧化酶

在接种到延胡索酸生产培养基中48小时后收获菌丝体。利用实施例1中所列的RNAqueous^TM试剂盒从米根霉NRRL菌株1526分离总RNA。利用如实施例1中所列的GeneRacer^TM试剂盒使用总RNA生成cDNA。使用一个丙酮酸羧化酶特异性引物5′-ATAACGATGCCTGCTGCACC-3′(SEQID NO：14)和GeneRacer^TM试剂盒3′巢式寡聚dT引物5′CGCTACGTAACGGCATGACAGTG 3′(SEQ ID NO：15)来PCR扩增pyrCcDNA。从克隆自产乳酸米根霉NRRL 395的pyrC基因组序列设计pyrC-特异性引物(SEQ ID No：14)。扩增后，利用

SV凝胶(SV Gel)和PCR清洁系统(PCR clean-up system)(Promega Corporation，Madison，WI)纯化推定的pyrC cDNA。使用PCR-Script^TM AMP克隆试剂盒(Stratagene，La Jolla，California)将扩增子克隆到pPCRScript载体中。将pyrC cDNA亚克隆到pPUC19中，测序，并转化到大肠杆菌菌株JCL1242中(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶敲除)(Gokarn等人，Appl.Microbiol.Biotech.，2001(56)：188-195)。推定的pyrC cDNA补充了磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶缺陷以允许在葡萄糖上生长。证明PEP羧化酶缺陷的生物体在葡萄糖上生长后，将pyrC cDNA亚克隆(通过依赖连接的方法和不依赖连接的方法)到多种其它的载体中。

实施例3

尿嘧啶营养缺陷型已在产乳酸米根霉菌株中成功用作选择标记(Skory，2002)。为在米根霉延胡索酸产生者NRRL 1526中检验不同构建体，通过NTG诱变和随之在5-氟乳清酸上的筛选开发了尿嘧啶营养缺陷型菌株。通过在pyr225b载体(Skory，2002)中用野生型pyrG基因(GenBank登录号AF497632)进行遗传互补而验证两个菌株为pyrG突变体。使用这些菌株之一，命名为S3C6B，进行转化。

将来自米根霉菌株NRRL 1526的pyrC cDNA与米根霉TEF启动子(P_tef)通过不依赖连接的克隆而融合。将所得的融合产物和来自酿酒酵母的磷酸甘油酸激酶终止子(T_pgk)克隆到pyr225b中，生成(图5)并通过限制性酶消化和PCR进行验证。将所得的构建体，Ptef:pyrC:Tpgk pyr225b转化到米根霉1526的尿嘧啶营养缺陷型菌株(S3C6B)的孢子中。通过(Skory，2002)中概述的在PDS-1000He System(Bio-Rad，Hercules，CA)中利用基因枪粒子轰击使用0.6μm金颗粒以1/8″间隙距离进行转化。回收5种尿嘧啶原养型推定转化体。分别利用对pyrC和pyrG特异性的引物

GGACTTCACACTGCATGGC(SEQ ID NO：16)和

GCTTGTCTACCAATTAGGTGCA(SEQ ID NO：17)通过PCR验证菌丝体中Ptef:pyrC:Tpgk pyr225b DNA的存在。

将来自Ptef:pyrC:Tpgk pyr225b的pyrC/pyrG盒移到真菌附加型载体YEM7中，该载体含有由米根霉Ptef启动子驱动的米根霉延胡索酸酶基因的拷贝(克隆自米根霉NRRL 1526，GenBank登录号X78576)以生成质粒pyrC fum pyrG YEM7(图6)。该质粒如本实施例中所描述的进行转化。回收5个尿嘧啶原养型推定转化体，并分别利用对pyrG和Ptef:fum联结(junction)特异性的引物，CCGAGCCACAGATCAGGAAT(SEQ ID NO：18)和GCAGAAGCTCGCAACATGGCTATGATGAA(SEQ ID NO：19)，通过PCR来验证pyrC fum pyrG YEM7DNA的存在。

应理解本发明不限于概述中所公开的实施方案，且意在覆盖如权利要求书所定义的本发明的精神和范围内的变化形式。

Claims

1.一种分离的或重组的多核苷酸，所述多核苷酸包括选自由以下组成的组的序列：

编码包括SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列；

与所述编码包括SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列完全互补的核苷酸序列；和

在严格条件下与所述与所述编码包括SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列完全互补的核苷酸序列杂交的序列，所述严格条件包括65℃下0.2×SSC。

2.如权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，所述多核苷酸还包括与所述多核苷酸序列可操作地连接的启动子。

3.如权利要求1或权利要求2所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述编码包括SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列是SEQ ID NO：1。

4.一种载体，所述载体包括权利要求1-3中任一项所述的分离的或重组的多核苷酸。

5.如权利要求4所述的载体，其中所述多核苷酸序列选自由开放阅读框、编码反义RNA的序列和编码干扰RNA的序列组成的组。

6.一种载体，所述载体包括：

启动子；和

用于表达根霉属(Rhizopus)来源的丙酮酸羧化酶蛋白的元件。

7.如权利要求6所述的载体，其中用于表达所述丙酮酸羧化酶蛋白的所述元件包括SEQ ID NO：1。

8.如权利要求6或权利要求7所述的载体，其中用于表达所述丙酮酸羧化酶蛋白的所述元件包括编码SEQ ID NO：2的多核苷酸序列。

9.如权利要求6-8中任一项所述的载体，其中所述丙酮酸羧化酶是米根霉(Rhizopus oryzae)来源的。

10.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括权利要求6-9中任一项所述的载体。

11.如权利要求10所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自由以下组成的组的属的：根霉属、酵母属(Saccharomyces)、链霉菌属(Streptomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、曲霉属(Aspergillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、棒状菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、变形菌属(Proteus)、肠杆菌属(Enterobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)和肠球菌属(Enterococcus)。

12.如权利要求10或权利要求11所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是丝状真菌。

13.如权利要求10-12中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是曲霉属的。

14.一种产生C4二羧酸的方法，所述方法包括：

在培养基中培养用选自由以下组成的组的序列转化的重组细胞：SEQID NO：1；SEQ ID NO：1的全长互补序列；与SEQ ID NO：1具有至少95％序列同一性且编码具有丙酮酸羧化酶活性的多肽的序列；编码包括SEQ IDNO：2的氨基酸序列的多肽的序列；和编码具有丙酮酸羧化酶活性的多肽的多核苷酸的序列，其中该多核苷酸与多核苷酸SEQ ID NO：1的全长互补序列在严格条件下杂交，所述严格条件包括65℃下0.2×SSC；和

从所述培养基回收所述C4二羧酸。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述重组细胞是选自由以下组成的组的属的：根霉属、酵母属、链霉菌属、毕赤酵母属、曲霉属、乳杆菌属、大肠杆菌、棒状菌属、短杆菌属、假单胞菌属、变形菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、欧文氏菌属、黄单胞菌属、黄杆菌属、链球菌属、乳球菌属、明串珠菌属和肠球菌属。

16.如权利要求14或权利要求15所述的方法，其中所述重组细胞是丝状真菌。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述丝状真菌是曲霉属。

18.如权利要求14-17中任一项所述的方法，其中所述重组细胞是根霉属来源的。

19.如权利要求14-18中任一项所述的方法，其中所述C4二羧酸选自由苹果酸、延胡索酸和琥珀酸组成的组。

20.如权利要求14-19中任一项所述的方法，其中所述C4二羧酸是苹果酸。