CN102356770B - 气单胞菌除藻剂及其去除蓝藻水华的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种气单胞菌除藻剂及其去除蓝藻水华的应用。所述气单胞菌除藻剂是由气单胞菌Aeromonas sp.DS-1的发酵液经正丁醇萃取、再蒸发除去正丁醇制得的固态制剂；所使用的气单胞菌Aeromonas sp.DS-1，保藏编号为CCTCC No：M2011180，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。所述的气单胞菌除藻剂用于消除蓝藻水华，除藻剂使用剂量为2-300mg/L，能有效去除含105-109个细胞/L蓝藻的水华。
Description
技术领域
本发明涉及一种气单胞菌发酵制备的除藻剂及其去除水华蓝藻的应用，属于生物环保技术领域。
背景技术
目前我国很多淡水水体呈现严峻的富营养化态势，水华的频发严重影响了水体水质，对于源水会大大增加饮用水处理的难度，同时还会威胁到人类的健康，从而产生巨大的经济损失和社会危害。水华治理的物理方法是利用某些设备、器材在水体中设置特定的安全隔离区，分离水华水体中的水华藻类或利用机械装置来进行除藻的方法，如直接过滤、气浮除藻、围隔栅栏、超声波法、光隔离法等，这些方法不引进二次污染，但其投入的成本较高且不适于大面积操作。水华治理的化学方法是利用化学产品或者矿物质来抑制、杀死或去除水华生物的方法。化学方法是目前采用最多、发展最快的一类方法，归纳起来分为三大类：直接灭杀法、絮凝剂沉淀法和天然矿物絮凝法。化学法具有相对简单，能够大面积操作等优点，但多数除藻剂除藻效果不彻底，且对生态环境产生不利影响，成本较高。由于物理与化学除藻方法存在水处理成本较高、容易产生有毒副产物导致水体二次污染等原因而限制了它们在实际应用中的广泛性，近年来对环境友好的生物控藻法受到越来越多的关注。细菌溶藻技术作为一种有效的控藻技术，引起了国内外广泛的关注。细菌的溶藻方式主要分为两类：①直接溶藻，即细菌与藻细胞直接接触，甚至侵入藻细胞内从而溶藻；②间接溶藻，即细菌通过分泌某种代谢产物溶解藻类或通过营养竞争从而抑制藻类的生长，其中，通过胞外分泌物溶藻的方式较为多见。
发明内容
为了克服物理和化学办法控制水华中存在的上述问题，本发明提供一种生物来源的除藻剂及其制备方法，以及利用该除藻剂消除蓝藻水华的方法，该技术不但能有效控制蓝藻水华，而且成本低、操作简单、对环境不构成危害。
本发明的技术方案如下：
本发明使用的气单胞菌的菌种分类命名为Aeromonas sp.DS-1，保藏编号为CCTCCNo：M2011180，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武昌珞珈山，邮编430072；保藏日期为2011年5月23日。
本发明所述Aeromonas sp.DS-1菌种是从天然淡水水体中分离获得的分泌溶藻物质的细菌，经鉴定，该菌株为气单胞菌Aeromonas sp.，命名为Aeromonas sp.DS-1。筛选方法为：将天然淡水水样接种到牛肉膏蛋白胨的液体培养基中富集培养，然后将所得培养物在牛肉膏蛋白胨平板上进行划线分离，得到单一菌落，再将单一菌落分别在牛肉膏蛋白胨平板上扩大培养，最后将平板培养物接种到含淡水蓝藻的培养液中进行溶藻实验，筛选出能够抑制铜绿微囊藻、鱼腥藻生长的细菌菌株Aeromonas sp.DS-1。
一种气单胞菌除藻剂，是由气单胞菌Aeromonas sp.DS-1的发酵液经正丁醇萃取，再蒸发除去正丁醇制得的固态制剂；所使用的气单胞菌Aeromonas sp.DS-1，保藏编号为CCTCCNo：M2011180，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武昌珞珈山，邮编430072；保藏日期为2011年5月23日。
本发明所述的气单胞菌除藻剂，是按以下步骤发酵制备的：
(1)将气单胞菌Aeromonas sp.DS-1CCTCC No：M2011180的单菌落1～2环接种到20-100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃条件下180rpm/min转速下振荡培养24-48小时，将获得的菌液以5-10wt％的接种量接入100-1000mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃条件下180rpm/min转速下振荡培养30-40小时制得种子液；
(2)以5-10wt％的接种量将种子液接入5-20L牛肉膏蛋白胨液体培养基中；灭菌参数为121℃，20-30分钟；发酵条件为，pH6.5，溶解氧(DO)为70-90，发酵温度25-35℃，搅拌速度70-130转/分钟，发酵时间16-48小时；
(3)将上述发酵产物在转速6000～10000rpm/min条件下离心2～10min，弃沉淀除去Aeromonas sp.DS-1菌体细胞，收集上清液，取上清液用正丁醇萃取2次，取正丁醇萃取液旋转蒸发法除去正丁醇，得到气单胞菌除藻剂的固态制剂。
所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，去离子水1000ml。
所述的旋转蒸发法是采用旋转蒸发仪，控制温度40-60℃，转速50-100rpm/min，将正丁醇蒸发去除。旋转蒸发仪为本领域通用产品可市购。
根据本发明，优选的，一种气单胞菌除藻剂，是按以下步骤发酵制备的：
将气单胞菌Aeromonas sp.DS-1CCTCC No：M2011180单菌落1～2环接种到30-80mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃条件下180rpm/min转速下振荡培养30-40小时；将获得的菌液以5-10wt％的接种量接入100-1000mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃条件下180rpm/min转速下振荡培养30-40小时，制得种子液；将种子液以5-10wt％的接种量接入5-20L牛肉膏蛋白胨液体培养基中，灭菌参数为121℃，20分钟；发酵条件为pH6.5、DO为80，发酵温度30℃，搅拌速度120转/分钟，发酵时间36小时，将发酵液离心，转速8000rpm/min离心5min除去菌体细胞，取上清液用正丁醇萃取2次，取正丁醇萃取液以旋转蒸发法除去正丁醇后得到固态制剂。收集正丁醇供重复使用。
本发明制得的除藻剂的固态制剂含高效除藻物质，通过高效液相色谱-质谱分析表明，本发明制得的除藻剂含17种氨基酸及多种三肽、二肽，经实验证明本发明的除藻剂能有效地消除蓝藻，详见实施例部分。
本除藻剂经发光细菌毒性检测，方法参照GB/T15441-1995《水质急性毒性的测定发光细菌法》进行，受试最大剂量400mg/L，受试时间为15min，发光细菌发光损失小于5％，本除藻剂对发光细菌发光损失LD50大于2.2g/L，证明本除藻剂对生物无毒害作用。
本发明的除藻剂的应用，用于消除蓝藻水华。所述蓝藻藻种主要是淡水蓝藻。
除藻剂使用剂量为2-300mg/L，能有效去除含106-109个细胞/L蓝藻的水华。
对于藻细胞密度为106-107个/L蓝藻水华，除藻剂使用剂量为2-10mg/L。
对于藻细胞密度为108个/L蓝藻水华，除藻剂使用剂量为30-40mg/L。
对于藻细胞密度为109个/L蓝藻水华，除藻剂使用剂量为50-300mg/L。
所述水华蓝藻藻种主要是淡水蓝藻，包括铜绿微囊藻FACHB927、铜绿微囊藻FACHB975、鱼腥藻FACHB245。除藻剂使用剂量低时可延长处理天数，一般处理天数为1-4天，可以达到除藻率达90％以上。
本发明的有益效果是：所制备的除藻剂除藻活性高且稳定，在天然水体pH条件下，不受温度影响；因萃取过程使用的正丁醇可循环使用，制备成本较低；制备过程简便，产品使用安全，对环境无危害，可用于各类淡水水体去除有害蓝藻使用，包括湖泊、水库、景观池塘、农业养殖水等，属于环保型除藻剂。
附图说明
图1是本发明实施例1除藻剂高分辨率液相色谱-质谱检测氨基酸的色谱图。所含17种氨基酸附表1说明。
图2是本发明实施例2除藻剂高分辨率液相色谱-质谱检测主要成分的色谱图。所含三肽、二肽附表2说明。
具体实施方式
实施例使用的气单胞菌的菌种为Aeromonas sp.DS-1，保藏编号为CCTCC No：M2011180。
实施例中淡水蓝藻藻种是铜绿微囊藻FACHB927、铜绿微囊藻FACHB975、鱼腥藻FACHB245(中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库，武汉珞珈山东湖南路7号)。实施例中牛肉膏蛋白胨液体培养基配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，去离子水1000ml。实施例中的旋转蒸发仪(Buchi R-220型)，控制温度40-60℃，转速50-100rpm/min。
实施例1.
将气单胞菌Aeromonas sp.DS-1CCTCC No：M2011180单菌落1环接种到50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃条件下180rpm/min转速下振荡培养36小时，将获得的菌液以6wt％的接种量接入700mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃条件下180rpm/min转速下振荡培养36小时，制得种子液；以6wt％的接种量将种子液接种于10L发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基，培养基为发酵罐的70％体积。发酵培养，灭菌参数为121℃，20分钟；发酵参数为，pH6.5，DO为80，发酵温度30.0℃，搅拌速度120转/分钟，发酵时间36小时。将发酵产物8000rpm/min离心5min除去菌体细胞，上清液用正丁醇萃取2次，以旋转蒸发法除去正丁醇后获得固态制剂。
本除藻剂的高分辨率液质检测氨基酸的色谱图如图1所示，对应的氨基酸检测结果列于表1中。其中赖氨酸最低除藻浓度为10mg/L。
表1氨基酸检测结果
实施例2.
将气单胞菌Aeromonas sp.DS-1CCTCC No：M2011180单菌落2环接种到60mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃条件下180rpm/min转速下振荡培养38小时，将获得的菌液以8wt％的接种量接入900mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃条件下180rpm/min转速下振荡培养38小时，制得种子液；以8wt％的接种量将种子液接种于10L发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基，发酵气单胞菌Aeromonas sp.DS-1，灭菌参数为121℃，20分钟；发酵参数为，pH6.5，DO为80，发酵温度30.0℃，搅拌速度120转/分钟，发酵时间36小时。将发酵产物8000rpm/min离心5min除去菌体细胞，上清液采用回收的正丁醇萃取2次，以旋转蒸发法除去正丁醇后获得固态制剂，收集正丁醇重复使用，不影响萃取效率及制备结果。固态制剂溶于甲醇采用高分辨率液相色谱-质谱检测主要成分的色谱图见图2，其中三肽、二肽成分见表2。
表2除藻剂主要成分检测结果
其中符号：Asp天冬氨酸；Asn天冬酰胺；Glu谷氨酸；Gln谷氨酰胺；Pro脯氨酸；Thr苏氨酸；Ile亮氨酸；Val缬氨酸；Tyr酪氨酸；Lys赖氨酸；Ser丝氨酸。
实施例3
取处于适应期的铜绿微囊藻FACHB927培养液各1L，分别加入到反应器A、反应器B中，藻密度为1×106细胞/L，其中反应器A中添加0.002g实施例1的除藻剂，反应器B不加除藻剂作为对照。处理2天，分别从反应器A、反应器B中取水样测定藻细胞数量，反应器A中的水样除藻率达95％以上，对照组B的藻密度上升。
实施例4
取处于对数期的铜绿微囊藻FACHB927培养液各1L，分别加入到反应器A、反应器B中，藻密度为1×108细胞/L，其中反应器A中添加0.03g实施例1的除藻剂，反应器B不加除藻剂作为对照。处理1天，分别从反应器A、反应器B中取水样测定藻细胞数量，反应器A的水样除藻率达90％以上，对照组B藻密度上升。
实施例5
取处于稳定期的铜绿微囊藻FACHB927培养液各1L，分别加入到反应器A、反应器B中，藻密度为1×109细胞/L，其中反应器A中添加0.06g实施例2的除藻剂，反应器B不加除藻剂作为对照。处理2天，分别从反应器A、反应器B中取水样测定藻细胞数量，反应器A的水样除藻率达95％以上，对照组B藻密度变化不大。
实施例6
取处于稳定期的铜绿微囊藻FACHB927培养液各1L，分别加入到反应器A、反应器B中，藻密度为7×109细胞/L，其中反应器A中添加0.3g实施例2的的除藻剂，反应器B不加除藻剂作为对照。处理2天，分别从反应器A、反应器B中取水样测定藻细胞数量，反应器A的水样除藻率达100％，对照组B藻密度轻微上升。
实施例7
取处于对数期的铜绿微囊藻FACHB975培养液各1L，分别加入到反应器A、反应器B中，藻密度为1×109细胞/L，其中反应器A中添加0.05g实施例1的除藻剂，反应器B不加除藻剂作为对照。处理3天，分别从反应器A、反应器B中取水样测定藻细胞数量，反应器A的水样除藻率达96％，对照组B藻密度上升。
实施例8
取处于对数期的鱼腥藻FACHB245培养液各1L，分别加入到反应器A、反应器B中，藻密度为5×109细胞/L，其中反应器A中添加0.1g实施例1的除藻剂，反应器B不加除藻剂作为对照。处理3天，分别从反应器A、反应器B中取水样测定藻细胞数量，反应器A的水样除藻率达98％，对照组B藻密度上升。
Claims (9)
1.一种气单胞菌除藻剂，是由气单胞菌Aeromonas sp.DS-1的发酵液经正丁醇萃取，再蒸发除去正丁醇制得的固态制剂；所述气单胞菌Aeromonas sp.DS-1，保藏编号为CCTCCNo:M2011180，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武昌珞珈山，保藏日期为2011年5月23日；
是按以下步骤发酵制备的：
（1）将气单胞菌Aeromonas sp.DS-1CCTCC No:M2011180的单菌落1～2环接种到20-100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃条件下180rpm/min转速下振荡培养24-48小时，将获得的菌液以5-10wt%的接种量接入100-1000mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃条件下180rpm/min转速下振荡培养30-40小时，制得种子液；
（2）以5-10wt%的接种量将种子液接入5-20L牛肉膏蛋白胨液体培养基中；灭菌参数为121℃，20－30分钟；发酵条件为，pH6.5，溶解氧为70-90，发酵温度25－35℃，搅拌速度70-130转/分钟，发酵时间16-48小时；
（3）将上述发酵产物在转速6000~10000rpm/min条件下离心2~10min，弃沉淀除去Aeromonas sp.DS-1菌体细胞，收集上清液，取上清液用正丁醇萃取2次，取正丁醇萃取液旋转蒸发法除去正丁醇，得到气单胞菌除藻剂的固态制剂。
2.如权利要求1所述的气单胞菌除藻剂，其特征在于所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，去离子水1000ml。
3.如权利要求1所述的气单胞菌除藻剂，其特征在于所述的旋转蒸发法是采用旋转蒸发仪，控制温度40-60℃，转速50-100rpm/min,将正丁醇蒸发去除。
4.如权利要求1所述的气单胞菌除藻剂，其特征在于是按以下步骤发酵制备的：
将气单胞菌Aeromonas sp.DS-1CCTCC No:M2011180单菌落1～2环接种到30-80mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃条件下180rpm/min转速下振荡培养30-40小时，将获得的菌液以5-10wt%的接种量接入100-1000mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃条件下180rpm/min转速下振荡培养30-40小时，制得种子液；以5-10wt%的接种量将种子液接入5-20L牛肉膏蛋白胨液体培养基中；灭菌参数为121℃，20分钟；发酵条件为pH6.5、DO为80，发酵温度30℃，搅拌速度120转/分钟，发酵时间36小时，将发酵液离心，转速8000rpm/min离心5min除去菌体细胞，取上清液用正丁醇萃取2次，取正丁醇萃取液以旋转蒸发法除去正丁醇后得到固态制剂；收集正丁醇供重复使用。
5.权利要求1～4任一项所述的气单胞菌除藻剂的应用，用于消除蓝藻水华。
6.如权利要求5所述的气单胞菌除藻剂的应用，其特征在于所述除藻剂使用剂量为2-300mg/L，能有效去除含106-109个细胞/L的水华。
7.如权利要求5所述的气单胞菌除藻剂的应用，其特征在于对于藻细胞密度为106-107个/L蓝藻水华，除藻剂使用剂量为2-10mg/L。
8.如权利要求5所述的气单胞菌除藻剂的应用，其特征在于对于藻细胞密度为108个/L蓝藻水华，除藻剂使用剂量为30－40mg/L。
9.如权利要求5所述的气单胞菌除藻剂的应用，其特征在于对于藻细胞密度为109个/L蓝藻水华，除藻剂使用剂量为50-300mg/L。
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