CN102353772A - 检测糖精钠残留的酶联免疫试剂盒及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测糖精钠残留的酶联免疫试剂盒及使用方法。所述试剂盒包括包被糖精钠抗原的酶标板，酶标记糖精钠抗体工作液、糖精钠标准溶液、底物液、底物缓冲液、反应终止液、浓缩洗涤液。本发明同时公开了应用所述试剂盒检测糖精钠残留的方法，包括进行样品的前处理、利用试剂盒进行检测和结果的处理与分析等步骤。本发明提供的检测糖精钠的试剂盒采用直接竞争酶联免疫吸附分析技术，灵敏度高、稳定性好，大大简化了操作步骤和反应时间，减少了因操作复杂引起的误差，降低了成本，非常适合大量样品的筛查，具有重要的实际应用推广意义。

Description

检测糖精钠残留的酶联免疫试剂盒及使用方法

技术领域

本发明属于酶联免疫检测技术领域，具体涉及一种检测食品中糖精钠残留的酶联免疫检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

糖精钠（Saccharin sodium，SA），学名邻磺酰苯酰亚胺钠，又称可溶性糖精，是糖精的钠盐，带有两个结晶水，是最古老的人工合成甜味添加剂，甜度约为蔗糖的200至500倍，其十万分之一的水溶液即有甜味感，浓度过高会出现苦味。糖精钠于1878年被美国科学家发现，很快就被食品工业界和消费者接受。在食品中主要应用于饮料、果冻、凉果、蜜饯、果酱、糕点、蛋白糖等，它不被人体代谢吸收，除了在味觉上引起甜的感觉外，对人体无任何营养价值。相反，当食用较多的糖精钠时，会影响肠胃消化酶的正常分泌，降低小肠的吸收能力，使食欲减退。

制造糖精钠的原料主要有甲苯、氯磺酸、邻甲苯胺等，均为石油化工产品。甲苯易挥发和燃烧，甚至引起爆炸，大量摄入人体后会引起急性中毒，对人体健康危害较大；氯磺酸极易吸水分解产生氯化氢气体，对人体有害，并易爆炸；糖精钠生产过程中产生的中间体物质对人体健康也有危害。糖精钠在生产过程中还会严重污染环境。目前从部分中小糖精钠厂私自流入广大中小城镇、农村市场的糖精，还因为工艺粗糙、工序不完全等原因而含有重金属、氨化合物、砷等杂物。它们在人体中长期存留、积累，不同程度地影响着人体的健康。糖精钠是有机化工合成产品，是食品添加剂而不是食品。

由于食用糖精钠对人体带来一定的危害，所以西方一些发达国家都对糖精钠严格控制使用，其控制标准一般为不超过消费食糖总量的5％。我国与发达国家相比，我国糖精钠使用量超出正常使用量的14倍。更有专家发出警告，至1999年下半年，全国糖业市场上糖精钠的份额己高达市场总份额的55％~60％，严重挤占了蔗糖的份额。一些企业为了追逐利润，在生产饮料和加工食品过程中，超量、超范围使用糖精钠，但在食品和饮料标签上却不注明含有糖精钠及其真实含量，使消费者却误以为吃的是食糖，损害了消费者的身体健康，也严重侵犯了消费者的知情权。特别是有少数的消费者在完全不知道糖精钠危害的情况下，短时间内食用大量糖精钠，引起血小板减少而造成急性大出血、多脏器损害等，引发恶性中毒事件。在中国广大的中小城镇和农村市场上，糖精钠的使用达到了泛滥的地步。据中国消费者协会近年来对国内近百种不同档次、类型的饮料的调查表明，就全国范围而言，大约有61.2％的饮料中含有各类甜味剂，其中含糖精钠的饮料达55.1％；有23.5％的饮料在生产中使用了糖精钠但却未在标签中标明；特别是在中小城镇和农村市场上，含有糖精钠的饮料高达90.9%，糖精钠泛滥程度令人触目惊心。此外，一些中小学校周围遍布的各种小食摊，卖各类小食品及饮料基本上都含有糖精，如汽水、雪糕、话梅等，既无生产标准又没有标识出处，长期食用，会导致青少年营养不良，对青少年的身体发育产生负面影响。

一直以来，有关食用糖精钠安全性问题颇受争议。1958年，美国食品药品管理局（FDA）开始对食品添加剂的使用进行管理，当时糖精钠已经能够在美国广泛使用了，因此它被列入最早的675种“公认安全”（GRAS）的食品原料名单之中。1972年，美国FDA根据一项长期大鼠喂养实验的结果决定取消糖精钠的“公认安全”资格。1977年，加拿大的一项多代大鼠喂养实验发现，大量的糖精钠可导致雄性大鼠膀胱癌。为此，美国FDA提议禁止使用糖精钠，但这项决定遭到国会反对，并通过一项议案延缓禁用。1991年，美国FDA根据一些研究结果撤回了禁止糖钠精使用的提议。但由于上述原因，在美国使用糖精钠仍需在标签上注明“使用本产品可能对健康有害，本产品含有可以导致实验动物癌症的糖精钠”。在国际上，糖精钠的使用也因为这些关于大鼠致癌的研究发表后受到一定影响，欧美国家糖精的使用量不断减少。目前JECFA规定糖精钠的ADI值为每日每千克体重0～5mg。

自从1973年，我国就开始对糖精钠的毒性进行了一系列的流行病学和毒理方面的研究，并进行糖精铺与膀胱癌关系的调查。国内外关于糖精钠安全发生的争议延续至今，未取得一致意见。由于我国人民生活水平的现状，糖精钠的需求也略呈上升趋势。在我国目前无更安全、非生热量甜昧剂完全替代的情况下，为确保人民身体键康，糖精钠作为食品添加剂，国家标准GB2760-86规定：糖精钠用于酱菜、调味酱汁、浓缩果汁，蜜饯、配制酒、冷饮，糕点、饼干、面包中，最大限量为0.15g/kg （浓缩果汁按浓缩倍数的80%加入），凉果最大限量为5.0 g/kg。同时，卫生部《食品添加剂卫生管理办法》（1987）还规定：“专供婴儿的主辅食品除按规定可加入强化剂外，不得加入人工合成甜昧剂、色素、香精、谷氨酸钠及不适宜的添加剂等”。另外，病人食品和大量食用的主食（例如馒头，发糕等）也都不应使用糖精钠。

通常，检测糖精钠的方法主要有高效液相色谱法（HPLC），气相色谱法(GC)，薄层色谱法（TLC）、分光光度法、电位滴定法、电化学分析法等等。HPLC法是糖精钠残留检测的确证方法，其优点是检测精确度高， 但因其仪器化程度高、检测时间长、过程繁琐、检测费用昂贵等而阻碍其推广应用，而酶联免疫分析（ELISA）快速检测技术因成本低、操作简单、速度快、一次检测样本量大、仪器化程度低，值得我们推广成为常用的筛选方法。

目前国内外未有商品化的糖精钠ELISA检测试剂盒，有关糖精钠免疫分析技术（IA）也鲜有报道，只有一篇关于糖精钠残留间接竞争ELISA方法检测的文献报道（Wang Y等，2011）。但是存在设计原理的问题和稳定性差、检测步骤复杂等缺点。其采用间接竞争ELISA法，在微孔条上预包被上偶联抗原，加入样本与糖精钠抗体，样本中的糖精钠将和微孔条上预包被偶联抗原竞争糖精钠抗体，经过孵育及洗涤步骤，然后加入酶标记物，再经过孵育及洗涤步骤后显色定量，操作步骤繁琐，至少需8个步骤。由于操作复杂、步骤多，生产与保存成本高，很难满足实际应用的需求。

另外，目前也未检索到有关糖精钠免疫方法相关技术文献，发明名称为“滴定法测定糖精钠中和液含量的检测方法”的中国专利申请（申请号200710150236.3）公开了一种糖精钠酶检测方法，采用滴定法测定糖精钠中和液含量的检测方法，该方法包括以下步骤：首先精确称取0.5克糖精钠中和液于100毫升三角烧瓶中，加入10毫升醋酸酐加热至沸腾，冷却后加入20毫升冰醋酸；然后滴入结晶紫指示剂三滴，再用全自动滴定管将0.1mol/L标准高氯酸非水滴定剂滴入上述溶液,至该溶液呈蓝绿色即为终点；然后计算糖精钠的含量。该方法存在不能同时批量测定糖精钠，而且准确性差，灵敏度低等缺陷。

总之，目前国内外现有糖精钠采用的仪器检测方法复杂、繁琐，很难应用于实践，且现有其他检测方法产品由于普遍存在稳定性差、准确度低、样品前处理及检测步骤复杂、设备条件要求较高、价格昂贵等不足，严重影响了糖精钠残留检测与监控，因此研制稳定性高、操作简单、设备要求低、廉价的ELISA试剂盒对于准确快速、高批量检测糖精钠具有非常重要的经济和社会意义。

发明内容

本发明的一个目的是针对现有糖精钠检测产品的技术不足，提供一种高特异性、高灵敏度、价格低廉、操作简单，能大批量快速检测糖精钠的酶联免疫检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供利用上述酶联免疫试剂盒检测糖精钠残留的方法。

为了实现上述目的，本发明设计如下检测思想：首先将糖精钠抗原包被于固相载体（酶标板）上，然后加入标样或待测样品，再加入酶标记糖精钠抗体，包被抗原与待测样品中的糖精钠竞争酶标抗体，待测样品糖精钠含量高时，则与固相抗原结合的酶标抗体就少，反之结合在固相抗原上的酶标抗体就多，反应后加入底物进行显色加以测定，当酶标抗体量一定时，加入的待测样品含糖精钠越多，与固相抗原结合酶标抗体就越少，发色反应减弱，百分吸光度值低，反之，则发色反应增强，百分吸光度增高，因而根据百分吸光度值与糖精钠浓度之间的半对数关系作图即得标准曲线，再根据糖精钠的标准曲线和待检样品的百分吸光度值，即可推算出待测样品中糖精钠的浓度。

本发明的具体技术方案是：

提供一种检测糖精钠的酶联免疫试剂盒，包括：包被了糖精钠抗原的酶标板；酶标记糖精钠抗体工作液；糖精钠标准溶液；底物液；底物缓冲液；反应终止液；浓缩洗涤液；

所述酶标板是96孔或40孔酶标板，酶标板孔内包被有能与抗糖精钠抗体特异结合的糖精钠抗原，所述糖精钠抗原是使用碳二亚胺法（EDC）、活泼酯法（DCC、NHS）、混合酸酐法（氯甲酸异丁酯）将糖精钠与载体蛋白偶联得到的；所用的包被液为pH值为9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液（含1～2g碳酸钠和2～4g碳酸氢钠，双蒸水1L），封闭液为1～5％脱脂奶粉溶液；  

所述糖精钠抗体的制备过程中，所用的免疫原为采用活泼酯法（DCC、NHS）或混合酸酐法（氯甲酸异丁酯）将糖精钠半抗原与载体蛋白共价偶联合成得到的，以免疫抗原免疫兔子或小鼠，制备糖精钠多克隆抗体、利用杂交瘤技术制备糖精钠单克隆抗体或利用基因工程方法制备基因工程抗体。收集抗血清、腹水、发酵液等，用辛酸硫酸铵沉淀纯化或过亲和层析柱进行纯化。

所述酶标记糖精钠抗体工作液为采用戊二醛法或过碘酸盐氧化法将酶与糖精钠抗体进行偶联得到的。所用标记酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，本发明优选辣根过氧化物酶，且采用改良后的过碘酸盐氧化法进行标记，提高了标记效率，节省了酶与抗体的用量，保证标记后酶与抗体具有良好的活性。 

上述糖精钠标准溶液的浓度为：12800 μg/L、3200 μg/L、800 μg/L、200 μg/L、50 μg/L、0 μg/L。

所述底物显色液当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物液为含有3,3,5,5－四甲基联苯胺（TMB）或邻苯二胺（OPD）的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液，底物缓冲液为含有过氧化氢或过氧化脲的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液，所述终止液为1～2mol/L硫酸溶液或2mol/L氢氧化钠溶液；

当标记酶为细菌提取碱性磷酸酶时，所述底物液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述底物缓冲液为含有过氧化氢或过氧化脲的pH 5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液，所述终止液为1～2mol/L硫酸溶液或2mol/L的氢氧化钠溶液。

所述浓缩洗涤液为含0.5～1.5% 吐温20的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液pH值为7.4，浓度为0.1mol/L，为正常使用浓度的15～25倍。

可以作为固定糖精钠抗原的载体的物质较多，例如聚苯乙烯、硝酸纤维素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、交联葡萄糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。该载体的形式可以为凹孔、纸片、小珠等。

本发明所述抗原、抗体的制备方法具体陈述如下：

（一）抗原的合成

（1）半抗原的合成：

采用6-氨基糖精（6-ASA）（常规市购）作为糖精钠半抗原，分子式为C₇H₆N₂O₃S。

（2）包被原和免疫原的合成：

将糖精钠半抗原和牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、钥孔血蓝蛋白（KLH）等载体蛋白，通过碳二亚胺法（EDC）、活泼酯法（DCC、NHS）、混合酸酐法（氯甲酸异丁酯）进行偶联得到包被抗原与免疫原。免疫原与包被原通过柱层析进行纯化，纯度经SDS－PAGE电泳鉴定。

（二）糖精钠抗体的制备

（1）糖精钠单克隆抗体的制备

动物免疫：半抗原与载体蛋白偶联物为免疫原对Balb/c小鼠进行间隔免疫，间接ELISA检测并得到血液里含有糖精钠特异性抗体的小鼠脾脏。

细胞融合与克隆：取产生特异性抗体的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP20融合，采用间接竞争酶联免疫方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法或显微克隆法对阳性孔进行克隆化，得到并建立产单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠（8周龄）腹腔注入灭菌石蜡油，7～14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7～10天后采集腹水。经辛酸－饱和硫酸胺法或亲和层析法进行腹水纯化，纯度经SDS－PAGE电泳鉴定，小瓶分装，-20℃保存。

（2）糖精钠兔多克隆抗体的制备

本发明采用新西兰大白兔作为免疫动物，以糖精钠与载体蛋白偶联物为免疫原对新西兰大白兔进行免疫，多次免疫后测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸胺分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。

（3）糖精钠基因工程抗体的制备

基因工程抗体主要指小分子抗体，包括：Fab（由完整的轻链和Fd构成），Fv（由V_H和V_L构成），ScFv（单链抗体，V_H和V_L之间由一条连接肽连接而成），单域抗体（仅由VH组成）等经基因工程技术改造后的抗体。

提取分泌糖精钠单克隆抗体的杂交瘤细胞总RNA，反转录扩增cDNA第一链。以扩增的cDNA为模板，采用鼠源单链抗体可变区基因通用引物，利用PCR和重叠延伸PCR技术扩增单链抗体基因，插入表达载体pBV220，在大肠杆菌中表达。利用镍柱进行亲和纯化，SDS-PAGE电泳检测纯度。

所述鼠源单链抗体可变区基因通用引物的核苷酸序列如下：

V_H-Back：5′-CAG GTS MAR CTG CAG SAG TCW GG-3′；

V_H-For：5′-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT GCC-3′；

V_L-Back：5′-GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CCA-3′；

V_L-For：5′-CCG TTT TAT TTC CAG CCT GGT CCC-3′。

所述PCR条件为：94 °C 5 min，94 °C 1 min，54 °C 1 min，72 °C 1 min，25个循环，72 °C 10 min。

其中，酶标记糖精钠抗体的制备：

将糖精钠抗体与辣根过氧化物酶（HRP）采用过碘酸钠法进行偶联。具体方法为：

①溶解5mg HRP于1mL超纯水中，加入新配置的0.1mol/L过碘酸钠75μL，置室温或4℃冰箱反应20min或30min。

②反应完后装入透析袋，0.001mol/L pH4.0醋酸缓冲溶液4℃透析过夜，期间需更换透析液几次。

③将抗体用0.1mol/L碳酸缓冲液稀释至10mg/mL，另外用0.1mol/L碳酸缓冲液将活化好的HRP的溶液pH调至9.5。将0.5mL抗体加入HRP溶液中，置室温或4℃冰箱反应2h。

④加入100μL 4mg/mL硼氢化钠，4℃冰箱反应2h。

⑤对0.01mol/L PBS透析过夜，加入保存液-20℃保藏备用。

其中，酶标板的制备方法为：

用包被缓冲液将糖精钠抗原按需要稀释，向酶联板微孔中加入抗原稀释液，放入37℃环境进行孵育，再放入4℃环境中过夜孵育（得到的酶联板的稳定性好），倾去包被液，用洗涤液洗涤，然后在每孔中加入封闭液，37℃孵育，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

本发明还提供了利用上述酶联免疫试剂盒进行食品中糖精钠检测的方法，包括以下步骤：

（1）样品前处理；

（2）使用试剂盒检测；

（3）结果处理与分析。

步骤（1）所述待测样品前处理方法为：

a. 糕点样本处理：

将糕点粉碎，称取样品5g，加入15mL蒸馏水，震荡20min，5000r/min离心10min，取1mL上清至另一离心管，加入等量正己烷，震荡摇匀2min后，8000 r/min离心10min，吸走上层正己烷，用下清液直接检测，稀释倍数3应在结果计算中考虑。

b. 果酱样本处理：

称取样品5g，加入15mL蒸馏水，震荡20min，5000r/min离心10min，吸取上层清液用蒸馏水稀释5倍后直接检测。稀释倍数15应在结果计算中考虑。

c. 饮料类（汽水、果汁等）

汽水：取适量样品超声10min，除去CO₂后，称取样品5g，用蒸馏水稀释10倍后直接检测。稀释倍数10应在结果计算中考虑。

果汁：取适量样品5000r/min离心10min，称取样品5g后，用蒸馏水稀释10倍后直接检测。稀释倍数10应在结果计算中考虑。

d. 蜜饯、凉果类

将样品去核，将果肉绞碎，分别称取5.00g，加入30mL蒸馏水，浸泡2min后，再超声30min，5000r/min离心10min，取上清液分别用蒸馏水稀释10倍后直接检测。稀释倍数60应在结果计算中考虑。

使用试剂盒检测步骤为：

（1）将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温平衡；

（2）将标准品或待测样品加入已经包被有糖精钠抗原的酶标板孔内，然后每孔加入酶标记物，轻拍混匀，孵育；

（3）洗涤；

（4）每孔加入等量的底物缓冲液与底物液，轻拍混匀，避光孵育；

（5）每孔加入反应终止液，混合均匀，在波长450nm或492nm下，以空气为空白，酶标仪测定各孔吸光值；

检测结果处理与分析：

以所获标准样品吸光值的平均值计算百分吸光度值，以百分吸光度值为纵坐标，糖精钠准溶液浓度的半对数为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程。用同样的方法计算样品溶液的百分吸光度值，根据方程式求出对应样品的糖精钠浓度。所述百分吸光度值的计算式为：

百分吸光度值(%)=（B/B₀）×100

其中，B为标准溶液或样品的平均吸光值，B₀为0μg/L标准溶液的平均吸光度值。

所述检测结果的分析还可以利用计算机专业软件进行计算与分析。

本发明对糖精钠线性检测范围为50～12800μg/L，检测限为50μg/L，整个检测过程只需45min就可以完成。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的试剂盒采用直接竞争ELISA检测模式，采用高特异性、高亲合力的抗体，减少了操作步骤，提高了检测的灵敏度、准确度；采用包被抗原进行酶标板的包被，相对于抗体包被，更有利于达到较好的包被效果与较长的保存时间，从而提高了试剂盒检测的精密度与稳定性；另外本试剂盒利用酶标记抗体技术，将酶直接标记于糖精钠特异性抗体上，将糖精钠特异性抗体与酶两种最重要的反应物合二为一，不仅大大简化了操作步骤和反应时间，减少了因操作复杂引起的误差，而且无需在试剂盒内再配置抗抗体，同时也节约了糖精钠特异性抗体与酶的用量，从而大大降低了试剂盒的成本。基于以上优点本试剂盒非常适用于糖精钠残留的痕量分析与批量检测，具有重要的现实意义。

附图说明

图1为标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。本发明采用的试剂和材料及仪器，除非特别说明，皆为常规试剂和材料及仪器。

实施例1  抗原的制备

糖精钠抗原的制备：

a.将10mmol/L 6-氨基糖精（6-ASA）溶解在1mL的蒸馏水中，用0.1mol/L的盐酸调pH值至1.5，溶液用冰水冷却。加入1mL 30mmol/L的NaNO₂水溶液，磁力搅拌30min；

b.离心，取上清液，缓慢加入到7mL 6.8mg/mL的BSA或90mg/mL OVA载体蛋白硼酸盐缓冲溶液中，然后在磁力搅拌下反应过夜；

c.待反应完成后，装入透析袋，然后用0.9%生理盐水于4℃透析3天，透析液每天更换3次，得产物；

d.采用紫外扫描测定结合比（方法参照陈新建等 ，1998），将抗原浓缩保存或冻干保存得到糖精钠免疫原（6-ASA-BSA）和包被原（6-ASA-OVA），分装保存于-20℃的冰箱中。　

实施例2  抗体的制备

（1）糖精钠鼠单克隆抗体制备：

动物免疫程序：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以糖精钠半抗原与牛血清白蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为60μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，腹腔注射，间隔3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。

    细胞融合与克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按4：1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争酶联免疫方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用显微克隆法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成5×10⁶

个/mL的细胞悬液，分装于冻存管，在－70℃超低温冰箱中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠（8周龄）腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁶个/只，14天后采集腹水。用免疫层析法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存。

（2）糖精钠兔多克隆抗体的制备

本发明参照本技术领域常规方法，采用新西兰大白兔作为免疫动物，以糖精钠与载体蛋白偶联物为免疫原对新西兰大白兔进行免疫，多次免疫后测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸胺分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。

（3）糖精钠基因工程抗体的制备

基因工程抗体主要指小分子抗体，包括：Fab（由完整的轻链和Fd构成），Fv（由V_H和V_L构成），ScFv（单链抗体，V_H和V_L之间由一条连接肽连接而成），单域抗体（仅由VH组成）等经基因工程技术改造后的抗体。

提取分泌糖精钠单克隆抗体的杂交瘤细胞总RNA，反转录扩增cDNA第一链。以扩增的cDNA为模板，采用鼠源单链抗体可变区基因通用引物，利用PCR和重叠延伸PCR技术扩增单链抗体基因，插入表达载体pBV220，在大肠杆菌中表达。利用镍柱进行亲和纯化，SDS-PAGE电泳检测纯度。

所述鼠源单链抗体可变区基因通用引物的核苷酸序列如下：

V_H-Back：5′-CAG GTS MAR CTG CAG SAG TCW GG-3′；

V_H-For：5′-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT GCC-3′；

V_L-Back：5′-GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CCA-3′；

V_L-For：5′-CCG TTT TAT TTC CAG CCT GGT CCC-3′。

所述PCR条件为：94 °C 5 min，94 °C 1 min，54 °C 1 min，72 °C 1 min，25个循环，72 °C 10 min。

实施例3  酶标记糖精钠抗体的制备

辣根过氧化物酶HRP（购自Sigma公司）标记糖精钠抗体的制备采用过碘酸盐氧化法，具体方法为：

a.溶解5mg HRP于1mL超纯水中，加入新配置的0.1mol/L过碘酸钠75μL，置室温或4℃冰箱反应20min或30min。

b.反应完后装入透析袋，0.001mol/L pH4.0醋酸缓冲溶液4℃透析过夜，期间需更换透析液几次。

c.将糖精钠抗体用0.1mol/L碳酸缓冲液稀释至10mg/mL，另外用0.1mol/L碳酸缓冲液将活化好的HRP的溶液pH值调至9.5。将0.5mL抗体加入HRP溶液中，置室温或4℃冰箱反应2h。

d.加入100μL 4mg/mL硼氢化钠，4℃冰箱反应2h。

e.对0.01mol/L PBS透析过夜，加入保存液-20℃保藏备用。

实施例4  酶联免疫试剂盒组分的配制

（1） 浓缩洗涤缓冲液的配制：含 0.5～1.5% 吐温20的磷酸盐缓冲液（pH值为7.4，0.1mol/L），为正常使用浓度的15～25倍。

（2）封闭液的配制：脱脂奶粉1.0～5.0 g溶于100mL蒸馏水。

（3）底物缓冲液的配制：30％过氧化氢30μL溶于19mL的pH5.0磷酸-

柠檬酸缓冲液（0.2M Na₂HPO₄25.7mL，0.1M 柠檬酸24.3mL，加蒸馏水50mL）中，4℃保存。

（4）底物液的配制：将3,3,5,5－四甲基联苯胺（TMB）80mg 溶于10mL 

pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲液（0.2M Na₂HPO₄25.7mL，0.1M 柠檬酸24.3mL，加蒸馏水50mL）中，4℃保存。

（5）酶标板微孔板的包被：包被抗原用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液（含1～2g碳酸钠和2～4g碳酸氢钠，双蒸水1L）稀释成0.1～5ug/mL，在酶标板的每孔加100uL，37℃包被1h 后4℃下包被过夜，倾去包被液，用PBST洗涤3次，拍干，然后在每孔中加入200uL1.0～5.0%脱脂奶粉，放入37℃温箱中1h后用PBST洗涤3次，干燥后封入铝箔袋中4℃保存。

（6）糖精钠标准溶液的配制：准确称取糖精钠标样12.8mg，溶于0.1L缓冲液中，然后用去离子水稀释分别配制12800μg/L、3200μg/L、800μg/L、200μg/L、50μg/L糖精钠溶液，另外去离子水配制0μg/L对照样，4℃保存。

（7）试剂分装：各种试剂按要求配制，测定合格后无菌分装。酶标记糖精钠抗体工作液7mL/瓶，糖精钠标准样品1mL/瓶，底物液7mL/瓶，底物缓冲液7mL/瓶，终止液7mL/瓶，浓缩洗液50mL/瓶。分装后贴标签，注明批号和有效期，4℃保存。

（8）试剂盒的组装：分别将可拆卸包被好包被抗原的微孔板1块，酶标记糖精钠抗体工作液、底物液、底物缓冲液、终止液、浓缩洗液、各1瓶，糖精钠标准溶液6瓶，使用说明书1份置试剂盒内指定位置。试剂盒检验合格后封装，4℃保存。

实施例5  酶联免疫试剂盒组分的配制

实验步骤同实施例4，不同的是采用购自Sigma公司的碱性磷酸酶为标记酶，所述底物液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述底物缓冲液为含有过氧化氢或过氧化脲的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液，所述终止液为1～2mol/L硫酸溶液或2mol/L的氢氧化钠溶液，按照实验室常规方法配制。

实施例6  检测糖精钠的酶联免疫试剂盒的组建

组建检测糖精钠的酶联免疫试剂盒，包含下述组分：

（1）包被糖精钠抗原的酶标板的96孔酶标板；或根据产品需要选用40

孔酶标板；

（2）辣根过氧化物酶标记糖精钠单克隆抗体，7mL/瓶；

（3）糖精钠标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、50μg/L、200μg/L、

800μg/L、3200μg/L、12800μg/L，1mL/瓶；

（4）底物缓冲液，7mL/瓶；

（5）底物液，7mL/瓶；

（6）终止液，7mL/瓶；

（7）浓缩洗涤液，50mL/瓶；

（8）使用说明书，1份；

（9）盖板膜，2张；

（10） 自封袋（含干燥剂），1个。

实施例7 应用实施例

一、样品前处理

（1）糕点样本处理：

将糕点粉碎，称取样品5g，加入15mL蒸馏水，震荡20min，5000r/min离心10min，取1mL上清至另一离心管，加入等量正己烷，震荡摇匀2min后，8000 r/min离心10min，吸走上层正己烷，用下清液直接检测，稀释倍数3应在结果计算中考虑。

（2）果酱样本处理：

称取样品5g，加入15mL蒸馏水，震荡20min，5000r/min离心10min，吸取上层清液用蒸馏水稀释5倍后直接检测。稀释倍数15应在结果计算中考虑。

（3）饮料类

汽水：取适量样品超声10min，除去CO₂后，称取样品5g，用蒸馏水稀释10倍后直接检测。稀释倍数10应在结果计算中考虑。

果汁：取适量样品5000r/min离心10min，称取样品5g后，用蒸馏水稀释10倍后直接检测。稀释倍数10应在结果计算中考虑。

（4）蜜饯、凉果类

将样品去核，将果肉绞碎，分别称取5.00g，加入30mL蒸馏水，浸泡2min后，再超声30min，5000r/min离心10min，取上清液分别用蒸馏水稀释10倍后直接检测。稀释倍数60应在结果计算中考虑。

二、试剂盒的检测方法

（1）将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温（20～24℃）平衡30min以上，将足够标准和样品所用数量的条板固定于支架，标准和样品做两个平行实验，按顺序编号。

（2）在标准品孔加入50μL标准品，样品孔加入50μL待测样品。然后每孔加入50μL酶标记物，轻拍混匀。盖上盖板膜，在室温孵育30min。

（3）倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每轮洗板拍打3次）以保证完全除去孔中的液体。用250μL蒸馏水充入孔中，再次倒掉微孔中的液体，再重复操作3遍。

（4）每孔加入100μL显色液（将底物缓冲液与底物液等体积混合），轻拍混匀，盖上盖板膜，暗处室温孵育15min。

（5）加入50μL反应终止液到微孔中。混合好在波长450nm（以空气为空白）测定各孔吸光值，必须在加入终止液后60min内读取吸光值。

检测结果计算与分析：

以所获标准样品吸光值的平均值计算百分吸光度值，以百分吸光度值为纵坐标，糖精钠标准溶液浓度的半对数为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程。见附图1。Y=-18.395x+102.43；R²=0.9973。用同样的方法计算样品溶液的百分吸光度值，根据方程式求出对应样品的糖精钠浓度。所述百分吸光度值的计算式为：

百分吸光度值(%)=（B/B₀）×100

其中，B为标准溶液或样品的平均吸光值，B₀为0μg/L标准溶液的平均吸光度值。

    检测结果的分析还可以利用计算机专业软件进行计算与分析，对糖精钠线性检测范围为50～12800μg/L，检测限为50μg/L，整个检测过程只需45min就可以完成。

实施例8  试剂盒精密度与准确度试验

1、标准品溶液重复性试验

从3批按照实施例4（6）中的方法制备的酶标板中，各抽出20个微孔，测定800μg/L标准溶液的吸光度值（OD值），重复20次，计算变异系数CV％，结果见表1。

表1 标准品溶液重复性试验

结果表明试剂盒标准品检测的批内变异系数范围在4.7～6.2％之间，批间变异系数为8.4％。

2、样本重复性与准确度试验

准确度是指测得值与真值的符合程度，在ELISA测定中，准确度常以回收率表示，精密度常以变异系数来表示。在空白糕点中，将糖精钠添加至终浓度为0.5mg/kg、1mg/kg、在空白果酱中，将糖精钠添加至终浓度为3mg/kg、6mg/kg、蜜饯、凉果中，将糖精钠添加至终浓度为5mg/kg、10mg/kg，在空白汽水、果汁中，将糖精钠添加至终浓度为0.2mg/L（mg/kg）、0.5mg/L（mg/kg），每个浓度各10个平行，测定3批。计算平均值、添加回收率及批内与批间变异系数。结果见表2。

表2样本重复性与准确度试验结果

结果表明糕点、果酱、汽水、果汁、蜜饯、凉果样本的添加回收率在82.2～113.6％之间，批内变异系数在3.2～10.4％之间，批间变异系数在8.6～13.5％之间。

实施例9 保存期试验

（1）将试剂盒放置于2～8℃，分别取0、2、4、6、8、9、10、11和12个月的试剂盒，对糖精钠标准样品（800μg/L）的吸光度值、50％抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。

（2）将试剂盒在37℃保存的条件下放置12天，每天对糖精钠标准样品（800 μg/L）的吸光度值、50％抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。

（3）将试剂盒在－20℃冰箱保存12天，每天对糖精钠标准样品（800μg/L）的吸光度值、50％抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。

从结果可看出，经过三种条件保存试验，糖精钠标准样品（800μg/L）的吸光度值下降小于6％，且OD不低于1.4；50％抑制率在302.3～311.4μg/L之间；

添加回收率在82～112％之间；批内变异系数小于12％；各项指标均符合质量要求，因此，试剂盒可以在2～8℃保存12个月。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  华南农业大学

 

<120>  检测糖精钠残留的酶联免疫试剂盒及使用方法

 

<130> 

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  23

<212>  DNA

<213>  引物V H-Back

 

<400>  1

caggtsmarc tgcagsagtc wgg                                             23

 

 

<210>  2

<211>  24

<212>  DNA

<213>  引物V H-For

 

<400>  2

tgaggagacg gtgaccgtgg tgcc                                            24

 

 

<210>  3

<211>  24

<212>  DNA

<213>  引物V L-Back

 

<400>  3

gacatcgagc tcactcagtc tcca                                            24

 

 

<210>  4

<211>  24

<212>  DNA

<213>  引物V L-For

 

<400>  4

ccgttttatt tccagcctgg tccc                                            24

Claims (9)

1.一种检测糖精钠残留的酶联免疫试剂盒，其特征在于包含下列各成分：

（1）包被了糖精钠抗原的酶标板；

（2）酶标记糖精钠抗体工作液；

（3）糖精钠标准溶液；

（4）底物液；

（5）底物缓冲液；

（6）反应终止液；

（7）浓缩洗涤液；  

其中，所述酶标板包被有能与抗糖精钠抗体特异性结合的糖精钠抗原，并封闭微孔表面未吸附糖精钠抗原的位点；

所述糖精钠抗原是采用6-氨基糖精与载体蛋白偶联得到；

所述糖精钠抗体为糖精钠单克隆抗体、兔多克隆抗体或基因工程抗体的任意一种；

所述酶标记糖精钠抗体工作液是将标记酶与糖精钠抗体进行偶联得到，所述标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取的碱性磷酸酯酶。

2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物液为含有3,3,5,5－四甲基联苯胺或邻苯二胺的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液，所述底物缓冲液为含有过氧化氢或过氧化脲的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液，所述终止液为1～2mol/L硫酸溶液或2mol/L氢氧化钠溶液。

3.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述标记酶为细菌提取的碱性磷酸酯酶时，所述底物液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述底物缓冲液为含有过氧化氢或过氧化脲的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液，所述终止液为1～2mol/L硫酸溶液或2mol/L的氢氧化钠溶液。

4.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述浓缩洗涤液为含0.5~1.5% 吐温20的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液pH值为7.4，浓度为0.1mol/L。

5.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述糖

精钠标准溶液的浓度分别为： 12800μg/L、3200μg/L、800μg/L、200μg/L、50μg/L、0μg/L。

6.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述酶标板是96或40孔酶标板。

7.一种权利要求1、2、3、4、5或6任一项所述酶联免疫试剂盒的应用，其特征在于应用于检测饮料、果冻、凉果、蜜饯、果酱、糕点或蛋白糖中的糖精钠残留方面。

8.一种权利要求1所述酶联免疫试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)待测样品的前处理；

(2)将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温平衡；将标准品或待测样品加入已经包被有糖精钠抗原的酶标板孔内，每孔加入酶标记物，轻拍混匀，孵育；洗涤；每孔加入等量的底物缓冲液与底物液，轻拍混匀，避光孵育；每孔加入反应终止液，混合均匀，在波长450nm或492nm下，以空气为空白，酶标仪测定各孔吸光值；

(3)结果处理与分析。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于步骤（1）所述待测样品为糕点、果酱、饮料、蜜饯肉或凉果肉。

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