CN102353730A - 基于生物酶技术的低聚半乳糖检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种食品工程技术领域的基于生物酶技术的低聚半乳糖检测方法，首先采用三氯乙酸及乙酸铅脱蛋白质法对待测对象进行预处理后通过膜过滤去掉杂质获得待测样品，然后用不同浓度的氢氧化钠和乙酸钠进行离子交换和梯度洗脱，最后用四电位脉冲安培检测器进行检测。本发明适用于含低聚半乳糖的牛乳及低聚半乳糖溶液体系中各种低聚半乳糖成分的分离和检测，采用离子色谱法，利用离子交换和梯度洗脱的方法对低聚半乳糖进行分离，配合四电位脉冲安培检测器进行检测，能够除掉样品中的蛋白质、脂肪以及可能存在的乳化剂等大分子物质对分析柱、检测器等的污染和干扰，使检测精准、快速。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种食品工程技术领域的方法，具体是一种基于生物酶技术的低聚半乳糖检测方法。
背景技术
低聚半乳糖(Galacto-oligosaccharide，GOS)是以乳糖为底物，在具有半乳糖基转移活性的酶β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)的作用下，首先将乳糖水解成半乳糖和葡萄糖，然后再将半乳糖转移到乳糖的半乳糖基上生成的一类含有2～5个单糖分子的低聚糖，分子式为(Gal)n-Glu，n＝2～4。低聚半乳糖的生物酶法生成过程见图1所示。
在自然界，动物的乳汁中存在微量的低聚半乳糖，母乳中含量稍多。已证实的低聚半乳糖有几十种，结构主要包括二糖(β-D-Gal-(1→6)-D-Glc、β-D-Gal(1→6)-D-Gal、β-D-Gal(1→3)-D-Gal，β-D-Gal(1→3)-D-Glc)；三塘(β-D-Gal(1→6)β-D-Gal(1→4)-D-Glc、β-D-Galp(1→3)-β-D-Gal(1→4)-D-Glc 、β-D-Galp(1→6)-β-D-Glc(1→2-D-Gal 、β-D-Gal(1→3)-β-D-Gal(1→6)-D-Glc)；四糖(β-D-Gal(1→6)-β-D-Gal(1→6)-β-D-Gal(1→4)-D-Glc、β-D-Gal(1→6)-β-D-Gal(1→3)-β-D-Gal(1→4)-D-Glc)和五糖(β-D-Gal(1→6)-β-D-Gal(1→6)-β-D-Gal(1→4)-β-D-Gal(1→4)-D-Glc)等。
低聚半乳糖具有许多独特生理功能，例如：1)促使双歧杆菌的增殖，从而抑制有害细菌；2)减少有毒发酵产物及有害细菌酶的产生、抑制病原菌和腹泻，摄入低聚半乳糖，可有效地减少有毒发酵产物及有害细菌酶的产生。3)防止便秘；4)增强免疫力、抗肿瘤；5)保护肝功能；6)合成维生素、促进钙的消化吸收；7)低能量、不会引起龋齿。
近年来，由于低聚半乳糖具有的独特功能而成为一个新的研究热点，作为一种食物配料被广泛应用于乳制品、乳酸菌饮料、双歧杆菌酸奶、谷物食品和保健食品中，尤其是应用于婴幼儿和老年人的食品中。
各种低聚半乳糖之间结构、性质相似，尤其是在其制备过程中，不免要生成葡萄糖、半乳糖以及残留部分乳糖，且相同分子量的半乳糖之间不易分离纯化，因此作为功能性成分而添加的GOS是一个单糖、乳糖及多种GOS的混合物。通过普通的分离和检测方法很难实现对这些物质的进行分离和检测，那么也就不能确定添加量和主要功能成分。
迄今为止，专一性的分离和检测低聚半乳糖的方法未见报道。通常都是参考低聚糖的分离检测方法，主要有：毛细管电泳法、高效液相色谱法、分光光度法、连续流动分析和气相色谱分析。
离子色谱法是分离和检测低聚半乳糖的一个选择。其检测器一般采用电化学检测器，其原理在于：在碱性条件下，糖类的羟基带电荷。羟基的数量、位置的不同而带电性不同。因此可以通过离子交换，检测其带电性来分离和检测不同的糖类。
早在1986年，就有采用脉冲安培检测技术，将普通的安培检测器改进成三电位的脉冲安培检测器，检测样的信号仅为第一个脉冲电势(糖的氧化检测)，而第二、三个电位分别是清洗电位(使电极表面吸附的氧化产物脱离电极表面)和再活化电位(使电极表面还原为原初状态)，通过三个电位的循环，维持电极的活性，使之成为较好的糖分析方法。早期的三电位检测法很快被美国戴安公司(Dionex)采用，并推出了三电位安培检测器和专门进行糖分析的阴离子色谱柱等专利产品。但该方法也并不完美，清洗电位的使用容易导致电极表面发生化学腐蚀和金电极表面凹陷，从而使灵敏度下降。近年来，戴安公司又推出了四电位积分脉冲安培检测法，即在实验过程中使用四个不同的电位，即糖的氧化(糖的检测)、电极还原清洗(使电极表面吸附的氧化产物脱离电极表面)、电极氧化清洗(使电极表面氧化)和电极表面活化电位(使电极表面还原为原初状态)。该点位具有灵敏度高、重现性好的优点，基本上消除了电化学腐蚀和金电极表面的凹陷现象。
该方法灵敏度高，如果所用的流动相和检验样品不是特别纯，微小的杂质也能够被分离和检测到，进而尽可能地消除了干扰。实验结果证明该方法可靠，能够将低聚糖混合物中各种低聚半乳糖有效地分离并准确地检测含量，为具有生物活性的低聚半乳糖产品的应用奠定了基础。
经过对现有技术的检索发现，现有文献多是参考糖的检测方法，主要使用高效液相色谱法、分光光度法和气相色谱法。这些方法能够检测葡萄糖、果糖、蔗糖和总糖量。但是该现有技术不能够将生物酶法制备过程中生成的各种低聚半乳糖分离并检测含量。因为生物酶法制备过程中生成的各种低聚半乳糖之间结构相似，性质相近。近尤其是在其制备过程中，生成的半乳糖以及残留部分乳糖很容易相互结合生成新的低聚半乳糖。因此作为功能性成分的低聚半乳糖是一多种糖的混合物。通过普通的检测方法很难实现对这些物质的进行分离和检测，那么也就不能确定量和主要功能成分。经过检索国家知识产权局数据中心(www.sipo.gov.cn)、世界产权组织(www.wipo.int)、欧洲专利局(www.espacenet.com)和美国专利商标局(www.uspto.gov)没有发现与专利申请文件相同的专利授权。
李建文、王竹和杨月欣2006年发表的“高效离子色谱法测定糖浆中低聚半乳糖含量”(“卫生研究”2006年第5期)记载了一种在AOAC2001.02方法基础上以高效离子色谱-脉冲安培检测可溶性膳食纤维糖浆中的低聚半乳糖的方法。该技术能够测定可溶性膳食纤维糖浆中的半乳糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和果糖和低聚半乳糖总量。但是还不能将结构相似、性质相的各种低聚半乳糖进行有效分离并检测各个低聚半乳糖的含量。文章中未见实际的分析图谱，只是标准品检测图谱。而且分子量相同的半乳糖和葡萄糖分离效果欠佳。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种基于生物酶技术的低聚半乳糖检测方法，适用于含低聚半乳糖的牛乳及低聚半乳糖溶液体系(即不含蛋白质、脂肪、矿物质等，只含低聚半乳糖)中各种低聚半乳糖成分的分离和检测。能够减少或避免前面所提到的生物活性低聚半乳糖产品难以确定功能性成分及其添加量的问题，本发明采用离子色谱法，利用离子交换和梯度洗脱的方法对低聚半乳糖进行分离，配合四电位脉冲安培检测器进行检测，能够除掉样品中的蛋白质、脂肪以及可能存在的乳化剂等大分子物质对分析柱、检测器等的污染和干扰，使检测精准、快速。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明首先采用三氯乙酸及乙酸铅脱蛋白质法对待测对象进行预处理后通过膜过滤去掉杂质获得待测样品，然后用不同浓度的氢氧化钠和乙酸钠进行离子交换和梯度洗脱，最后用四电位脉冲安培检测器进行检测。
所述的待测对象是指：只含低聚半乳糖的牛乳及低聚半乳糖溶液体系。
所述的预处理是指：对待测对象中加入浓度为1％wt.的三氯乙酸溶液5毫升及2％wt.的乙酸铅溶液，摇匀，超声20min，4℃，15000rpm，离心10min，取上清液。
所述的膜过滤是指：通过0.22μm纤维素膜进行过滤后采用2.5cc，已经过10mL甲醇、15mL水活化的OnGuard II RP柱并弃去初始6mL样品后收集2mL待测样品。
所述的离子交换是指：使用配有GP50梯度泵、ED50电化学检测器Chromeleon色谱工作站的DX-600型离子色谱仪，采用4mm×250mm的CarboPacTMPA20分析柱和4mm×50mm的CarboPacTM PA20保护柱对低聚半乳糖进行分离。
所述的离子交换使用的流动相包括：色谱级超纯水、125mmol/L NaOH和2mol/L乙酸钠。
所述的离子交换和梯度洗脱的条件为：洗脱时间90分钟，流速为1mL/min，流动相依依次为7-90％wt.的125mmol/L NaOH，9.8-93.1％wt.的色谱级超纯水以及0.1-0.5％wt.的2mol/L乙酸钠。
所述的离子交换和梯度洗脱的条件具体为：
所述的检测是指：在室温环境下以1mL/min流速，进样体积20μL，采用俩字交换和梯度洗脱法，通5psi氮气检测，使用四电位脉冲安培检测器采用波形检测法，其检测电压分别为E1＝+0.10V、E2＝-2.00V、E3＝+0.60V和E4＝-0.10V。
本发明可通过市售的葡萄糖、半乳糖、乳糖和一些低聚半乳糖标准品对分离测定的结果进行验证。
本发明技术效果包括：
1)能够很好地分离开分子量相同而结构不同的低聚半乳糖。因为低聚半乳糖主要含有各种异构二聚半乳糖、三聚半乳糖和四聚半乳糖，其结构和性质非常相似。传统的方法是区分不开分子量相同而结构不同的低聚半乳糖，分子量相同的糖类会出在一个图谱峰或2个图谱峰中，无法辨认到底是什么糖。
2)能够实现各种二聚、三聚及四聚半乳糖精确地定量。现在各大的化学试剂公司不可能提供各种异构化的二聚、三聚和四聚半乳糖标准品。异构化的低聚半乳糖的定量很难实现。本实验采用葡萄糖和半乳糖标准品制作了标准曲线，根据出峰面积求出定量系数。然后根据各种异构化的低聚半乳糖出峰面积，使用该定量系数进行了准确定量。因为该方法的分离结果表明各种异构化的低聚半乳糖之间无重叠部分，其保留时间最少间隔0.83min。
3)分离和检测方法简便、快捷。采用本实验发明的方法对预处理的样品进行分析，只要90分钟就可以完成样品中各种低聚半乳糖的分离和检测。检测结果的精密度高，可实现1ppm的检测。
根据图2可以看出，半乳糖和葡萄糖可以很好地被分离开，其保留时间相差约2min。而在没有进行梯度洗脱的时候，使用125mMNaOH等度洗脱时，葡萄糖和半乳糖的保留时间完全一致，进而在进样葡萄糖和半乳糖混标的时候，其色谱峰约是单一葡萄糖和半乳糖的峰面积之和。当采用NaOH和NaOAc梯度洗脱法后，葡萄糖和半乳糖在不同时间被洗脱出来。同时其他4种低聚糖也能够被很好地分离出来，证明了该分离方法的有效性。
5、检测用标准曲线的制作
由于低聚糖的标准品目前市面上能买到种类有限，而且低聚半乳糖本身就是混合物，所以实验过程中采用葡萄糖、半乳糖、乳糖和4种低聚糖共计7种标准物质在一定浓度范围内进行了检测，重复三次取其平均值，制作了标准曲线。结果表明各个标准品的检测结果在相应浓度范围内具有良好的线性关系(见表2)。
表2 七种标准品的线性范围及其线性相关系数
| 标准品 | 线性范围(mg/L) | 线性相关系数R2 |
| 半乳糖 | 0.2-10 | 0.9999 |
| 葡萄糖 | 0.2-5 | 0.9992 |
| 乳糖 | 0.2-10 | 0.9999 |
| 异麦芽三糖 | 0.2-10 | 0.9998 |
| 麦芽三糖 | 0.2-10 | 0.9999 |
| 麦芽四糖 | 0.2-10 | 0.9999 |
在实际应用过程中对未知的异构化低聚半乳糖的定量采用葡萄糖和半乳糖标准品定量系数，参考其标准偏差(SD)和相对标准偏差(RSD)计算各种异构化的低聚半乳糖含量。
附图说明
图1为各种低聚半乳糖的分离和检测图谱。
图2为低聚半乳糖标准品的分离和检测图谱。
图3为含活性低聚半乳糖牛乳样品的分离检测图谱。
图4为低聚半乳糖溶液样品的分离检测图谱。
图5为实施例低聚半乳糖生物酶法生成过程示意图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
对含有低聚半乳糖牛奶的检测结果
样品的预处理：取样品牛奶10克，加入1％三氯乙酸溶液5毫升及2％乙酸铅溶液，摇匀，超声20min，4℃，15000rpm，离心10min，取上清液，通过0.22μm纤维素膜和OnGuard II RP柱(2.5cc，已经过10mL甲醇、15mL水活化)，弃去初始6mL样品后收集2mL样品待测。
检测条件：检测温度室温，流速1mL/min，进样体积20μL，采用梯度洗脱法(详见表1)，通5psi氮气检测，使用四电位脉冲安培检测器，采用波形检测法，其检测电压分别为E1＝+0.10V、E2＝-2.00V、E3＝+0.60V和E4＝-0.10V。
试剂：色谱级超纯水、125mmol/L NaOH、2mol/L乙酸钠。
结果：检测结果见图3。统计结果见表3
对照标准品的保留时间，本实验分离结果表明的活性低聚半乳糖牛乳样品中含有2种二聚半乳糖，1种三聚半乳糖和1种四聚半乳糖，而且能够将含有的各种低聚半乳糖很好地分开。根据检测得到的峰面积乘以标准品定量系数可以得出各种低聚半乳糖的含量(见表3)。
表3 检测含活性低聚半乳糖牛乳样品的保留时间、峰面积及峰高
| Peak# | 保留时间(min) | 峰面积(nC＊min) | 含量(g/L) |
| 1 | 1.8 | 57679 | - |
| 2 | 2.63 | 37563 | - |
| 3 | 2.95 | 86066 | - |
| 4 | 4.12 | 77415 | - |
| 5 | 6.35 | 51867 | - |
| 6 | 13.8 | 9880865 | 5.817 |
| 7 | 15.83 | 11414960 | 6.720 |
| 8 | 25.42 | 2592781 | 1.526 |
| 9 | 29.45 | 11893719 | 7.002 |
| 10 | 35.52 | 1130678 | 0.665 |
| 11 | 55.33 | 36069809 | 21.235 |
| 12 | 72.82 | 3260660 | 1.919 |
注：1-12代表图3中按时间先后出现的12个峰。1-5是样品其他微量物质，无法计算。
实施例2
对低聚半乳糖溶液的检测结果
样品的预处理：取糖总量7.2％的低聚半乳糖溶液样品5克，在15000rpm转速下离心10min，取上清液，通过0.22μm纤维素膜和OnGuard II RP柱(2.5cc，已经过10mL甲醇、15mL水活化)，弃去初始6mL样品后收集2mL样品待测。
检测条件：流速1mL/min，检测温度室温，进样体积20μL，采用梯度洗脱法(详见表1)，通5psi氮气检测，积分脉冲安培四电位波形检测法，其检测电压分别为：E1＝+0.10V。
试剂：色谱级超纯水、125mmol/L NaOH、2mol/L乙酸钠。
结果：检测结果见图4。
分离和检测结果表明实验用低聚半乳糖溶液因为底物乳糖浓度高，反应时间长样品中含有3种二聚半乳糖，4种三聚半乳糖和1种四聚半乳糖，分子量相同结构差异的低聚半乳糖能够明显分开。根据检测得到的峰面积乘以标准品定量系数可以得出各种低聚半乳糖的含量(见表4)。因此，本发明方法能够对含有低聚半乳糖样品中的各种成分进行有效地分离和含量检测。
表4 检测低聚半乳糖溶液的保留时间、峰面积及峰高
注：1-11代表图3中按时间先后出现的11个峰。3号峰因含量过低，超过计算标准偏差(SD)和相对标准偏差(RSD)无法计算。
如图5所示，前三个峰完全在一个时间出现，使用方法是125mMNaOH等度洗脱，最后两个峰谱是采用NaOH和NaOAc梯度洗脱法后，出现的峰谱图。
Claims (8)
1.一种基于生物酶技术的低聚半乳糖检测方法，其特征在于，首先采用三氯乙酸及乙酸铅脱蛋白质法对待测对象进行预处理后通过膜过滤去掉杂质获得待测样品，然后用不同浓度的氢氧化钠和乙酸钠进行离子交换和梯度洗脱，最后用四电位脉冲安培检测器进行检测。
2.根据权利要求1所述的基于生物酶技术的低聚半乳糖检测方法，其特征是，所述的预处理是指：对待测对象中加入浓度为1％wt.的三氯乙酸溶液5毫升及2％wt.的乙酸铅溶液，摇匀，超声20min，4℃，15000rpm，离心10min，取上清液。
3.根据权利要求1所述的基于生物酶技术的低聚半乳糖检测方法，其特征是，所述的膜过滤是指：通过0.22μm纤维素膜进行过滤后采用2.5cc，已经过10mL甲醇、15mL水活化的OnGuard II RP柱并弃去初始6mL样品后收集2mL待测样品。
4.根据权利要求1所述的基于生物酶技术的低聚半乳糖检测方法，其特征是，所述的离子交换是指：使用配有GP50梯度泵、ED50电化学检测器Chromeleon色谱工作站的DX-600型离子色谱仪，采用4mm×250mm的CarboPacTMPA20分析柱和4mm×50mm的CarboPacTMPA20保护柱对低聚半乳糖进行分离。
5.根据权利要求1所述的基于生物酶技术的低聚半乳糖检测方法，其特征是，所述的离子交换使用的流动相包括：色谱级超纯水、125mmol/L NaOH和2mol/L乙酸钠。
6.根据权利要求1或5所述的基于生物酶技术的低聚半乳糖检测方法，其特征是，所述的离子交换和梯度洗脱的条件为：洗脱时间90分钟，流速为1mL/min，流动相依依次为7-90％wt.的125mmol/LNaOH，9.8-93.1％wt.的色谱级超纯水以及0.1-0.5％wt.的2mol/L乙酸钠。
7.根据权利要求6所述的基于生物酶技术的低聚半乳糖检测方法，其特征是，所述的离子交换和梯度洗脱的条件具体为：
8.根据权利要求1所述的基于生物酶技术的低聚半乳糖检测方法，其特征是，所述的检测是指：在室温环境下以1mL/min流速，进样体积20μL，采用俩字交换和梯度洗脱法，通5psi氮气检测，使用四电位脉冲安培检测器采用波形检测法，其检测电压分别为E1＝+0.10V、E2＝-2.00V、E3＝+0.60V和E4＝-0.10V。
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