CN102345172A - 建立可控突变率突变库的方法与应用 - Google Patents

建立可控突变率突变库的方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及“建立可控突变率突变库的方法与应用”，属于生物技术领域。本发明依据TaqDNA聚合酶在合成碱基时的固有误差和突变特性，针对预期替换不同碱基数目，确认其循环数和起始模板量，建立了一种突变率可控的突变文库。因此可以根据客户的需求来定制不同碱基突变数目的文库，使突变文库的适应性和目的性增强。本发明采用CrylIe蛋白建立的突变文库中，活性显著提高的突变株占整个突变库的11.96％，其中文库III高毒力突变株的比例达到13.16％，表明该随机突变文库的方法筛选到活力显著提高的突变株的几率很高；针对高毒力突变株突变位点人工合成的突变体，杀虫活性是未突变CrylIe蛋白的1000倍。

Description

建立可控突变率突变库的方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及建立可控突变率突变库的方法与应用。
背景技术
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。Bt在芽孢形成期可形成杀虫晶体蛋白(InsecticidalCrystalProteins，ICPs)，也称δ-内毒素(delta-endotoxin)[Bravo.A.，Gill S.S.，Soberón M.Bacillus thuringiensisMechanisms and Use.Comprehensive Molecular lnsect Science Elsevier，2005，175～206.]，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系[Schnepf.E，Crickmore.N，Van Rie.J.，Lereclus.D，Baum.J，Feitelson.J，Zeigler.D.R.，Dean.D.H.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev，1998，62(3)：775-806.]。从1981年，Schnepf和Whiteley克隆了第一个编码δ-内毒素的crylAal基因，截止2008年6月已发现和克隆了412种ICPs基因。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、对人畜无害[DeMaagd R.A.，Bravo A.，Crickmore N.How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to col onize the insectworld.Trends Genet，2001，17：193～199.]，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了最广泛的应用。
但随着Bt制剂的大量使用及转基因作物的大面积种植，靶标昆虫逐渐产生抗性，继续从自然界中分离具有高毒力的新型Bt cry基因难度不断增加，通过分子设计、蛋白质工程等新的技术对现有的Cry毒素进行改造成为了研究热点。但目前尚没有一个技术可以实现Cry蛋白的定向进化。定点突变和结构域互换，需要在已知杀虫晶体蛋白蛋白结构与功能的关系的前提下进行设计；通过随机突变和基因重组建立突变库，突变率和重组率难于控制，导致突变体少，无有益突变，或者突变库庞大，无法进行生物活性测定。因此，建立一个突变率可控的cry蛋白定向进化技术对于获得高毒力的cry基因具有重要意义。
2000年，本实验室的宋福平等人从Bt菌株Bt c007中克隆了一种新类型的crylI基因。crylIe基因(专利号：CN1401772)该基因编码分子量为81kD的蛋白质，由719个氨基酸组成(Song et al.，2003)。作为国内发现的第一个Bt模式cry基因，crylIe对玉米螟、小菜蛾等鳞翅目害虫活性较高，与目前全球广泛商业化应用的CrylA等蛋白无交互抗性，现在正在用于国内转基因抗虫玉米的研制，具有良好的应用前景。但CrylIe蛋白的毒力与实际应用仍有一定差距。因此，通过分子设计的方法提高CrylIe对鳞翅目害虫活性具有重要的理论和实践意义。
发明内容
针对上述领域中的不足，依据Taq DNA聚合酶在合成碱基时的固有误差和突变特性，建立一种突变率可控的随机突变文库的方法。通过对苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白CrylIe的定向进化进行的研究，得到活性显著提高的突变株，并且占整个突变体库的13.16％。针对高毒力突变株突变位点人工合成的突变体，杀虫活性是来突变CrylIe的1000倍。
建立可控突变率突变库的方法，步骤如下：
A、确定突变条件：
(1)确定替换率：将起始模板进行梯度稀释，实时荧光定量PCR扩增，最低浓度的指数扩增最大循环数下可以得到最多的突变体；挑取最低浓度下的若干克隆测序，得到每个克隆平均突变碱基数，按式(I)计算替换率，
替换率＝每个克隆平均突变碱基数/(突变目的片段碱基数×最大循环数)；(I)
(2)确定预替换碱基数目所需的指数扩增循环数C1、C2、C3......，按式(II)计算：
循环数＝预期替换碱基数目/(突变目的片段碱基数×替换率)(II)
其中C1、C2、C3分别代表预替换碱基数目为1、2、3时所需指数扩增循环数，
(3)确定所需起始模板量：实时荧光定量PCR扩增处于指数扩增的最大循环数与步骤(2)中确定的循环数C1、C2、C3......相比较，最接近的该PCR扩增所用模板量确定为所需起始模板量T1、T2、T3......
其中T1、T2、T3分别代表预替换碱基数目为1、2、3时PCT扩增所需起始模板量，
B、可控突变率突变库的建立：按照确定的循环数C1、C2、C3......和对应确定的起始模板量T1、T2、T3......，将起始模板PCR扩增得到可控突变率突变库L1、L2、L3......，所述L1、L2、L3分别代表平均替换碱基数为1、2、3的突变库。
所述起始模板为含有编码CrylIe蛋白的核苷酸片段的载体。
所述起始模板为含有编码CrylIe蛋白的核苷酸片段的质粒。
所述质粒为pAclIe，由pUC19克隆载体，crylAc启动子，crylIe基因全长组成。
所述预期替换碱基数目为1、2、3，可控突变率突变库为L1、L2、L3。
上述方法得到的可控突变率突变库L1、L2、L3......。
上述突变库中的突变体，所述突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO1，其氨基酸序列为SEQ ID NO12；
或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO2，其氨基酸序列为SEQ ID NO13；
或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO3，其氨基酸序列为SEQ ID NO14；
或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO4，其氨基酸序列为SEQ ID NO15；
或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO5，其氨基酸序列为SEQ ID NO16；
或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO6，其氨基酸序列为SEQ ID NO17；
或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO7，其氨基酸序列为SEQ ID NO18；
或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO8，其氨基酸序列为SEQ ID NO19；
或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO9，其氨基酸序列为SEQ ID NO20；
或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO10，其氨基酸序列为SEQ ID NO21；
或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO11，其氨基酸序列为SEQ ID NO22。
一个人工突变体，其氨基酸序列为将上述任一两个以上突变体中的氨基酸的替换位叠加后得到。
所述人工突变体的其氨基酸序列为SEQ ID NO24；其核苷酸序列为SEQ ID NO23，或者其氨基酸序列为SEQ ID NO26，核苷酸序列为SEQ ID NO25；其氨基酸序列为SEQ ID NO28，核苷酸序列为SEQ ID NO27。
上述突变体在杀害鞘翅目害虫中的应用。
本发明依据Taq DNA聚合酶在合成碱基时的固有误差和突变特性，针对预期替换不同碱基数目，建立了一种突变率可控的突变文库。采用本发明方法建立的文库L1、L2、L3……是按碱基突变数目的不同来区分的，因此可以根据客户的需求来定制不同碱基突变数目的文库，使突变文库的适应性和目的性增强。
根据文献报道，对于Cry蛋白，获得活性提高的突变体，关键点在于如何选择合适的突变频率，一般有益突变的频率很低，绝大多数突变是有害的。突变频率过高，会导致无义突变；突变频率偏低，则野生型将占据突变群体的优势，很难筛选到理想的突变体。根据本发明建立可控突变文库的方法，计划建立3个低的、不同碱基替换率的随机突变库，分别是：文库I含1个碱基的替换；文库II含2个碱基的替换；文库III含3个碱基的替换；随机挑选100个单克隆测序，总计得到，文库I中的平均突变碱基为0.86个，文库II中的平均突变碱基个数为2.1个，文库III中平均突变碱基个数为2.79个，3个文库中平均突变碱基个数符合预期设计，表明本发明建立可控突变率突变文库的方法是可行的。
本发明的实施例中虽然采用的是CrylIe蛋白来说明本发明建立突变文库的方法，但从上面叙述的原理来看，它采用的是Taq DNA聚合酶在合成碱基时的固有误差和突变特性来实现的，因此对于其它核苷酸片段来说，同样是可以适用的。
本发明的实施例得到的突变文库中，活性显著提高的突变株(其核苷酸序列如SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11)，高毒力突变株占整个突变库的11.96％，其中文库III高毒力突变株的比例达到13.16％，表明该随机突变文库的方法筛选到活力显著提高的突变株的几率很高；针对高毒力突变株突变位点人工合成的突变体(其核苷酸序列如SEQ ID NO23)，杀虫活性是未突变CrylIe蛋白的1000倍。
附图说明
图1实时荧光定量PCR扩增/循环图
图2随机突变文库建立流程图
图3文库I、II、III中的平均突变率
图4突变文库蛋白表达分析
其中1.未突变的CrylIe；2.pUC19载体；B.BSA；3-7为突变文库中的单克隆蛋白
图5合成序列蛋白表达分析
B.BSA；1.pUC19载体；2.MS11蛋白；3.M157&667蛋白；4.M157&311蛋白
具体实施方式
1确定突变条件
1.1突变率的测定
取1μl质粒pAclIe(pUC19克隆载体，crylAc启动子，crylIe基因)经微量分光光度计NaroDrop定量，浓度为290ng/μl。进行梯度稀释，分别取1μl，进行荧光定量PCR，
反应体系：
2×Taq DNA polymerase Mix            10μl
上游引物(10μM)                      1μl
下游引物(10μM)                      1μl
20×SYBRGreenI                       1μl
模板                                 1μl
ddH2O                        to  20μl
反应条件：94℃       5min
Figure BSA00000214087000031
72℃        10min
T：根据不同的引物，选择不同的退火温度。
PCR扩增如图1所示。
在一系列的稀释模板中，浓度最低的起始模板量为0.0011ng(紫色曲线)，处于指数扩增的最大循环数为31个循环，可以得到最多的突变体。挑取100个克隆测序，279个碱基突变，每个克隆平均突变碱基数为2.79，替换率为4.88×10-5。
1.2根据突变碱基的个数确定所需的饱和扩增循环数
根据公式：
Figure BSA00000214087000041
注：替换率指在一定的实验条件下Taq DNA聚合酶合成每个碱基的出错率；每个克隆突变碱基数指每个克隆预期的替换碱基数；片段碱基数指突变目的片段的碱基数；循环数指每个克隆得到预期替换碱基数所需的指数扩增循环数。
Figure BSA00000214087000043
计算出达到预期碱基替换时，每个文库所需要的循环数：文库I：11个循环；文库II：22个循环；文库III：33个循环；文库IV：44个循环。
1.3确定PCR扩增起始模板量
根据公式得到的循环数及实时荧光定量PCR的检测(图1)结果，确定建立突变文库所需起始模板量及循环数(表1)。
表1基于荧光定量PCR构建不用突变率的文库所需的条件
Figure BSA00000214087000044
2随机突变文库建立
突变条件确立之后，以crylIe基因为材料建立随机突变文库，建立流程见图2。
2.1文库I
选用Taq DNA聚合酶和S5-mlIe、S3-mlIe引物对进行PCR扩增时，加入起始模板量为4.53ng，设置12个循环数。
2.2文库II
选用Taq DNA聚合酶和S5-mlIe、S3-mlIe引物对进行PCR扩增时，加入起始模板量为0.017ng，设置23个循环数。
2.3文库III
选用Taq DNA聚合酶和S5-mlIe、S3-mlIe引物对进行PCR扩增时，加入起始模板量为0.0011ng，设置31个循环数。
反应体系：
2×Taq DNApolymerase Mix           10μl
上游引物(10μM)                    1μl
下游引物(10μM)                    1μl
模板                               1μl
ddH2O                      to  20μl
反应条件：
         94℃      5min
Figure BSA00000214087000051
         72℃      10min
T；根据不同的引物，选择不同的退火温度。
取3μl扩增产物进行琼脂糖电泳检测(120V，30min)。
不同的起始模板量，经过不同的PCR循环之后，琼脂糖凝胶回收2160bp的含有突变基因的条带，选用Nhe I和Bsp1407I酶切突变条带，回收1845bp的酶切片段，于此同此，用Nhe I和Bsp1407I酶切质粒pAclIe，回收3351bp的片段。将这2个片段连接后转化JM109感受态细胞，挑取单克隆进行96孔板保存。
3随机突变文库序列分析
从每个突变文库中随机挑选100个单克隆进行序列测定，并对结果进行分析。
将序列测定结果中的碱基序列与crylIe序列进行比对，并将碱基序列翻译成氨基酸序列进行比对，分别对无义突变、同义突变、错义突变和为突变的单克隆进行统计，统计结果见表2。
表2突变类型统计
Figure BSA00000214087000052
Figure BSA00000214087000061
通过对三个突变文库中突变碱基与合成碱基的总数进行统计，来计算平均的突变碱基个数。文库I中的平均突变碱基个数为0.86，文库II中的平均突变碱基个数为2.1，文库III中的平均突变碱基个数为2.79，3个文库中平均突变碱基个数符合预期设计且呈线性分布(图3)，证明根据Taq DNA聚合酶在合成碱基时的固有误差和突变特性建立突变率可控的随机突变文库的方法是可行的。
4随机突变文库蛋白表达
对突变文库I、II、III进行蛋白提取，查看蛋白的表达情况，总共提取510个样品的蛋白，从SDS-PAGE电泳结果来看，获得表达的有267个。图4是其中的代表图片。
5随机突变文库生物活性测定
将甘蓝叶片用清水洗净晾干，选取鲜嫩一致的甘蓝叶片，用打孔器切成直径为5cm的圆片，将不同的蛋白表达产物浸泡甘蓝叶片，约10min，晾干，放入培养皿中，每个培养皿接2龄幼虫15头，每个处理重复三次，25℃生化培养箱中保温，培养48h后调查死、活虫数，并观察幼虫取食情况。
对92个错义突变的蛋白进行小菜蛾的生物活性测定，测试结果显示如表3-4所示
表3小菜蛾生物活性测定
Figure BSA00000214087000062
从上表中，可以看出，在测试的92个突变蛋白对小菜蛾的生物活性时，有11个突变蛋白的活性有明显的不同程度的提高。与未突变的CrylIe相比，活性提高最大的是13倍。表4中，列出这11个活性显著提高的突变体的突变位点，在结构域I、II、III中均有分布。高毒力突变株占整个突变库的11.96％，其中文库III高毒力突变株的比例达到13.16％，表明该随机突变文库的方法筛选到活力显著提高的突变株的几率很高。
表4突变碱基与氨基酸位点
Figure BSA00000214087000063
Figure BSA00000214087000071
综合活性显著提高的突变株M157、M311、M460、M466、M499、M4103、M525、M527、M645、M667、M670的突变位点，人工合成序列MS11(SEQ23，蛋白序列SEQ24)、M157&667(SEQ25，蛋白序列SEQ26)、M157&311(SEQ27，蛋白序列SEQ28)，表达蛋白如图4。与未突变的Cry1Ie相比，突变体M157、M667和M311活性分别提高了10倍、7倍和2倍，叠加后的突变体M157&667活性提高了96倍，M157&311活性提高了17倍，MS11活性提高439倍(表5)。
表5小菜蛾生物活性测定
Figure ISA00000214087200021
Figure ISA00000214087200031
Figure ISA00000214087200041
Figure ISA00000214087200051
Figure ISA00000214087200061
Figure ISA00000214087200081
Figure ISA00000214087200091
Figure ISA00000214087200101
Figure ISA00000214087200111
Figure ISA00000214087200121
Figure ISA00000214087200131
Figure ISA00000214087200141
Figure ISA00000214087200151
Figure ISA00000214087200161
Figure ISA00000214087200171
Figure ISA00000214087200181
Figure ISA00000214087200191
Figure ISA00000214087200211
Figure ISA00000214087200221
Figure ISA00000214087200231
Figure ISA00000214087200251
Figure ISA00000214087200261
Figure ISA00000214087200271
Figure ISA00000214087200291
Figure ISA00000214087200301
Figure ISA00000214087200311
Figure ISA00000214087200331
Figure ISA00000214087200341
Figure ISA00000214087200351
Figure ISA00000214087200361
Figure ISA00000214087200381
Figure ISA00000214087200391

Claims (10)

1.建立可控突变率突变库的方法，步骤如下：
A、确定突变条件：
(1)确定替换率：将起始模板进行梯度稀释，实时荧光定量PCR扩增，最低浓度的指数扩增最大循环数下可以得到最多的突变体；挑取最低浓度下的若干克隆测序，得到每个克隆平均突变碱基数，按式(I)计算替换率，
替换率＝每个克隆平均突变碱基数/(突变目的片段碱基数×最大循环数)；(I)
(2)确定预替换碱基数目所需的指数扩增循环数C1、C2、C3......，按式(II)计算：
循环数＝预期替换碱基数目/(突变目的片段碱基数×替换率)(II)
其中C1、C2、C3分别代表预替换碱基数目为1、2、3时所需指数扩增循环数，
(3)确定所需起始模板量：实时荧光定量PCR扩增处于指数扩增的最大循环数与步骤(2)中确定的循环数C1、C2、C3......相比较，最接近的该PCR扩增所用模板量确定为所需起始模板量T1、T2、T3......
其中T1、T2、T3分别代表预替换碱基数目为1、2、3时PCT扩增所需起始模板量，
B、可控突变率突变库的建立：按照确定的循环数C1、C2、C3......和对应确定的起始模板量T1、T2、T3......，将起始模板PCR扩增得到可控突变率突变库L1、L2、L3......，所述L1、L2、L3分别代表平均替换碱基数为1、2、3的突变库。
2.根据权利要求1所述的建立可控突变率突变库的方法，所述起始模板为含有编码CrylIe蛋白的核苷酸片段的载体。
3.根据权利要求2所述的建立可控突变率突变库的方法，所述起始模板为含有编码CrylIe蛋白的核苷酸片段的质粒。
4.根据权利要求3所述的建立可控突变率突变库的方法，所述质粒为pAclIe，由pUC19克隆载体，crylAc启动子，crylIe基因全长组成。
5.根据权利要求4所述的建立可控突变率突变库的方法，所述预期替换碱基数目为1、2、3，可控突变率突变库为L1、L2、L3。
6.根据权利要求1-5任一所述方法得到的突变库L1、L2、L3......。
7.权利要求6所述的突变库中的突变体，所述突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO1，其氨基酸序列为SEQ IDNO12；
或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO2，其氨基酸序列为SEQ ID NO13；
或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO3，其氨基酸序列为SEQ ID NO14；
或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO4，其氨基酸序列为SEQ ID NO15；
或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO5，其氨基酸序列为SEQ ID NO16；
或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO6，其氨基酸序列为SEQ ID NO17；
或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO7，其氨基酸序列为SEQ ID NO18；
或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO8，其氨基酸序列为SEQ ID NO19；
或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO9，其氨基酸序列为SEQ ID NO20；
或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO10，其氨基酸序列为SEQ ID NO21；
或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO11，其氨基酸序列为SEQ ID NO22。
8.一个人工突变体，其氨基酸序列为将权利要求7的突变体中的任一两个以上氨基酸的替换位叠加后得到。
9.根据权利要求8所述的人工突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO24；其核苷酸序列为SEQ ID NO23，或者其氨基酸序列为SEQ ID NO26，核苷酸序列为SEQ ID NO25；其氨基酸序列为SEQ ID NO28，核苷酸序列为SEQ ID NO27。
10.权利要求7、8、9任一突变库中的突变体或是人工突变体在杀害鞘翅目害虫中的应用。
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