CN102344965B - 转基因小麦b73-6-1的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种转基因小麦B73-6-1的检测方法，是通过PCR的方法检测序列为SEQ IDNO：12的基因组件，该基因组件中包括序列为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的边缘序列。采用本发明的方法可以快速、灵敏地实现对转基因小麦B73-6-1的品系鉴定，该方法特异性强，灵敏度高，快速准确。
Description
技术领域
本发明涉及一种转基因小麦品系的鉴定方法。
背景技术
转基因小麦是利用基因工程技术，将外源基因导入小麦基因中，经过筛选得到的能够表达目的基因的小麦。在基因转移和表达研究中，需要对经转化处理的幼苗进行分子检测，以淘汰非转化植株。选择标记基因(如新霉素磷酸转移酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因和潮霉素转移酶基因等)和报告基因(如B2葡萄糖苷酸酶基因和荧光素酶基因等)已被广泛用于转化植株和组织的筛选，但在某些情况下，这种筛选效果不可靠。PCR是用于此目的检测的常用技术之一，具有灵敏、快速的优点。对于此技术的应用在于寻找恰当的、特异性强的标记性基因片段，并以此为基础设计相匹配的引物及扩增条件。
发明内容
本发明的目的在于提供能准确快速地鉴定转基因小麦B73-6-1的方法，所述的转基因小麦B73-6-1的检测方法，是通过PCR的方法检测序列为SEQ ID NO：12的基因组件，该基因组件中包括序列为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的边缘序列。
上述本发明的方法所述及的PCR扩增的引物对是SEQ ID NOS：3/4和/或SEQ IDNOS：5/6：
B73-FF1(SEQ ID NO：3)：AGTATATCCGGGACGTTACAACAC
B73-FR1(SEQ ID NO：4)：TATCAGTGTGCATGGCTGGATATGTA
B73-RF1(SEQ ID NO：5)：CACGGCGCGTTGAATCTCCTCTGTAT
B73-RR1(SEQ ID NO：6)：ATGCCTTTGTTTTCCCGCCCTCCCA。
容易理解，采用上述方法进行PCR扩增，如果扩增结果为阳性，则待测的小麦为转基因小麦B73-6-1；如果扩增结果为阴性，则待测的小麦不是转基因小麦B73-6-1。
更为优选的技术方案中，PCR反应条件是
94℃，1min，1个循环；
98℃10s，55℃30s，72℃30s，35个循环；
72℃，7min，1个循环。
本发明的转基因小麦B73-6-1的检测方法的最优技术方案是：
采用50μLPCR反应体系，其中含有：待测样品DNA，其浓度优选5ng/μL，10×LA PCR BufferII(Mg2+Plus)5ul，dNTP各0.4mM，碱基序列为SEQ ID NOS：3～6的PCR引物各0.2μM，Taq DNA聚合酶0.05U/ul。
采用本发明的方法可以快速、灵敏地实现对转基因小麦B73-6-1的品系鉴定，该方法特异性强，灵敏度高，快速准确。
附图说明
本发明附图3幅，
图1是实施例1以样品C基因组DNA为模板扩增的1％琼脂糖凝胶电泳图，其中：M是DL2,000DNA Marker；1～6分别是ubiquitin、NOS、bar1、bar2、uidA和GAG56D。
图2是实施例1以样品A、B、C基因组DNA为模板扩增的1％琼脂糖凝胶电泳图，其中：M1是λ-Hind III digest，M2是DL2,000DNA Marker，1～6分别是C-ubiquitinF/Nos R，C-ubiquitin F/bar R1，C-ubiquitin F/uidA R，A-ubiquitin F/Nos R，A-ubiquitinF/bar R1和A-ubiquitin F/uidA R。
图3是实施例1的1％琼脂糖凝胶电泳图，其中M：DL2,000 DNA Marker。
具体实施方式
本申请的发明人经过大量研究，成功地克隆出包括转基因小麦B73-6-1中特异性外源序列的基因组件B，该基因组件B中包括uidA，ubi，lacZ 1Dx5和小麦基因组部分序列。该基因组件B的全序列如SEQ ID NO：12所示。在所获得的上述基因组件B全序列的基础上，发明人进一步获得转基因成分的边缘序列，即SEQ ID NO：15和SEQID NO：16所示的序列，它们分别位于SEQ ID NO：12序列的第1～403位及11786～14690位。针对SEQ ID NO：12所示的基因组件的检测可以通过PCR来实现，使用特异性的引物对SEQ ID NOS：3/4和/或SEQ ID NOS：5/6在一定条件下扩增，如扩增出目标序列，即可判定所检测样品源自转基因小麦B73-6-1。
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1.转基因小麦特异性基因组件A、B、C全序列及相应边缘序列的获取
1、转基因样品基因组DNA提取
分别选取转基因小麦B72-8-11b、转基因小麦B73-6-1和转基因小麦B102-1-2，分别标记为样品A、样品B和样品C。各个样品粉碎后在液氮中研成细末，然后使用DNAExtraction Kit for GMO Detection Ver.2.0(TaKaRa Code No.D9093)进行基因组DNA提取。
以1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品质量，并使用超微量分光光度计(Nanodrop)对检测样品基因组DNA质量和浓度，检测结果显示：基因组DNA质量符合后续实验要求，样品A、B和C的平均基因组DNA浓度是162.69ng/μL、125.80ng/μL、203.75ng/μL，也符合后续实验要求。
2、转基因小麦特异性基因组件A、B、C全序列获取以及元件分析
(1)根据从GenBank获取的小麦内、外源基因相关信息设计引物如表1所示：
表1定性PCR检测小麦内源基因、外源基因所需的引物序列
使用TaKaRa LA
DNA Polymerase(Code No.DRR002A)，以步骤1提取得到的样品C基因组DNA为模板，以上述引物交叉配对进行PCR扩增，扩增各个可能存在的元件，各取5μl进行3％琼脂糖凝胶电泳，结果如附图1所示。然后使用TaKaRaAgarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)对电泳条带进行回收测序，获得各元件序列。
在上述工作基础上，进一步获取各元件之间序列，方法如下：
试剂：使用TaKaRa多种PCR Kit，如TaKaRa LA
DNA Polymerase(CodeNo.DRR002A)，TaKaRa LA
With GC Buffer(Code No.DRR02AG)等。
模板：以步骤1提取得到的样品A、B、C的基因组DNA为模板。
引物：上述表1中各个F引物和各个R引物交叉配对。
进行多次不同条件PCR扩增，扩增各个元件之间的序列，得到ubiquitin F/uidAR之间的序列结果正确。简述如下：
使用TaKaRa LA
DNA Polymerase(Code No.DRR002A)，以A基因组DNA和C基因组DNA为模板，进行PCR扩增，各取5μl进行3％琼脂糖凝胶电泳，结果如附图2所示。使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(CodeNo.DV805A)对电泳条带回收测序，ubiquitin F/uidA R之间的序列结果正确。
(2)侧翼序列获取
1)以基因组DNA进行侧翼序列获取
以获得的ubiquitin F/uidA R之间的序列为基础，设计侧翼序列引物，使用TaKaRaGenome Walking Kit(TaKaRa Code No.D316)结合TaKaRa LA
(Code No.DRR002A)获取ubiquitin F/uidA R序列两端的侧翼序列。
2)构建片断库进行侧翼序列获取
所以使用Clontech Genome WalkerTM Universal Kit(Clontech Code No.638904)构建片断库，PCR扩增试剂使用
2PCR Kit(Clontech Code No.639206)，进行侧翼序列的获取，并逐步步移。最终获取转基因小麦高分子量谷蛋白亚基转基因小麦不同品系，即样品A、B、C中转基因成分的边缘序列。
其中，Clontech Genome WalkerTM Universal Kit Clontech Genome WalkerTMUniversal Kit的基本实验过程如下：
a.将genomic DNA分别使用PvuII、DraI、StuI、EcoRV酶切；
b.纯化后分别连接至GenomeWalkerAdaptor；
c.TE稀释后用于PCR反应；
d.设计引物进行PCR扩增，并分析实验结果，回收目的条带；
e.对目的条带进行测序，分析测序结果；对获得的新“目的”序列，进行序列验证；
f.反复重复上述步骤d～e，直至完成所需部分的全序列。
(3)序列全长及边缘序列的获取
经上述实验过程获得边缘序列，并最终得到各个样品的目标基因组件全长序列，所述的基因组件应当是包括了外源性基因和边缘序列的基因片段。
1)样品A：转基因小麦B72-8-11b
包括转基因小麦B72-8-11b中特异性外源序列的基因组件A，该基因组件A中包括uidA，ubi，lacZ 1Dx5和小麦基因组部分序列。该基因组件A的全序列如SEQ IDNO：11所示。该基因组件A中各元件分析结果表明：基因组件A序列全长10384，其中：1～1782是uidA，1766～3794是ubi，3797～6475是lacZ，6476～8073是1Dx5，8213～10384是小麦基因组部分序列。
上述基因组件A全序列中，发明人所确定的边缘序列，即SEQ ID NO：14所示的序列，它位于SEQ ID NO：11序列的第8213～10384位。
2)样品B：转基因小麦B73-6-1
包括转基因小麦B73-6-1中特异性外源序列的基因组件B，该基因组件B中包括头尾两段的小麦基因组部分序列，以及这两段序列中的uidA，ubi，lacZ，1Dx5，coliDH1。该基因组件B的全序列如SEQ ID NO：12所示。该基因组件B中各元件分析结果表明：基因组件B序列全长14690，1～403是小麦部分基因组序列，404～2468是uidA，2477～4500是ubi，4503～7178是lacZ，7177～8377是1Dx5，9179～11784是coliDH1，11786～14690是小麦部分基因组序列。
上述基因组件B全序列中，发明人所确定的边缘序列，即SEQ ID NO：15和SEQID NO：16所示的序列，它们分别位于SEQ ID NO：12序列的第1～403位及11786～14690位。
3)样品C：转基因小麦B102-1-2
包括转基因小麦B102-1-2中特异性外源序列的基因组件C，该基因组件C中包括头尾两段的小麦基因组部分序列，以及这两段序列中的ubi，vector pBANF-bar，vectorpUbiGUSPlus，vector HSP，reporter vestor pUbiGUSPlus，ubiquitin以及coli DH1。该基因组件C的全序列如SEQ ID NO：13所示。该基因组件C中各元件分析结果表明：基因组件C序列全长14042，1～3993是小麦部分基因组序列，3994～5164是ubi，5220～5750是vector pBANF-bar，5766～6044是vector pUbiGUSPlus，6044～8682是vector HSP，8695～9671是reporter vestor pUbiGUSPlus，9672～10121是ubiquitin，10121～10213是coli DH1，10214～14042是小麦部分基因组序列。
上述基因组件C全序列中，发明人所确定的边缘序列，即SEQ ID NO：17所示的序列，它们位于SEQ ID NO：13序列的第10214～14042位。
3、PCR检测方法的建立
为了扩增得到SEQ ID NOS：11～13各自特异的检测区，根据其各自全序列设计PCR检测引物。经过多轮PCR检测引物筛选，最终得到如下特异性引物如表2：
表2
| 序列编号 | 引物名称 | 长度nt | 碱基序列(5’-3’) |
| SEQ ID NO：1 | B72-F1 | 28 | ATGATGGAGGGCATTACTTGGGAGTGAA |
| SEQ ID NO：2 | B72-R1 | 25 | ACCCTGATCCCCAAAGTAAACTCGC |
| SEQ ID NO：3 | B73-FF1 | 24 | AGTATATCCGGGACGTTACAACAC |
| SEQ ID NO：4 | B73-FR1 | 26 | TATCAGTGTGCATGGCTGGATATGTA |
| SEQ ID NO：5 | B73-RF1 | 26 | CACGGCGCGTTGAATCTCCTCTGTAT |
| SEQ ID NO：6 | B73-RR1 | 25 | ATGCCTTTGTTTTCCCGCCCTCCCA |
| SEQ ID NO：7 | B102-F1 | 20 | GCGAGAGCCGCTGTATGTTC |
| SEQ ID NO：8 | B102-R1 | 22 | CGAGTAAATAATGCCAGCCTGT |
| SEQ ID NO：9 | GAG56D-F | 21 | CCCAACAACAACCACCGTTCA |
| SEQ ID NO：10 | GAG56D-R | 21 | TGGCCCTGGACGAGAGTACCT |
其中GAG56D-F/GAG56D-R的扩增对象为小麦属特异性内源基因。建立PCR反应体系为：总体积50μL，dH2O为基础，含有：待测样品DNA 5ng/μL，10×LA PCR BufferII(Mg2+Plus)(TaKaRa LA
Code No，DRR002A)5ul，dNTP各0.4mM，引物对(表3)各0.2μM，Taq DNA聚合酶(TaKaRa LA
Code No，DRR002A)0.05U/ul。
上述体系按照下述条件进行PCR扩增：
94℃，1min，1个循环；
98℃10s，55℃30s，72℃30s，35个循环；
72℃，7min，1个循环。
PCR扩增产物取10ul，进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图3及表3所示：
表3
从该结果可见，各设计引物能非常准确、特异性地扩增出目标基因片段。
经过条件优化，B102-1-2品系转基因小麦样品的PCR扩增条件优化为：
94℃，1min，1个循环；
98℃10s，62℃30s，72℃30s，35个循环；
72℃，7min，1个循环。
基于此，得出结论：
(1)方法A：对转基因小麦B72-8-11b(样品A)的PCR检测，使用B72-F1/B72-R1(SEQ ID NO：1/2)为特异性引物进行PCR扩增，条件为：
总体积50μL，dH2O为基础，含有：待测样品DNA 5ng/μL，10×LA PCR BufferII(Mg2+Plus)5ul，dNTP各0.4mM，引物B72-F1和B72-R1各0.2μM，Taq DNA聚合酶(TaKaRa LA
)0.05U/ul。
上述体系按照下述条件进行PCR扩增：
94℃，1min，1个循环；
98℃10s，55℃30s，72℃30s，35个循环；
72℃，7min，1个循环。
经1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，如扩增结果为阳性，则待测样品是转基因小麦B72-8-11b，如扩增结果为阴性，则待测样品不是转基因小麦B72-8-11b。
(2)方法B：对转基因小麦B73-6-1(样品B)的PCR检测，使用B73-FF1/B73-FR1(SEQ ID NOS：3/4)或者B73-RF1/B73-RR1(SEQ ID NOS：5/6)为特异性引物进行PCR扩增，条件为：
总体积50μL，dH2O为基础，含有：待测样品DNA 5ng/μL，10×LA PCR BufferII(Mg2+Plus)5ul，dNTP各0.4mM，引物B73-FF1/B73-FR1或B73-RF1/B73-RR1各0.2μM，Taq DNA聚合酶(TaKaRa LA
)0.05U/ul。
上述体系按照下述条件进行PCR扩增：
94℃，1min，1个循环；
98℃10s，55℃30s，72℃30s，35个循环；
72℃，7min，1个循环。
经1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，如扩增结果为阳性，则待测样品是转基因小麦B73-6-1，如扩增结果为阴性，则待测样品不是转基因小麦B73-6-1。
(3)方法C：对转基因小麦B102-1-2(样品C)的PCR检测，使用B102-F1/B102-R1(SEQ ID NOS：7/8)为特异性引物进行PCR扩增，条件为：
总体积50μL，dH2O为基础，含有：待测样品DNA 5ng/μL，10×LA PCR BufferII(Mg2+Plus)5ul，dNTP各0.4mM，引物B102-F1和B102-R1各0.2μM，Taq DNA聚合酶(TaKaRa LA
)0.05U/ul。
上述体系按照下述条件进行PCR扩增：
94℃，1min，1个循环；
98℃10s，62℃30s，72℃30s，35个循环；
72℃，7min，1个循环。
经1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，如扩增结果为阳性，则待测样品是转基因小麦B102-1-2，如扩增结果为阴性，则待测样品不是转基因小麦B102-1-2。
实施例2.应用于实际样品的检测
1、样品制备：
选取待测小麦样品10个(如表4所示)，分别在液氮中研成细末，使用DNAExtraction Kit for GMO Detection Ver.2.0(TaKaRa Code No.D9093)进行基因组DNA提取。然后以琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA质量、以超微量分光光度计(Nanodrop)检测基因组DNA进行质量和浓度，确定样品基因组DNA的质量和浓度均符合后续实验要求。
2、按照实施例1所建立的方法A、方法B和方法C对这10个样品进行检测，结果如表4所示，其中“+”表示扩增结果为阳性，“-”表示扩增结果为阴性。
从表4的检测结果可以看出，
方法A可以准确、灵敏、特异性地检测出来源于转基因小麦B72-8-11b的样品；对其余转基因小麦及非转基因小麦样品报告为非转基因小麦B72-8-11b样品，与样品实际情况相符；
方法B可以准确、灵敏、特异性地检测出来源于转基因小麦B73-6-1的样品；对其余转基因小麦及非转基因小麦样品报告为非转基因小麦B73-6-1样品，与样品实际情况相符；
方法C可以准确、灵敏、特异性地检测出来源于转基因小麦B102-1-2的样品；对其余转基因小麦及非转基因小麦样品报告为非转基因小麦B102-1-2样品，与样品实际情况相符。
表4
Claims (2)
1.转基因小麦B73-6-1的检测方法，是通过PCR的方法检测序列为SEQ ID NO:12的基因组件，该基因组件中包括序列为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的边缘序列；
所述的PCR扩增的引物对是SEQ ID NOS:3/4和/或SEQ ID NOS:5/6；
所述的PCR反应条件是：
94℃，1min，1个循环；
98℃10s，55℃30s，72℃30s，35个循环；
72℃，7min，1个循环。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的PCR反应体系为50μL体系，含有：待测样品DNA5ng/μL；10×LA PCR BufferII，Mg2+Plus，5μL；dNTP各0.4mM；引物对各0.2μM；Taq DNA聚合酶0.05U/μL。
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