CN102344918A - 纳米吸附改善酶稳定性的方法 - Google Patents

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徐红华
李丽
于国萍
姜毓君
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Abstract

本发明公开了一种通过纳米颗粒作为吸附载体提高酶稳定性的方法，该方法采用不同纳米粒径的SiO2作载体，选用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶为模型酶，分别在pH4.0-10.0和pH4.0-8.0范围内，使载体-酶质量比实现3∶1，1∶1和1∶3三个不同的比例，室温下搅拌3h，使二者通过静电作用相互吸附。本方法可以大大提高酶稳定性，以20nmSiO2为载体的胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，在80℃时酶活力较天然酶分别提高了88％和82％，同时，本发明的方法操作简单，条件温和，酶稳定性改善显著，易于推广，具有较高的经济效益。

Description

纳米吸附改善酶稳定性的方法
技术领域
本发明涉及一种提高酶稳定性的方法，特别涉及一种以纳米颗粒作为酶吸附载体改善酶稳定性的方法。
背景技术
酶是由蛋白质组成，其空间结构对所处的环境十分敏感。一般情况下，对热、强酸、强碱、有机溶剂等均不够稳定，在反应中易失活。天然酶的不稳定性大大限制了其应用领域和应用效果，选择适宜的载体对酶进行固定化可以提高酶的稳定性。
在酶固定化采用的方法中，吸附法是最简单的一种方法。它的最大优点是工艺简便、条件温和，酶分子不会被破坏，得到的固定化酶稳定性好。
通过吸附作用对酶的稳定性进行改善，关键的问题是选择合适的载体。在众多载体中，纳米二氧化硅是比较常见的一种无机载体，它具有较高的表面能和生物相容性，价格低廉。此外，还有较高的机械强度有利于在生物反应器中进行工业生产。因此，在通过吸附对酶进行固定化中具有较高的应用价值。
载体粒径大小、载体和酶吸附的方式直接影响固定化酶的稳定性，目前的研究结果已经证实，纳米载体优于微米载体。但是，目前采用正硅酸乙酯与N-(β-氨乙基)-氨丙基三乙氧基硅烷在油包水形成的微胶囊中同步水解的方法，一步法制备了氨基化的二氧化硅颗粒，以此作为载体，通过戊二醛作为交联剂，采用共价法对不同酶进行固定化。此种方法固定化时间长达几十小时，操作复杂，同时，由于交联剂的存在，不利于保持较高的酶活力，酶稳定性改善不显著。
发明内容
本发明在最大限度提高酶活保持率情况下，提供一种改善酶稳定性的方法。采用纳米SiO2作载体，调整介质的pH，利用酶和纳米载体所带电荷不同，自组装形成酶-载体聚合体，从而达到提高酶稳定性的目的。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
纳米吸附改善胰蛋白酶稳定性的方法：分别用pH4.0-10.0的缓冲液配制3.3mg/mL，10mg/mL和30mg/mL胰蛋白酶溶液，再用相同pH的缓冲液配制10mg/mL纳米SiO2溶液。各取10mL胰蛋白酶溶液和纳米SiO2溶液使酶和载体质量比实现1∶3，1∶1和3∶1三个比例，在室温下，用电动搅拌器搅拌吸附3h。所述胰蛋白酶是一种常用的动物蛋白酶，酶活力单位为285U/mg，酶解最适pH7.8，最适温度37℃。所述纳米SiO2粒径分布均一，分别为20nm、100nm、300nm。
以吸附后的酶活保持率、热稳定性和酸碱稳定性为指标，吸附pH优选为7.8，酶和载体质量比优选为1∶1，载体SiO2粒径优选为20nm。
本发明另一种通过纳米吸附改善木瓜蛋白酶稳定性的方法：分别用pH4.0-8.0的缓冲液配制3.3mg/mL，10mg/mL和30mg/mL木瓜蛋白酶溶液，再用相同pH的缓冲液配制10mg/mL纳米SiO2溶液。各取10mL木瓜蛋白酶溶液和纳米SiO2溶液使酶和载体质量比实现1∶3，1∶1和3∶1三个比例。在室温下，用电动搅拌器搅拌吸附3h。所述木瓜蛋白酶是一种来源广泛的植物蛋白酶，酶活力单位为617U/mg，酶解最适pH6.0，最适温度50℃。所述纳米SiO2粒径分布均一，分别为20nm、100nm、300nm。
以吸附后的酶活保持率、热稳定性和酸碱稳定性为指标，吸附pH优选为6.0，酶和载体质量比优选为1∶1，载体SiO2粒径优选为20nm。
本发明采用以纳米颗粒作为酶吸附载体改善酶稳定性的方法，与现有技术相比具有以下优点：
1.通过调整pH使纳米SiO2载体和酶带有相反电荷，通过静电吸附的物理方法完成酶的固定化，避免了现有化学方法对酶分子结构的影响与破坏，使吸附后酶活性保持率较高。
2.吸附时间与传统的化学交联法相比明显缩短。本方法吸附时间仅需3h甚至更短，而传统的化学交联法要长达几十个小时。
3.与化学交联法和微米SiO2固定化酶的方法相比，本方法可以更有效提高酶稳定性。化学交联法对木瓜蛋白酶固定化后，80℃时固定化酶活力较游离酶提高了53％，常规微米SiO2吸附后提高了25％，而本发明采用的方法提高了82％。
4.本发明的方法操作简单，酶稳定性改善显著，易于推广，具有较高的经济效益。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。
实施例1
分别用0.1mol/L pH7.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制10mg/mL胰蛋白酶溶液和10mg/mL 20nm SiO2溶液。各取10mL胰蛋白酶溶液和纳米SiO2溶液混合使酶和载体质量比为1∶1，在室温条件下，用电动搅拌器搅拌吸附3h。
经检测，吸附后酶活保持率为61％。在pH7.8的条件下，吸附在20nmSiO2载体的胰蛋白酶在80℃时酶活力较游离酶提高了88％；在温度为37℃、pH3.0的条件下，固定化酶活力较游离酶提高了78％。
实施例2
分别用0.1mol/L pH7.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制10mg/mL胰蛋白酶溶液和10mg/mL 100nm SiO2溶液。各取10mL胰蛋白酶溶液和纳米SiO2溶液混合使酶和载体质量比例为1∶1，在室温条件下，用电动搅拌器搅拌吸附3h。
经检测，吸附后酶活保持率为56％，在pH7.8的条件下，吸附在100nmSiO2载体的胰蛋白酶在80℃时酶活力较游离酶提高了72％；在温度为37℃、pH3.O的条件下，固定化酶括力较游离酶提高了65％。
实施例3
分别用0.05mol/L pH9.0的硼砂-氢氧化钠缓冲液配制10mg/mL胰蛋白酶溶液和10mg/mL 300nm SiO2溶液。各取10mL胰蛋白酶溶液和300nm SiO2溶液混合使酶和载体质量比例为1∶3，在室温条件下，用电动搅拌器搅拌吸附3h。
经检测，吸附后酶活保持率为47％；在pH7.8的条件下，吸附在300nmSiO2载体的胰蛋白酶在80℃时酶活力较游离酶提高了54％；在温度为37℃、pH3.O的条件下，固定化酶活力较游离酶提高了48％。
实施例4
分别用O.1mol/L pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制1Omg/mL木瓜蛋白酶溶液和10mg/mL 20nm SiO2溶液。各取10mL木瓜蛋白酶溶液和20nm SiO2溶液混合使酶和载体质量比为1∶1，在室温条件下，用电动搅拌器搅拌吸附3h。
经检测，吸附后酶活保持率为53％，在pH6.0的条件下，吸附在20nmSiO2载体的木瓜蛋白酶在80℃时酶活力较游离酶提高了82％；在温度为50℃、pH3.0的条件下，固定化酶活力较游离酶提高了49％。
实施例5
分别用0.1mol/L pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制10mg/mL木瓜蛋白酶溶液和10mg/mL 100nm SiO2溶液。各取10mL木瓜蛋白酶溶液和100nmSiO2溶液混合使酶和载体质量比为1∶1，在室温条件下，在电动搅拌器作用下搅拌吸附3h。
经检测，吸附后酶活保持率为42％，在pH6.0的条件下，吸附在100nmSiO2载体的木瓜蛋白酶在80℃时酶活力较游离酶提高了61％；在温度为50℃、pH3.0的条件下，固定化酶活力较游离酶提高了29％。
实施例6
分别用0.1mol/L pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制10mg/mL木瓜蛋白酶溶液和10mg/mL 300nm SiO2溶液。各取10mL木瓜蛋白酶溶液和300nmSiO2溶液混合使酶和载体质量比为1∶1，在室温条件下，在电动搅拌器作用下搅拌吸附3h。
经检测，吸附后酶活保持率为39％，在pH6.0的条件下，吸附在300nmSiO2载体的木瓜蛋白酶在80℃时酶活力较游离酶提高了60％；在温度为50℃、pH3.0的条件下，固定化酶活力较游离酶提高了25％。

Claims (8)

1.本发明涉及一种通过纳米颗粒作为吸附载体改善酶稳定性的方法，其特征在于选择不同粒径纳米颗粒为载体，将酶通过物理吸附作用固定在该载体上。
2.权利要求1中所提到的酶主要有两种：胰蛋白酶(最适温度37℃，最适pH7.8，等电点10.9，最适条件下的酶活力为285U/mg)和木瓜蛋白酶(最适温度50℃，最适pH6.0，等电点8.75，最适条件下的酶活力为617U/mg)
3.权利要求1中所提到的纳米颗粒是二氧化硅颗粒，粒径有20nm、100nm和300nm三种。
4.权利要求1所提到改善酶稳定性的方法，具体步骤如下：用不同pH的缓冲液配制一定浓度的酶溶液和纳米SiO2溶液。取酶溶液和纳米SiO2溶液按一定比例混合，于室温下在电动搅拌器作用下搅拌吸附一定时间。
5.根据权利要求4中所述的方法，其特征在于：对于胰蛋白酶，配制酶和载体缓冲溶液的pH范围在4.0-10.0；对于木瓜蛋白酶，配制酶和载体缓冲溶液的pH范围在4.0-8.0。
6.根据权利要求4中所述的方法，其特征在于纳米SiO2溶液的浓度10mg/mL；酶溶液的浓度为3.3mg/mL，10mg/mL和30mg/mL，使酶和载体的质量比实现1∶3，1∶1和3∶1三个比例。
7.权利根据权利要求4中所述的方法，其特征在于纳米SiO2和酶的吸附时间是3h。
8.根据权利要求5中所述的方法，其特征在于pH在4.0-8.0的缓冲液是0.1mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；pH范围在8.1-8.9的缓冲液是0.05mol/L的Tris-盐酸缓冲液；pH范围在9.0-10.0的缓冲液是0.05mol/L的硼砂-氢氧化钠缓冲液。
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