CN102341507B - 作为癌症标记的chk2多态型 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码细胞周期检测点激酶2的人基因CHK2(CHEK2)的基因修饰用途，其用于预测癌症风险和进展，用于预测对治疗癌症的药理学或非药理学治疗措施的反应，用于预测药物的不良作用。本发明还涉及提供单独基因变体，它们有助于检测和确认用于上述目的的更多基因修饰。这种基因修饰可包括在CHK2启动子的位置-7161用腺嘌呤取代鸟嘌呤，在位置-7235用鸟嘌呤取代胞嘧啶，在位置-10532用腺嘌呤取代鸟嘌呤，或在位置-10621到-10649缺失29个碱基对。

Description

作为癌症标记的CHK2多态型
本发明涉及确定治疗癌症的合适疗法的诊断方法。
癌症治疗的必要方面是首先实现明确诊断。诊断提供关于疾病实际阶段的信息，这对于随后要使用的治疗类型也是决定性因素，所述治疗类型为例如手术去除肿瘤和可任选的辐射和药物治疗，也可能使用物理方法(例如高热疗法)。经典的诊断方法包括所谓的“分期(staging)”和“分级(grading)”。分期描述了肿瘤大小和其侵袭，并检测淋巴结是否受到影响和是否存在远处转移灶(例如TNM分期系统)。分级是组织学检测肿瘤细胞，其中较低的恶性潜能归于高分化的肿瘤细胞而不是分化较差或去分化细胞。该分类在预测单独个体方面受到限制，临床经验显示具有相同肿瘤阶段的病人表现出明显不同的疾病进程和对治疗的不同反应，这在极端变化的存活阶段最清楚。
由于此原因，临床实践需要提供额外和更确切的、能改善癌症个体预断的标记。在乳癌病例中，其可通过将组织化学标记用于雌激素受体表达分析来实现。
另一种方法是搜索基因缺陷，例如肿瘤抑制基因中的体细胞突变。新方法尝试通过基因表达谱方法来预测疾病进程。癌症治疗的另一个问题是预测癌症药物的有效性、各最优剂量或治疗持续时间，以及预测严重和危险副作用的出现。例如，一些用伊立替康进行治疗的病人受到严重副作用折磨的情况可归咎于UGT1A1基因的遗传多态性。预先基因分析能在治疗开始前鉴定这类病人，并调整剂量。
此外，使用以生物技术方法生产的药物的疗法费用较贵，未来这些疗法将会限于病人，治疗效能可能取决于他们各自的状况。
恶性肿瘤的基本性质
癌细胞的特征是失去接触抑制和细胞生长不受控。这种改变自发或通过有害物(noxae)(破坏基因组的所谓致癌物质)引起。该有害物质包括许多化学物质、吸烟以及UV光。此外，遗传因素在癌症发展中起到重要作用。除了不受限制的生长，在其它器官中形成“后代肿瘤”(转移灶)的趋势是癌细胞的特征。转移灶通常经血液或淋巴管传播。在大部分病例中，癌症不可治愈且是致命的。治疗方法旨在通过手术去除原发肿瘤和转移灶。另外，可以用辐射治疗肿瘤。可尝试用所谓的细胞生长抑制剂、针对特定蛋白或表面标记的抗体或免疫调节物质(细胞因子、干扰素)杀死迅速增殖的细胞或诱导调亡。
确定癌症进程的预断因素具有很强相关性，其提供对特定治疗形式的反应的信息或能用于总体预测转移灶发生、肿瘤进展和存活。
显然，有多种单独、未发现的生物变量，其确定具有独立分期和分级的肿瘤疾病进程。这些因素包括遗传的宿主因素。还需要发展能预测肿瘤发生的遗传标记。此类标记用于将进一步的筛选方法(血清学、放射显影、超声波检查、MRT等)关注的人适时纳入。这允许在早期阶段诊断和治疗癌症，早期肿瘤的恢复和存活机会显著高于晚期肿瘤。
DNA修复机制的意义
由于DNA修复机制，细胞能去除DNA结构的缺陷性改变。这种DNA中的损伤可在DNA复制中自发产生，或由于致突变物质、极端高温或电离辐射的影响而产生。DNA损伤可导致有丝分裂的DNA复制以错误方式进行、蛋白质不再合成或错误合成或导致必要的染色体区域在双键打开后被切割。如果细胞的复杂修复机制不成功，增殖和休眠的体细胞中积累的缺陷数量大幅增加，使得正常细胞功能缺损。在生殖细胞中，子代细胞不再能存活，导致细胞系失活：细胞或第二或第三连续世代分别失去细胞分裂能力并死亡。在细胞周期控制中，控制蛋白能识别缺陷细胞或其DNA，并引起细胞周期停止或程序性细胞死亡(调亡)。
细胞周期检测点激酶2的意义
细胞最重要的功能是维持基因组完整性。出于此原因，有许多控制机制来确保细胞周期内所有过程被正确终止。这些控制机制称为“检测点 [1] ”。如该术语所示，这些是未精确定义的点，而是通过可在特定条件下起始的级联反应。
迄今已鉴定了一些细胞周期检测点。哺乳动物中研究最充分的检测点示于图1。一方面，存在由不同细胞周期阶段中的DNA损伤激活的DNA损伤检测点。外源因素如辐射，以及内源性事件如自发突变均会引起该损伤。另一方面，复制检测点通过不完整或缺陷性DNA复制激活。纺锤体检测点控制两极纺锤体的形成、着丝粒的附着和着丝点结构的形成。
只要这些过程未完全终止或损伤未修复，细胞向细胞周期下个阶段的转变就会受到抑制以确保维持细胞的基因组完整性。
细胞周期检测点激酶2参与细胞周期中的必要控制机制，所述机制确保传递到子代细胞的错误最少。在不同检测点激活的相关CHK2级联反应示于图2。由于DNA损伤，ATM(共济失调性毛细血管扩张，突变的)是磷酸化的，并因而被激活。ATM随之通过在氨基酸位置68上的苏氨酸(Thr)的磷酸化激活CHK2。此磷酸化是二聚体形成的前提条件，通过它CHK2能自身磷酸化。只有通过该方法，CHK2能以充分激活的形式存在并激活其效应物，并通过效应物引起缺陷细胞中的细胞周期停止于G1、S或G2/M期、DNA修复系统激活或调亡。
CHK2的效应物包括p53(肿瘤蛋白53)，其通过CHK2在丝氨酸(Ser)20磷酸化并从而稳定。然后，p53正调节参与DNA损伤修复、调亡、控制细胞周期的因子。BRCA1(乳腺癌1基因)也属于CHK2底物。它通过CHK2在Ser988磷酸化，并因而从与CHK2的复合体中释放，随之引起细胞周期终止以修复损伤的DNA。CDC25C(细胞分裂周期25C)也通过CHK2在Ser216磷酸化，而其自身磷酸酶活性被抑制且以细胞质方式降解。在此情况中，Cdk1(细胞周期蛋白依赖性激酶1)不能被激活，因而避免了具有受损DNA的细胞进入有丝分裂。此外，CDC25A通过CHK2在Ser123磷酸化，之后其被泛素化并以蛋白酶体依赖性方式降解。该蛋白对细胞周期中的细胞进程起到重要作用，然而其受到降解抑制。
CHK2在DNA损伤起始的信号转导中发挥重要作用。通过产生敲除小鼠分析CHK2的生理学重要性。Chk2-/+以及Chk2-/-小鼠可存活。然而，用亚致死剂量(8Gy)辐射后，它们表现出不同长度的存活期：野生型和Chk2-/+小鼠的平均存活期显著低于Chk2-/-小鼠。因此，Chk2-/-小鼠显示由辐射诱导的调亡率降低引起的抗辐射性。虽然Chk2-/-小鼠中的G2/M检测点不受影响，G1/S检测点尽管能够诱导但不能维持。这使得p53的转录活性减小。此外，肿瘤仅在Chk2-/-小鼠中发展，与具有至少一个功能性Chk2等位基因的小鼠相反。
因此，本发明所要解决的问题是提供一种能改进对癌症自然史和对任何治疗形式反应的预断的方法。具体而言，此方法还应能用于鉴别其DNA修复机制增强使得癌症治疗变难的病人。
通过用于预测发生癌症的风险、疾病进程、在癌症治疗中的药物效果和药物相关风险的体外方法解决此问题，其中搜索病人样品中人染色体22q12.1上CHK2基因启动子区域中的一个或多个基因修饰，所述基因修饰选自多态型(polymorphism，德文polymorphismus)-7161G＞A、多态型-7235C＞G、多态型-10532G＞A和多态型-10649-(-10621)del29。
用于上述目标的上述多态型的应用也是本发明的主题。
因此，本发明旨在：
a.提供基因CHK2启动子中改变功能的基因组多态性，其引起蛋白表达改变或引起剪接变体表达改变，或
b.适合在基因CHK2中分别发现和/或确认更多的多态型或单体型，
c.提供适合预测疾病总体风险和进程的多态型，
d.提供适合预测对药物和癌症治疗总体反应和副作用的多态型，特别是对CHK2抑制剂，
e.提供适合预测其它治疗形式(如辐射、高温、低温)总体效果的多态型。
由于CHK2对于维持基因组完整性的基础性意义，此类多态型适合预测癌症情况中总体疾病风险和/或疾病进程和/或预测所有药物或非药理疗法的治疗反应/治疗失败或不利的副作用。
基因CHK2启动子中多态型的检测
已知基因CHK2启动子区域中的3种多态型，它们可在通常能进入的数据库中发现。通过系统测序人的DNA样品，检测和确认了这3种多态型：-7161G＞A(rs2236141)、-7235C＞G(rs2236142)和-10532G＞A(rs5762767)(图5)。出于此目的，CHK2启动子区域的基因序列通过PCR反应扩增并用桑格(Sanger)的方法测序。本领域技术人员熟知为此目的必需的方法，例如获得PCR反应所需的引物对和选择测序引物。在本文中，发现缺失29个碱基对(-10649-(-10621)del29，无dbSNP ID)的新多态型(图5)。对这些SNP进行编号，从而数字+1分配给起始密码子ATG的核苷酸A。由于理解了数字0不存在，数字-1分配给起始密码子ATG的A之前的核苷酸。
根据本发明中多态型的用途来检测这些多态型，可通过本领域技术人员已知的任何方法进行，例如直接测序、PCR和之后的限制性分析、反向杂交、斑点印迹或槽印迹法、质谱、Taqman
Figure BPA00001431174300041
或LightCycler
Figure BPA00001431174300042
技术、Pyrosequencing、Invader
Figure BPA00001431174300044
技术、液态芯片(Luminex)方法。此外，这些基因多态型可通过多路杂交和杂交于DNA芯片在同时检测。
原则上，人体所有细胞均可以恶性形式产生并引起癌症。此处和下文的解释描述了肿瘤进展、转移和治疗反应的总体机制。在此方面，本文所述机制和权利要求涉及所有人肿瘤。以下仅作为例子列出。
泌尿生殖道肿瘤，如肾细胞癌、前列腺癌和精原细胞瘤；女性生殖系统肿瘤，如乳癌、子宫体癌、卵巢癌、宫颈癌；胃肠道肿瘤，如口腔、食管癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌；呼吸道肿瘤，如喉癌、支气管癌；皮肤瘤，如恶性黑色素瘤、基底细胞癌和T细胞淋巴瘤；造血系统肿瘤疾病，如霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、急性和慢性白血病、浆细胞瘤；大脑和神经组织各自的肿瘤疾病，如成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、脑膜肉瘤、星形细胞瘤以及软组织肿瘤，如肉瘤和头颈部肿瘤。
基因CHK2
人基因GHK2位于染色体22q12.1(Genebank登录号NM_007194)且编码在核中表达的65kD大小的蛋白质。在本文中，应指出该基因称作“CHK2”和“CHEK2”。在下文中，使用命名“CHK2”。图3显示该基因结构的示意图。已鉴定CHK2的活性启动子区域。该启动子区域包含许多转录因子SP1的结合位点，其结合加强转录活性。当NF-Y结合CCAAT盒时也观察到CHK2的正调节。
CHK2中的体细胞突变
据认为CHK2是潜在的肿瘤抑制基因，因为它在DNA损伤后的检测点阻滞中发挥重要作用且因为不同的肿瘤抑制基因是CHK2的底物。迄今，可以在一些患散发性肿瘤(sporadic tumour)(例如结直肠肿瘤、肺癌、前列腺癌，乳癌)的病人以及多肿瘤表型李法美尼综合症(Li-Fraumeni syndrome)的病人中检测到该基因的体细胞突变。与单核苷酸多态性(SNP)相反，这些突变例如未在相关病人的外周血细胞中发现。
CHK2修饰引起的肿瘤疾病风险
迄今，已可在一些病例中检测到不同肿瘤疾病的CHK2中的基因修饰并将其与疾病发展的风险相关联。这些不是常见的基因变体而是稀有突变(频率＜1％)，相比健康的对照组，其在病人大集合群中更常检测到。至今，仅有一个发表的研究不仅分析这些稀有突变，也分析了经常产生的SNP。在本文中，还分析了启动子多态型-7161G＞A(rs223641)与乳癌发展风险的相关性。然而，不能检测到关联性(Baynes等.ATM、BRCA1、BRCA2、CHEK2和TP53癌敏感性基因的常见变体不可能增加乳腺癌风险(Common variants in the ATM，BRCA1，BRCA2，CHEK2 andTP53 cancer susceptibility genes are unlikely to increase breast cancer risk).2007Breast Cancer Res 9：R27)。
作为化学治疗剂的CHK2抑制剂
由于检测点参与许多调控级联，它们是癌症药物的合适靶标。检测点蛋白的特定性质说明：(1)检测点的复杂信号转导系统提供了多种攻击靶标，(2)在健康细胞中，一些检测点似乎仅具有很小意义，这大幅降低了抑制剂的毒性，(3)恢复缺陷检测点可能导致细胞生长变慢，(4)对作为转导信号的检测点进行调整，其可能受干扰和(5)恢复受损的检测点可能增加癌细胞凋亡率，并因而提高它们对特定底物的敏感性。
与这些通过基因治疗方法最容易实现的目标相反，检测点的2种其它性质是更易识别的靶标。具有缺陷检测点的细胞表现出对辐射和细胞毒性物质的敏感性增加或抗性增加。抑制CHK2似乎在p53缺陷细胞中引起对DNA损伤剂的敏感，与此同时，它保护正常组织不受损伤并因而防止副作用。出于此原因，抑制CHK2是开发新抗癌药物可行方法的一部分。
分别已知或已开发了不同的CHK2抑制剂。目前，除了相对非特异性的抑制剂UCN-01和DBH(脱溴己炔二醇)(debromohymenialdisine)之外，也可获得特异性有效CHK”抑制剂。它们包括CHK2抑制剂2(2-(4-(4-氯苯氧基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-5-羧酰胺、VRX0466617(5-(4-(4溴苯基氨基)苯基-氨基)-3-羟基-N-(1-羟基丙-2-基)异噻唑-4-甲脒(carboximidamide))和NSC 109555((2E，2’E)-2，2-(1，1’-(4，4’-羰基-二(亚氮烷基)二(4，1-亚苯基))二(乙烷-1-基-1-亚基))二(肼甲脒)((2E，2’E)-2，2-(1，1’-(4，4’-carbonyl-bis(azanediyl)bis(4，1-phenylene))bis(ethane-1-yl-1-ylidene))bis(hydrazinecarboximidamide)，它们有助于减少放射疗法中的副作用(图4)。
作为化学治疗剂的CHK2激活剂
然而，CHK2激活剂可以是癌症治疗中的另一个选择。CHK2在抑制癌发生中起到作用，如果没有DNA损伤剂存在，其激活可诱导肿瘤细胞离开增殖状态并死亡。另外，这引起强G2阻滞。激活策略可能弥补抑制剂的劣势：肿瘤是异源的，由于此原因，仅失活单个级联并不总是足够的。通过过度激活维持的细胞周期机制(在许多肿瘤细胞类型中普遍)，可抵消异源性。
-7161G＞A，-7235C＞GT，-10532G＞A和-10649-(-10621)del-29多态型分布、单体型的检测和使用这些基因型以发现更多的相关多态型和单体型
为了此目的，检测不同白种人DNA样品的基因型。结果示于下表：
多态型 基因型
-7161G＞A GG：188 GA：43 AA：4
-7235C＞G CC：25 CG：88 GG：121
-10532G＞A GG：188 GA：43 AA：4
-10649-(-10621)del29 II：56 ID：109 DD：56
I＝插入，D＝缺失
进一步的分析显示这些健康白种人的DNA样品在特定多态型间存在连锁不平衡。术语连锁不平衡指所出现的等位基因组合(单体型)，在统计学上出现比其预期频率明显更多或更稀有的组合。在本文中，观察到多态型-7161G＞A和-10532G＞A彼此完全连锁。相反，多态型-7235C＞G和-10649-(-10621)del29互不相连，且与其它2种变体连锁程度也有限(图6A和B)。连锁量由值D’和r2表述。D’＝1和r2＝1指显著连锁。这些数值越接近1，连锁不平衡越密切。计算构建自这4种多态型的单体型产生7种不同等位基因组合。这些启动子变体没有形成优选的单体型(图6C)。为了确定所有可能的组合，需要检测4种多态型中的至少3种。
本发明的主题之一是这些新多态型能用于检测和确认CHK2或邻近基因中更多的相关基因组基因修饰，例如与基因的GHK2基因型存在连锁不平衡的基因。这些也可以是同样定位于染色体22但与基因CHK2距离远的基因。为了此目的，采用下列方法：
1.对于特定表型(如细胞性质、疾病状态、疾病进程、对药物组合物的反应)，确立了与多态型-7161G＞A、-7235C＞G、-10532G＞A和-10649-(-10621)del29的关联，其中这些关联的建立可独立地对各基因型或通过采用单体型的所有排列。
2.对于新检测到的CHK2或邻近基因中的基因修饰，使用上述基因型或单体型检测已存在的关联是提高还是降低。
下面简要描述附图。
图1：具有最重要检测点的细胞周期的示意图
图2：CHK2-调控的检测点的级联反应的图示
图3：人基因CHK2的内含子/外显子结构(非真实比例)
图4：一些CHK2抑制剂的结构式
图5：基因CHK2中多态型的示意图(非真实比例)
图6：使用Haploview程序进行基因CHK2中启动子多态型的连锁分析；A-多态型彼此连锁的图示。黑正方形表示r2＝1；灰色正方形表示r2＜0.5，浅灰色正方形表示r2＜0.1。B-各等位基因的频率和连锁可能性；C-构建的单体型的频率；三角形所指等位基因称为单体型标签等位基因，即这些等位基因必需被确定以用于明确单体型。
图7：基因CHK2启动子中转录因子的推定结合位点，用红色表示的碱基代表相关多态型的等位基因。
图8：含CHK2的-7235C＞G多态型的不同等位基因的构建物的电泳迁移率变动分析(EMSA)结果。加入细胞核提取物后，观察到核蛋白与C等位基因的结合增加。置换寡核苷酸的存在特异性抑制该结合。
图9：含CHK2的-10649-(-10621)del29 CHK2多态型的不同等位基因的构建物的电泳迁移率变动分析(EMSA)结果。加入细胞核提取物后，观察到2种等位基因都引起转录因子结合，第2种等位基因可与其竞争。然而，在此情况中的转录因子不同。
图10：取决于-10649-(-10621)del29多态型的CHK2启动子活性，通过SEAP受体测试所确定，**：p＜0.01
图11：取决于-7161G＞A多态型的CHK2 mRNA表达。显示CHK2-/β-肌动蛋白-mRNA的商。A：乳癌，B：CLL；**：p＜0.01；*：p＜0.05
图12：取决于-7235C＞G多态型的CHK2 mRNA表达。显示CHK2-/β-肌动蛋白-mRNA的商。A：乳癌，B：CLL；**：p＜0.05
图13：取决于女性乳癌患者中-10649-(-10621)del29多态型的CHK2 mRNA表达。显示CHK2-/β-肌动蛋白-mRNA的商。
图14：取决于-7161G＞A多态型的基因型的结直肠癌患者生存的卡普兰-迈耶分析。
图15：取决于-7235C＞G多态型的基因型的慢性淋巴白血病患者生存的卡普兰-迈耶分析；*：p＜0.05。
图16：肾细胞癌3期和4期患者生存的卡普兰-迈耶分析。A：取决于-7161G＞A多态型基因型的生存，B：取决于-7161G＞A多态型的无进展生存，C：取决于-7235C＞G多态型的生存；***：p＜0.001；*：p＜0.05。
图17：取决于-10649-(-10621)del29多态型的基因型的乳癌患者生存的卡普兰-迈耶分析。
图18：成胶质细胞瘤患者生存的卡普兰-迈耶分析。A：存活，B：取决于-10649-(-10621)del29多态型的基因型的无复发生存，C：存活，D：取决于-7235C＞G多态型的无复发生存；**：p＜0.01；*：p＜0.05
图19：取决于-7161G＞A多态型的基因型的前列腺癌患者生存的卡普兰-迈耶分析；**：p＜0.01
基因CHK2中启动子多态性的功能性意义
分析对基因CHK2中的启动子多态性必定起作用的功能性修饰。与分别取决于启动子的基因型和单体型的CHK2蛋白的可变剪接、组织特异性表达或过度表达的关联性具有可能性。在本文中，首先用计算机程序进行分析以发现所观察核苷酸交换是否能影响转录因子的结合。转录因子结合特定共有序列，可提高或降低启动子活性，从而导致基因转录增加或减少以及编码蛋白的表达增加或减少。如图7所示，上述所有启动子SNP均定位于不同转录因子(例如p53、NF-kB或Mef2)结合位点的共有序列，其结合可被多态性削弱。出现特定基因型的效果是这些结合位点失去或其由于共有序列改变而以新的方式形成。为了实验分析此效果，进行所谓的EMSA(电泳迁移率变动分析)。在该试验中，含相关多态型的短核酸区段用细胞核提取物进行孵育。然后，这些提取物中所含的转录因子蛋白以不同强度结合核酸区段。随后，用X射线胶片显现与DNA的结合。强结合会产生较强的带。图8显示此试验结果，其中采用了含-7235C＞G多态型的C或G等位基因的特定构建物。C构建物带的存在指示转录因子对此区域的结合。G构建物没有此带，表明没有转录因子结合该等位基因。特定寡核苷酸的带强度减小表明转录因子结合是特异性结合。图9显示此试验结果，其中采用含-10649-(-10621)del29多态型的插入等位基因或缺失等位基因的特定构建物。2种等位基因都引起转录因子结合，第2种等位基因可产生竞争。然而，在此情况中的转录因子不同。此外，图10显示转录因子与缺失等位基因结合导致启动子活性比插入等位基因的增强。
然后，通过实时PCR方法分析人组织中CHK2在mRNA水平的表达。为了此目的，采集来自乳癌手术的人组织以及白血病患者血细胞的mRNA，通过反转录酶法转录到cDNA中。本领域技术人员已知该方法。随后，用实时PCR(Taqman方法)确定表达水平，并与管家基因β-肌动蛋白基因的表达水平相比较。
结果示于图11-13。图11A显示-7161G＞A SNP的GG基因型在乳癌中的mRNA表达显著高于GA基因型。图11B也显示GG基因型在CLL病人中的mRNA表达增加。多态型-7235C＞G也显示基因表达中等位基因依赖性差异。如图12A和12B所示，C-等位基因载体的CHK2 mRNA显著少于GG基因型载体。这适用于乳癌患者和CLL病人。图13显示乳癌患者中纯合性缺失的mRNA表达增加。纯合性插入的表达最低。异合基因型显示中间值。在本文中，可观察到基因-剂量效果。
因此，已证实在基因CHK2中有引起癌组织中CHK2表达变化的基因修饰。这些可以是上述的启动子多态型或显示SNP连锁不平衡的多态型。因此，本发明的主题也包括定量CHK2表达，将其与已知的CHK2多态型相关联和发现新的、更适合的多态型并加以确认。
发现本文所示人癌组织中CHK2的基因型依赖性表达极为重要，因为CHK2活性降低可导致微随体和染色体不稳定，这两者都是基因组不稳定的部分特征，因而有利于肿瘤发生且对肿瘤进展有负作用(Ahn等.CHK2蛋白激酶(The CHK2protein kinase).2004 DNA Repair 3：1039-1047)。此外，CHK2的该基因型依赖性表达对CHK2抑制剂疗法反应有影响。预期基因表达较低易于患病(predispose)，这是由于特定基因型(例如e-7235C＞G多态型的CC基因型)对CHK2抑制剂的反应强于其它基因型。因此，基因CHK2的基因修饰能用于预测对癌症疗法的反应以辨别例如应答者或非应答者。这些基因修饰也可用于剂量发现和/或预测药物不利副作用的发生。这种癌症治疗可以是最广泛意义上的以药物为基础，即通过提供物质给身体，或这些癌症疗法可具有物理效果(如辐射、高温、低温)。
因此，我们预期对疾病进程，特别是肿瘤疾病案例产生效果，以及对影响CHK2级联调控的物质或直接抑制CHK2的物质的改善的反应。
采用CHK2的基因修饰预测疾病风险和疾病进程
由于细胞周期检测点激酶2在细胞周期调控中的关键作用，本发明的一个基本主题是采用CHK2基因修饰预测总体疾病风险和疾病进程的可能性。
癌的多步骤发展反映基因修饰的积累导致正常细胞转化成癌细胞以及正常组织转变成良性且可能转变成恶性、侵袭性肿瘤。肿瘤抑制基因和原癌基因中修饰的积累加速了肿瘤生成且可影响放射治疗和化学治疗。然而，日趋明确的是，受损DNA修复机制以及检测点是肿瘤基因组不稳定性增加的原因。由于检测点在维持基因组完整性中起到重要作用，预期可通过遗传确定的、可激活性降低的检测点影响各种和截然不同的肿瘤疾病进程。这意味着在所有人体细胞中表达且保护细胞抗DNA损伤的蛋白质的表达改变可调节细胞功能，其对所有生理学和病理生理学过程有决定性影响或至少调节这些过程。此外，对药物的反应以特定方式受到影响。这适用于所需和非所需的药物效果。
在科学文献中反复假设检测点蛋白的功能性改变对各种疾病和不同疾病进程的持续效果，因为它们是以高程度系统发生性维持的途径。此类基因修饰可以是检测点蛋白中的结构修饰突变，例如通过磷酸化降低蛋白活化或减小底物选择性。此外，可改变表达水平，其中可引起例如调亡的后续级联反应起始减少或出现功能改变的剪接变体。认为所有这些改变均是癌的基因倾向。
根据所述例子，显然，
1.编码广泛表达蛋白的基因中的基因修饰，影响或引起各种疾病和各种疾病风险，和
2.检测点蛋白是维持人体内基因组完整性的复合网络一部分。
涉及基因CHK2中基因修饰且由例如CHK2蛋白表达水平改变确定的疾病是例如任何亲代组织的良性和恶性瘤形成。
因此，本发明的一个基本主题是提供基因CHK2中诊断相关基因修饰作为所有人类癌症的预断因子。这将描述于下列所选例子。
结直肠癌—结直肠癌是胃肠道中最常见的肿瘤类型且是全球肿瘤相关死亡的主要原因之一(占总癌症死亡率的12-15％)。肿瘤切除术后的平均五年存活率仅有50％。预测疾病进程的标准方法是TNM或UICC分期系统。处于UICC III或IV期的病人的总体预后差于UICC I或II期病人。在转移的结直肠癌(UICC III或IV期)病例中施用辅助的化学治疗，可提高放射治疗的局部效果。这些病人大部分发生复发和转移，由此需要密集的后续治疗。因此，鉴别和建立能预测更多病程的适当标记很重要。本发明的另一个主题是采用CHK2中的基因修饰以能预测结直肠癌的更多病史。
图14显示结直肠肿瘤UICC III和IV期病人中取决于-7161G＞A多态型的存活差异。具有GG基因型的病人存活长于具有杂合GA基因型的病人。
慢性淋巴性白血病—慢性淋巴性白血病(CLL)的一个特征是大量的退化淋巴细胞。所有白血病的30％是慢性淋巴性白血病。发作的平均年龄是65岁。CLL可为良性长达20年，即病人没有任何症状，除了淋巴结肿大、疲劳和失去胃口。仅当淋巴细胞数量大幅增加、红细胞和血小板比例减少或出现其它并发症时才开始治疗。早期治疗对于病程没有效果。最重要的治疗措施是化学疗法。疾病越处于晚期，器官系统改变引起的健康损伤越重要。根据疾病的比奈(Binet)分期，医师可完成确定预后估计。CLL分期的特征还包括血液和骨髓中的淋巴细胞数量、脾和肝的大小及贫血的存在。CLL导致免疫系统中的改变，从而患该病的人发生其它种类癌的风险增大。然而，处于比奈系统相同分期的病人表现出很不同的病程。本发明所要解决的问题是表明基因CHK2中的基因修饰适合预测病程。
为了此目的，根据基因CHK2中的所述基因修饰对CLL病人进行基因分型，将基因状态与无进展生存相关联。图15显示取决于-7235C＞G多态型的存活。作为CC/GC基因型载体的病人存活期长于纯合GG的病人。
肾细胞癌—在肾细胞情况中，复发几率取决于肿瘤大小和肿瘤增殖。无转移的病人有高达80％的10年存活率，然而，有显著的个体间差异。由于目前普遍使用的超声波技术，许多肿瘤在非转移早期检测到且能及时治疗。如果存在远转移，可将手术去除肾脏与用白介素-2或干扰素-α的后续免疫治疗相结合。这就改善了身体对肿瘤细胞的防御。在转移的肾细胞癌情况中，干扰素、白介素-2和5-氟尿嘧啶在研究中可获得36％的应答率。目前，没有用于肾细胞癌患者存活的预测标记物。
图16A显示取决于-7161G＞A多态型的存活。具有GG基因型的病人存活期显著长于具有GA和AA基因型的病人(p＜0.05)。对于GG载体，到死亡的平均时间段是115个月，然而AA基因型的病人仅为9个月。类似数据适用于与-7161G＞A多态型相关联的无进展生存(图16B)。同样在此情况中，具有GG基因型的病人在观察期中表现出的进展最低。对于GG，平均无进展生存为52个月，而AA仅为2个月(p＜0.001)。-7235C＞G多态型也与生存相关(图16C)。G等位基因的载体的存活期长于具有CC基因型的病人(p＜0.05)。
乳癌—乳癌是欧洲和美国女性群体中最常见的肿瘤。它影响所有女性的7到10％，占全部女性癌死亡率的25％。乳癌病因仍未知，然而，已描述了风险因素，如家族易患性、辐射接触或雌激素影响。大部分病人有侵袭性癌。除了少部分例外，即使检测到远距离转移，通过手术治疗任何可动手术的乳癌。可变的根除初始手术治疗导致的局部复发率不同，但对长期存活机会没有影响。此外，复发或远距离转移通常仅在5或甚至10年后显现。出于此原因，早期检测这些损伤和术后密切监控病人很重要。
定期进行后续检测，在临时怀疑病例中，甚至直到手术后10年。迄今，几乎没有可预测进一步病程的有效标记物。因此，目前，将典型的因素如肿瘤大小、转移、淋巴结的参与、激素受体状态等用于预后。用于生存可能性和对治疗应答的遗传标记物可实质性改善乳癌患者的护理。本发明所要解决的问题是显示采用CHK2中的基因修饰适合预测进一步的病程。
图17显示乳癌患者的生存与-10649-(-10621)del29多态型相关联。当与作为至少一个缺失的等位基因载体的病人比较时，具有纯合插入的病人表现出最高的存活率。
成胶质细胞瘤—神经胶质瘤主要出现在成人中。其病因未知。神经胶质瘤的组织学特征是恶性进展、弥漫性侵袭和高异质性。最常见的恶性神经胶质瘤是成胶质细胞瘤(WHO分级IV)。它通常经胼胝体散布到脑的另一个半球。治愈性手术治疗仅在分级I的神经胶质瘤(毛细胞性星形细胞瘤)病例中可能。所有其它神经胶质瘤均会复发。目前，它们不能治愈。成胶质细胞瘤的平均存活时间是6到8个月。没有术后放射治疗，平均存活时间仅是2到3个月。目前，没有可用于预测该严重疾病进程的标记物。
用于生存预后和对治疗应答的遗传标记物可实质性改善成胶质细胞瘤患者的护理。本发明所要解决的问题是显示采用CHK2中的基因修饰适合预测进一步的病程。
图18A和B显示-10649-(-10621)del29多态型对成胶质细胞瘤病例的病程有影响。
具有插入等位基因的病人表现出更长的存活和同样更长的无复发存活。纯合插入的病人平均390天没有复发，然而，具有缺失等位基因的病人仅在206天没有复发。-7235C＞G多态型也与病程相关联(图18C和D)。具有CC基因型的病人存活长于具有GG基因型的病人，且杂合对象的存活期在两者之间，这有利于基因-剂量效果。当与作为G等位基因载体的病人相比较时，具有CC基因型的病人的无复发期也是最长的。
前列腺癌—前列腺癌是男性病人中第二大最常见的恶性瘤。它占所有肿瘤疾病的9-11％，且发病率提高。超过50％的病例是大于70岁的病人。对于早期诊断，可测量前列腺特异性抗原(PSA)水平。此类早期诊断检测对超过50岁且预期寿命大于10年的男性很有用。然而对PSA值的意义有争议。需要在直肠检测前采集PSA，否则PSA值虚高。此外，伴随良性前列腺炎会出现PSA值升高。在早期，前列腺癌通常没有症状，因为其在远离尿道的位置发生。出于此原因，用于早期诊断的自我检查不可行。法鲁克斯(Flocks)C期前列腺癌的5年存活率为60％，然而，存活可能性在10年后仅为30％，15年后仅为20％。迄今，几乎没有可用于预测进一步病程的有效标记物。
用于生存可能性和对治疗应答的遗传标记物可实质性改善患者的护理。图19显示与-7161G＞A多态型关联的存活。具有至少一个G等位基因的病人的存活优于具有AA基因型的病人。G等位基因载体的平均存活是2650天，AA基因型载体的存活仅为220天。这些结果明确表明基因CHK2中的基因修饰可用于本文所述目的。推断(a priori)这些疾病间没有关系。
采用基因CHK2中的基因修饰预测病程和对治疗的应答
发明意义内的药物遗传学涉及药物效能、药物效价和效力和/或出现不利作用的诊断。为了定义药物效能和/或不利的副作用的出现，除化学界定产物的特定物性之外，还采用多种参数。2种重要参数，即可达到的血浆浓度和可达到的血浆半衰期，很大程度上决定药物的效能或无效或不利作用的发生。除其它因素以外，通过特定药物在肝或其它身体器官中代谢成有效或无效代谢物的速率和它们从体内清除的速率来确定血浆半衰期值，其中该清除可经肾、呼吸气、汗、精液、粪便或其它分泌体发生。此外，在口服给药的情况中，效能受到所谓的“首过效应”限制，因为药物经肠吸收后，一定量的药物在肝中代谢成无效的代谢物。
代谢酶基因的突变或多态性可改变其活性，使得其氨基酸组成改变，从而对要代谢的底物的亲和性增加或减小，因此，代谢可加速或减速。以类似的方式，转运蛋白的突变或多态性可改变氨基酸组成，使得转运和随后的从体内清除加速或减速。
为了选择最适合病人的物质、最优剂量、最优剂型和避免不利的副作用(其中部分有害或致命)，知晓引起基因产物改变的遗传多态性或突变极为重要。
细胞周期检测点激酶2对化学治疗药物和放射治疗的意义
遗传不稳定是所有肿瘤的一个特征，其也在肿瘤形成、进展和产生药物抗性中发挥作用。大部分肿瘤细胞具有为它们提供存活优势的缺陷性G1-S检测点。然而，如果存在威胁基因组完整性的刺激，此缺陷意味着肿瘤细胞高度依赖于G2检测点。如果发生DNA损伤，CHK2用于维持G1检测点。因此，激活CHK2并由此恢复G1检测点提供了避免治疗抗性的可能性。已显示失去CHK2导致对辐射的抗性。此抗性可通过CHK2激活剂反转。由于CHK2也影响G2检测点，其抑制及由此引起的G2检测点失活提供了由基因毒性物质引起的DNA损伤和修饰积累并导致肿瘤细胞死亡的可能性。
如果出现影响基因表达的CHK2基因修饰，这将影响这些CHK2抑制剂的效能。预期具有基因型依赖性较低CHK2表达的病人对抑制剂的反应优于CHK2较高表达的病人。此外，这意味着能影响采用化学治疗和免疫治疗剂和/或放射的CHK2抑制剂联合疗法。这同样适用于CHK2激活剂。预期具有基因型依赖性CHK2较高表达的病人对激活剂的反应优于CHK2较低表达的病人。这提供了单独诊断对这些抗癌药物和治疗措施反应的总体潜能的可能性和单独预测这些疗法产生不利要作用的风险的可能性。
CHK2表达的基因型依赖性诊断可总体诊断化学治疗剂和放射的效能、其最优剂量和副作用的发生
化学治疗采用破坏效果尽可能精确靶向特定癌细胞和杀伤这些细胞或抑制其生长的物质。特定剂量的细胞生长抑制剂仅能杀伤特定百分比的靶细胞，其在进展治疗中保持不变。出于此原因，在治疗进程中不能减少化学治疗，即使肿瘤不再可检测到。应预期减少治疗会选择抗性肿瘤细胞克隆。化学治疗以短间隔施用，在几乎所有病例中，联合两种或更多细胞生长抑制剂以提高效能。出于此原因，该治疗也引起根据通用毒性标准(the Common Toxicity Criteria)分类的副作用。这些标准包括：白细胞和血小板的数量、恶心、呕吐、腹泻和口腔炎。
放射治疗是应用高能电离辐射以治疗恶性肿瘤。这种恶性肿瘤通常用化学和放射疗法联合治疗。多种晚期肿瘤疾病也能用此方法治疗。为了限制副作用，放射分成多个日单剂量且在几周中施用。然而，取决于剂量、穿透深度和单剂量数，会出现副作用，如红化、恶心、腹泻或脱发。
本发明基于方法的改进，该方法总体上适合判断细胞周期检测点激酶2的可激活性及由此判断G1和G2检测点可激活性。为了此目的，分析基因CHK2中的一种或多种多态型。高表达涉及可预测的检测点可激活性增加，并因而提供足够时间在损伤后执行DNA修复机制。CHK2表达较低时，检测点可激活性更小，DNA损伤完全未被修复或未被充分修复。因此，检测CHK2中多态型的存在可判断药物(特别是细胞生长抑制药物)和其它破坏肿瘤细胞基因组的治疗形式(如辐射)的效能和不利的作用。此外，这种CHK2中的多态性能用于判断与CHK2抑制剂组合的药物的效果。另外，判断CHK2中等位基因或单体型状态能用于确定个体最优和可接受的药物剂量。
为了判断细胞周期检测点激酶2和检测点的可激活性增加或减少，特别使用本文所述CHK2多态型的单独或所有可能的组合的检测。
此外，可使用基因CHK2中的所有其它基因修饰，它们与这些多态型连锁不平衡和/或额外提高或抑制互变剪接过程或表达。
可使用本领域技术人员已知的任何方法检测基因修饰，如直接测序、限制性分析、反向杂交、斑点印迹或槽印迹法、质谱、Taqman
Figure BPA00001431174300161
或LightCycler
Figure BPA00001431174300162
技术、焦磷酸测序等。此外，可根据多重PCR和与DNA芯片的杂交，同时检测这些基因多态型。为了判断G蛋白可激活性的提高，也可使用能直接检测CHK2或CHK2剪接变体的表达水平的其它方法。
所述的方法特别适合判断损伤肿瘤细胞DNA的物质的效果。这些物质包括奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、叶酸、伊立替康、卡培他滨和顺铂，列表可酌情扩展。此外，可预测免疫治疗剂(例如干扰素或白介素)或信号转导抑制剂在肿瘤细胞中的效果。
此外，可预测放射治疗措施(如采用γ射线、X射线、电子、中子、质子和碳离子的辐射)的效果，列表可酌情扩展。广义上，放射治疗也指医学使用微波和热波(thermic wave)、光和UV疗法以及超声波放射治疗。
下列实施例进一步阐述使用CHK2中的基因修饰预测疾病风险和病程
实施例
根据CHK2多态性对不同肿瘤集合和健康对照进行基因分型，比较基因型和/或等位基因分布。在此情况中，观察到基因型和等位基因分布的显著差异。一般不能预测CHK2表达增加是有利的还是不利的。因此，CHK2中的多态型适合预测疾病风险。风险等位基因或风险基因型的疾病风险(单独或组合)表示为“优势比”(OR)，以及95％置信区间(95％CI)和p值。
实施例1
结直肠癌病人(n＝143)vs.对照(n＝235)
-7161G＞A -7235C＞G
等位基因 结肠癌 对照 基因型 结肠癌 对照
G 241(84.3％) 419(89.2％) CC 8(5.6％) 25(10.7％)
A 45(15.7％) 51(10.8％) CG 70(49.0％) 88(37.6％)
GG 65(45.5％) 121(51.7％)
P＝0.050 P＝0.048
等位基因或基因型分布显著不同(分别为p＝0.05和0.048)；
OR A相对于G＝1.534(95％CI＝0.997-2.361)p＝0.05；
OR CG相对于CC＝2.486(95％CI＝1.056-5.851)p＝0.034；
因此，发展结肠癌的风险增大可归咎于-7161A等位基因载体。因而，CHK2mRNA表达减少与发展该疾病的风险增加相关。
实施例2
-7235C＞G多态型与结直肠癌病例中存活之间的关联性
进一步检测-7235C＞G多态性基因型与结直肠癌病人存活之间是否有关联性。这示于下图20。
根据此图，具有-7235CC基因型的病人存活率明显较低。
因此，发展结肠癌的风险增大可分别归咎于-7161A等位基因和72-7235CG基因型的载体。因而，CHK2 mRNA表达减少与发展该疾病的风险增加相关联。
实施例3
慢性淋巴白血病患者(CLL，n＝166)vs.对照(n＝234)
-7235C＞G
基因型 CLL 对照
CC 7(4.2％) 25(10.7％)
CG 75(54.2％) 88(37.6％)
GG 84(50.6％) 121(51.7％)
基因型分布显著不同(p＝0.039)。可计算CLL的下列风险度(OR)：
OR CG相对于CC＝3.044(95％CI＝1.246-7.435)，P＝0.012；
OR GG加CG相对于CC＝2.7(95％CI＝1.2-6.4)，P＝0.024；
实施例4
成胶质细胞瘤患者(n＝198)vs.对照(n＝235)
-7161G＞A
等位基因 成胶质细胞瘤 对照 基因型 成胶质细胞瘤 对照
G 331(83.6％) 419(89.2％) GG 145(73.2％) 188(80.0％)
A 65(16.4％) 51(10.8％) GA 41(20.7％) 43(18.3％)
AA 12(6.1％) 4(1.7％)
等位基因和基因型分布显著不同(分别为P＝0.017和P＝0.039)。
可计算出下列风险度：
OR A相对于G：1.613(95％CI＝1.088-2.393)；P＝0.021；
OR AA相对于GG：3.890(95％CI＝1.229-12.31)；P＝0.019；
OR AA加AG相对于GG：3.73(95％CI＝1.2-11.8)；P＝0.021；
因此，发展成胶质细胞瘤的风险增大可分别归咎于-7161A等位基因载体和-7161AA/AG基因型的载体。因而，CHK2 mRNA表达减少与发展该病的风险增加相关。
实施例5
取决于-7235C＞G多态型的成胶质细胞瘤患者生存的Cox回归分析
下表显示完全切除肿瘤后肿瘤导致的成胶质细胞瘤患者死亡的多变量Cox回归分析模型结果(HR＝危害比，*＝参比，CI＝置信区间，ED＝初始诊断[德语：Erstdiagnose]，m＝男性，w＝女性[德语：weiblich]
初始诊断时的年龄：58.84±13.38
性别分布：M：65.4％；W：34.6％
为了确认所分析的-7235C＞G多态型是成胶质细胞瘤患者生存的独立预后因子，进行包括病人生存所有潜在风险因素的多变量COX回归分析。纯合GG载体的肿瘤导致死亡的风险比C等位基因载体高2.7倍(CI：1.05-7.03；P＝0.040)。
如所预期，治疗类型(放射疗法；放射/化学疗法)证明是最佳预后因素(P＝＜0.001)，接着是初始诊断时的年龄(P＝0.008)和-7235C＞G多态型，即降低死亡风险的治疗。
实施例6
涉及-10621del29多态型和成胶质细胞瘤病例中的生存
下表显示完全切除肿瘤后肿瘤导致成胶质细胞瘤患者死亡的多变量Cox回归分析模型结果(HR＝危害比，*＝参比，CI＝置信区间，ED＝初始诊断[德语：Erstdiagnose]，m＝男性，w＝女性[德语：weiblich]
初始诊断时的年龄：58.84±13.38
性别分布：M：65.4％；W：34.6％
与插入等位基因的载体相比，作为纯合缺失载体的病人在此病更早死亡的风险高近3倍(P＝0.008)。如所预期，治疗类型是病人生存的最佳预后因素(P＝＜0.001)，接着是初始诊断的年龄(P＝0.005)和分析的多态性。
实施例7
女性乳癌患者(n＝240)vs.女性对照(n＝78)
-10649-(-10621)del29
基因型 乳癌 对照
II 29(12.1％) 21(26.9％)
ID 162(67.5％) 38(48.7％)
DD 49(20.4％) 19(24.4％)
基因型分布显著不同(p＝0.003)。可计算出下列风险度：OR ID相对于II：3.087(95％CI＝1.590-5.995)，p＝0.001
实施例8
取决于-7235C＞G多态性基因型的喉癌患者的生存
下图21显示给予联合放射化学疗法的喉癌患者的生存曲线。
Figure BPA00001431174300211
同样在此病例中，卡普兰-迈耶曲线显著不同(p＝0.048)。施用放射化学疗法后，具有CC基因型的病人的生存显著优于携带G等位基因的病人(P＝0.048)。5年后，约90％的CC载体存活，而几乎70％的G等位基因载体在该时间点已死亡。这由COX回归分析证实。
为确认所分析的多态型是喉癌患者生存的独立预后因速，进行多变量COX回归分析。所得结果示于下列表。
Figure BPA00001431174300212
与纯合CC载体相比，杂合GC载体具有的肿瘤导致死亡的风险高大于9倍(CI：1.17-71.34；P＝0.035)，而纯合GG基因型的风险高7.8倍(CI：1.01-60.70；P＝0.049)。相关多态型被证明是唯一的独立预后因素。病人年龄导致的风险变化较小。因此，病人年龄在此情况下与作为预后因素无关。
对于给予放射化学疗法的病人，初始诊断时的年龄被证明是最佳预后因子(P＝0.013)，接着是-7235C＞G多态型。
域(field)AJCC列出肿瘤分级，其中1表示成功治疗的最有利期，4表示最不利期。1级指与亲本组织高度相似性的分化良好的恶性组织(“低级”)。3级指低分化的恶性组织。

Claims (2)

1.用于在病人样品的人染色体22q12.1上的基因CHK2的启动子区域中搜索一种或多种基因修饰的试剂在制备用于预测癌症疾病风险、癌症疾病进展、在癌症疾病治疗中使用药物组合物的风险和药物组合物益处的试剂盒或组合物中的用途，其中，所述基因修饰选自多态型-7161G>A、多态型-7235C>G、多态型-10532G>A和多态型-10649-(-10621)del29，且当所述基因修饰是多态型-7161G>A和/或多态型-10532G>A时，所述癌症疾病选自结直肠癌、肾细胞癌、成胶质细胞瘤和前列腺癌；当所述基因修饰是多态型-7235C>G时，所述癌症疾病选自结直肠癌、肾细胞癌、成胶质细胞瘤、慢性淋巴白血病和喉癌；当所述基因修饰是多态型-10649-(-10621)del29时，所述癌症疾病选自成胶质细胞瘤和乳癌。
2.如权利要求1所述用途，其特征在于，所述基因修饰选自：多态型-7161G>A、-7235C>G、-10532G>A和-10649-(-10621)del29中的1种、2种、3种或4种。
CN201080011412.5A 2009-03-06 2010-03-08 作为癌症标记的chk2多态型 Active CN102341507B (zh)

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Regulation of Chk2 gene expression in lymphoid maligancies:involvement of epigenetic mechanisms in Hodgkin"s lymphoma cell lines;KATO N ET AL;《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》;20041231;第11卷(第suppl.2期);S153-S161 *
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