KR20230165202A - Msi 암을 진단하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 MSI 암의 진단 분야에 관한 것이다. 본 연구에서, 본 발명자들은 ICI를 이용한 임상 시험에 관여하는 다기관 전향적 환자의 dMMR/MSI mCRC에서 MSI를 검출하기 위한 MSISensor의 성능을 평가했다. 본 분석은 mCRC 및 nmCRC에서 MSI를 식별하기 위한 FDA 승인된 NGS 기반 진단 테스트가 금표준 참조 방법과 비교했을 때 부정확한 결과를 제공했음을 입증했다. 결과적으로, 모든 샘플의 전체 엑솜 서열분석(WES) 데이터를 추가로 분석하여 CRC 및 기타 원발성 종양 유형에서 MSI 게놈 신호의 검출을 개선시켰다. 이를 통해 MSISensor의 약점과 한계를 식별한 후 새로 최적화된 알고리즘, 즉 MSICare를 설계하고 검증할 수 있었다. CRC 및 비-CRC 종양에서 MSI를 검출하기 위한 MSICare의 높은 정확도는 범암에서 MSI를 평가하기 위한 향후 참조 테스트가 될 수 있도록 해야 한다. 따라서, 본 발명은 종양 샘플로부터, 그리고 가능한 경우, 정상 샘플로부터 DNA를 현저하게 추출하고 서열분석하는 단계를 포함하고 MNR의 분석을 작동시킴을 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 MSI 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

Description

MSI 암을 진단하는 방법

본 발명은 종양 샘플(tumoral sample)로부터, 그리고 가능한 경우, 정상 샘플로부터 DNA를 현저하게 추출하고 서열분석(sequencing)하는 단계를 포함하고 MNR의 분석을 작동시킴을 포함하여, 이를 필요로 하는 환자에서 MSI 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

현미부수체 불안정성(microsatellite instability; MSI)이라고 하는 인간 종양 표현형은 불일치 복구(mismatch repair; MMR) 유전자의 비활성화 변경과 관련이 있다. MSI는 린치 증후군(Lynch syndrome)과 관련된 유전성 종양(inherited tumor)에서 처음 보고되었다. 이는 인간에게 가장 흔한 암 소인 증후군(cancer predisposition syndrome) 중 하나이며 특별한 관리와 유전 상담(genetic counseling)이 필요하다. MSI는 나중에 산발성 결장직장암(sporadic colorectal cancer; CRC)에서 관찰되었으며, 다른 원발성 종양(primary tumor)에서는 더 드물게 관찰되었다(1-4). MSI가 있는 종양은 일반적으로 세포독성 T-세포 림프구의 조밀한 침윤을 나타낸다(5). 최근에, MSI 종양, 특히 MSI CRC는 면역 체크포인트(immune checkpoint; ICK) 관련 단백질을 과발현하여 면역 탈출(immune-escape)을 허용함으로써 이러한 적대적인 면역 미세환경에 저항하는 것으로 보고되었다(6, 7). 또한, MSI 상태는 전이성 CRC(mCRC) 환자에서 ICK 억제제(ICI)의 임상적 이점을 예측하는 것으로 나타났다(8-11). 이러한 관찰은 새로 진단된 모든 CRC의 보편적인 MSI/dMMR 스크리닝을 권장하는 국제 가이드라인으로 이어졌다(12). 또한, 기원의 원발 조직에 관계없이 모든 인간 종양에서 MSI 상태의 평가를 뒷받침하는 증거가 증가하고 있다.

당사를 포함한 여러 전문 암 센터에서는 CRC에서 MSI 및 dMMR을 테스트하기 위한 허용된 참조 방법, 즉 MSI를 위한 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR) 기반 방법(13-15) 및 dMMR에 대한 면역조직화학(immunohistochemistry; IHC)을 표준화하고 검증하는 것을 목표로 했다(검토를 위해 또한 16 참조). mCRC에서, 본 발명자들은 최근 이러한 금표준 방법(gold standard method)을 사용한 MSI 및/또는 MMR 테스트 결과의 잘못된 해석이 ICI에 대한 1차 내성을 나타내는 대부분의 사례를 설명할 수 있다고 강조했다(17). 한편, 차세대 서열분석(next generation sequencing; NGS) 기술을 기반으로 한 대체 FDA 승인 방법이 CRC를 포함한 범암(pan-cancer)에서 MSI 스크리닝을 위해 보고되었다(18). 이는 종양과 짝을 이룬 정상 샘플의 지정된 현미부수체 영역에서 서열 판독치를 분석하고 종양에서 불안정한 유전자좌(loci)의 백분율을 누적 점수로 보고하는 알고리즘(algorithm), 즉 MSISensor의 사용을 기반으로 한다(19). 그러나, MSISensor의 진단 성능은 MSI/dMMR 상태가 참조 IHC 및 MSI-PCR 방법을 사용하여 이미 확립된 환자 코호트, 특히 ICI로 치료받은 mCRC 환자의 전향적 환경에서는 아직 평가되지 않았다.

따라서, 본 연구에서 발명자들의 목적은 ICI를 사용한 임상 시험(NCT02840604 및 NCT033501260)에 관여하는 다기관 전향적 환자의 dMMR/MSI mCRC에서 MSI를 검출하기 위한 MSISensor의 성능을 평가하는 것이었다. 오진을 피하기 위해, 그들은 IHC 및 MSI-PCR을 사용한 전문 센터의 모든 CRC 샘플에서 dMMR 및 MSI 상태를 이전에 재평가했다. 인간 암에서 MSISensor로 수득된 결과를 추가로 평가하기 위해, 그들은 또한 mCRC 및 비전이성 CRC(nmCRC)의 후향적 다기관 시리즈뿐만 아니라 공개적으로 이용 가능한 일련의 CRC 및 MSI를 자주 나타내는 기타 원발성 종양 유형도 분석했다. 본 연구 결과는 mCRC 및 nmCRC에서 MSI를 식별하기 위한 FDA 승인 NGS 기반 진단 테스트가 금표준 참조 방법(gold standard reference method)과 비교했을 때 부정확한 결과를 제공했음을 입증한다. 중요하게도, 이 오진에는 ICI에 대해 양성 반응을 보였지만, IHC 및 MSI PCR 방법을 참조하지 않고 MSISensor가 단독으로 MSI 스크리닝에 사용되었다면 치료되지 않았을 3명의 mCRC 환자가 포함되었다. 결과적으로, 모든 샘플의 전체 엑솜 서열분석(WES) 데이터를 추가로 분석하여 CRC 및 기타 원발성 종양 유형에서 MSI 게놈 신호의 검출을 개선시켰다. 이를 통해 MSISensor의 약점과 한계를 식별한 후 새롭게 최적화된 알고리즘, 즉 MSICare를 설계하고 검증할 수 있었다. CRC 및 비-CRC 종양에서 MSI를 검출하기 위한 MSICare의 높은 정확도는 범암에서 MSI를 평가하는 향후 참조 테스트가 될 수 있도록 해야 한다.

따라서, 본 발명은 종양 샘플로부터, 그리고 가능한 경우, 정상 샘플로부터 DNA를 현저하게 추출하고 서열분석하는 단계를 포함하고 MNR 분석을 작동시킴을 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 MSI 암을 진단하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 청구범위에 의해 정의된다.

본 발명의 상세한 설명:

따라서, 본 발명자들은 환자의 종양 샘플이 이용 가능할 때, 그리고 임의로 상기 환자의 정상 샘플도 또한 이용 가능할 때 사용될 수 있는 방법을 개발했다.

따라서, 본 발명은 i) 종양 샘플로부터, 그리고 가능한 경우 이를 필요로 하는 환자로부터 수득된 정상 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계, ii) 상기 환자의 정상 샘플의 DNA에서 적어도 12개의 핵산 길이를 갖는 모노뉴클레오티드 반복(mononucleotide repeats; MNR) 서열의 수(N) 및 상기 환자의 종양 샘플의 DNA에서 상응하는 MNR을 서열분석하거나, 종양 샘플에서 모노뉴클레오티드 반복(MNR)의 수(N) 및 상응하는 정상 샘플에서 적어도 12개의 핵산 길이를 갖는 것을 서열분석하는 단계, iii) 정상 샘플의 이용 가능 여부에 따른 각 MNR에 대한 △비율을 계산하는 단계, iv) 종양 샘플에 대한 종양 순도(tumor purity; TP)를 계산하는 단계, v) 조정된 △비율을 계산하는 단계, vi) MNR의 △비율의 총 수에 대한 조정된 △비율이 돌연변이된(mutated) MNR의 수의 비율을 수행함으로써 MSICare 점수를 수득하는 단계, 및 vii) 단계 vi)에서 수득된 MSICare 점수가 계산된 임계값(threshold value)보다 우수할 때 이를 필요로 하는 환자가 MSI 암에 걸린 것으로 결론을 내리는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 MSI 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

특정 양태에서, 본 발명은 i) 종양 샘플로부터, 그리고 가능한 경우 이를 필요로 하는 환자로부터 수득된 정상 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계, ii) 상기 환자의 정상 샘플의 DNA에서 적어도 12개의 핵산 길이를 갖는 모노뉴클레오티드 반복(MNR) 서열의 수(N) 및 상기 환자의 종양 샘플의 DNA에서 상응하는 MNR을 서열분석하거나, 종양 샘플에서 모노뉴클레오티드 반복(MNR)의 수(N) 및 상응하는 정상 샘플에서 적어도 12개의 핵산 길이를 갖는 것을 서열분석하는 단계, iii) 정상 샘플의 이용 가능 여부에 따른 각 MNR에 대한 △비율을 계산하는 단계, iv) 종양 샘플에 대한 종양 순도(TP)를 계산하는 단계, v) iv)에서 계산된 TP로 인해 조정된 △비율을 계산하는 단계, vi) MNR의 △비율의 총 수에 대한 조정된 △비율이 돌연변이된 MNR의 수의 비율을 수행함으로써 MSICare 점수를 수득하는 단계, 및 vii) 단계 vi)에서 수득된 MSICare 점수가 계산된 임계값보다 우수할 때 이를 필요로 하는 환자가 MSI 암에 걸린 것으로 결론을 내리는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 MSI 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

종양 샘플과 정상 샘플이 환자로부터 이용 가능할때, 본 발명의 방법은 다음과 같이 기재된다.

따라서, 본 발명의 제1 구현예는 i) 이를 필요로 하는 환자로부터 수득된 종양 및 정상 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계, ii) 상기 환자의 정상 샘플의 DNA에서 적어도 12개의 핵산 길이를 갖는 모노뉴클레오티드 반복(MNR) 서열의 수(N) 및 상기 환자의 종양 샘플의 DNA에서 상응하는 MNR을 서열분석하는 단계, iii) 각 MNR에 대한 △비율을 계산하는 단계, iv) 종양 샘플에 대한 종양 순도(TP)를 계산하는 단계, v) 조정된 △비율을 계산하는 단계, vi) MNR의 △비율의 총 수에 대한 조정된 △비율이 돌연변이된 MNR의 수의 비율을 수행함으로써 MSICare 점수를 수득하는 단계, 및 vii) 단계 vi)에서 수득된 MSICare 점수가 계산된 임계값보다 우수할 때 이를 필요로 하는 환자가 MSI 암에 걸린 것으로 결론을 내리는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 MSI 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

이 특정 구현예에서, 본 발명은 i) 이를 필요로 하는 환자로부터 수득된 종양 및 정상 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계, ii) 상기 환자의 정상 샘플의 DNA에서 적어도 12개의 핵산 길이를 갖는 모노뉴클레오티드 반복(MNR) 서열의 수(N) 및 상기 환자의 종양 샘플의 DNA에서 상응하는 MNR을 서열분석하는 단계, iii) 각 MNR에 대한 △비율을 계산하는 단계, iv) 종양 샘플에 대한 종양 순도(TP)를 계산하는 단계, v) 단계 iv)에서 계산된 TP로 인해 조정된 △비율을 계산하는 단계, vi) MNR의 △비율의 총 수에 대한 조정된 △비율이 돌연변이된 MNR의 수의 비율을 수행함으로써 MSICare 점수를 수득하는 단계, 및 vii) 단계 vi)에서 수득된 MSICare 점수가 계산된 임계값보다 우수할 때 이를 필요로 하는 환자가 MSI 암에 걸린 것으로 결론을 내리는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 MSI 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제1 구현예에 따르면, "상기 환자의 정상 샘플의 DNA에서 적어도 12개의 핵산 길이를 갖는 모노뉴클레오티드 반복(MNR) 서열의 수(N) 및 상기 환자의 종양 샘플의 DNA에서 상응하는 MNR을 서열분석하는 것"은 이 방법의 경우, 환자의 정상 샘플의 DNA에서 적어도 12개의 핵산 길이를 갖는 MNR만을 고려하지만, 종양 샘플의 경우, 상응하는 MNR은 그들의 크기와 상관없이 서열분석된다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 특정 유전자좌의 경우, 정상 샘플에서 12개의 핵산의 MNR이 서열분석될 것이고 종양 샘플에서는, 예를 들어, 돌연변이에 따라 11개의 핵산 또는 10개의 핵산 길이를 갖는 상응하는 MNR이 또한 서열분석될 수 있다.

본 발명의 제1 구현예에 따르면, 정상 샘플의 DNA에서 적어도 12개의 핵산 길이를 갖는 모노뉴클레오티드 반복(MNR) 서열의 수(N)는 이들 반복이 정상 및 종양 샘플 모두에서 적어도 20개의 매핑 판독치에 의해 커버되는 경우 본 발명에 따른 방법에서 고려될 것이다.

본원에 사용된 용어 "△비율"은 정상 샘플과 비교하여 종양 샘플에서의 판독 수의 추정을 나타내며, 다음과 같이 계산된다: 각 MNR에 대해, 정상 조직에서 정규화된 판독 수는 각 MNR에 대한 종양 조직에서 정규화된 판독 수로부터 뺀다[△비율 = %종양-%정상]. 예를 들어, 특정 유전자좌의 경우, 판독치가 정상 샘플에서 20 A의 MNR에 대해 98이고, 19 A의 MNR에 대해 2이며, 종양 샘플의 경우 20 A의 MNR에 대해 90이고, 19 A의 MNR의 경우 10이면, △비율은 MNR 19 A에 대해 10 - 2 = 8일 것이다.

그런 다음, 모든 유전자좌에 대해, MSI 지수는 각 MNR의 △비율의 합일 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "MSI 지수" 또는 "MSI 신호" 또는 "MSIg"는 모든 후보 MNR에 대한 △비율 값의 합에 상응한다.

본원에 사용된 용어 "종양 샘플에 대한 종양 순도(TP)"는 정상 조직에 의한 종양의 오염 백분율의 추정을 나타내며, 본 발명의 제1 구현예에 따라 다음과 같이 정상 샘플에서 14와 같거나 더 우수한(= 14개의 산 핵의 길이와 같거나 더 우수함, 참조: Jonchere et al. 2018) MNR 및 상기 환자의 종양 샘플의 DNA에서 상응하는 MNR에 대해 수득된 MSI 지수의 중앙값을 수행하여 계산되고, 정상 조직에서는 적어도 20회 판독, 종양 샘플에서는 적어도 30회 판독에 의해 커버된다.

일부 구현예에서, 14 또는 13의 MNR로부터, 상기 MNR의 돌연변이 빈도는 높고, 따라서 점수의 결정이 더 정확하다. 특히, TP는 MNR 14로부터 충분히 효과적이다.

본 발명에 따르면, 14와 같거나 더 우수한 MNR은 이 유전자좌에 있을 수 있다: chr7:121099908-121099923, chr2:119647053-119647067, chr2:44318095-44318110, chr1:100267651-100267665, chr1:214653467-214653482.

본원에서 사용된 용어 "조정된 △비율"은 TP로 인해 △비율의 정규화를 의미하며, 다음과 같이 계산된다: 조정된 △비율 = △비율 x 특정 MNR에 대한 종양 샘플에 대한 추정된 TP. MNR에 대한 조정된 △비율이 50% 미만일 때, MNR이 야생형임을 의미하고, 조정된 △비율이 50% 이상일 때, MNR이 돌연변이된다는 것을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "MSIcare 점수"는 MNR의 △비율의 총 수에 대한 조정된 △비율이 돌연변이된 MNR의 수의 비율을 나타낸다(= 조정된 △비율이 돌연변이됨 및 (+) 조정된 △비율이 돌연변이되지 않음). 결과는 0에서 100 사이의 숫자(백분율)이다. 분석 횟수에 따라, MSI 결장직장암에 대한 MSIcare 컷오프는 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% 및 25%일 수 있으며, 더욱 특히 20% 또는 21%이다. 본 발명에 따르면, 결장직장암의 경우, MSIcare 점수가 21 미만, 특히 20 미만일 때, 결장직장암은 MSI 결장직장암이 아닐 것이며, MSIcare 점수가 21 이상, 특히 20 이상일 때, 결장직장암은 MSI 결장직장암일 것이다.

일부 구현예에서, 순수한 MSI 신호는 이 긴 MNR에서 적어도 2bp 이상의 체세포 결실(somatic deletion)을 고려해야만 포획될 수 있다. 특히, 종양 샘플의 MNR과 정상 샘플의 MNR 사이에는 적어도 2bp의 차이가 있다.

본 발명의 제2 구현예에서, MSI 암의 진단에서, 의료 전문가는 본 발명의 방법을 수행하기 위해 환자로부터 이용 가능한 정상 샘플을 갖지 못한다는 사실에 직면할 수 있다. 그들은 MSI 암이 의심되는 환자의 종양 샘플만 가질 수 있다. 이 경우에, 반복의 정상 다형성 영역(normal polymorphic zone)의 식별은 각 반복에 대한 무료 데이터베이스 덕분에 수행될 수 있다. 그런 다음, 종양 샘플에서 이 정상 다형성 영역 외부에서 관찰된 돌연변이된 반복만이 고려될 것이다. 이 다형성 영역 외부에서는 정상 샘플의 판독 수가 제로(zero)로 간주될 것이다. 이러한 맥락에서, 본 발명의 방법의 여러 단계는 이를 고려하여 수행될 수 있다.

따라서, 일부 구현예에서, MSICare는 종양 샘플로만 달성될 수 있다.

따라서, 이 제2 구현예에서, 본 발명은 또한 i) 이를 필요로 하는 환자로부터 수득된 종양 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계, ii) 종양 샘플에서 모노뉴클레오티드 반복(MNR)의 수(N) 및 상응하는 정상 샘플에서 적어도 12개의 핵산 길이를 갖는 것을 서열분석하는 단계, iii) MNR에 대한 정상 다형성 영역을 평가하는 단계, iv) 각 MNR의 정상 다형성 영역 외부에서만 종양 샘플에 나타나는 돌연변이된 MNR을 평가하는 단계, v) 종양 샘플로부터 수득된 각 MNR에 대한 △비율을 계산하는 단계, vi) 종양 샘플에 대한 종양 순도(TP)를 계산하는 단계, vii) 조정된 △비율을 계산하는 단계, viii) MNR의 △비율의 총 수에 대한 조정된 △비율이 돌연변이된 MNR 수의 비율을 수행함으로써 MSICare 점수를 수득하는 단계, 및 ix) 단계 viii)에서 수득된 MSICare 점수가 계산된 임계값보다 우수할 때 이를 필요로 하는 환자가 MSI 암에 걸린 것으로 결론 내리는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 MSI 암을 진단하는 방법에 관한 것이다("CRC 정상 샘플이 없는 고형 종양에서 MSIcare 진단" 결과 참조).

이 특정 구현예에서, 본 발명은 또한 i) 이를 필요로 하는 환자로부터 수득된 종양 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계, ii) 종양 샘플에서 모노뉴클레오티드 반복(MNR)의 수(N) 및 상응하는 정상 샘플에서 적어도 12개의 핵산 길이를 갖는 것을 서열분석하는 단계, iii) MNR에 대한 정상 다형성 영역을 평가하는 단계, iv) 각 MNR의 정상 다형성 영역 외부에서만 종양 샘플에 나타나는 돌연변이된 MNR을 평가하는 단계, v) 정상 조직에서 정규화된 판독 수가 각 다형성 영역 외부에서 제로와 같다는 점을 고려하여 종양 샘플로부터 수득된 각 MNR에 대한 △비율을 계산하는 단계, vi) 종양 샘플에 대한 종양 순도(TP)를 계산하는 단계, vii) 조정된 △비율을 계산하는 단계, viii) MNR의 △비율의 총 수에 대한 조정된 △비율이 돌연변이된 MNR 수의 비율을 수행함으로써 MSICare 점수를 수득하는 단계, 및 ix) 단계 viii)에서 수득된 MSICare 점수가 계산된 임계값보다 우수할 때 이를 필요로 하는 환자가 MSI 암에 걸린 것으로 결론 내리는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 MSI 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

이 특정 구현예에서, 본 발명은 또한 i) 이를 필요로 하는 환자로부터 수득된 종양 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계, ii) 종양 샘플에서 모노뉴클레오티드 반복(MNR)의 수(N) 및 상응하는 정상 샘플에서 적어도 12개의 핵산 길이를 갖는 것을 서열분석하는 단계, iii) MNR에 대한 정상 다형성 영역을 평가하는 단계, iv) 각 MNR의 정상 다형성 영역 외부에서만 종양 샘플에 나타나는 돌연변이된 MNR을 평가하는 단계, v) 정상 조직에서 정규화된 판독 수가 각 다형성 영역 외부에서 제로와 같다는 점을 고려하여 종양 샘플로부터 수득된 각 MNR에 대한 △비율을 계산하는 단계, vi) 종양 샘플에 대한 종양 순도(TP)를 계산하는 단계, vii) 단계 vi)에서 계산된 TP로 인해 조정된 △비율을 계산하는 단계, viii) MNR의 △비율의 총 수에 대한 조정된 △비율이 돌연변이된 MNR 수의 비율을 수행함으로써 MSICare 점수를 수득하는 단계, 및 ix) 단계 viii)에서 수득된 MSICare 점수가 계산된 임계값보다 우수할 때 이를 필요로 하는 환자가 MSI 암에 걸린 것으로 결론 내리는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 MSI 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "상응하는 정상 샘플" 또는 "유사한 정상 샘플"에 관한 정보는 데이터 베이스, 특히 게놈의 반복을 참조하는 무료 데이터 베이스로부터 수득된다.

본원에 사용된 용어 "반복"은 특정 유전자좌에 대해 반복되는 핵산(또는 핵염기)의 수를 나타낸다. 따라서, 용어 "반복"은 핵산의 길이를 나타낸다. 예를 들어, 핵산 A(아데닌)에 대한 반복이 12인 경우, 이는 핵산 A가 특정 유전자좌에서 12회 연속적으로 반복된다는 것을 의미한다. 본 발명에 따르면, 본원에 사용된 용어 "반복"은 "현미부수체"와 동일한 의미이다.

본원에 사용된 용어 "돌연변이된 반복"(또는 "돌연변이된 MNR")은 반복이 정상 반복(정상 샘플에서 발견)과 비교하여 돌연변이된다(하나 또는 여러 핵산의 결실 또는 첨가)는 것을 나타낸다. 반복은, 예를 들어, MSI 암의 맥락에서 돌연변이된다.

본원에 사용된 용어 "비돌연변이된 반복"(또는 "비돌연변이된 MNR")은 반복이 정상 반복(정상 샘플에서 발견)과 비교하여 돌연변이(하나 또는 여러 핵산의 결실 또는 첨가)가 없음을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "다형성" 또는 "다형성 반복"은 샘플에서 발견할 수 있는 상이한 크기의 반복을 나타낸다. 따라서, "다형성 영역"은 샘플에서 찾을 수 있는 상이한 반복을 나타내고, "정상 다형성 영역"은 (돌연변이되지 않은) 정상 샘플에서 찾을 수 있는 상이한 반복을 나타낸다. 예를 들어, 정상 맥락(또는 MSS 맥락)에서, 주어진 반복에 대해, 상기 반복은 15개 또는 16개의 핵산 크기를 가질 수 있다. MSI 맥락에서, 동일한 반복은 13, 14, 15 또는 16개의 핵산 크기를 가질 수 있다. 따라서, 본 예에서, 정상 샘플에 대한 정상 다형성 영역은 15 내지 16 사이일 것이고, 따라서 13 또는 14개 핵산의 모든 반복은 돌연변이된 반복으로 간주될 것이며, 따라서 본 발명의 제2 양태에 따라 고려될 것이다. 따라서, 그리고 제2 구현예에 따르면, △비율은 상기 기재된 바와 동일한 방법에 의해 계산된다. 예를 들어, 다형성 영역 외부에서 식별될 돌연변이의 경우, %정상은 제로(0)와 같을 수 있으며, 따라서 △비율은 상기 기재된 바와 같이 %종양과 같을 수 있다.

본 발명의 제2 구현예에 따르면, 정상 샘플의 DNA에서 적어도 12개의 핵산 길이를 갖는 모노뉴클레오티드 반복(MNR) 서열의 수(N)는 이러한 반복이 종양 샘플에서만 적어도 20개의 매핑 판독치에 의해 커버되는 경우 본 발명에 따른 방법에서 고려될 것이다.

본 발명의 제2 구현예에 따르면, 종양 순도는 다음과 같이 정상 샘플(예를 들어, 데이터베이스에 의해 수득됨)에서 14와 같거나 더 우수한(= 14개 산 핵 길이와 동일하거나 우수한) MNR 및 상기 환자의 종양 샘플의 DNA에서 상응하는 MNR에 대해 수득된 MSI 지수의 중앙값을 수행하여 계산되고, 종양 샘플에 대해 적어도 30회 판독으로 커버된다.

본원에 사용된 용어 "모노뉴클레오티드 반복"(MNR)은 반복이 단지 고유한 핵산의 반복을 갖는다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 길이가 12인 핵산 A에 대한 모노뉴클레오티드 반복은 12회 연속으로 핵산 A의 반복을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "유전자좌"는 특정 유전자 또는 유전자 마커가 위치되는 염색체의 특정 고정 위치에 관한 것이다. 용어 유전자좌는 용어 "MNR" 또는 "마커(marker)"를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "반복의 수"는 특정 유전자좌에 대해 특정 길이(예: 14개의 연속 핵산 A)의 "반복"이 반복되는 횟수를 나타낸다. 따라서, "반복의 수"는 또한 주어진 반복을 함유하는 유전자좌의 수를 나타낸다.

사용된 용어 "판독"은 서열분석될 유전자좌(또는 MNR 또는 마커)의 일부 또는 정확한 사본이고, 핵산의 내용 및 순차적 순서를 결정하는 데 사용되는 서열분석기(sequencer) 기기에 의해 생성된 DNA 단편을 나타낸다.

특정 구현예에서, 서열분석 후 유전자좌당 판독 계수는 10 내지 5000 사이, 10 내지 4000 사이, 특히 100 내지 4000 사이, 특히 1000 내지 3000 사이, 더욱 특히 1500 내지 2500 사이이다. 특히, 서열분석 후 유전자좌당 판독 계수는 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250; 300, 350 또는 400이다.

본원에 사용된 용어 "N"은 또한 테스트될 유전자좌(또는 메이커)의 수에 상응하는 하나의 특정 서열분석 검정의 반복의 최대 수를 나타낸다. 이 숫자는 1부터 시작하여 큰 숫자까지이다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 서열분석은 10 내지 1,000,000 사이, 10 내지 10,000 사이, 특히 100 내지 10,000 사이, 보다 특히 100 내지 1000 사이의 다수의 유전자좌로 수행된다.

일부 구현예에서, 이 숫자는 1 내지 1000 사이, 특히 1 내지 441 사이, 더욱 특히 21 또는 그 이상이다. 특히, 이 숫자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441이다.

일부 구현예에서, 방법의 더 나은 견고성을 위해, 서열분석된 반복 수는 적어도 21이다.

일부 구현예에서, 마커가 많을수록 테스트가 더 최적화되고 강력해진다.

본 발명의 방법에 따르면, 모노뉴클레오티드 반복(MNR)의 서열분석은 전체 엑솜(WE) 또는 특정 유전자좌에서 수행될 수 있다.

일부 구현예에서, 다수의 N 반복이 연구되고 종양에 의해 영향을 받는 기관에 따라, 돌연변이된 N의 수는 가변적일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "샘플"은 DNA, 특히 배아 DNA, 특히 암성 DNA(암성 세포의 DNA)를 함유할 가능성이 있는 환자로부터 수득된 임의의 생물학적 샘플을 지칭한다. 전형적으로, 샘플은 고체 샘플(예: 생검) 또는 체액 샘플, 예를 들어, 혈액, 혈장 또는 혈청을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

특정 구현예에서, 샘플은 정상 샘플 또는 종양 샘플이다.

본원에 사용된 용어 "정상 샘플"은 건강한 조직의 DNA를 지칭한다. 특히, 정상 샘플은 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC) 또는 점액이다.

본 발명에 따르면, "정상 샘플"은 또한 "건강한 샘플" 또는 "야생형 샘플", 즉 돌연변이를 함유하는 종양 샘플(MSI 암)과 비교하여 비암성 세포 또는 암성 세포(MSS 암)로부터 수득된, 돌연변이가 없는 샘플을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "종양 샘플"은 종양 DNA, 특히 순환 종양 DNA 1차 혈액 세포(circulating tumor DNA primary blood cell; PBC)를 함유하는 임의의 생물학적 샘플을 지칭한다. 특정 구현예에서, 샘플은 종양 순환 세포이거나 종양 고형 덩어리이다. 특정 구현예에서, PBMC 또는 PBC로부터 수득된 배아 DNA는 MSI 암을 진단하는 데 사용될 것이다. 특정 구현예에서, 샘플은 동결되거나 동결되지 않을 수 있고, 샘플은 원발성 종양 또는 전이성 종양으로부터 유래될 수 있다.

일부 구현예에서, 종양 샘플은 고형 종양에 상응한다.

본원에 사용된 용어 "고형 종양"은 당업계에서의 일반적인 의미를 가지며, 일반적으로 낭종(cyst) 또는 액체 영역(예: 생검)을 함유하지 않는 조직의 비정상적인 덩어리와 관련된다. 고형 종양은 양성(암이 아님) 또는 악성(암)일 수 있다. 상이한 유형의 고형 종양은 종양을 형성하는 세포의 유형에 따라 명명된다. 고형 종양의 예로는 육종(sarcoma)과 암종(carcinoma)이 있다.

일부 구현예에서, 종양 샘플은 액체 종양에 상응한다.

본원에 사용된 용어 "액체 종양"은 당업계에서의 일반적인 의미를 가지며, 혈액, 골수 또는 림프절에서 발생하는 종양에 관한 것이다. 상이한 액체 종양은 백혈병(Leukaemia), 림프종(Lymphoma) 및 골수종(Myeloma)의 유형을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "MSI 암"은 적어도 2개의 현미부수체 마커에서 불안정성이 검출된다는 것을 나타낸다. 반대로, 하나의 현미부수체 마커에서 불안정성이 검출되거나 검출되지 않으면, 상기 암은 "MSS 암"이다. 이 정의는 진단이 펜타플렉스 방법(pentaplex method)으로 수행되는 경우에만 유용하다(참조: 예를 들어, Suraweera N et al., Evaluation of tumor microsatellite instability using five quasimonomorphic mononucleotide repeats and pentaplex PCR. Gastroenterology. 2002 or Buhard O et al., Multipopulation analysis of polymorphisms in five mononucleotide repeats used to determine the microsatellite instability status of human tumors. J Clin Oncol.2006). "MSS 암"은 안정한 현미부수체를 갖는 암을 나타낸다. "MSI 암"은 불안정한 현미부수체를 갖는 암을 지칭한다.

특히, 본 발명의 방법은 MSS 암보다 MSI 암을 구별하는 데 유용하다.

일부 구현예에서, MSIcare는 결핍된 단백질에 관계없이 MSI 진단을 위해 수행될 수 있다.

특히, MSIcare는 MLH1, MSH2, MSH6 또는 PMS2와 같은 유전자가 결핍되는(예: 돌연변이되거나 비기능적) 맥락에서 사용될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "환자(patient)" 또는 "대상체(subject)"는 포유동물을 나타낸다. 전형적으로, 본 발명에 따른 환자는 MSI 암에 걸린 임의의 대상체(특히 인간)를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "핵산" 또는 "핵염기"는 당업계에서의 일반적인 의미를 갖고, 코딩 또는 비코딩 핵 서열을 지칭한다. 핵산은 DNA(데옥시리보핵산) 및 RNA(리보핵산) 핵산을 포함한다. 따라서, 핵산의 예는 DNA, mRNA, tRNA, rRNA, tmRNA, miRNA, piRNA, snoRNA 및 snRNA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 핵산은 게놈의 코딩 및 비코딩 영역(예: 핵 또는 미토콘드리아)을 포함한다.

특정 구현예에서, 특정 반복에서 핵산의 길이(x)(또는 수)는 12 내지 30 사이, 특히 12 내지 18 사이이다. 본 발명에 따르면, 특정 반복에서 핵산의 길이(x)(또는 수)는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "암"은 당업계에서의 일반적인 의미를 갖고, 고형 종양 및 혈액 매개 종양을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 용어 암은 피부, 조직, 장기, 뼈, 연골, 혈액 및 혈관의 질환을 포함한다. 용어 "암"은 원발성 암(primary cancer) 및 전이성 암(metastatic cancer)을 모두 추가로 포함한다. 암의 예로는 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 위장, 잇몸, 머리, 신장, 간, 폐, 비인두, 목, 난소, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀 또는 자궁의 암 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 암은 구체적으로 다음과 같은 조직학적 유형일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다: 신생물, 악성(neoplasm, malignant); 암종(carcinoma); 미분화 암종(carcinoma, undifferentiated); 거대 및 방추 세포 암종(giant and spindle cell carcinoma); 소세포 암종(small cell carcinoma); 유두암종(papillary carcinoma); 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma); 림프상피암종(lymphoepithelial carcinoma); 기저 세포 암종(basal cell carcinoma); 모기질 암종(pilomatrix carcinoma); 이행 세포 암종(transitional cell carcinoma); 유두 이행 세포 암종(papillary transitional cell carcinoma); 선암종(adenocarcinoma); 악성 가스트린종(gastrinoma, malignant); 담관암종(cholangiocarcinoma); 간세포 암종(hepatocellular carcinoma); 복합 간세포 암종 및 담관암종(combined hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma); 섬유주 선암종(trabecular adenocarcinoma); 아데노이드 낭성 암종(adenoid cystic carcinoma); 선종성 폴립의 선암종(adenocarcinoma in adenomatous polyp); 선암, 가족성 용종증 대장균(adenocarcinoma, familial polyposis coli); 고형 암종(solid carcinoma); 카르시노이드 종양, 악성(carcinoid tumor, malignant); 세기관지 폐포 선암종(branchiolo-alveolar adenocarcinoma); 유두 선암종(papillary adenocarcinoma); 발색성 암종(chromophobe carcinoma); 호산성 암종(acidophil carcinoma); 호산성 선암종(oxyphilic adenocarcinoma); 호염기성 암종(basophil carcinoma); 투명 세포 선암종(clear cell adenocarcinoma); 과립 세포 암종(granular cell carcinoma); 여포성 선암종(follicular adenocarcinoma); 유두 및 여포성 선암종(papillary and follicular adenocarcinoma); 비캡슐화 경화성 암종(nonencapsulating sclerosing carcinoma); 부신 피질 암종(adrenal cortical carcinoma); 자궁내막 암종(endometroid carcinoma); 피부 부속 암종(skin appendage carcinoma); 아포크린 선암종(apocrine adenocarcinoma); 피지 선암종(sebaceous adenocarcinoma); 이구성(ceruminous); 선암종(adenocarcinoma); 점막표피양 암종(mucoepidermoid carcinoma); 낭선암종(cystadenocarcinoma); 유두성 낭선암종(papillary cystadenocarcinoma); 유두 장액성 낭선암종(papillary serous cystadenocarcinoma); 점액성 낭선암종(mucinous cystadenocarcinoma); 점액성 선암종(mucinous adenocarcinoma); 반지 세포 암종(signet ring cell carcinoma); 침윤성 관 암종(infiltrating duct carcinoma); 수질 암종(medullary carcinoma); 소엽 암종(lobular carcinoma); 염증성 암종(inflammatory carcinoma); 파제트병, 유방(paget's disease, mammary); 세엽 세포 암종(acinar cell carcinoma); 선편평 암종(adenosquamous carcinoma); 편평 화생이 있는 선암종(adenocarcinoma w/squamous metaplasia); 흉선종, 악성(thymoma, malignant); 난소 기질 종양, 악성(ovarian stromal tumor, malignant); 난포막종, 악성(thecoma, malignant); 과립층 세포 종양, 악성(granulosa cell tumor, malignant); 및 모세포종, 악성(roblastoma, malignant); 세르톨리 세포 암종(Sertoli cell carcinoma); 라이디히 세포 종양, 악성(leydig cell tumor, malignant); 지질 세포 종양, 악성(lipid cell tumor, malignant); 부신경절종, 악성(paraganglioma, malignant); 유방 외 부신경절종, 악성(extra-mammary paraganglioma, malignant); 갈색 세포종(pheochromocytoma); 사구체육종(glomangiosarcoma); 악성 흑색종(malignant melanoma); 무색소성 흑색종(amelanotic melanoma); 표재 확장성 흑색종(superficial spreading melanoma); 거대 색소 모반의 말리그 흑색종(malig melanoma in giant pigmented nevus); 상피 세포 흑색종(epithelioid cell melanoma); 청색 모반, 악성(blue nevus, malignant); 육종(sarcoma); 섬유육종(fibrosarcoma); 섬유 조직구종, 악성(fibrous histiocytoma, malignant); 점액 육종(myxosarcoma); 지방육종(liposarcoma); 평활근육종(leiomyosarcoma); 횡문근육종(rhabdomyosarcoma); 배아 횡문근육종(embryonal rhabdomyosarcoma); 폐포 횡문근육종(alveolar rhabdomyosarcoma); 간질 육종(stromal sarcoma); 혼합 종양, 악성(mixed tumor, malignant); 뮬러 혼합 종양(mullerian mixed tumor); 신장모세포종(nephroblastoma); 간모세포종(hepatoblastoma); 암육종(carcinosarcoma); 중간엽종, 악성(mesenchymoma, malignant); 브레너 종양, 악성(brenner tumor, malignant); 엽상 종양, 악성(phyllodes tumor, malignant); 활막 육종(synovial sarcoma); 중피종, 악성(mesothelioma, malignant); 미분화세포종(dysgerminoma); 배아 암종(embryonal carcinoma); 기형종, 악성(teratoma, malignant); 난소 갑상선종, 악성(struma ovarii, malignant); 융모막암종(choriocarcinoma); 중배엽종, 악성(mesonephroma, malignant); 혈관육종(hemangiosarcoma); 혈관내피종, 악성(hemangioendothelioma, malignant); 카포시 육종(kaposi's sarcoma); 혈관 주위세포종, 악성(hemangiopericytoma, malignant); 림프관육종(lymphangiosarcoma); 골육종(osteosarcoma); 피질 주위 골육종(juxtacortical osteosarcoma); 연골육종(chondrosarcoma); 연골모세포종, 악성(chondroblastoma, malignant); 중간엽 연골육종(mesenchymal chondrosarcoma); 뼈의 거대 세포 종양(giant cell tumor of bone); 유잉 육종(ewing's sarcoma); 치성 종양, 악성(odontogenic tumor, malignant); 사기질모세포성 치아육종(ameloblastic odontosarcoma); 사기질모세포종, 악성(ameloblastoma, malignant); 사기질모세포성 섬유육종(ameloblastic fibrosarcoma); 송과종, 악성(pinealoma, malignant); 척색종(chordoma); 신경교종, 악성(glioma, malignant); 뇌실막종(ependymoma); 성상세포종(astrocytoma); 원형질 성상세포종(protoplasmic astrocytoma); 섬유성 성상세포종(fibrillary astrocytoma); 성상모세포종(astroblastoma); 교모세포종(glioblastoma); 희소돌기아교종(oligodendroglioma); 희돌기아교세포종(oligodendroblastoma); 원시 신경외배엽(primitive neuroectodermal); 소뇌 육종(cerebellar sarcoma); 신경절아세포종(ganglioneuroblastoma); 신경모세포종(neuroblastoma); 망막모세포종(retinoblastoma); 후각 신경성 종양(olfactory neurogenic tumor); 수막종, 악성(meningioma, malignant); 신경섬유육종(neurofibrosarcoma); 신경집종, 악성(neurilemmoma, malignant); 과립 세포 종양, 악성(granular cell tumor, malignant); 악성 림프종(malignant lymphoma); 호지킨병(Hodgkin's disease); 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma); 파라육아종(paragranuloma); 악성 림프종, 소림프구성(malignant lymphoma, small lymphocytic); 악성 림프종, 대세포, 미만성(malignant lymphoma, large cell, diffuse); 악성 림프종, 여포성(malignant lymphoma, follicular); 균상 식육종(mycosis fungoides); 기타 특정 비호지킨 림프종(other specified non-Hodgkin's lymphomas); 악성 조직구증(malignant histiocytosis); 다발성 골수종(multiple myeloma); 비만 세포 육종(mast cell sarcoma); 면역 증식성 소장 질환(immunoproliferative small intestinal disease); 백혈병(leukemia); 림프성 백혈병(lymphoid leukemia); 형질 세포 백혈병(plasma cell leukemia); 적백혈병(erythroleukemia); 림프육종 세포 백혈병(lymphosarcoma cell leukemia); 골수성 백혈병(myeloid leukemia); 호염기성 백혈병(basophilic leukemia); 호산구성 백혈병(eosinophilic leukemia); 단핵구 백혈병(monocytic leukemia); 비만 세포 백혈병(mast cell leukemia); 거핵모구성 백혈병(megakaryoblastic leukemia); 골수성 육종(myeloid sarcoma); 털 세포 백혈병(hairy cell leukemia); 린치 증후군(Lynch syndrome)(유전성 비용종증 결장직장암(hereditary nonpolyposis colorectal cancer; HNPCC) 증후군으로 공지됨) 및 CMMRD(체질적 불일치 복구 결핍) 증후군. 일부 구현예에서, 환자는 결장직장암, 특히 전이성 결장직장암을 앓고 있다.

특정 구현예에서, 암은 전이성 암이다.

특정 구현예에서, 암은 결장직장암, 위암 또는 자궁내막암이다.

특정 구현예에서, 암은 전이성 결장직장암, 전이성 위암 또는 전이성 자궁내막암이다.

하나의 구현예에서, 결과를 환자에게 전달하는 추가 단계가 본 발명의 방법에 첨가될 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 방법은 MSS 암을 MSI 암과 구별할 수 있게 한다.

본 발명에 따르면, 방법은 생체외 방법 또는 시험관내 방법이다.

본 발명의 MSICare는 하나 이상의 컴퓨터 프로그램을 실행하는 하나 이상의 프로그래머블 프로세서에 의해 수행되어 입력 데이터에 대해 작동하고 출력을 생성하여 기능을 수행할 수 있다. 알고리즘은 또한 특수 목적 논리 회로(special purpose logic circuitry), 예를 들어, FPGA(필드 프로그래머블 게이트 어레이(field programmable gate array)) 또는 ASIC(주문형 집적 회로(application-specific integrated circuit))에 의해 수행될 수 있으며, 장치도 또한 이로써 구현될 수 있다. 컴퓨터 프로그램의 실행에 적합한 프로세서에는, 예로서, 일반 및 특수 목적 마이크로프로세서와 임의 종류의 디지털 컴퓨터의 임의의 하나 이상의 프로세서가 모두 포함된다. 일반적으로, 프로세서는 판독 전용 메모리(read-only memory) 또는 랜덤 액세스 메모리(random access memory) 또는 둘 다에서 명령어(instructions)와 데이터를 수신한다. 컴퓨터의 필수 요소는 명령어를 수행하기 위한 프로세서와 명령어 및 데이터를 저장하기 위한 하나 이상의 메모리 장치(memory device)이다. 일반적으로, 컴퓨터는 데이터를 저장하기 위한 하나 이상의 대용량 저장 장치, 예를 들어, 자기(magnetic), 자기-광학 디스크(magneto-optical disk) 또는 광학 디스크(optical disk를 포함하거나 또는 이로부터 데이터를 수신하거나 이들에게 데이터를 전송하거나 이들 둘 다를 위해 작동적으로 결합될 것이다. 그러나, 컴퓨터는 이러한 장치를 가질 필요는 없다. 또한, 컴퓨터는 다른 장치에 내장될 수 있다. 컴퓨터 프로그램 명령어 및 데이터를 저장하는 데 적합한 컴퓨터 판독 가능 매체(Computer-readable media)는 모든 형태의 비휘발성 메모리(non-volatile memory), 매체 및, 예로서, 반도체 메모리 장치, 예를 들어, EPROM, EEPROM 및 플래시 메모리 장치(flash memory device); 자기 디스크, 예를 들어, 내장 하드 디스크(internal hard disk) 또는 이동식 디스크(removable disk); 자기 광학 디스크; 및 CD-ROM 및 DVD-ROM 디스크를 포함하는 메모리 장치를 포함한다. 프로세서와 메모리는 특수 목적 논리 회로로 보완되거나 이에 통합될 수 있다. 사용자와의 상호작용을 제공하기 위해, 본 발명의 구현예는 사용자에게 정보를 표시하기 위한 디스플레이 장치(display device), 예를 들어, 비제한적인 예로서, CRT(음극선관) 또는 LCD(액정 디스플레이) 모니터와 사용자가 컴퓨터에 입력을 제공할 수 있는 키보드 및 포인팅 장치(pointing device), 예를 들어, 마우스 또는 트랙볼(trackball)을 갖는 컴퓨터에서 구현될 수 있다. 다른 종류의 장치도 사용자와의 상호작용을 제공하는 데 사용될 수 있고; 예를 들어, 사용자에게 제공되는 피드백(feedback)은 임의의 형태의 감각 피드백(sensory feedback), 예를 들어, 시각 피드백(visual feedback), 청각 피드백(auditory feedback) 또는 촉각 피드백(tactile feedback)일 수 있고, 사용자로부터의 입력은 음향(acoustic), 음성(speech) 또는 촉각 입력(tactile input)을 포함하여 임의 형태로 수신될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 알고리즘은 백엔드 컴포넌트(back-end component), 예를 들어, 데이터 서버(data server)를 포함하는 컴퓨팅 시스템(computing system), 또는 미들웨어 컴포넌트(middleware component), 예를 들어, 애플리케이션 서버(application server)를 포함하는 컴퓨팅 시스템, 또는 프론트-엔드 컴포넌트(front-end component), 예를 들어, 그래픽 사용자 인터페이스(graphical user interface) 또는 사용자가 본 발명의 구현과 상호작용할 수 있는 웹 브라우저(Web browser)를 갖는 클라이언트 컴퓨터(client computer)를 포함하는 컴퓨팅 시스템, 또는 하나 이상의 이러한 백-엔드, 미들웨어 또는 프론트-엔드 컴포넌트의 임의 조합으로 구현될 수 있다. 시스템의 구성 요소는 디지털 데이터 통신의 임의의 형태 또는 매체, 예를 들어, 통신 네트워크(communication network)에 의해 상호 연결될 수 있다. 통신 네트워크의 예는 근거리 네트워크(local area network; "LAN") 및 광역 네트워크(wide area network; "WAN"), 예를 들어, 인터넷을 포함한다. 컴퓨팅 시스템은 클라이언트와 서버를 포함할 수 있다. 클라이언트와 서버는 일반적으로 서로 멀리 떨어져 있으며, 전형적으로 통신 네트워크를 통해 상호 작용한다. 클라이언트와 서버의 관계는 각각의 컴퓨터에서 실행되고 서로 클라이언트-서버 관계를 갖는 컴퓨터 프로그램에 의해 발생한다.

본 발명의 또 다른 목적은 컴퓨터로 구현될 때, 상기 기재된 방법을 실행하기 위한 코드 명령어(code instruction)를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품이다.

MSIcare 점수의 비교를 위해 사용되는 미리 결정된 참조 값은 본원에 기재된 바와 같이 결정될 수 있는 "컷오프" 또는 "임계" 값을 포함할 수 있다. MSIcare 점수 수준에 대한 각 참조("컷오프") 값은, 예를 들어, 다음 단계를 포함하는 방법을 수행함으로써 미리 결정될 수 있다:

a) 암을 앓고 있는 환자의 샘플 수집을 제공하는 단계;

b) 단계 a)에서 제공된 수집에 함유된 각 샘플에 대한 MSIcare 점수를 결정하는 단계;

c) 상기 수준에 따라 종양 조직 샘플의 순위를 매기는 단계;

d) 상기 샘플을 그들의 발현 수준에 따라 순위가 매겨진 구성원의 수를 각각 증가시키고, 감소시키는 하위 집합의 쌍으로 분류하는 단계;

e) 단계 a)에서 제공된 각 샘플에 대해 상응하는 암 환자의 실제 임상 결과와 관련된 정보를 제공하는 단계;

f) 샘플의 하위 집합의 각 쌍에 대해, 생존 곡선의 카플란 마이어 백분율(Kaplan Meier percentage)을 수득하는 단계;

g) 샘플의 하위 집합의 각 쌍에 대해 두 하위 집합 간의 통계적 유의성(p 값)을 계산하는 단계;

h) 수준의 참조 값으로, p 값이 가장 작은 수준의 값을 선택하는 단계.

예를 들어, MSIcare 점수는 100명의 환자의 100개의 췌장암 샘플에 대해 평가하였다. 100개의 샘플은 그들의 발현 수준에 따라 순위가 매겨진다. 샘플 1은 가장 좋은 발현 수준을 갖고, 샘플 100은 가장 나쁜 발현 수준을 갖는다. 첫 번째 그룹화는 두 개의 하위 집합을 제공한다: 한쪽에는 샘플 Nr 1이 있고 다른 쪽에는 99개의 다른 샘플이 있다. 한쪽에는 샘플 1 내지 99를, 다른 쪽에는 샘플 Nr 100을 제공하는 마지막 그룹화까지 다음 그룹화는 한쪽에는 샘플 1과 2를, 다른 쪽에는 나머지 98개 샘플을 제공하는 등이다. 상응하는 췌장암 환자의 실제 임상 결과와 관련된 정보에 따라, 두 개의 하위 집합의 99개 그룹 각각에 대해 카플란 마이어 곡선이 제조된다. 또한, 99개 그룹 각각에 대해, 두 하위 집합 사이의 p 값이 계산되었다.

최소 p값이 가장 강한 기준에 따른 식별과 같은 참조 값이 선택된다. 다른 용어로, p 값이 최소인 두 하위 집합 사이의 경계에 상응하는 발현 수준이 참조 값으로 간주된다. 참조 값이 반드시 발현 수준의 중앙값일 필요는 없다는 점에 유의해야 한다.

일상적인 작업에서, 참조 값(컷오프 값)은 췌장암 샘플 및 따라서 상응하는 환자를 식별하기 위해 본 방법에 사용될 수 있다.

시간의 함수로서 생존율의 카플란-마이어 곡선은 치료 후 특정 시간 동안 생존하는 환자의 비율을 측정하는 데 통상적으로 사용되며, 당업자에 의해 익히 공지되어 있다.

당업자는 또한 단백질의 발현 수준을 평가하는 동일한 기술이 물론 참조 값을 수득하기 위해 사용되어야 하고, 이후 본 발명의 방법에 따른 환자의 단백질의 발현 수준의 평가를 위해 사용되어야 한다는 것을 이해한다.

본 발명에 따르면, MSIcare 컷오프는 민감도(sensitivity)와 특이성(specificity)의 합의 최대가 수득되는 반올림된 값을 선택함으로써 개시 코호트에서 결정되었다(수신기 작동 특성(Receiver Operating Characteristic; ROC) 분석). 분석 횟수에 따라, MSI 결장직장암에 대한 MSIcare 컷오프는 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%와 25% 사이일 수 있으며, 보다 특히 20% 또는 21%이다. 이를 위해, 본 발명자들은 상이한 사용 가능한 방법들 중에서 이진 분류 작업에서 특정 메트릭을 최적화하는 컷포인트(cutpoint)를 추정하고 부트스트래핑(bootstrapping)을 사용하여 성능을 검증하는 'cutpointr' 패키지(https://github.com/thie1e/cutpointr)를 적용했다. 본원에 사용되는 바와 같이, ≪특정 메트릭≫은 민감도와 특이성의 합을 나타낸다.

본 발명의 또 다른 양태는 i) 이를 필요로 하는 환자로부터 수득된 종양 및 정상 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계, ii) 상기 환자의 정상 샘플의 DNA에서 적어도 12개의 핵산 길이를 갖는 모노뉴클레오티드 반복(MNR) 서열의 수(N) 및 상기 환자의 종양 샘플의 DNA에서 상응하는 MNR을 서열분석하는 단계, iii) 각 MNR에 대한 △비율을 계산하는 단계, iv) 종양 샘플에 대한 종양 순도(TP)를 계산하는 단계, v) 조정된 △비율을 계산하는 단계, 및 vi) 조정된 △비율이 50% 미만일 때 MNR이 야생형이라고 결론 내리고, 조정된 △비율이 50% 이상일 때 MNR이 돌연변이된다고 결론을 내리는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 MNR의 돌연변이를 진단하는 방법에 관한 것이다.

이러한 특정 양태에 따르면, 본 발명은 또한 i) 이를 필요로 하는 환자로부터 수득된 종양 및 정상 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계, ii) 상기 환자의 정상 샘플의 DNA에서 적어도 12개의 핵산 길이를 갖는 모노뉴클레오티드 반복(MNR) 서열의 수(N) 및 상기 환자의 종양 샘플의 DNA에서 상응하는 MNR을 서열분석하는 단계, iii) 각 MNR에 대한 △비율을 계산하는 단계, iv) 종양 샘플에 대한 종양 순도(TP)를 계산하는 단계, v) 단계 iv)에서 계산된 TP로 인해 조정된 △비율을 계산하는 단계, 및 vi) 조정된 △비율이 50% 미만일 때 MNR이 야생형이라고 결론 내리고, 조정된 △비율이 50% 이상일 때 MNR이 돌연변이된다고 결론을 내리는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 MNR의 돌연변이를 진단하는 방법에 관한 것이다.

이 방법에 따르면, 돌연변이는 암 세포의 출현을 담당한다.

하나의 구현예에서, 돌연변이는 MSI 암의 출현을 담당하는 반복 또는 현미부수체이다.

서열분석 방법:

본 발명에 따르면, 서열분석 단계는 맥삼-길버트(Maxam-Gilbert) 방법(Methods in Enzymology 65, 499-560 (1980))을 사용하는 화학적 서열분석(chemical sequencing)을 포함하지만, 제한되지 않는 임의의 방법; 생거(Sanger) 방법(Proc. Natl. USA 74, 5463-67 (1977))을 사용하는 효소 서열분석(enzymatic sequencing); 질량 분석법 서열분석(mass spectrometry sequencing); 칩 기반 기술(chip-based technology)을 사용한 서열분석; 및 실시간 정량적(real-time quantitative) PCR에 의해 달성될 수 있다.

화학적 서열분석에서, 염기 특이적 변형은 방사성 또는 형광 표지된 DNA 단편의 염기 특이적 절단을 초래한다. 4개의 개별 염기 특이적 절단 반응으로, 폴리크릴아미드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis; PAGE)에 의해 길이에 따라 분리되는 네 세트의 중첩된 단편이 생성된다. 자가 방사선 촬영(autoradiography) 후, 겔의 각 밴드(단편)는 염기 특이적 절단 이벤트에서 유래되기 때문에 서열은 직접 판독될 수 있다. 따라서, 네 개의 "사다리"에 있는 단편 길이는 DNA 서열의 특정 위치로 직접 번역된다.

효소 서열분석에서, DNA 단편의 4개의 염기 특이적 세트는 프라이머를 공지되지 않은 DNA 서열 영역으로 연장하는 프라이머/주형 시스템으로 시작하고, 이로써 주형을 복사하고, 쇄 종결 시약의 존재하에 상보적 가닥을 DNA 중합효소, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) DNA 중합효소 I의 클레노브 단편(Klenow fragment), 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)의 DNA 중합효소, Taq DNA 중합효소 또는 변형된 T7 DNA 중합효소인 시쿼나제(Sequenase)에 의해 합성함으로써 형성된다(Tabor et al., Proc. Natl. Scl. USA 84, 4767-4771 (1987)).

DNA 서열분석을 위한 몇 가지 새로운 방법(고처리량 서열분석(High-throughput sequencing; HTS) 방법)이 1990년대 중후반에 개발되어 2000년까지 상용 DNA 서열분석기로 구현되었다. 이들은 함께 "차세대" 또는 "2세대" 서열분석 방법이라고 칭명되었다. 이러한 HTS는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 단일 분자 실시간 서열분석, 이온 반도체, 파이로서열분석, 합성에 의한 서열분석, 결찰에 의한 서열분석, 나노기공 서열분석, 쇄 종결 및 혼성화에 의한 서열분석. 이러한 방법 중 일부는 전체 유전자 서열분석(Whole Gene Sequencing; WGS), 전체 엑솜 서열분석(Whole Exome Sequencing; WES) 또는 표적 서열분석을 허용한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 방법에 따른 서열분석은 표적화된 대규모 병렬 서열분석 접근법을 사용하여 수행되는 2세대 서열분석(Second-Generation Sequencing; NGS)과 같은 초심층 서열분석(ultra-deep sequencing)이며, 이에 의해 게놈의 특정 영역 패널, 본원에서는 모노뉴클레오이드 현미부수체(mononucleoid microsatellite)가 서열분석된다(참조: 예를 들어, Goodwin, S and all, 2016. Coming of age: Ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics).

치료 방법

다른 양태에서, 본 발명은 또한 상기 환자에게 치료적 유효량의 방사선 요법, 화학 요법, 면역 요법 또는 이들의 조합을 투여하는 단계를 포함하는, 본 발명의 방법에 따라 MSI 암을 갖는 것으로 식별된 환자의 암을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.

본원에 사용된 용어 "치료" 또는 "치료하다"는 질환에 걸릴 위험이 있거나 질환에 걸린 것으로 의심되는 대상체뿐만 아니라 질환 또는 의학적 상태로 아프거나 앓고 있다고 진단받은 대상체의 치료를 포함하여 예방적 또는 예방적 치료뿐만 아니라 치료적 또는 질환 수정 치료를 모두 지칭하며, 임상적 재발의 억제를 포함한다. 치료는 의학적 장애가 있거나 궁극적으로 장애를 획득할 수 있는 대상체에게 장애 또는 재발성 장애의 하나 이상의 증상을 예방하거나, 치료하거나, 이의 발병을 지연시키거나, 이의 중증도를 감소시키거나 개선시키기 위해, 또는 이러한 치료의 부재하에 예상되는 것 이상으로 대상체의 생존을 연장하기 위해 투여될 수 있다. "치료 섭생(therapeutic regimen)"이란 질병의 치료 패턴, 예를 들어, 요법 동안 사용되는 투여 패턴을 의미한다. 치료 섭생은 유도 섭생(induction regimen) 및 유지 섭생(maintenance regimen)을 포함할 수 있다. "유도 섭생" 또는 "유도 기간(induction period)"이라는 문구는 질환의 초기 치료에 사용되는 치료 섭생 (또는 치료 섭생의 일부)을 지칭한다. 유도 섭생의 일반적인 목표는 치료 섭생의 초기 기간 동안 대상체에게 높은 수준의 약물을 제공하는 것이다. 유도 섭생은 의사가 유지 섭생 동안 사용하는 것보다 더 많은 투여량의 약물을 투여하거나, 의사가 유지 섭생 동안 약물을 투여하는 것보다 더 자주 약물을 투여하거나, 또는 둘 다 포함할 수 있는 "로딩 섭생(loading regimen)"을 (부분적으로 또는 전체로) 사용할 수 있다. "유지 섭생" 또는 "유지 기간(maintenance period)"이라는 문구는 질병 치료 동안 대상체의 유지를 위해, 예를 들어, 대상체를 장기간(수개월 또는 수년) 관해 상태로 유지하기 위해 사용되는 치료 섭생 (또는 치료 섭생의 일부)을 지칭한다. 유지 섭생은 연속 요법(예: 규칙적인 간격으로, 예를 들어, 매주, 매월, 매년 등으로 약물을 투여) 또는 간헐적 요법(예: 치료 중단, 간헐적 치료, 재발시 치료 또는 특정 소정의 기준[예: 질환 발현 등]의 달성시 치료)를 사용할 수 있다.

용어 "화학요법제"는 종양 성장을 억제하는 데 효과적인 화학적 화합물을 지칭한다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예를 들어, 티오테파 및 사이클로스포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어, 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스파오라미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토제닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CBI-TMI 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라누스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스터드; 니트로스우레아, 예를 들어, 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예를 들어, 에네딘 항생제(예: 칼리케아마이신, 특히 칼리케아마이신(11 및 칼리케아마이신 211, 참조, 예를 들어, Agnew Chem Intl. Engl. 33:183-186 (1994); 다이네마이신 A를 포함하는 다이네마이신; 에스페라마이신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네딘 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 칸니노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이단르비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙톰그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사산물, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신, 예를 들어, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파르니드 글리코사이드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK®; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로겐나늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아르닌; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘A, 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브롬톨; 미토락톨; 피포브로만; 각시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀(TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.].) 및 독세탁셀(TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어, 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-1 1; 토포아이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산; 카페시타빈; 상기 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 이 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예를 들어, 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜(파레스톤)을 포함하는 항에스트로겐; 및 항안드로겐, 예를 들어, 플루타미드, 닐루타마이드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 및 상기 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.

환자가 MSI 암을 앓고 있다고 결론이 내려질 때, 의사는 환자에게 표적 요법을 투여하는 선택을 할 수 있다.

표적 암 요법은 암의 성장, 진행 및 확산에 관여하는 특정 분자("분자 표적")를 방해하여 암의 성장과 확산을 차단하는 약물 또는 기타 물질이다. 표적 암 요법은 때때로 "분자 표적 약물", "분자 표적 요법", "정밀 의약품" 또는 유사한 명칭으로 칭명된다.

일부 구현예에서, 표적 요법은 대상체에 티로신 키나제 억제제를 투여하는 것으로 구성된다. 용어 "티로신 키나제 억제제"는 수용체 및/또는 비수용체 티로신 키나제의 선택적 또는 비선택적 억제제로 작용하는 다양한 치료제 또는 약물 중 임의의 것을 지칭한다. 티로신 키나제 억제제 및 관련 화합물은 당업계에 익히 공지되어 있으며, 미국 특허 공보 2007/0254295에 기재되어 있으며, 이는 본원에 전체가 참조로 포함된다. 티로신 키나제 억제제와 관련된 화합물은 티로신 키나제 억제제의 효과를 요약할 것, 예를 들어, 관련 화합물이 티로신 키나제 신호전달 경로의 다른 구성원에 작용하여 그 티로신 키나제의 티로신 키나제 억제제와 동일한 효과를 생성한다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 본 발명의 구현예의 방법에 사용하기에 적합한 티로신 키나제 억제제 및 관련 화합물의 예는 다사티닙(BMS-354825), PP2, BEZ235, 사라카티닙, 게피티닙(이레사), 수니티닙(수텐트; SU11248), 에를로티닙(타르세바; OSI-1774), 라파티닙(GW572016; GW2016), 카네르티닙(CI 1033), 세막시닙(SU5416), 바탈라닙(PTK787/ZK222584), 소라페닙(BAY 43-9006), 이마티닙(글리벡; STI571), 레플루노마이드(SU101), 반데타닙(작티마; ZD6474), MK-2206(8-[4-아미노사이클로부틸)페닐]-9-페닐-1,2,4-트리아졸로[3,4-f][1,6]나프티리딘-3(2H)-온 하이드로클로라이드) 이의 유도체, 이의 유사체 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기에 적합한 추가의 티로신 키나제 억제제 및 관련 화합물은, 예를 들어, 미국 특허 공보 2007/0254295, 미국 특허 번호 5,618,829, 5,639,757, 5,728,868, 5,804,396, 6,100,254, 6,127,374, 6,245,759, 6,306,874, 6,313,138, 6,316,444, 6,329,380, 6,344,459, 6,420,382, 6,479,512, 6,498,165, 6,544,988, 6,562,818, 6,586,423, 6,586,424, 6,740,665, 6,794,393, 6,875,767, 6,927,293 및 6,958,340에 기재되어 있으며, 이들 모두 본원에 전체가 참조로 포함된다. 특정 구현예에서, 티로신 키나제 억제제는 경구 투여되고, 적어도 하나의 I상 임상 시험, 더욱 바람직하게는 적어도 하나의 II상 임상 시험, 더욱 더 바람직하게는 적어도 하나의 III상 임상 시험의 대상체였던, 가장 바람직하게는 적어도 하나의 혈액학적 또는 종양학적 적응증에 대해 FDA의 승인을 받은 소분자 키나제 억제제(small molecule kinase inhibitor)이다. 이러한 억제제의 예는 게피티닙, 에를로티닙, 라파티닙, 카네르티닙, BMS-599626(AC-480), 네라티닙, KRN-633, CEP-11981, 이마티닙, 닐로티닙, 다사티닙, AZM-475271, CP-724714, TAK-165, 수니티닙, 바탈라닙, CP-547632, 반데타닙, 보수티닙, 레스타우르티닙, 탄두티닙, 미도스타우린, 엔자스타우린, AEE-788, 파조파닙, 악시티닙, 모타세닙, OSI-930, 세디라닙, KRN-951, 도비티닙, 셀리시클립, SNS-032, PD-0332991, MKC-I (Ro-317453; R-440), 소라페닙, ABT-869, 브리바닙(BMS-582664), SU-14813, 텔라티닙, SU-6668, (TSU-68), L-21649, MLN-8054, AEW-541 및 PD-0325901을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

환자가 MSI 염을 앓고 있다고 결론이 내려질 때, 의사는 환자에게 면역요법제를 투여하는 선택을 할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "면역요법제"는 암 세포에 대한 신체의 면역 반응을 간접적으로 또는 직접적으로 향상, 자극 또는 증가시키고/시키거나 다른 항암 요법의 부작용을 감소시키는 화합물, 조성물 또는 치료를 지칭한다. 따라서, 면역 요법은 암 세포에 대한 면역 시스템 반응을 직접적으로 또는 간접적으로 자극 또는 향상시키고/시키거나 다른 항암제에 의해 유발될 수 있었던 부작용을 줄이는 요법이다. 면역 요법은 또한 당업계에서 면역 요법, 생물학적 요법, 생물학적 반응 조절제 요법 및 생물 요법으로 지칭된다. 당업계에 공지된 일반적인 면역요법제의 예는 사이토카인, 암 백신, 모노클로날 항체 및 비사이토카인 보조제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 면역요법제 치료는 환자에게 면역 세포(T 세포, NK 세포, 수지상 세포, B 세포...)의 양을 투여하는 것으로 구성될 수 있다.

면역요법제는 비특이적일 수 있다, 즉 일반적으로 면역계를 강화하여 인체가 암세포의 성장 및/또는 확산과 싸우는 데 더 효과적이 되도록 하거나, 또는 그들은 특이적일 수 있다, 즉 암세포 자체를 표적으로 하는 면역요법 섭생은 비특이적 및 특이적 면역요법제의 사용을 조합할 수 있다.

비특이적 면역요법제는 면역계를 자극하거나 간접적으로 개선시키는 물질이다. 비특이적 면역요법제는 암의 치료를 위한 주 요법으로 단독으로 뿐만 아니라 주 요법 이외에 사용되었고, 이 경우 비특이적 면역요법제는 다른 요법(예: 암 백신)의 효과를 증진시키는 보조제로서 기능한다. 비특이적 면역요법제는 또한 다른 요법의 부작용, 예를 들어, 특정 화학요법제에 의해 유발되는 골수 억제를 줄이기 위해 이 후자의 맥락에서 기능할 수 있다. 비특이적 면역요법제는 주요 면역계 세포에 작용하여 사이토카인 및 면역글로불린의 생산 증가와 같은 2차 반응을 일으킬 수 있다. 대안적으로, 제제 자체는 사이토카인을 포함할 수 있다. 비특이적 면역요법제는 일반적으로 사이토카인 또는 비사이토카인 보조제로 분류된다.

많은 사이토카인이 면역계를 강화하기 위해 설계된 일반적인 비특이적 면역 요법으로서 또는 다른 요법과 함께 제공되는 보조제로서 암 치료에 적용되는 것으로 밝혀졌다. 적합한 사이토카인은 인터페론, 인터류킨 및 콜로니 자극 인자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 의해 고려되는 인터페론(IFN)은 일반적인 유형의 IFN, IFN-알파(IFN-α), IFN-베타(IFN-β) 및 IFN-감마(IFN-γ)를 포함한다. IFN은, 예를 들어. 성장을 늦추고, 더 정상적인 거동을 갖는 세포로의 발달을 촉진하고/하거나, 항원의 생산을 증가시켜 암세포를 면역계가 쉽게 인식하고 파괴할 수 있도록 함으로써 암세포에 직접 작용할 수 있다. IFN은 또한, 예를 들어, 혈관신생을 늦추거나 면역계를 강화하고/하거나 자연 살해(NK) 세포, T 세포 및 대식세포를 자극함으로써 암세포에 간접적으로 작용할 수 있다. 재조합 IFN-알파는 로페론(Roche Pharmaceuticals)과 인트론 A(Schering Corporation)로 시판되고 있다. IFN-알파를 단독으로 또는 다른 면역요법제 또는 화학요법제와 함께 사용하면 흑색종(melanoma)(전이성 흑색종(metastatic melanoma) 포함), 신장암(renal cancer)(전이성 신장암(metastatic renal cancer) 포함), 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer) 및 자궁경부암(cervical cancer)(전이성 자궁경부암(metastatic cervical cancer) 포함)을 포함한 다양한 암의 치료에 효능을 나타내었다.

본 발명에 의해 고려되는 인터류킨은 IL-2, IL-4, IL-11 및 IL-12를 포함한다. 시판되는 재조합 인터류킨의 예는 Proleukin®(IL-2; Chiron Corporation) 및 Neumega®(IL-12; Wyeth Pharmaceuticals)을 포함한다. 자이모제네틱스, 인코포레이티드(Zymogenetics, Inc.)(Seattle, Wash.)는 현재 본 발명의 조합에 사용하기 위해 또한 고려되는 재조합 형태의 IL-21을 테스트하고 있다. 인터류킨은 단독으로 또는 다른 면역요법제 또는 화학요법제와 병용하여 신장암(전이성 신장암 포함), 흑색종(전이성 흑색종 포함), 난소암(ovarian cancer)(재발성 난소암(recurrent ovarian cancer) 포함), 자궁경부암(전이성 자궁경부암 포함), 유방암, 결장직장암(colorectal cancer), 폐암(lung cancer), 뇌암(brain cancer) 및 전립선암을 포함한 다양한 암의 치료에 효능을 나타내었다.

인터류킨은 또한 다양한 암의 치료에서 IFN-알파와 병용하여 양호한 활성을 보여주었다(Negrier et al., Ann Oncol. 2002 13(9):1460-8; Touranietal, J. Clin. Oncol. 2003 21(21):398794).

본 발명에 의해 고려되는 콜로니 자극 인자(CSF)는 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF 또는 필그라스팀), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF 또는 사르그라모스팀) 및 에리트로포이에틴(에포에틴 알파, 다르베포이에틴)을 포함한다. 하나 이상의 성장 인자에 의한 치료는 전통적인 화학 요법을 받고 있는 대상체에서 새로운 혈액 세포의 생성을 자극하는 데 도움이 될 수 있다. 따라서, CSF에 의한 치료는 화학 요법과 관련된 부작용을 줄이는 데 도움이 될 수 있으며, 더 많은 투여량의 화학요법제가 사용되도록 할 수 있한다. 다양한 재조합 콜로니 자극 인자, 예를 들어, Neupogen®(G-CSF; Amgen), 뉴라스타(펠필그라스팀; Amgen), 류킨(GM-CSF; Berlex), 프로크릿(에리트로포이에틴; Ortho Biotech), 에포겐(에리트로포이에틴; Amgen), 아르네스프(에리트로포이에틴)가 시판되고 있다. 콜로니 자극 인자는 흑색종, 결장직장암(전이성 결장직장암 포함) 및 폐암을 포함한 암의 치료에 효능을 나타내었다.

본 발명의 조합에 사용하기에 적합한 비사이토카인 보조제는 레바미솔, 명반 하이드록사이드(명반), 칼메트-게린 바실러스(Calmette-Guerin bacillus)(ACG), 불완전한 프로인트 보조제(incomplete Freund's Adjuvant; IFA), QS-21, DETOX, 키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole limpet hemocyanin; KLH) 및 디니트로페닐(DNP)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 비사이토카인 보조제는 다른 면역요법제 및/또는 화학요법제와 병용하여, 예를 들어, 결장암 및 결장직장암(레비마졸); 흑색종(BCG 및 QS-21); 신장암 및 방광암(BCG)을 포함한 다양한 암에 대한 효능을 입증했다.

특이적 또는 비특이적 표적을 갖는 것 이외에, 면역요법제는 활성일 수 있고, 즉 신체 자체의 면역 반응을 자극할 수 있거나, 또는 그들은 수동적일 수 있다, 즉 신체 외부에서 생성된 면역계 구성 요소를 포함할 수 있다.

수동적 특이적 면역 요법은 전형적으로 암세포의 표면에서 발견되는 특정 항원에 특이적이거나 특정 세포 성장 인자에 특이적인 하나 이상의 모노클로날 항체의 사용을 포함한다. 모노클로날 항체는, 예를 들어, 특정 유형의 암에 대한 대상체의 면역 반응을 강화하거나, 혈관 신생에 관여하는 것과 같은 특정 세포 성장 인자를 표적으로 하여 암세포의 성장을 방해하거나, 화학요법제, 방사성 입자 또는 독소와 같은 제제에 연결되거나 접합될 때 다른 항암제의 암세포로의 전달을 강화하는 다양한 방식으로 암의 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 조합에 포함하기에 적합한 암 면역요법제로서 현재 사용되는 모노클로날 항체는 리툭시맙(Rituxan®), 트라스투주맙(Herceptin®), 이브리투모맙 티욱세탄(Zevalin®), 토시투모맙(Bexxar®), 세툭시맙(C-225, Erbitux®), 베바시주맙(Avastin®), 젬투주맙 오조가마이신(Mylotarg®), 알렘투주맙(Campath®) 및 BL22를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 모노클로날 항체는 유방암(진행성 전이성 유방암(advanced metastatic breast cancer) 포함), 결장직장암(진행성 및/또는 전이성 결장직장암 포함), 난소암, 폐암, 전립선암, 자궁경부암, 흑색종 및 뇌종양(brain tumour)을 포함한 광범위한 암의 치료에 사용된다. 다른 예는 항-CTLA4 항체(예: 이필리무맙), 항-PD1 항체, 항-PDL1 항체, 항-TIMP3 항체, 항-LAG3 항체, 항-B7H3 항체, 항-B7H4 항체 또는 항-B7H6 항체를 포함한다.

특히, 본 발명에 따라 CMMRD 또는 MSI 백혈병(leukemia)/림프종(lymphoma)으로 진단된 환자는 항-CTLA4, 항-PD1, 항-PD-L1을 단독으로 또는 조합으로 포함하는 면역 체크포인트 차단(immune checkpoint blockade)과 같은 면역 요법, 또는 종양 특이적 항원에 기반한 항암 백신 또는 수지상 세포 백신으로 치료될 수 있다.

활성적 특정 면역 요법은 전형적으로 암 백신의 사용을 포함한다. 전체 암세포, 암세포의 일부 또는 암세포에서 유래되는 하나 이상의 항원을 포함하는 암 백신이 개발되었다. 암 백신은 단독으로 또는 하나 이상의 면역요법제 또는 화학요법제와 함께 흑색종, 신장암, 난소암, 유방암, 결장직장암 및 폐암을 포함한 여러 유형의 암의 치료에서 조사되고 있다. 비특이적 면역요법제는 신체의 면역 반응을 향상시키기 위해 암 백신과 함께 유용하다.

면역요법제 치료는 문헌(Nicholas P. Restifo, Mark E. Dudley and Steven A. Rosenberg "Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response, Nature Reviews Immunology, Volume 12, April 2012)에 기재된 바와 같은 입양 면역 요법으로 구성될 수 있다. 입양 면역 요법에서, 대상체의 순환 림프구 또는 종양 침윤 림프구는 시험관내에서 단리시키고, IL-2와 같은 림포카인에 의해 활성화시키거나 종양 괴사를 위한 유전자로 형질도입하고, 재투여한다(Rosenberg et al., 1988; 1989). 활성화된 림프구는 가장 바람직하게는 이전에 혈액 또는 종양 샘플에서 단리되고 시험관내에서 활성화(또는 "확장")된 대상체 자신의 세포이다. 이러한 형태의 면역 요법은 흑색종 및 신장 암종의 여러 퇴행 사례를 생성했다.

환자가 MSI 암을 앓고 있다고 결론이 내려질 때, 의사는 환자에게 방사선 치료제를 투여하는 선택을 할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "방사선 치료제"는, 제한 없이, 암을 치료하거나 개선하는 데 효과적이라고 당업자에게 공지된 임의의 방사선 치료제를 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 방사선 치료제는 근접 치료(brachytherapy) 또는 방사성 핵종 요법(radionuclide therapy)으로 투여되는 것과 같은 제제일 수 있다. 이러한 방법은 임의로 화학 요법 및/또는 다른 방사선 요법과 같지만, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 추가의 암 요법의 투여를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 키트 또는 장치:

본 발명의 추가의 목적은 샘플로부터 DNA를 추출하고 서열분석하는 수단을 포함하는, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트 또는 장치에 관한 것이다.

일부 구현예에서, 키트 또는 장치는 유전자좌당 적어도 한 쌍의 프라이머를 포함한다.

본 발명은 다음의 도면 및 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다. 그러나, 이러한 실시예 및 도면은 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

도 1. 배경 및 연구 설계. FDA, 식품의약국; MSI, 현미부수체 불안정; CRC, 결장직장암; mCRC, 전이성 결장직장암; nmCRC, 비전이성 결장직장암; WES, 전체 엑솜 서열분석; ICI, 면역 체크포인트 억제제; IHC, 면역조직화학.
도 2. MSI / dMMR 또는 MSS/ pMMR 상태가 이전에 금표준 참조 방법으로 평가된 전이성 및 비전이성 CRC의 전향적 및 후향적 코호트에서 MSISensor를 사용한 MSI의 재평가.
A) 상자 그림은 전향적 코호트(코호트 1, C1)의 전이성 CRC를 갖는 25명 MSI(빨간색) 및 77명 MSS(파란색) 환자의 WES로부터 수득된 돌연변이된 현미부수체의 백분율(MSISensor 점수)을 보여준다.
B) 상자 그림은 후향적 코호트(코호트 2, C2)의 비전이성 CRC를 갖는 88명의 MSI 환자(왼쪽)와 전이성 CRC를 갖는 25명의 MSI 환자(오른쪽)의 WES로부터 수득된 돌연변이된 현미부수체의 백분율(MSISensor 점수)을 보여준다.
C) 상자 그림은 51명의 MSI, 14명의 MSI-L 및 53명의 MSS 환자(코호트 3, C3)를 포함한 118명의 TCGA 환자의 WES로부터 수득된 돌연변이된 현미부수체의 백분율(MSISensor 점수)을 보여준다.
MSS를 MSI 종양(녹색 점선)과 구별하기 위해 컷오프 MSISensor 점수 10(FDA 권장)을 사용하였다. 비전이성 샘플은 원으로, 전이성 샘플은 다이아몬드로 표시된다. 수평 막대그래프는 각 코호트에 대한 진성 음성(TN), 진성 양성(TP), 거짓 음성(FN) 및 거짓 양성(FP) 백분율을 나타낸다.
도 3. MSISensor의 약점과 한계를 식별함으로써 CRC에서 MSI의 계산적 검출의 개선.
C1 + C2(왼쪽) 및 C3(오른쪽) 코호트에서 MSISensor 점수의 밀도 플롯. 컷오프 MSISensor 점수 10(FDA 권장 사항)을 사용하여 MSI 종양(녹색 점선)으로부터 MSS를 분리하였다. 인접한 히스토그램은 MSISensor 점수에 따른 종양 샘플의 분포를 나타낸다.
도 4. MSICare의 진단 성능 테스트.
A) C1 및 C2 코호트에서 MSICare 점수의 밀도 플롯.
B) C3 코호트에서 MSICare 점수의 밀도 플롯.
도 5. TCGA의 위 및 자궁내막 종양에서 MSI의 식별을 위한 MSISensor 및 MSICare의 비교 성능.
A) 상자 그림은 코호트 3의 104명의 TCGA GC 환자(55명의 MSI, 9명의 MSI-L, 및 42명의 MSS 포함) 및 278명의 TCGA EC 환자(159명의 MSI, 17명의 MSI-L 및 MSS 102명 포함)의 WES로부터 수득된 MSISensor 점수를 보여준다. 컷오프 MSISensor 점수 10(FDA 권장 사항)을 사용하여 MSS와 MSI 종양(녹색 점선)을 구별하였다.
B) 상자 그림은 CRC, GC 또는 EC를 갖는 동일한 TCGA 환자의 WES로부터 수득된 MSICare 점수를 보여준다. 컷오프 MSICare 점수 20을 사용하여 MSS와 MSI 종양(녹색 점선)을 구별하였다.
도 6. MSI를 검출하기 위한 MSISensor의 약점 및 한계의 식별(민감도 부족).
A) 현미부수체의 각 범주(모노-, 디-, 트리-, 테트라- 또는 펜타-뉴클레오티드 반복)에 대한 WES 데이터(C1 및 C2)에서 MSISensor로 식별된 체세포 돌연변이의 총 수의 분포. 모노뉴클레오티드 반복(MNR) 서열은 dMMR 결장 종양에서 지금까지 가장 불안정한 현미부수체 범주이고, 따라서 MSISensor에 의해 사용된 다른 형태의 반복(예: 디-, 트리-, 테트라-, 펜타-)보다 MSI와 MSS CRC를 더 잘 구별한다.
B) 크기(5 내지 12의 범위, MSICare 점수)에 따른 돌연변이된 MNR의 백분율(C1 및 C2). 5+는 길이가 5bp 이상인 모든 모노뉴클레오티드 반복을 포함하고; 6+는 길이가 6bp 이상인 모든 모노뉴클레오티드 반복을 포함하고 등이다. 12bp 이상의 긴 MNR은 두 표현형(파란색 직사각형)을 가장 잘 구분했다.
도 7. MSISensor 점수에 따른 게놈 불안정성 지수. 코호트 C1 및 C2의 MSISensor 점수(x축)에 따른 종양의 게놈 불안정성 지수(모노뉴클레오티드 반복 불안정성 기준, 상세한 내용은 재료 및 방법 참조)의 분포
도 8. MSI를 검출하기 위한 MSISensor의 약점 및 한계의 식별(특이성 부족).
A) MSISensor에 의해 돌연변이된 현미부수체를 갖는 것으로 식별된 3개의 종양에서 이형접합성 손실(Loss Of Heterozygosity; LOH)의 3개의 예에 대한 반복 길이에 따른 판독치의 밀도 플롯.
B) T16 현미부수체의 야생형 및 돌연변이된 프로파일이 제시되어 있다(정상 DNA, 야생형, 녹색; MSI 종양 DNA, 돌연변이됨, 노란색). 이는 말더듬(stuttering)(T15)으로 인해, 순수한 MSI 신호가 이 긴 MNR에서 2bp 이상의 체세포 결실을 고려해야만 포획될 수 있음을 보여준다.
도 9. 표적 패널 서열분석 데이터를 사용하는 MSI의 식별을 위한 MSISensor 와 MSICare의 비교 성능
A) 상자 그림은 C1 및 C2 코호트 환자(모든 환자, 오른쪽 패널; MLH1, MSH2, MSH6 또는 PMS2 결핍 CRC를 갖는 동일한 환자, 왼쪽 패널)에 대해 MSK-IMPACT로부터 수득된 돌연변이된 현미부수체의 백분율(MSISensor 점수)을 보여준다. 컷오프 MSISensor 점수 10(FDA 권장 사항)을 사용하여 MSS와 MSI 종양(점선)을 구별하였다.
B) 상자 그림은 C1 및 C2 코호트 환자(모든 환자, 오른쪽 패널; MLH1, MSH2, MSH6 또는 PMS2 결핍 CRC를 갖는 동일한 환자, 왼쪽 패널)에 대해 MSK-IMPACTTM으로부터 수득된 돌연변이된 현미부위체의 백분율(MSICare 점수)을 보여준다. 컷오프 MSISensor 점수 20을 사용하여 MSS와 MSI 종양(점선)을 구별하였다.
C) 상자 그림은 C4 코호트 환자(모든 환자, 오른쪽 패널; MLH1, MSH2, MSH6 또는 PMS2 결핍 CRC를 갖는 동일한 환자, 왼쪽 패널)의 표적 서열분석 후 수득된 돌연변이된 현미부수체의 백분율(MSISensor 점수 및/또는 MSICare 점수)을 보여준다. 유일한 하나의 오진된 사례의 펜타플렉스 프로파일이 상자에 표시된다.
수평 막대 그림은 진성 음성(TN), 진성 양성(TP), 거짓 음성(FN) 및 거짓 양성(FP)의 백분율을 나타낸다.
도 10. MSIDIAG를 사용한 표적 서열분석 후 MSISensor 점수의 평가.
상자 그림은 C4 코호트 환자(모든 환자, 왼쪽 패널; MLH1, MSH2, MSH6 또는 PMS2 결핍 CRC를 갖는 동일한 환자, 오른쪽 패널)의 표적 서열분석 후 수득된 돌연변이된 현미부수체의 백분율(MSISensor 점수)을 보여준다.
수평 막대 그림은 진성 음성(TN), 진성 양성(TP), 거짓 음성(FN) 및 거짓 양성(FP)의 백분율을 나타낸다.
도 11. 뇌종양에서 MSI 수준 평가
뇌종양을 갖는 8명의 MMRp(IHC에 따름) 환자 및 24명의 dMMR(IHC에 따름) 환자의 WES로부터 패널 서열분석으로부터 수득된 돌연변이된 현미부수체의 백분율(MSICare 점수)의 막대 그림. dMMR 환자 중 4명은 체질적 불일치 복구 결핍 CMMRD를 나타내고, 3명은 린치 증후군을 갖고, 17명은 테모졸로미드 치료 후 dMMR 종양(post_TMZ)을 갖는다. y축은 log10 스케일을 갖는다.
도 12. WIND- MSICare를 사용하는 CRC 정상 샘플이 없는 고형 종양에서 MSI 상태의 진단
상자 그림은 표적 서열분석 후 종양 전용 샘플로부터 수득된 돌연변이된 현미부수체의 백분율(WIND-MSICare 점수)을 보여준다. 샘플은 IHC에 따라 MMRd 또는 MMRp였다.
도 13. WIND- MSICare를 사용하는 종양 순환 DNA에서 MSI 상태의 진단
막대 그림은 임의의 정상 비교 없이 4명의 환자의 순환 DNA로부터 패널 서열분석으로부터 수득된 돌연변이된 현미부수체의 백분율(WIND-MSICare 점수)을 보여준다. "T1" 샘플은 첫 면역 요법 치료 당일에 추출했다. "T2" 샘플은 첫 번째 면역 요법 치료 3개월 후 추출했다. 환자 MS-CIRC-041은 IHC에 따라 pMMR인 것으로 공지되어 있다. 환자 MS-CIRC-005, MS-CIRC-012 및 MS-CIRC-045는 IHC에 따라 dMMR인 것으로 공지되어 있다. 컷오프 MSICare 점수 20을 사용하여 MSS와 MSI 종양을 구별하였다.

[표 1]

실시예 :

재료 및 방법

연구 집단

이 연구의 임상적 근거와 설계는 도 1에 제시되어 있다. 102명의 mCRC 환자(코호트 C1, 도 1)는 2015년 5월부터 2019년 11월 사이에 환자를 모집한 두 개의 다기관 프랑스 임상 시험(NCT02840604 및 NCT033501260)에서 유래되었다.

NCT02840604는 엑솜 분석이 환자의 일상적인 치료에서 실현 가능하다는 것을 보여줌으로써 표적 요법에 대한 접근성을 개선하고 유전적 암 소인의 검출을 개선시키는 것을 목표로 했다. 게놈 서열분석(WES)은 프랑스 디종에 위치한 게놈 및 면역요법 의학 연구소의 조르주 프랑수아 르클레르 암 센터(Georges-Francois Leclerc Cancer Center, Genomic and Immunotherapy Medical Institute, Dijon, France)에서 수행되었다. 환자는 적어도 한 라인의 전신 요법 중에 진행된 국소 진행성, 수술 불가능 또는 전이성 암을 나타낸 경우 자격이 주어졌다. NIPICOL 시험(NCT033501260)은 니볼루맙(항PD-1) 및 이필리무맙(항-CTLA-4)에 의한 MSI/dMMR mCRC 환자의 치료를 포함한다. ICI에 대한 mCRC 반응은 고형 종양에서의 반응 평가 기준(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors; RECIST)에 따라 결정되었다(20). NCT033501260 코호트에서 26건의 사례가 ICI로 치료되었다. 이 중, 23건은 MSI/dMMR로 확인되었고, 3건은 중앙에서 MSI 및 MMR 상태의 재평가 후 나중에 MSS/pMMR로 식별되었다. 게놈 서열분석(WES)은 IntegraGen SA(프랑스 에브리)에 의해 수행되었다. 모든 환자는 시험 및 게놈 분석에 대한 정보에 입각한 서명된 사전 동의서를 제공했다. 동의서 제공 후, 환자들은 체질 유전자 테스트 결과를 설명하기 위해 유전학자와 상담을 받았다. 이 상담 후, 환자는 체질 엑솜 분석을 위한 혈액 샘플의 제공을 수락하거나 거부할 수 있었다. 이 시험 프로토콜은 기관 검토 위원회의 승인을 받았으며, 헬싱키 선언(Declaration of Helsinki)에 따라 수행되었다.

역사적 후향적 코호트도 또한 분석되었다(코호트 C2, 도 1). 이는 1998년에서 2016년 사이에 프랑스 6개 병원에서 MSI 또는 dMMR(17)로 진단받은 mCRC 환자 25명과 1998년부터 2007년 사이에 MSI/dMMR nmCRC(21)로 진단받은 파리 생 앙투안 병원(Saint Antoine Hospital, Paris)의 환자 88명을 포함하였다. mCRC에 대한 원발성 및/또는 전이성 종양 조직은 WES를 사용하여 IntegraGen SA(프랑스 에브리)에 의해 분석되었다. 모든 환자는 서면 동의서를 제공했으며, 이 연구는 참여 센터의 기관 검토 위원회/윤리 위원회에 의해 승인되었다.

본 발명자들은 세 번째 독립적 종양 코호트(C3)에서 MSICare와 MSISensor의 성능을 추가로 평가하고 비교했다. 이는 MSI 상태가 이전에 베테스다 현미부수체 패널을 사용하여 PCR로 평가되었고 WES 데이터가 TCGA로부터 공개적으로 이용할 수 있었던 118명의 CRC 환자를 포함하였다. MSI-H(n = 51) 또는 MSI-L(n = 14)를 갖는 모든 CRC 환자와 유사한 비율의 MSS 환자(n = 53)가 포함되었다(22). C3은 또한 비교적 MSI 발생률이 높은 TCGA의 382개의 결장외 종양, 즉 위암(MSI-H 53명, MSI-L 9명, MSS 42명) 및 자궁내막암(MSI-H 159명, MSI-L 17명, MSS 102명)을 포함하였다.

새로운 후향적 코호트는 WES가 임상 치료에 일상적으로 사용되지 않기 때문에 표적 NGS를 사용하여 조사했다(코호트 C4)(상세함은 아래 참조). C4는 이전에 MSI PCR 및 IHC를 사용하여 MSI/dMMR 또는 MSS/pMMR CRC(MSI 137명, MSS 15명)로 진단받은, 파리의 생 앙투안 병원과 릴 대학 병원(Lille University Hospital)의 152명의 새로운 환자를 수집한 후향적이고 비연속적이었다. 생 앙투안 병원의 dMMR/MSI CRC 사례는 종양에서 검출된 MMR 결함에 관계없이 1998년부터 2021년 사이에 dMMR/MSI로 이전에 진단받았다. 종양 및 비종양 DNA 물질 모두 이러한 사례에 이용 가능하였고, 그들은 이전에 WES로 분석되지 않았다(C2 코호트와 중복되지 않음). 2016년부터 2021년까지 이용 가능한 물질(생검 또는 외과적 절제)을 사용하는 릴 대학 병원의 dMMR/MSI CRC 사례는 MSH6 또는 PMS2 발현의 단리된 손실을 나타냈다. 그들은 이러한 희귀한 dMMR/MSI CRC 환경, 특히 진단하기 더 어려운 것으로 공지된 MSH6 결핍 CRC에서 MSI를 식별하기 위한 MSICare의 성능을 추가로 평가하기 위해 선택되었다²¹.

범암에서 MSI 표현형을 조사하기 위해, 비-CRC 환자의 추가의 공개적 후향적 코호트(코호트 C5)도 WES를 사용하여 분석하였다. 이 코호트는 WES 데이터가 TCGA에서 공개적으로 이용 가능하였던 34명의 환자를 포함한다. 이 코호트는 유방 침윤성 암종(BRCA, n=8), 자궁경부 편평 세포 암종 및 자궁경부 선암종(CESC, n=7), 식도 암종(ESCA, n=3), 두경부 편평 세포 암종(HNSC, n=3), 급성 골수성 백혈병(LAML, n=4), 폐 편평 세포 암종(LUSC, n=4) 및 피부 피부 흑색종(SKCM, n=5)을 포함한다. 이 환자들은 DNA 복구 결핍을 암시하는 돌연변이 징후, 보다 구체적으로는 MMR, MMR/POLE 또는 POLE 징후가 있는 경우에 선택되었다. 그런 다음, MSICare 및 MSIsensor는 정상 조직과 종양 조직을 모두 고려하여 서열분석 데이터에 상대적으로 사용되었다.

또한, 비-CRC 샘플에서 MSIcare의 성능을 조사하기 위해, 32명의 뇌종양 환자의 코호트(C6)도 또한 연구했다. 이 코호트는 파리의 Institut du Cerveau - ICM의 환자를 포함하고, 환자는 체질적 불일치 복구 결핍(CMMRD, n=4), 린치 증후군(Lynch, n=3), 테모졸로마이드 치료 후 교모세포종 재발(post_TMZ, n=17) 및 MMR 능숙 교모세포종(n=8)을 갖는 4개 그룹의 환자로 계층화되었다. MSICare는 진단하기 어려운 것으로 공지된 이 종양 위치에 적용되었다.

마지막으로, 액체 생검을 사용한 MSI 진단의 타당성을 평가하기 위해, 4명의 전이성 CRC 환자의 파일럿의 혈액 샘플을 분석했다(코호트 C7). 이 환자들은 처음에 NIPICOL 시험(C1, NCT033501260)에 포함되었으며, 각각 참조 방법 IHC 및 MSI-PCR을 사용하여 4명의 환자 중 3명은 dMMR/MSI이었고, 1명은 pMMR/MSS였다. 종양 순환 DNA(ctDNA) 서열분석 데이터는 정상 샘플 비함유 MSIcare(WIND-MSIcare, 아래 참조)를 사용하여 분석했다.

모든 환자는 서면 동의서를 제공했으며, 연구는 참여 센터의 기관 검토 위원회/윤리 위원회의 승인을 받았다.

샘플

전향적 코호트(C1, 임상 시험 NCT02840604 및 NCT033501260)에서, mCRC 샘플은 포르말린 고정 및 파라핀 매립되었으며(FFPE), 원발성 또는 전이성 종양 조직으로 구성되었다. 후향적 코호트(C2)에서, 모든 nmCRC 샘플(n = 88)은 DNA 추출 까지 -80℃에서 저장되었다. mCRC 환자(n=25)의 경우, 이 희귀한 CRC 아형에 대한 보다 완전한 설명을 제공하기 위해 FFPE로 보존된 원발성 종양 및 전이(n=45; 원발성 종양 25개 및 전이 20개)를 모두 가능할 때마다 수집하고 분석했다. 공개 후향적 코호트(C3)의 경우, 냉동 조직 샘플은 기재된 바와 같이 원발성 종양 부위(결장직장, 위, 자궁내막)에서 수집하였다(22). C4 후향적 코호트에서, 다양한 기술 조건과 DNA의 품질하에서 MSICare 방법의 타당성을 평가하기 위해 CRC 샘플(N = 152; 원발성 또는 전이)과 일치된 비종양 샘플은 FFPE(N = 87) 또는 냉동되었다(N = 65). NGS 기반 MSI를 수행하기 위해 모든 코호트에서 일치된 정상 콜론 점막 샘플이 고려되었다.

이 연구에서 C4의 모든 CRC 샘플은 이전에 기재된 바와 같이^{14 -16} 면역조직화학(IHC)을 사용한 dMMR 상태 및 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용한 MSI에 대해 이 연구에 참여한 전문가 센터(프랑스 파리 생 앙투안 병원 및 프랑스 릴 대학 병원)에서 중앙 재평가되었다.

공개 후향적 비-CRC 코호트(C5)의 경우, 냉동 조직 샘플은 기재된 바와 같이²⁴ 원발성 종양 부위로부터 수집하였다. 그리고 뇌종양 코호트(C6)의 경우, 모든 샘플은 FFPE였으며, MMR 상태는 IHC를 사용하여 평가했다. 이 코호트이 경우, 정상 점막 또는 혈액 DNA가 일치된 정상 샘플로 사용되었다.

마지막으로, 액체 생검 샘플(C7)의 경우, 혈액 DNA는 면역 체크포인트 억제제로 처리된 전이성 CRC 환자의 혈장에서 추출했다. 각각 치료 전과 치료 3개월 후에 두 개 시점 T1 및 T2를 수행하였다.

면역조직화학 및 MSI - PCR

이 사후 연구에 사용된 C1 및 C2의 모든 CRC 샘플은 이전에 기재된 바와 같이(13-15) 면역조직화학(IHC)을 사용한 dMMR 상태 및 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용한 MSI에 대해 본 전문가 센터(생 앙투안 병원, 프랑스 파리)에서 중앙 재평가했다.

MSISensor 종점

C1 및 C2의 거짓 음성은 각각 MSI-PCR 및 IHC를 사용하여 처음에 MSI 또는 dMMR로 진단되었지만 완전한 엑솜 데이터(18, 19)를 고려할 때 음성 MSISensor 점수(≤ 10%)를 나타내는 샘플로 정의되었다. 이는 디종의 조르주 프랑수아 르클레르 암 센터와 파리의 생 앙투안 병원에서 중앙 평가를 통해 수행되었다. MSISensor의 민감도는 전체 진성 양성 및 거짓 음성 사례 중 진성 양성 사례의 백분율로서 계산되었다.

ImpactTM 유전자 패널(C1, C2, C3)19, 20; 또는 (ii) 종양의 표적 서열분석 후 마커의 MSIDIAG 현미부수체 패널(아래 참조)(C4). 이는 파리 생 앙투안 병원(C1, C2, C3, C4), 디종 조르주 프랑수아 르클레르 암 센터(C1), 또는 릴 대학 병원(C4)에서 중앙 평가에 의해 수행되었다. MSISensor의 민감도는 총 진성 양성 및 거짓 음성 사례 중 진성 양성 사례의 백분율로서 계산되었다.

MSISensor를 이용한 전체 엑솜 서열분석 및 NGS 기반 MSI 진단

전향적(C1) 및 후향적(C2) 코호트의 경우, WES 절차는 제조업체에 의해 권장되고(SureSelect Human Exon Kit v5, 75 MB; Agilent, Les Ulis, France), 그리고 이전에 기재된 바와 같이(23) 수행되었다. 전이성 종양 샘플의 경우, 생성된 판독치는 참조 게놈 hg38(GRCh38)에 매핑되었고, 후향적 비전이성 샘플의 경우 판독치는 hg19(GRC37) 상에 매핑되었다. MSISensor는 WES 데이터로부터 현미부수체의 돌연변이 상태를 평가하기 위해 기본 설정에서 사용되었다(19).

CRC 및 기타 종양에서 MSI 검출의 민감도를 높이기 위해 최적화된 NGS 기반 MSICare 방법의 구현

WES 데이터에서 정상 샘플과 종양 샘플 사이의 판독 분포의 비교에 기초하는 MSI의 검출을 최적화하기 위해 새로운 방법(MSICare)이 개발되었다. 길이가 12개 염기쌍(bp) 이상인 모노뉴클레오티드 반복(MNR)은 정상 및 종양 샘플 모두에서 적어도 20개의 매핑 판독치로 커버되는 경우에만 분석에 고려되었다. 그런 다음, 각 후보 MNR을 커버하는 총 판독 수를 종양 및 일치된 건강한 조직에서 정규화하였다(임의의 값 100). 각 MNR의 경우, 건강한 조직의 정규화된 판독 수는 종양 조직의 정규화된 판독 수로부터 빼서[△비율 = %종양-%정상] 모든 후보 MNR의 △비율 값의 합에 상응하는 MSI 지수(MSI 신호, MSIg)를 생성했다. 그런 다음, △비율 값은 각 종양 샘플에 대한 종양 순도(TP)를 추정하여 조정했으며, 추정된 TP는 종양에서 적어도 30회 판독과 정상 조직에서 20회 판독으로 커버되는 길이가 14bp 이상인 모든 MNR에 대한 MSI 신호의 중앙값에 상응한다. 그런 다음, △비율의 조정된 값을 사용하여 소정의 MNR을, 관찰된 현미부수체 돌연변이가 원발성 종양 샘플에서 이형접합성 또는 동형접합성일 수 있다는 점을 감안하여, 야생형(조정된 △비율 = △비율 x 추정된 TP < 50%) 또는 돌연변이됨(조정된 △비율 = △비율 x 추정된 TP ≥ 50%)으로 분류했다. 마지막으로, 종양 샘플에 대한 MSICare 점수는 이 접근법을 사용하여 분석된 총 현미부수체 수 중에서 돌연변이된 현미부수체의 백분율에 상응한다. 스크립트와 설명서는 https://github.com/MSI.CRSA/MSICare의 Github를 통해 이용 가능하다.

MSICare 컷오프 결정

상이한 코호트에서 MSI와 MSS 샘플의 구별을 최적화하기 위해 MSICare의 컷오프 값이 추정되었다. 이 작업은 이진 분류 작업에서 최적의 컷오프 포인트를 추정하고 부트스트래핑을 사용하여 그들의 성능을 검증하는 cutpointr 패키지(버전 1.0.32)를 사용하여 수행되었다. 컷오프 포인트 20은 77개의 MSS와 138개의 MSI의 발견 세트(discovery set)(C1 + C2; CRC, 발견 세트)를 사용하여 결정된 다음, 공개 TCGA 데이터의 MSI의 검증 세트(validation set)(C3; CRC 및 비-CRC, 검증 세트)에 적용되었다(추가 상세함은 결과 섹션 참조). MSK-ImpactTM 유전자 패널에 제한된 부분적 WES 데이터만 고려할 때 CRC 환자의 동일한 코호트에서 MSI를 식별하기 위한 MSICare를 테스트하기 위해 동일한 컷오프가 다시 테스트되었다.

최적화된 현미부수체 마커 패널로 쌍을 이룬 종양 및 정상 점막 샘플의 표적 서열분석 후 MSICare를 사용하여 CRC에서 MSI의 진단

임상 적용의 관점에서, MSI 테스트는 전체 엑솜 서열분석에서뿐만 아니라 패널 테스트에서도 중요하다. MSISensor와 비교된 MSICare의 성능은 동일한 컷오프를 사용하여 추가의 독립적 다기관 CRC 코호트(C4)에서 다시 평가되었다. 쌍을 이룬 종양 및 정상 점막 샘플에 대한 이 코호트의 서열분석은 현미부수체 마커의 최적화된 표적 패널, 즉 MSIDIAG를 사용하여 수행되었다. 이 패널은 불안정성이 WES 후 C1, C2 및 C3의 MSI 종양 샘플에서 배타적으로 관찰된 12bp 이상의 크기를 갖는 MNR 중에서 선택된 441개의 모노뉴클레오티드 반복을 포함한다(MSS CRC에서 체세포 돌연변이의 낮은 빈도; p-값 <0.05를 갖는 카이 제곱 테스트(chi-squared test)). 포획 및 서열분석 후, 판독치는 100배에서 500배 사이로 구성된 커버리지 깊이로 인간 게놈 빌드(human genome build)(hg38)에 매핑되었다. MSI의 진단은 이전에 C1, C2 및 C3의 WES 데이터로부터 수행된 것과 정확히 동일하게 MSISensor 또는 MSICare 절차를 사용하여 평가되었다(상기 참조).

고형 및 액체 생검 모두에 대한 정상 샘플이 없는(종양 단독) DNA 서열분석 데이터를 사용하여 CRC에서 MSI 상태를 검출하기 위한 WIND-MSICare의 구현.

일치하는 정상 샘플이 없는 MSI를 검출하기 위해, 정상 다형성 영역이 764개의 정상 샘플의 데이터베이스를 사용하여 각 반복에 대해 식별되었다. 길이가 12염기쌍(bp) 이상인 모노뉴클레오티드 반복(MNR)은 종양 샘플에서 적어도 20개의 매핑 판독치에 의해 커버되는 경우에만 분석에 고려되었다. 그런 다음, 종양에서 각 후보 MNR을 커버하는 총 판독 수를 정규화했다(임의의 값 100). 그런 다음, 종양 샘플에서, 이 정상 다형성 영역 외부에서 관찰된 돌연변이된 반복만이 고려되었다. 이 다형성 영역 외부에서는, 정상 샘플의 판독 수를 각 MNR에 대해 제로[△비율 = 다형성 영역 외부의 %종양]와 같은 것으로 간주되었다. 이러한 맥락에서, MSICare 방법의 여러 단계(상기 참조)는 이를 고려하여 수행되었다.

MSI 지수(MSI 신호, MSIg)가 생성되었고, 모든 후보 MNR에 대한 △비율 값의 합에 상응했다. 그런 다음, △비율 값은 각 종양 샘플에 대한 종양 순도(TP)를 추정함으로써 조정되었고, 추정된 TP는 종양에서 적어도 30회 판독에 의해 커버되는 길이가 14bp 이상인 모든 MNR에 대한 MSI 신호의 중앙값에 상응한다. 그런 다음, △비율에 대한 조정된 값을 사용하여 소정의 MNR을, 관찰된 현미부수체 돌연변이가 원발성 종양 샘플에서 이형접합성 또는 동형접합성일 수 있다는 점을 감안하여, 야생형(조정된 △비율 = △비율 x 추정된 TP < 50%) 또는 돌연변이됨(△비율 조정 = △비율 x 추정된 TP ≥ 50%)으로 분류했다. 마지막으로, 종양 샘플에 대한 WIND-MSICare(정상 DNA를 포함하지 않음(Without Including Normal DNA)) 점수는 이 접근법을 사용하여 분석된 총 현미부수체 수 중에서 돌연변이된 현미부수체의 백분율에 상응한다.

이 방법은 C4 코호트의 환자 종양(고형 샘플) 및 전이성 CRC를 나타내는 4명의 환자의 파일럿(C7)의 액체 생검(ctDNA)에 또한 적용되었다. 이 마지막 코호트는 MSIDIAG 패널을 사용하여 서열분석되었으며, 판독치는 분석을 가장 민감하도록 하기 위해 3000배에서 5000배 사이로 구성된 커버리지 깊이로 인간 게놈 빌드(hg38)에 매핑되었다.

결과

mCRC 및 nmCRC 모두에서 MSISensor에 의한 MSI의 빈번한 오진

C1 및 C2의 모든 CRC 샘플은 펜타플렉스 PCR 및 IHC의 금표준 참조 방법을 사용하여 MSI 및 dMMR 상태에 대해 중앙 재평가했다(도 1). MSISensor는 전향적 C1 코호트에서 77건의 MSS/pMMR mCRC의 상태를 확인했다(도 1 및 도 2a; MSISensor 점수 ≤ 10%). 그러나, 25개의 MSI/dMMR mCRC 샘플 중 4개의 상태는 확인하지 못했다(도 2a; MSISensor 점수 ≤ 10%). 따라서, C1의 오진 빈도는 16%였다(N = 4/25, 민감도 84%, 95%CI: 69%-99%).

후향적 C2 코호트에서 MSI/dMMR이 있는 25명의 mCRC 환자에서 MSISensor의 민감도가 추가로 평가되었다(도 1). mCRC에서, 오진 빈도는 32%로 훨씬 더 높았다(N = 8/25, 32%; 민감도 68%, 95%CI: 49.3%-86.7%)(도 2b). C2 코호트의 MSI/dMMR를 갖는 88명의 nmCRC 환자에서, 오진은 9%로 발생했다(N = 8/88, 9%; 민감도 91%, 95%CI: 85%-97%)(도 2b). MSISensor의 유사한 성능은 MSK-IMPACTTM으로 관찰되었다(상세한 내용은 재료 및 방법 참조). MSI/dMMR CRC 중에서 검출된 전반적인 거짓 음성 사례의 수는 MSISensor 점수를 결정하는 데 사용된 MSK 패널의 3가지 버전 모두에 대해 매우 유사했다(데이터는 표시되지 않음). MSISensor의 민감도는 nmCRC와 mCRC가 모두 포함된 CRC 환자의 공개 C3 코호트에서 또한 평가되었다(도 1). 누락된 진단 빈도는 9.8%(N = 5/51)로 다시 매우 유사했으며, MSI/dMMR CRC 환자에서 90%(95%CI: 82%-98%)의 민감도를 제공하였다. 이는 mCRC의 하나의 오진 사례(1/3, 33%)를 포함하였다(도 2c). MSISensor는 C3으로부터 2건의 MSS/pMMR mCRC의 상태를 제외한 모든 상태를 확인했으며, 따라서 이 방법의 주요 한계가 민감도의 부족임을 나타낸다. C2 및 C3 코호트와 비교하여 C1 코호트에서 MSISensor의 전반적인 성능은 표 1A에 제시되어 있다.

CRC에서 DNA 반복의 MSI 게놈 신호를 해독함으로써 MSISensor의 약점 및 한계의 식별

이 연구에서 분석된 3개의 환자 코호트에 대한 MSISensor 점수의 변동을 보여주기 위해 밀도 플롯을 생성하였다(도 3). 코호트 C1 및 C2의 모든 샘플의 MSI/dMMR 및 MSS/pMMR 상태는 이전에 중앙에서 검증되었기 때문에 풀링시켰다. 공개 코호트 C3의 CRC 샘플은 본 발명자들이 IHC 및 MSI-PCR을 사용하여 이러한 종양의 상태를 독립적으로 확인할 수 없었기 때문에 별도로 고려되었다. 밀도 프로파일은 3개의 코호트에 대해 이미 상기 표시된 바와 같이 dMMR CRC에서 MSI 검출에 대한 MSISensor의 민감도 부족을 명백하게 강조한다(도 2 및 표 1).

본 발명자들은 다음으로 NGS 데이터 분석에서 특정 매개변수를 수정하여 CRC에서 MSI 검출을 개선할 수 있어야 한다는 가설을 세웠다. 이를 뒷받침하기 위해, WES 분석은 MSISensor가 다음과 같은 이유로 민감도가 부족했음을 나타냈다: (i) MNR 서열은 지금까지 dMMR 결장 종양에서 가장 불안정한 범주의 현미부수체였으며, 따라서 MSISensor에 의해 사용된 다른 유형의 반복(예: 디-, 트리-, 테트라-, 펜타-)보다 MSI와 MSS CRC를 더 잘 구별할 수 있었고(도 6a); (ii) MSS와 MSI 결장 종양을 구별하는 MNR의 능력은 길이에 따라 달라졌으며, 12bp 이상의 긴 MNR이 MSISensor에 의해 사용된 다른 현미부수체와 비교하여 가장 변별력이 높은 것으로 밝혀졌고(도 6b); (iii) MSISensor는 추정된 TP가 30 내지 40% 미만인 CRC 샘플에서 MSI를 검출하는 데 적합하지 않았다. 이는, 종종 비종양 및 염증성 pMMR/MSS 세포에 의한 높은 오염 수준으로 인해, 원발성 MSI CRC에서 MSISensor의 민감도에 대한 중요한 제한이다(도 7)(또한 본 리뷰(24) 및 추가 상세함을 위해 원본 간행물 14, 15, 21, 23, 25 참조). WES 분석은 또한 MSISensor가 두 가지 이유로 특이성이 부족하다는 것을 나타냈다. 첫째, MSISensor 계산 도구는 일부 MNR에 대해 진정한 MSI 신호와 대립유전자 손실(LOH)을 혼동했다. LOH는 높은 수준의 염색체 불안정성을 갖는 MSS 결장 종양에서 자주 발생한다(도 8a). 둘째, PCR 반응 중 DNA 중합 효소에 의한 말더듬(stuttering)은 현미부수체, 특히 긴 MNR에서 자주 발생한다. 따라서, MSI의 오진은 이러한 현미부수체에서 작은 1bp 결실이 MSISensor에 의해 MSI를 나타내는 것으로 간주될 때 발생할 수 있다(도 8b).

CRC에서 MSI의 NGS 기반 검출을 개선하기 위한 MSICare의 설계 및 검증

위에서 언급한 MSISensor의 위험을 피하기 위해, 본 발명자들은 다음으로 WES 프로파일 분석을 기반으로 CRC에서 MSI를 정확하게 검출하기 위해 MSICare로서 지칭되는 새로운 계산 도구를 설계했다. MSISensor와 대조적으로, MSICare는 쌍을 이룬 정상 조직의 DNA에서가 아니라 dMMR 암의 DNA에서 긴 MNR(≥ 12bp)에서 발생하는 적어도 2bp 길이의 체세포 결실로서 정의되는 진정한 MSI 신호를 식별한다(추가 상세한 내용은 재료 및 방법 참조). 수신기 작동 특성(ROC) 곡선은 MSICare 점수의 이진 분류를 가정하여 작제되었다. 이는 20%의 컷오프 값을 사용할 때 100% 민감도 및 100% 특이성으로 C1 및 C2에서 dMMR과 pMMR CRC 사이의 완벽한 구별을 나타냈다(도 4a 및 데이터는 표시되지 않음). dMMR/MSI 샘플은 이 값에 대한 분산이 거의 없는 80% 이상의 평균 MSICare 점수을 나타낸 반면, pMMR/MSS 샘플의 평균 MSICare 점수는 10% 미만이었다. 따라서, MSICare는 MSI를 MSS CRC 사례와 구별하는 데 매우 효과적인 것으로 보인다. 컷오프 값 20%를 사용하여 달성된 높은 수준의 차별은 공개 C3 코호트(도 4b 오른쪽 패널)에서 검증되었으며, MSISensor로 거짓 음성 상태를 나타낸 진성 MSI였던 5건 중 3건을 수정하도록 유도했다. 흥미롭게도, 이전에 TCGA에 따라 PCR에 의해 MSI로 분류되었던 음성 MSISensor 상태를 갖는 나머지 두 개의 CRC 샘플은 MSICare로 명확하게 MSS로 유지되었다. 이들 종양 모두의 엑솜 프로파일의 상세한 분석은 공지된 MSI 표적 유전자의 코딩 영역 내에 위치된 현미부수체의 돌연변이가 거의 없음을 보여주었다(데이터는 표시되지 않음). 또한, 샘플 중 하나는 TCGA에 따라 pMMR을 나타내었으며, 이는 모호한 MSI 상태를 시사한다. C2 및 C3 코호트와 비교하여 C1 코호트에서 MSICare의 전반적인 성능은 표 1B에 제시되어 있다.

본 발명자들은 종양의 dMMR 결함의 특성을 고려하여 MSICare의 성능을 분석한다. 결과는 이 테스트의 민감도가 이 코호트의 MSH6 결핍 또는 PMS2 결핍 결장 종양에서 최적으로 유지됨을 나타낸다(민감도 100%).

MSICare는 위 및 자궁내막 종양에서 MSI를 검출하는 데 MSISensor보다 더 우수한 성능을 가질 수 있다

MSI의 검출을 위한 MSISensor의 성능은 MSI 표현형을 자주 나타내는 두 가지 다른 원발성 암 유형, 즉 위암(GC)과 자궁내막암(EC)에서 평가되었다. TCGA의 GC 및 EC에 대한 이용 가능한 WES 데이터의 조사는 MSI의 검출에서 MSISensor와 비교하여 MSICare의 경우 훨씬 더 우수한 성능을 나타냈다(도 5a 및 b, 표 1B).

표적 NGS를 사용하여 CRC에서 MSI를 검출하는 데 있어서 MSICare의 성능 확인

WES는 임상 치료에서 일상적으로 사용되지 않기 때문에, 본 발명자들은 최종적으로 쌍을 이룬 정상 점막 샘플과 비교하여 CRC 샘플의 표적 서열분석 후 MSI를 검출하기 위한 MSICare의 높은 성능을 확인하는 것을 목표로 했다. 이는 제한된 MSK-IMPACTTM 유전자 패널에 포함된 현미부수체만을 고려하여 C1과 C2에서 먼저 수행되었다(상세한 내용은 재료 및 방법 참조). 이러한 조건하에 이들 코호트의 MSI/dMMR 중에서 검출된 전체 거짓 음성 사례의 수는 MSK-IMPACTTM의 3가지 버전 모두에 대해 MSISensor, 특히 MSH6 및 PMS2 결핍 설정(민감도 28.6%, 95%CI: 4.9%-62%)에서 중요했다(도 9a). 대조적으로, MSICare의 성능은 동일한 조건하(민감도 100%)에 최적으로 유지되었다(도 9b).

다음으로, 본 발명자들은 MSIDIAG로 칭명되는 441개의 모노뉴클레오티드 반복의 최적으로 설계된 패널(길이≥ 12 pb 및 MSI 종양에서 불안정; 상세한 내용은 방법 참조)을 생성했다. 이 패널을 사용하여, 본 발명자들은 152명의 환자(MSI 137명, MSS 15명)를 포함하고 MSH6(35명) 또는 PMS2(9명) 결핍이 있는 CRC가 풍부한 C4 코호트에서, MSICare는 MMR 결함과 관계없이 CRC에서 여전히 최적으로 MSI를 검출한 반면(민감도 99.3%, 95%CI: 97.8%-100.7%; 특이성 100%)(도 9C), MSISensor는 예상대로 비특이적이 되는 동안 덜 민감하게 유지되었다(민감도 97.1%, 95%CI: 92.7%-99.2%; 특이성 73.3%, 95%CI: 44.9%-92.2%)(도 10).

범암에서 DNA 복구 결함 징후를 보이는 환자에 대한 MSICare와 MSIsensor 의 비교 분석

MMR, MMR/POLE 또는 POLE와 관련된 돌연변이 징후를 나타내는 34명의 TCGA 범암 환자 중, 22/34명은 MSICare에 의해 MSI로 식별된 반면(데이터는 표시되지 않음), 14/34명은 MSIsensor에 의해 MSI로 식별되었다(데이터는 표시되지 않음). 유방 침윤성 암종(BRCA)과 식도 암종(CESC)에서, MMR 돌연변이 징후가 있는 모든 환자는 MSICare에 의해 MSI로 분류되고, POLE 징후가 있는 환자는 MSS로 식별된다(데이터는 표시되지 않음). MSI센서를 사용하면, 이러한 두 가지 암 유형에서 MSS로 식별된 환자 5/7명(MSI센서 점수 <10)은 MMR 돌연변이 징후를 나타내고, 2/7명은 POLE 징후를 나타낸다(데이터는 표시되지 않음). 이는 MSICare 결과가 유방 침윤성 및 식도 암종에서 MMR 돌연변이 징후와 잘 연관되는 것으로 보인다는 것을 시사한다.

MSICare를 사용하여 뇌종양에서 MSI 수준의 평가

뇌종양 환자의 경우, 현미부수체 불안정성 수준이 MSICare를 사용한 MMR 능숙 뇌종양 샘플(n = 8)에서보다 CMMRD(n = 4), LYNCH(n = 3) 및 post_TMZ(n = 17) MMR 결핍 뇌종양 샘플에서 더 높은 반면, 이는 MSISensor를 사용하는 경우에서는 그렇지 않았음을 관찰했다(도 11). 이러한 결과는 MSIcare가 뇌종양에서 MSI를 진단하는 데 사용될 수 있음을 시사한다. 그러나, 예상대로, MSI/dMMR 뇌종양 샘플이, 예를 들어, MSI CRC과 비교하여 경미한 MSI 표현형을 나타냈기 때문에 최적의 컷오프 값을 정의하기 위해서 추가 실험이 필요하다(본 발명자들은 MSI PCR이 뇌종양에서 MSI를 검출할 수 없음을 상기시킨다).

CRC 정상 샘플이 없는 고형 종양에서 MSIcare 진단

정상 DNA와 일치하는 것을 참조하지 않는 MSICare 방법을 적용하여 C4 코호트의 일련의 128개 결장직장 샘플에서 MSI를 검출했으며, 각각 IHC 및 PCR MSI를 사용하여 이 중 108개는 MMRd/MSI였고, 20개는 MMRp/MSS였다. 모든 샘플은 이 접근법을 사용하여 올바르게 분류되었으며(도 12), 이는 이 새로운 버전의 MSICare, 즉 WIND-MSICare가 CRC에서 MSI를 검출하는 데 MSICare만큼 민감할 수 있다는 점을 강조한다. 범암에서 WIND-MSICare의 성능을 조사하기 위한 추가 실험이 진행 중이다.

종양 순환 DNA에서 MSIcare 진단

전이성 CRC 환자의 혈액에서 추출된 순환 종양 DNA에서 MSI를 검출하기 위해 WIND-MSICare를 다시 테스트했다(MSI 3건, MSS 1건). 이 파일럿 연구에서, 이 알고리즘은 ICI 요법을 받기 전에 MSI CRC 환자의 3개의 샘플에서 MSI를 검출할 수 있었다(도 13). 대조적으로, 그것은 예상대로 MSS CRC 환자에서 MSI를 검출하지 못했으며, ICI 요법을 받은 후 MSI CRC 환자의 3개의 샘플에서도 MSI를 검출하지 못했다(도 13). 비록 그들은 소규모의 일련의 환자에 대해서만 수득되었지만, 이러한 결과는 WIND-MSICare가 MSI CRC 환자의 혈장에서 MSI를 검출하는 데 이용 가능할 수 있음을 나타낸다. 비전이성 MSI CRC 환자 및/또는 전이성 또는 비전이성 비결장직장암 환자에서의 성능을 조사하기 위해서는 추가 결과가 필요하다.

결론

최근 여러 간행물은 뚜렷한 계산 알고리즘을 사용하여 인간 암에서 MSI를 검출하기 위한 NGS의 잠재력을 강조했다(18, 19, 26-29). 이 중, MSISensor는 FDA 승인을 받았으며, 종양의 원발성 위치에 관계없이 전이성 암 환자에서 ICI 요법의 처방을 안내하는 데 사용된다. MSISensor는 다수의 CRC를 포함한 진행성 고형암에 대해 테스트되었다. 그러나, 이 NGS 기반 테스트의 성능은 이전에 참조 PCR 및 IHC 방법을 사용하여 MSI/dMMR 상태에 대해 평가된 대규모의 CRC 시리즈에서는 아직 평가되지 않았다. MSISensor의 정확도는 MSI/dMMR mCRC로 간주되어 이후 ICI로 치료받은 환자에게 특히 중요하다. 이 연구에서, 발명자들은 MSISensor가 MSI의 검출에 대한 민감도가 부족하다는 명확한 증거를 제공한다. 이는 이전에 대규모 전문 테스트 센터에서 수행된 IHC 및 MSI-PCR 방법에 의해 MSI/dMMR 또는 MSS/pMMR로 확인된 mCRC 및 nmCRC 샘플의 대규모 코호트에서 나타났다. 이러한 결과는 ICI 요법에 대한 특별한 임상적 관련성이 있다. 그들은 MSI mCRC 환자의 전향적 코호트에서 MSI-PCR 및 IHC 테스트의 부재하에 MSISensor 단독의 결과를 고려하면 환자의 약 16%(4/25)가 ICI 치료를 받지 못했을 것이라고 강조한다. MSISensor에 의해 검출되지 않은 환자 4명 중 3명은 치료에 반응성인 것으로 확인되었다. 여기 대규모 후향적 환자 코호트에서 볼 수 있듯이, nmCRC에서 MSI를 검출하기 위한 민감도의 부족은 또한 린치 증후군의 검출 실패와 같은 다른 불리한 임상적 결과를 가질 수 있다. 이러한 발견으로부터, 그들은 CRC에서 MSI를 식별하기 위한 NGS 기반 기준을 시급히 변경할 필요가 있다고 결론지었다. CRC 환자의 본 결과는 ICK 차단 요법에 대해 장기간 양성 반응을 나타낸 2명의 전립선암 환자의 dMMR 종양에서 NGS가 MSI를 검출할 수 없었다는 것을 발견한 또 다른 연구 결과와 일치한다(30). 두 종양 모두 CD3 세포에 의한 높은 돌연변이 부담과 고밀도의 종양내 침윤을 나타냈다. 따라서, 그들은 TCGA의 위 및 자궁내막 종양의 본 연구에서 분석에 의해 또한 시사된 바와 같이 MSI의 검출를 위한 MSISensor의 낮은 민감도가 모든 종양 유형에 적용될 가능성이 있다고 추정한다.

MSI의 검출을 위해 여기에 제안된 새로운 MSICare 생물정보학 도구는 MSISensor와 비교하여 훨씬 더 나은 성능을 보여준다. 그것은 여기서 테스트된 CRC 코호트에서 PCR-MSI와 비교하여 100%의 민감도와 특이성을 갖고, 따라서 금표준 IHC 및 MSI-PCR 방법의 성능과 일치한다. 중요하게는, 그것은 MSISensor에 의해 처음에는 검출되지 않았던 4개의 mCRC에서 MSI를 검출했으며, 이 중 3개는 면역 요법에 대해 양성 반응을 나타냈다. 임상 종양학에서 MSI의 분석을 위한 전문 센터로서, 그들은 이 바이오 분석 도구를 최적화하여 종양 DNA에서 MSI 검출이 특이적으로 유지하면서 매우 민감하도록 했다. MSICare의 사용은 기질 조직으로 고도로 오염된 CRC에서 MSI를 진단할 수 있도록 하고, 이는 MSI 원발성 종양에서 흔한 사례이다. 참고로, 이 새로운 알고리즘은 MLH1, MSH2, MSH6 또는 PMS2의 1차 MMR 결함에 관계없이 FFPE 및 냉동 원발성 또는 전이성 조직 샘플 모두에 대해 동일한 성능을 나타내고, 이는 어느 하나의 조직 물질이 분석에 적합할 수 있음을 시사한다.

특히, MSISensor와 대조적으로, MSI 진단이 더 어려운 MSH6 결핍 CRC 및 희귀한 PMS2 결핍 CRC에서 MSI를 식별하는 데 관련성이 있는 것으로 확인되었다. 중요하게는, 그리고 다시 MSISensor와 대조적으로, MSI 평가 성능은, 마커의 MSK-ImpactTM 패널로 제한된 전체 또는 부분 엑솜 데이터로 테스트되었을 때, 최적으로 유지되었다. MSICare는 또한 종양 샘플(MSIDIAG)의 표적 서열분석 후 최적으로 설계된 현미부수체 마커 세트로 활용했을 때 뛰어난 성능을 나타냈다. 독립적 CRC 시리즈에서 다양한 서열분석 전략으로 MSI를 검출하는 MSICare의 뛰어난 진단 성능은 CRC에서 MSI를 검출하는 이 방법의 관련성을 높은 수준의 증거로 검증한다. MSIDIAG 패널은 종양 DNA에서 MSI를 검출하는 데 특히 관심이 있는 모노뉴클레오티드 반복을 포함하고, 따라서 이 검정의 최적의 민감도를 위해 표적 서열분석 분석에서 MSICare와 함께 이 패널을 사용할 것이 권장된다. 요약하면, 이러한 데이터는 MSICare가 자체 제작 또는 FDA 승인 패널을 사용하여 WES 또는 표적 NGS에서 CRC의 MSI 표현형을 결정하기 위한 새로운 NGS 기반 국제 참조 방법이 될 가능성을 갖는다는 것을 확립한다. 특히, MSI가 전이성 환경에서 필수적인 테라노스틱 바이오마커가 되고 있기 때문에, 번역 연구, 임상 시험 및 CRC 환자 관리의 일상적 임상 실습에 매우 유용해져야 한다.

요약하면, MSICare는 특히 MSI가 전이성 환경에서 필수적인 테라노스틱 바이오마커가 되고 있기 때문에, CRC 환자 및 기타 암의 관리의 일상적 임상 실습에 매우 유용할 것이다.

참고 문헌:

본 출원 전반에 걸쳐, 다양한 참고 문헌은 본 발명이 속하는 당해 기술 상태를 기재한다. 이러한 참고 문헌의 개시내용은 본 개시내용에 참조로 포함된다.

Claims (8)

1. i) 종양 샘플로부터, 그리고 가능한 경우 이를 필요로 하는 환자로부터 수득된 정상 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계, ii) 상기 환자의 정상 샘플의 DNA에서 적어도 12개의 핵산 길이를 갖는 모노뉴클레오티드 반복(mononucleotide repeats; MNR) 서열의 수(N) 및 상기 환자의 종양 샘플(tumoral sample)의 DNA에서 상응하는 MNR을 서열분석(sequencing)하거나, 종양 샘플에서 모노뉴클레오티드 반복(MNR)의 수(N) 및 상응하는 정상 샘플에서 적어도 12개의 핵산 길이를 갖는 것을 서열분석하는 단계; iii) 정상 샘플의 이용 가능 여부에 따른 각 MNR에 대한 △비율을 계산하는 단계, iv) 종양 샘플에 대한 종양 순도(tumor purity; TP)를 계산하는 단계, v) 조정된 △비율을 계산하는 단계, vi) MNR의 △비율의 총 수에 대한 조정된 △비율이 돌연변이된(mutated) MNR의 수의 비율을 수행함으로써 MSICare 점수를 수득하는 단계, 및 vii) 단계 vi)에서 수득된 MSICare 점수가 계산된 임계값(threshold value)보다 우수할 때 이를 필요로 하는 환자가 MSI 암에 걸린 것으로 결론을 내리는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 MSI 암을 진단하는 방법.
2. 제1항에 있어서, i) 이를 필요로 하는 환자로부터 수득된 종양 및 정상 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계, ii) 상기 환자의 정상 샘플의 DNA에서 적어도 12개의 핵산 길이를 갖는 모노뉴클레오티드 반복(MNR) 서열의 수(N) 및 상기 환자의 종양 샘플의 DNA에서 상응하는 MNR을 서열분석하는 단계, iii) 각 MNR에 대한 △비율을 계산하는 단계, iv) 종양 샘플에 대한 종양 순도(TP)를 계산하는 단계, v) 조정된 △비율을 계산하는 단계, vi) MNR의 △비율의 총 수에 대한 조정된 △비율이 돌연변이된 MNR의 수의 비율을 수행함으로써 MSICare 점수를 수득하는 단계, 및 vii) 단계 vi)에서 수득된 MSICare 점수가 계산된 임계값보다 우수할 때 이를 필요로 하는 환자가 MSI 암에 걸린 것으로 결론을 내리는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 MSI 암을 진단하는 방법.
3. 제1항에 있어서, i) 이를 필요로 하는 환자로부터 수득된 종양 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계, ii) 종양 샘플에서 모노뉴클레오티드 반복(MNR)의 수(N) 및 상응하는 정상 샘플에서 적어도 12개의 핵산 길이를 갖는 것을 서열분석하는 단계, iii) MNR에 대한 정상 다형성 영역(normal polymorphic zone)을 평가하는 단계, iv) 각 MNR의 정상 다형성 영역 외부에서만 종양 샘플에 나타나는 돌연변이된 MNR을 평가하는 단계, v) 종양 샘플로부터 수득된 각 MNR에 대한 △비율을 계산하는 단계, vi) 종양 샘플에 대한 종양 순도(TP)를 계산하는 단계, vii) 조정된 △비율을 계산하는 단계, viii) MNR의 △비율의 총 수에 대한 조정된 △비율이 돌연변이된 MNR 수의 비율을 수행함으로써 MSICare 점수를 수득하는 단계, 및 ix) 단계 viii)에서 수득된 MSICare 점수가 계산된 임계값보다 우수할 때 이를 필요로 하는 환자가 MSI 암에 걸린 것으로 결론 내리는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 MSI 암을 진단하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 전이성(metastatic)이거나 전이성이 아닌, 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 결장직장암(colorectal cancer), 위암(gastric cancer) 또는 자궁내막암(endometrial cancer)인, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결과를 환자에게 전달하는 추가 단계가 첨가되는, 방법.
7. i) 이를 필요로 하는 환자로부터 수득된 종양 및 정상 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계, ii) 상기 환자의 정상 샘플의 DNA에서 적어도 12개의 핵산 길이를 갖는 모노뉴클레오티드 반복(MNR) 서열의 수(N) 및 상기 환자의 종양 샘플의 DNA에서 상응하는 MNR을 서열분석하는 단계, iii) 각 MNR에 대한 △비율을 계산하는 단계, iv) 종양 샘플에 대한 종양 순도(TP)를 계산하는 단계, v) 조정된 △비율을 계산하는 단계, 및 vi) 조정된 △비율이 50% 미만일 때 MNR이 야생형이라고 결론 내리고, 조정된 △비율이 50% 이상일 때 MNR이 돌연변이된다고 결론을 내리는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 MNR의 돌연변이를 진단하는 방법.
8. 이를 필요로 하는 환자에게 치료적 유효량의 방사선 요법(radiotherapy), 화학 요법(chemotherapy), 면역 요법(immunotherapy) 또는 이들의 조합을 투여하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제6항의 방법에 따라 MSI 암을 갖는 것으로 식별된 환자의 암을 치료하기 위한 방법.