TW202006360A - 評估罹癌個體是否適用抗癌藥物的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明揭露一種評估罹癌個體是否適用抗癌藥物的方法，其中抗癌藥物為週期蛋白依賴型激酶抑制劑(CDK inhibitor)，方法包括：(1)以活體外檢測罹癌個體的活體外樣本的第一基因的拷貝數及第二基因的拷貝數，藉此分別得出第一基因拷貝數變異值(CNV)與第二基因拷貝數變異值，由第一基因拷貝數變異值及第二基因拷貝數變異值得出拷貝變異數比值(CNV比值=CNV第一基因/CNV第二基因)。其中第一基因可轉譯出「細胞週期素」(cyclin)，且第二基因可轉譯出「週期蛋白依賴型激酶抑制蛋白」(cyclin dependent kinase inhibitor，CDKN)。以及(2)由拷貝變異數比值評估罹癌個體是否適用CDK抑制劑。

Description

評估罹癌個體是否適用抗癌藥物的方法
本發明是關於一種血漿中基因拷貝數變異的生物標誌，特別關於一種將血漿中基因拷貝數變異作為生物標誌用於對鼻咽癌和其它癌症用藥指引。
目前已知正常人類體細胞內染色體皆為雙套(diploid)，除了性染色體上的基因，其它對偶基因其的拷貝數(copy number)應為二。但在癌細胞中，某些基因的拷貝數會有擴增(amplification)(拷貝數大於2)或缺失(deletion)(拷貝數小於<2)的現象。
癌細胞的重要特徵是不斷生長且不受調控，其原因之一是調控細胞週期的基因拷貝數變異(copy number variation，CNV)，癌細胞中常有CNV變異的基因，有促進細胞生長細胞週期素D1(cyclin D1，CCND1)基因的擴增和抑制細胞生長週期蛋白依賴型激酶抑制蛋白(cyclin dependent kinase inhibitor 2A/p16，CDKN2A/p16)基因的缺失。目前已知在癌症病人的周邊血可偵測到癌細胞的游離DNA(cell free DNA，cfDNA)，這些癌細胞的游離DNA往往帶有特定DNA的突變，因此可作為鑑別癌症的指標。
此外，目前已有主要用於轉移性乳癌的核准標靶藥物CDK抑制劑，針對於轉移性乳癌病患使用，以達抑制癌細胞生長。然而，這些藥物並非對每個癌症患者都具有抑制癌細胞生長的功效。
因此，現仍亟需精準及快速篩選適合使用此類癌症標靶藥物 的患者，以作為CDK抑制劑藥物精準的個人用藥建議評估的方法。故而，如何在施用CDK抑制劑之前，透過癌症患者的活體外樣本，篩選適用此藥物的患者，以避免治療效果受限或耗費患者時間及金錢，已成為重要的課題之一。
有鑒於上述課題，本發明之目的在於發展出評估癌症病患是否適合使用標靶藥物的方法。本發明的方法用於檢測癌症病患活體外樣本，以分別偵測CCND1基因和CDKN2A基因的基因拷貝數變異(copy number variation，CNV)，進而計算CCND1基因和CDKN2A基因的「CNV比值」，用CNV比值作為評估癌細胞的細胞週期的調控是否有問題，用來評估許可之癌症標靶藥物，例如「抑制細胞週期藥物」(cell cycle inhibitors)是否適合用於此癌症病患。
於是本發明提供一種評估一罹癌個體是否適用一抗癌藥物的方法，其中抗癌藥物為一「週期蛋白依賴型激酶抑制劑」(CDK inhibitor)，方法包括：於活體外檢測罹癌個體的一活體外樣本中的一第一基因的拷貝數及一第二基因的拷貝數，藉此分別得出一第一基因拷貝數變異值與一第二基因拷貝數變異值，由第一基因拷貝數變異值及第二基因拷貝數變異值得出一拷貝變異數比值，其中第一基因可轉譯一「細胞週期素」(cyclin)，且第二基因可轉譯一「週期蛋白依賴型激酶抑制蛋白」(cyclin dependent kinase inhibitor，CDKN)；以及由拷貝變異數比值評估罹癌個體是否適用CDK抑制劑。
在一實施例中，罹癌個體係罹患乳癌、食道癌(esophageal squamous-cell carcinoma，ESCC)、肝癌(HCC)、肺腺癌、黑色素癌(melanoma)、大腸癌(colon cancer)、攝護腺癌(prostate cancer)、卵巢癌(ovary cancer)、腎臟癌(kidney cancer)、或白血病(leukemia)。
在一實施例中，細胞週期素為一G1期的細胞週期素。
在一實施例中，細胞週期素為Cyclin D。
在一實施例中，第一基因為CCND1。
在一實施例中，週期蛋白依賴型激酶抑制蛋白為一G1期或一S期的週期蛋白依賴型激酶抑制蛋白。
在一實施例中，第二基因為CDKN2A或CDKN2B。
在一實施例中，第一基因為CCND1，且第二基因為CDKN2A。
在一實施例中，抗癌藥物為週期蛋白依賴型激酶4/6抑制劑(CDK 4/6 inhibitor)。
在一實施例中，抗癌藥物為帕博西尼(palbociclib)、ribocilib、或abemaciclib。
在一實施例中，當拷貝變異數比值大於4時，則認定罹癌個體為適用抗癌藥物。
在一實施例中，於活體外檢測第一基因及第二基因各自的拷貝數，係經由一定量聚合酶連鎖反應(Q-PCR)來進行。
在一實施例中，活體外樣本為一癌組織樣本或一血液樣本。
在一實施例中，活體外樣本為血液樣本中的一游離DNA(cell free DNA，cfDNA)。
在一實施例中，罹癌個體係罹患鼻咽癌(nasopharynx cancer，NPC)，且該方法進一步包括於活體外檢測罹癌個體的一鼻咽癌EB病毒量之一步驟，且罹癌個體是否適用抗癌藥物是根據拷貝變異數比值與鼻咽癌EB病毒量來共同評估。
在一實施例中，第一基因為CCND1。
在一實施例中，第二基因為CDKN2A或CDKN2B。
在一實施例中，第一基因為CCND1，且第二基因為CDKN2A。
在一實施例中，抗癌藥物為週期蛋白依賴型激酶4/6抑制劑(CDK 4/6 inhibitor)。
在一實施例中，抗癌藥物為帕博西尼(palbociclib)、ribocilib、或abemaciclib。
在一實施例中，當鼻咽癌病毒量大於5000顆/毫升且拷貝變 異數比值大於4時，則認定罹癌個體為適用抗癌藥物。
在一實施例中，活體外樣本為一癌組織樣本或一血液樣本。
在一實施例中，活體外樣本為血液樣本中的一游離DNA(cfDNA)。
綜上所述，本發明方法的功效在於：提供一個可以評估癌症病人是否適合使用癌症標靶藥物的方法。本發明透過萃取患者活體外樣本，並以簡單、快速的基因分析方法測定CCND1基因和CDKN2A基因的CNV比值。用來作為癌症標靶藥物個人精準用藥建議參考。由於這些標靶藥物價格昂貴，醫師可透過本發明的方法快速篩選合適的病人(例如CNV比值高)，作為建議用藥的輔助依據。
S01~S04、S03’‧‧‧步驟
圖1A為本發明評估罹癌個體是否適用抗癌藥物的方法的第一實施例的流程圖。
圖1B為本發明評估罹癌個體是否適用抗癌藥物的方法的第二實施例的流程圖。
圖2A及2B為5個轉移性NPC-PDX腫瘤的單核苷酸變異(SNV)。圖2A中列出了從定序數據中鑑定的5種NPC-PDX腫瘤的體細胞突變(包括非同義誤義和剪接點突變)，每個柱狀圖上方的數字代表鹼基置換的數量。圖2B對於282個SNV，指出每個鹼基置換的百分比。
圖3A至3D為NPC-PDX腫瘤中的基因改變。圖3A：NPC-PDX腫瘤與相應患者的周邊血單核球細胞(PBMC)的拷貝數變異(CNV)，四種配對的PDX腫瘤樣品(ST，LN，LG和LV)中的全基因體CNV改變，向左下的箭頭指出CCND1 CNV增加，向左上的箭頭指出CDKN2A CNV缺失。圖3B具有骨頭轉移的親代NPC腫瘤及其衍生的NPC-PDX的HE和EB病毒編碼的小RNA(EBER)染色結果。圖3C顯示基於WES和圖3D顯示基於癌症基因組Cancer panel CP-409的超深度定序(ultra-deep sequencing)的NPC FFPE-骨頭和PDX-骨頭的CNV圖譜比較(與拷貝數改變有關或不相 關的基因分別以不同的顏色或以灰色表示)。每個評估位置觀察到的拷貝數在y軸上顯示為log2量表。相關性圖與Pearson相關係數r表示兩個CNV特徵之間的相似性。
圖4A至4C為CP-409 FFPE-LN和PDX-LN之間的CNV概況比較。基於CP-409的超深度定序的NPC(圖4A)FFPE-LN和(圖4B)PDX-LN的CNV圖譜。每個評估位置觀察到的拷貝數在y軸上顯示為log2量表。與拷貝數改變相關或不相關的基因分別用不同的顏色或灰色表示。圖4C指出了相關性圖與Pearson相關係數r。
圖5A至5D為鼻咽癌患者和PDX腫瘤的CCND1 mRNA表現和IHC染色結果。圖5A為基於5種PDX組織、C666-1(EBV陽性NPC細胞)和NP69(不朽化正常鼻咽細胞，作為對照組細胞株)的cDNA微陣列數據，顯示候選基因(CCND1，CDKN2A和CDKN2B)的表現倍數變化。圖5B顯示在PBMC，兩個NPC細胞株和五個PDX(GAPDH作為內部對照組)中CCND1的RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖5C為鼻咽癌13號患者(鼻咽癌原發部位、鼻咽癌轉移至骨頭，PDX-骨頭腫瘤)和圖5D為鼻咽癌2號患者(鼻咽癌轉移至淋巴結，以及PDX-LN腫瘤)的組織IHC染色圖。
圖6A至6E為C666.1細胞和PDX-C666.1異種移植藥物篩選。圖6A顯示C666.1細胞藥物敏感性測試結果，圖6B至6D顯示PDX-C666.1異種移植物的藥物敏感性測試結果。圖6B指出了PDX-C666.1的腫瘤體積，圖6C顯示腫瘤重量(g)和圖6D顯示小鼠體重的變化。縮寫GSK為GSK126；DEC為帝希他濱；GEM為吉西他濱；PAL為帕博西尼。圖6E為在PAL(0、0.1、0.5和1μM)存在下C666.1細胞的流式細胞儀分析結果。
圖7A至7H為NPC-PDX藥物篩選。圖7A至7F顯示PDX-骨頭(NPC13-F4對應於來自第13號患者的骨頭轉移NPC腫瘤在第4代移植到NOD/SCID小鼠中)；圖7A及7B顯示對照組(DMSO)、GEM、PAL處理的小鼠大體的腫瘤，圖7C為腫瘤體積，圖7D為腫瘤重量，圖7E為小鼠體重變化和圖7F為細胞週期蛋白D1的IHC和EBER染色。圖7G至7H為PDX-LN(NPC02-F11對應於2號患者衍生的淋巴結轉移性NPC腫瘤在第 11代移植到NOD/SCID小鼠中)，圖7G腫瘤體積，圖7H腫瘤重量。縮寫GSK為GSK126；DEC為帝希他濱；GEM為吉西他濱；PAL為帕博西尼。
圖8A至8C為PDX-LN(NPC02F12)的藥物篩選結果。圖8A為PDX-LN的腫瘤體積；圖8B為腫瘤重量；和圖8C為在DMSO(對照組)，DEC(降低劑量)和PAL存在下小鼠的體重變化。縮寫DEC為帝希他濱；PAL為帕博西尼。
圖9A至9C為用不同藥物治療的NPC PDX-B中的基因表現。圖9A：暴露於5種藥物處理的NPC PDX-B中的九種細胞週期相關基因的RNA表現，上圖為基於原始標準化(reads per kilobase million，RPKM)RNA序列數據，中圖為用DMSO對照組標準化的倍數變化，下圖為在DMSO中的內部對照組GAPDH標準化的RT-PCR確效。圖9B：在NPC PDX-B組織中DMSO(對照組)，GEM、PAL和GEM+PAL處理後九種細胞週期相關蛋白的西方墨點法結果。圖9C：用不同濃度的GEM(0.1、1和10μM)和PAL(0.1、1和5μM)處理48小時後的C666-1細胞中，9種細胞週期相關蛋白的西方墨點法結果。
圖10A至10D為鼻咽癌血漿中細胞基因CNV與低EBV拷貝數的相關性。圖10A：具有低EBV病毒量(小於5,000拷貝數/毫升)的24個NPC血漿中CCND1，CDKN2A和RAD52的CNV的Q-PCR結果。圖10B：在24個NPC血漿中CCND1，CDKN2A和RAD52的CNV與log EBV DNA量(低拷貝數/毫升)之間的相關曲線。並指出Pearson’s相關係數r和指數回歸趨勢線。圖10C：從2002~2016年的血漿中，81例轉移性鼻咽癌患者的EBV拷貝數限值(cut off value)(5000拷貝數/毫升和10000拷貝數/毫升)的總體存活率。FFPE組織週期素D1免疫組織化學染色(2002~2016)的轉移性鼻咽癌患者的臨床特徵總結於表5(表5內容記載於後)。
圖11A至11C為22例NPC血漿中CCND1，CDKN2A和RAD52的CNV與高EBV拷貝數的相關性。圖11A：具有高EBVDNA量(大於5,000拷貝數/毫升)的22個NPC血漿中的CCND1，CDKN2A和RAD52的CNV)的Q-PCR結果。圖11B：22個NPC血漿樣品中CCND1，CDKN2A和RAD52的CNV與log EBV DNA量之間的相關圖。圖11C：22個NPC血漿中 CCND1/CDKN2A的CNV比值與log EBV病毒量之間的相關性。並指出Pearson’s相關係數r和指數回歸趨勢線。
圖12A至12E為Cyclin D1 IHC在轉移性鼻咽癌臨床樣本中的應用。圖12A：肝和肺轉移的鼻咽癌患者中的細胞週期素D1表現。NPC患者的Kaplan-Meier生存曲線根據細胞週期素D1 IHC染色中(圖12B)密度和(圖12C)陽性細胞百分比分類。患有T4N2M0(IVa期)的46歲鼻咽癌患者也是B型肝炎病毒帶原者，接受同步化學放射治療(concurrent chemoradiotherapy，CCRT)以控制局部疾病。9個月後檢測到肝轉移(細胞週期素D1染色，圖12A)，並進行了5種不同的緩和性化學治療。最後，患者在新加坡約翰斯霍普金斯醫學中心(Johns Hopkins Singapore International Medical Centre)接受palbociclib(PAL)作為挽救治療。圖12D：顯示患者臨床治療反應的血漿EBV DNA量在用PAL治療後降低。圖12E：顯示以2個月的間隔進行PAL治療之前和之後的全身腫瘤掃描，且顯示病況穩定。
以下將參照相關圖式，說明依本發明所提供的各種實施例，其中相同的元件將以相同的參照符號加以說明。
需先說明的是，本文所提及的任何文獻若係藉由引用方式提及，其係如同該些文獻各別且明文地被指明而使得該些文獻的內容納為本文揭露的一部分。當納入的參考文獻中術語的定義或用法與本文中提供之術語的定義相違背時，係以本文所提供之術語定義為準，而不採用該參考文獻中之術語的定義。
以下提供了本發明的多個實施例，雖然每個實施例都代表在某種可能的情況下本發明所揭露之元件的一種組合，但本發明仍應包括其所揭露之元件的所有可能的組合。因此，如果一個實施例包括元件A、B及C，而第二實施例包括元件B及D，即使未明確揭露，本發明應理解為仍包括A、B、C及/或D的其他種類的任意組合。
而在下述的某些實施例中，其中描述了用於表示成分的量、 特性(例如濃度、反應條件等等)的數值，其應理解為在一些情況下被用語「大約」加以修飾。因此，在某些實施例中，本說明書及所附之申請專利範圍中所記載的數值參數是近似值，其可依據特定實施例所試圖獲得之所需特性而改變。在某些實施例中，應根據所記載之有效位數的數字及應用一般的數值簡化技術來解釋數值參數。然而，即便在某些實施例中，其數值範圍及數值參數是近似值，但在具體實驗例中所提出的數值則是盡可能地精確記載。在本文中所記載的數值可能包含某些誤差，其係因於統計各個量測值而產生的標準差所導致。
除非本文另有規定，本文所提出的所有數值範圍應解釋為包含它們的端點，而開放式範圍應解釋為包含商業上可實施的數值。同樣地，除非本文另有規定，所有的數值列表應被認為包含其中間的數值。亦即，本文所提及的數值範圍僅意在作為一一指稱各個落在該範圍內的單獨數值的簡寫方法。除非另有說明，在範圍內的每個單獨數值皆被納為本說明書揭露之一部分，如同其於本文中一一被指稱。
本文所揭露之替代元件或實施例之群組不應解釋為本發明之限制。每個群組成員可被單獨地提及和要求保護，或者係以與該群組內其他成員或本文中其他元件任意結合的方式被提及和要求保護。基於便利性及/或專利性的理由，群組中之一個或多個成員可以納入在群組中或自群組中刪除。當發生任何前述之納入或刪除的情況時，說明書應被視為包括修改後之群組，從而滿足所附之申請專利範圍中使用的所有馬庫西式群組之書面說明要件。而說明書中的任何語詞即便未見於申請專利範圍中，但仍不應解釋為實施本發明的必要元素。
以下敘述提供了根據本發明的實施例應用在患者體外檢測基因拷貝數以評估罹癌個體是否適用CDK抑制劑的示例性方案。應理解的是，雖然該些方案列出單獨或組合之癌症、特定基因拷貝數及CDK抑制劑，但本發明的實施例可以提供具有相同或相似效果的各種替代的CDK抑制劑。此外，CDK抑制劑的選擇以根據患者年齡、癌症種類、癌症階段及整體健康狀況而改變。
術語「罹癌個體」、「患者」係指自罹患癌症的個體，癌症的 種類包含但不限於乳癌、食道癌(esophageal squamous-cell carcinoma，ESCC)、肝癌(HCC)、肺腺癌、黑色素癌(melanoma)、大腸癌(colon cancer)、攝護腺癌(prostate cancer)、卵巢癌(ovary cancer)、腎臟癌(kidney cancer)、或白血病(leukemia)。「個體」及「患者」可以互換使用且係指人類或非人類的哺乳動物或鳥類。非人類的哺乳動物包含，例如家畜及寵物，如綿羊、豬、犬科動物、貓科動物及鼠類哺乳動物。在某些實施例中，患者是人類。
術語「抗癌藥物」、「癌症標靶藥物」可以互換使用且係指自用於治療或處理罹癌個體的藥物，「抗癌藥物」的種類包含但不限於週期蛋白依賴型激酶抑制劑(CDK inhibitor)、帕博西尼(palbociclib)、ribocilib、abemaciclib、吉西他濱(Gemcitabine)、帝希他濱(decitabine)、GSK-12。
術語「活體外的生物樣本」係指自生物體所分離而出的生物材料，包含但不限於細胞、組織、器官等。舉例來說，其可為自動物體所分離出來的細胞，經原代培養(primary culture)後以利後續使用，或者亦可將其培養為細胞株(cell line)經適當保存後，以進行後續利用。
術語「拷貝數」係指生物體內某基因在基因體中的個數。舉例來說，已知正常人類體細胞內染色體皆為雙套(diploid)，對偶基因的拷貝數(copy number)應為2，而性染色體上的基因，拷貝數應為1。
術語「拷貝數變異值」係指生物體內某個基因在基因體中的個數發生變異的變異值，變異包含但不限於插入、缺失等。舉例來說，已知正常人類體細胞內染色體皆為雙套(diploid)，對偶基因的拷貝數(copy number)應為2，若發生缺失的變異，拷貝數會小於2，而原拷貝數與變異後拷貝數的差異即為拷貝數變異值。
術語「游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)」係指生物體內在細胞外呈現游離狀態且無細胞狀態的的DNA，廣泛存在於動植物及人類的血清、血漿、腦脊液、尿液、痰液或糞便等樣本當中。
術語「編碼」係指某基因(DNA)序列可透過轉錄作用轉錄為RNA，再經過「轉譯」，產生蛋白質。因此，「基因編碼」為某蛋白質係指該基因是可以「轉譯」為某蛋白質的基因序列。
本發明評估罹癌個體是否適用抗癌藥物的方法能依據罹癌個體的活體外樣本中的第一基因的拷貝數及第二基因的拷貝數，藉此分別得出第一基因拷貝數變異值與第二基因拷貝數變異值，由第一基因拷貝數變異值及第二基因拷貝數變異值得出拷貝變異數比值，進而由拷貝變異數比值評估罹癌個體是否適用CDK抑制劑。以下將以實施例來說明本發明評估罹癌個體是否適用抗癌藥物的方法。
請參照圖1A，其為本發明評估罹癌個體是否適用抗癌藥物的方法的第一實施例的流程圖。在本實施例中，抗癌藥物為一週期蛋白依賴型激酶抑制劑(CDK inhibitor)，方法包括以下步驟。步驟S01：於活體外檢測罹癌個體的一活體外樣本中的一第一基因的拷貝數及一第二基因的拷貝數，藉此分別得出一第一基因拷貝數變異值與一第二基因拷貝數變異值。步驟S02：由第一基因拷貝數變異值及第二基因拷貝數變異值得出一拷貝變異數比值，其中第一基因編碼有一細胞週期素(cyclin)，且第二基因編碼有一週期蛋白依賴型激酶抑制蛋白(cyclin dependent kinase inhibitor，CDKN)。以及步驟S03：由拷貝變異數比值評估罹癌個體是否適用CDK抑制劑。在本實施例中，抗癌藥物為週期蛋白依賴型激酶4/6抑制劑(CDK 4/6 inhibitor)，例如但不限於帕博西尼(palbociclib)、ribocilib、或abemaciclib。
在本實施例中，步驟S01是於活體外檢測罹癌個體的一活體外樣本中的一第一基因的拷貝數及一第二基因的拷貝數，藉此分別得出一第一基因拷貝數變異值與一第二基因拷貝數變異值。舉例而言，於活體外檢測第一基因及第二基因各自的拷貝數，係經由一定量聚合酶連鎖反應(Q-PCR)來進行。特別地，活體外檢測還包括但不限於PCR、NGS等本領域通常知識者熟知可用於檢測基因拷貝數的方法。罹癌個體係罹患乳癌、食道癌(esophageal squamous-cell carcinoma，ESCC)、肝癌(HCC)、肺腺癌、黑色素癌(melanoma)、大腸癌(colon cancer)、攝護腺癌(prostate cancer)、卵巢癌(ovary cancer)、腎臟癌(kidney cancer)、或白血病(leukemia)。特別地，此處的癌症種類用以舉例說明，而非對本發明的限制。在本實施例中，罹癌個體是人類。在本實施例中，活體外樣本為一癌組織樣本或一血液樣本，例如但不限於血液樣本中的一游離DNA(cfDNA)。舉例而言，癌組織樣本 可以例如但不限於淋巴液、唾液、活體組織切片或任何本領域中具有通常知識者熟知的癌組織樣本。
在本實施例中，步驟S02係由第一基因拷貝數變異值及第二基因拷貝數變異值得出一拷貝變異數比值，其中第一基因編碼有一細胞週期素(cyclin)，且第二基因編碼有一週期蛋白依賴型激酶抑制蛋白(cyclin dependent kinase inhibitor，CDKN)。舉例而言，細胞週期素為G1期的細胞週期素，例如但不限於Cyclin D。週期蛋白依賴型激酶抑制蛋白為G1期或S期的週期蛋白依賴型激酶抑制蛋白。在本實施例中，第一基因為CCND1，第二基因為CDKN2A或CDKN2B。在另一實施例中，第一基因為CCND1，且第二基因為CDKN2A。
在本實施例中，步驟S03係評估罹癌個體是否適用CDK抑制劑。舉例而言，步驟S03是由步驟S02中所得到的拷貝變異數比值來進行評估，當拷貝變異數比值大於4時，則認定罹癌個體為適用抗癌藥物。於此，拷貝變異數比值的評估依據可依據抗癌藥物的種類、罹癌個體的種類或亞種而有所不同，本發明並無限制。
請參照圖1B，其為本發明評估罹癌個體是否適用抗癌藥物的方法的第二實施例的流程圖。在本實施例中，罹癌個體係罹患鼻咽癌(nasopharynx cancer，NPC)，且該方法包括第一實施例中的步驟S01及步驟S02，步驟S01及步驟S02的詳細敘述如前，於此不再重複贅述。在本實施例中，此方法進一步包括下列步驟，步驟S03’：於活體外檢測罹癌個體的一鼻咽癌EB病毒量之一步驟，步驟S04：罹癌個體是否適用該抗癌藥物是根據拷貝變異數比值與鼻咽癌EB病毒量來共同評估。
在本實施例中，步驟S03’係於活體外檢測罹癌個體的鼻咽癌EB病毒量，舉例而言，罹癌個體是人類。在本實施例中，活體外樣本為一癌組織樣本或一血液樣本，例如但不限於血液樣本中的一游離DNA(cfDNA)。舉例而言，癌組織樣本可以例如但不限於淋巴液、唾液、活體組織切片、或任何本領域中具有通常知識者熟知的癌組織樣本。在本實施例中，於活體外檢測鼻咽癌EB病毒量，係經由定量聚合酶連鎖反應(Q-PCR)來進行。特別地，活體外檢測還包括但不限於ELISA、西方墨點法、PCR等 本領域通常知識者熟知可用於檢測病毒量的方法。
在本實施例中，步驟S04係評估罹癌個體是否適用抗癌藥物，舉例而言，步驟S04是由步驟S03’中所得到的拷貝變異數比值與鼻咽癌EB病毒量來共同評估，當鼻咽癌病毒量大於5000顆/毫升且拷貝變異數比值大於4時，則認定罹癌個體為適用抗癌藥物。詳細而言，第二實施例步驟S04與第一實施例步驟S03的差異為是否需要依據鼻咽癌EB病毒量來進行評估。於此，拷貝變異數比值、鼻咽癌EB病毒量的評估依據可依據抗癌藥物的種類、罹癌個體的物種、亞種而有所不同，本發明並無限制。
以下以數個實驗例來說明前述各實施例的生物學特性及其分子作用機制。
而經以下實驗發現，在鼻咽癌的患者中，血漿EBV DNA量與CCND1/CDKN2A的CNV比值呈正相關。因此，測定游離CCND1和CDKN2A之間的CNV比值以及NPC血漿中的EBV DNA量可以提供有助於有效監測NPC進展和復發的資訊。此外，游離CCND1/CDKN2A比值可能意味著NPC復發患者是否適合細胞週期依賴型激酶抑制劑PAL治療。根據經驗，當患者血漿中的EBV DNA量大於5,000拷貝數/毫升(或5000顆/毫升)時，患者的病情逐漸惡化，因此應該採取更積極的醫療措施。CNV CCND1/CDKN2A比率的截止值設定為4，這對應於血漿中約為5,000拷貝數/毫升的EBV DNA量。本實驗將這種CNV比值與血漿中的EBV DNA量相結合，可以有效地用作NPC患者個人化治療的指南。
材料與方法
藥物
吉西他濱(Gemcitabine，GEM)、GSK-126和帝希他濱(decitabine，DEC)購自Sigma Chemical Co(St.Louis，MO)。帕博西尼(palbociclib，PAL)購自MedChem Express(Monmouth Junction，NJ)。
細胞生長測定和動物研究
NP69(T抗原不朽化鼻咽上皮(nasopharyngeal epithelial，NP)細胞)，C666-1(攜帶EBV的NPC細胞)和HK-1(無EBV的NPC細胞)細胞維持在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI環境中。細胞生長測定 和動物研究如文獻中所述的方法進行(Hsu CL,et al：Application of a patient-derived xenograft model in cytolytic viral activation therapy for nasopharyngeal carcinoma.Oncotarget 2015,6(31)：31323-31334.)。所有涉及實驗動物的實驗均遵循長庚醫院(CGMH)動物實驗指南，並獲得長庚醫院動物研究批准。
細胞週期分析
將細胞(1×106)接種在含有10% FBS的完全培養基的10公分培養皿中培養24小時。將培養基替換為不含FBS的基本培養基，再培養24小時。接下來，將細胞用含有10% FBS和0~1μM帕博西尼的完全培養基處理24小時後，用胰蛋白酶消化，並在4℃的環境下，在70%乙醇中固定30分鐘。然後，用PBS清洗固定的細胞，用100μg/mL RNAase處理並用50μg/mL碘化丙啶(Propidium Iodide)染色。染色後，用PBS清洗細胞，並使用Navios(TM)流式細胞儀(Beckman Coulter)分析。數據是使用Kaluza流式細胞術分析軟體來評估。
參與的患者
2013年7月至2016年6月，共有17位活體組織切片(biopsy)證實為局部復發或遠處轉移的鼻咽癌患者參與試驗；2002~2016年間在長庚醫院收集了139例NPC患者的活體組織切片/福馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed，paraffine-embedded，FFPE)；且NPC患者具有經長庚醫院的研究作業倫理規範審議小組(Institutional Review Board，IRB)批准的帕博西尼書面知情同意書。
來自患者的異種移植物(Patient-derived xenograft，PDX)
PDX模型是根據參考文獻的實驗方法產生的(Hsu CL,et al：Application of a patient-derived xenograft model in cytolytic viral activation therapy for nasopharyngeal carcinoma.Oncotarget 2015,6(31)：31323-31334.)。簡而言之，NPC腫瘤樣本來自患者的活體組織切片或手術切除的組織。每個樣本被立即切成小段，浸入含有抗生素的PBS中並皮下植入被麻醉的NOD/SCID小鼠的側腹區域。生長到直徑約1公分後，切除異種移植物並將其植入隨後的下一代的小鼠中。在小鼠中PDX腫瘤的繼代需要2~4個月。
PDX模型中的藥物敏感性試驗
將腫瘤植入NOD/SCID小鼠後，在異種移植物體積達到50~150立方毫米後，將動物隨機分組(每組3~5隻，側腹部有腫瘤)，並腹腔注射以施用各種藥物：吉西他濱、GSK-126，帝希他濱；和管餵(oral lavage)：帕博西尼。使用以下劑量方案：吉西他濱(2mg/kg，5次/週)，GSK-126(2.5mg/kg，5次/週)，帝希他濱(2.5mg/kg，3次/週)和帕博西尼(150mg/kg，5次/週)。將吉西他濱，GSK-126和帝希他濱溶於DMSO中，並將帕博西尼溶於蒸餾水中。EBV陽性細胞株-C666-1-異種移植的小鼠作為對照組。每周用卡尺測量腫瘤尺寸，並用公式計算腫瘤體積，腫瘤體積(mm3)=a(長度，mm)×b2(寬度，mm)×0.5。收穫的腫瘤用於進一步分析。每組約3至5隻小鼠。在化學注射後1個月或更早時間(如果腫瘤尺寸大於2000立方毫米，體重減輕超過20%，小鼠不能維持其正常攝入食物和水達3天，患有排尿或排便困難，或者其他違反人道待遇規定的情況)犧牲小鼠。腫瘤最終體積使用調整後的二因子變異數分析(two-way ANOVA)進行多重比較。
基因體DNA萃取
根據製造商說明書的說明，分別使用QIAamp DNA mini試劑盒、QIAamp DNA FFPE Tissue試劑盒(Qiagen)和QIAamp DNA blood mini試劑盒(Qiagen)從PDX、FFPE和血漿游離DNA中萃取基因體DNA。萃取得的DNA樣本是使用NanoDrop或QubitTM dsDNA HS分析試劑盒(Invitrogen)進行定量的。基因體DNA的完整性是用Fragment AnalyzerTM系統(Advanced Analytical Technologies，Inc)進行測定。
定量反轉錄PCR
使用2X SyBr(Bio-Rad BP170-8882AP)10μL，分別加入正向引子和反向引子(10μM,0.6μL)，和自血漿中游離的DNA 8μL，進行Q-PCR(20μL)反應。以Roche LightCycler 96進行定量PCR反應。反應完成後，將NLRP3的Ct值換算為拷貝數2，之後將(1)CCND1，(2)CDKN2A，(3)RAD52的Ct值與NLRP3的Ct值比較其換算拷貝數。CCND1-正向引子(SEQ ID NO：1)、CCND1-反向引子(SEQ ID NO：2)、CDKN2A-正向 引子(SEQ ID NO：3)、CDKN2A-反向引子(SEQ ID NO：4)、RAD52-正向引子(SEQ ID NO：5)、RAD52-反向引子(SEQ ID NO：6)的序列請參見序列表。
全外顯子定序(Whole exome sequencing，WES)
對來自NPC PDX腫瘤及其對應的NPC患者的匹配周邊血的基因體DNA進行全外顯子定序。(a)(NPC PDX-ST，-LN，-LG，-LV)(Macrogen，韓國，使用SureSelectXT Lib。Prep Kit，HiSeq 4000，Illumina)以及(b)NPC PDX-Bone和PDX-LN(ACTgenomics，台灣)。
從WES數據中鑑定體細胞突變
將從Macrogen獲得的WES定序的Fastq文件，過濾去除外加的接頭(adaptor)DNA序列。來自NPC PDX腫瘤(ST，LN，LG，LV)的DNA序列是使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)工具進行比對的，並過濾去除小鼠DNA序列-小鼠參考基因體-MM10，剩餘的PDX腫瘤為人類DNA序列和來自匹配患者周邊血的DNA定序與人類參考基因體-hg19-分別使用BWA進行比對。來自PDX腫瘤和正常樣本的變體是使用基因體分析工具包(Genome Analysis Toolkit，GATK)管道來辨識的。GATK Unified Genotyper被用於挑出(single nucleotide variants，SNV)和插入/缺失(insertion/deletions，Indels)(Genomics，台灣)。
ACTOnco綜合癌症基因組定序(ACTgenomics)
基因體DNA(80ng)使用癌症基因組的409種癌症相關基因的編碼外顯子共15992個引子對(由四個引子對庫primer pool)進行擴增(Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel，Life Technologies)。擴增物透過使用Ion Amplicon Library Kit(Life Technologies)與條碼接頭(barcoded adaptor)連接。條碼文庫隨後透過乳液聚合酶鏈鎖反應(emulsion PCR)與定序珠結合並使用Ion PITM Hi-QTM Chef Kit(Life Technologies)進行富集。擴增文庫的質量和數量是使用片段分析儀(AATI)和Qubit(Invitrogen)來確定的。根據製造商的方案，使用Ion PITM Chip Kit v3(Life Technologies)在Ion Proton定序儀上進行定序。
全外顯子序列數據分析
根據Ion AmpliSeqTM Exome RDY文庫製備試劑盒(ACTgenomics)建構文庫。簡而言之，50ng基因體DNA是使用12個引子對庫(primer pair pool)(Ion AmpliSeq Exome RDY試劑盒，Life Technologies)來擴增，以標靶18,835個基因(約57.7Mb)的所有編碼外顯子。使用Ion XpressTM條碼接頭(barcoded adapters)試劑盒(Life Technologies)將擴增物與條碼接頭連接。條碼文庫隨後通過乳液聚合酶鏈鎖反應(emulsion PCR)與定序珠結合，並用Ion PITM Hi-QTM Chef Kit(Life Technologies)富集。擴增的文庫是使用片段分析儀(AATI)和Qubit(Invitrogen)來確定質量和數量。根據製造商的方案(ACTgenomics)使用Ion PI晶片(Life Technologies)在Ion Proton定序儀上進行。使用Ion Torrent Suite(5.0版)將定序儀產生的原始讀值與人類hg19參考基因體的序列比對，使用Torrent Coverage Analysis插件計算覆蓋深度。使用Torrent Variant Caller外掛程式(5.0版)鑑定單核苷酸變體(single nucleotide variants，SNV)和短插入/缺失(INDEL)。Variant Effect Predictor(VEP)(77版)被應用於使用來自COSMIC的：v.70；dbSNP 138和「千人」基因體：階段1的數據庫註釋每個變體。將比對變異序列低於覆蓋率25或頻率低於5%的過濾去除。在「千人」基因體計劃階段1中報告的變體，具有大於1%的次要等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)且ACT基因體學內部(in-house)PBMC數據庫中被認為具有多型性。
拷貝數變化分析
PDX-B和WBC-B的擴增DNA片段其定序讀值若為最低第5個百分比和變異係數大於或等於0.3將被去除。將來自四個不同庫(pool)的其餘擴增物標準化以校正庫的設計偏差。ONCOCNV用於標準化總擴增物數量、GC含量、長度和技術相關偏差，然後用基因感測模型(gene-aware model)對樣本進行區隔。該方法還可用於建立ACTgenomics內部PBMC數據庫中樣本拷貝數變異的基線。全外顯子定序讀值[Fastq格式，NPC PDX和PBMC(-ST，-LN，-LG，-LV)]是使用具有5%容許誤差的FANSe2演算法進行定位(mapped)到人類參考基因體hg19。採用獨特的定位讀值進行進一步分析以避免不明確。每個基因的讀值密度被計算，並將每個樣本的 讀值計數除以外顯子長度。使用正常核型WBC樣本的平均讀值密度作為標準化的標準。讀取每個基因的密度並將每個樣本相對於標準值(Changgong Biotech，台灣)進行標準化。由於所有樣本均來自男性患者，常染色體的正常拷貝數設為2，性染色體X和Y的正常拷貝數設為1。每個基因和樣本的拷貝數被對應地繪製。
RNA序列
PDX樣本的RNA是按照製造商的方案，使用TRIzol(Invitrogen)試劑萃取的。依照製造商的建議，用DNAase I處理除去剩餘的DNA。完整的PolyA+mRNA是使用NEB Poly(A)mRNA磁性分離模組(New England Biolabs)選擇的。mRNA文庫的建構是按照製造商的方案，使用Illumina(New England Biolabs)的NEBNext Ultra RNA文庫製備試劑盒(library prep kit)進行的。在Illumina HiSeq X Ten定序儀上進行150個循環的定序。透過Illumina過濾器過濾的高質量讀數，用以進行生物資訊分析(Changgong Biotech)。序列是使用NGS分析平台中的超精確定位演算法(hyper-accurate mapping algorithm)FANSe2將序列定位到包含人類RefSeq-RNA，小鼠RefSeq-RNA和EB病毒序列(NCBI登錄號：AY961628，DQ279927和V01555)的組合參考序列數據庫「Chi-Cloud」(http：//www.chi-biotech.com)。丟棄定位到小鼠參考序列的讀值並將剪接變體合併。基因表現水平使用RPKM方法定量。至少有10個讀值的基因被認為是可量化的。基因差異表現(Differentially expressed genes，DEG)是利用edgeR套裝軟體(3.12.0版)分析，並考慮到至少2倍的變化且p<0.05。DEGs的基因本體論和路徑分析分別使用topGO(2.22.0版)和KOBAS(2.0版)進行。
抗體
西方墨點法分析使用每個泳道100微克蛋白質裂解物。本實驗例中使用的抗體：RB1(CusaBio PA003948)，RB-P(Cell Signaling 9307)，E2F1(Santa Cruz SC-193)，CDK2(CusaBio PA001533)，CDK4(Santa Cruz SC-23896)，CDK6(Santa Cruz SC(Santa Cruz SC-8396)，CCNE2(Proteintech 11935-1-AP)，CDKN2A(Prosci 4211)，CDKN1A(Santa Cruz SC-6246)，PCNA(Proteintech 10205-2-AP)和GAPDH(Santa Cruz FL-335)。
統計學分析
細胞株和腫瘤重量數據以平均值±SD表示。最終腫瘤體積是使用二因子變異數分析(ANOVA)比較的。透過線性回歸描繪RAD52，CCND1和CCND2A的CNV與EBV DNA量的相關性。總體存活率是從獲得PDX組織到死亡的時間計算的，通過Kaplan-Meier曲線繪圖，並使用對數秩檢定(log-rank test)進行比較。在所有分析中，p值均為雙尾，且在p值小於0.05時，數據被認為是具有統計學顯著差異的。
實驗例一：建立6個NPC-PDX株並分析其基因體突變
2013年7月至2016年6月期間，從17個經活體組織切片證實為鼻咽癌局部復發/轉移的NPC病例成功建立了5個NPC-PDX株。NPC-PDX親代腫瘤的轉移部位包括軟組織(ST)，淋巴結(LN)，肺(LG)，肝(LV)和骨頭。腫瘤PDX植入率約為30%。PDX植入陽性患者的生存期比PDX植入陰性患者更短(p=0.033)。在先前研究中，致癌性EBV被認為是有效的突變驅動因素，在鼻咽癌腫瘤中的突變率相對較低。與先前的研究結果一致，本實驗例中鑑定了每個腫瘤的34~99個單核苷酸變體(SNV)，並且在與匹配的患者的周邊血單核球細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)比較時，來自轉移的NPC腫瘤的5個PDX腫瘤中，總共有282個誤義(missense)和剪接點體細胞突變(splicing site mutation)(如圖2A所示)。主要的變化是C到T(26.2%)和G到A(20%)的轉變(圖2B)。與NPC-PDX腫瘤中有限的體細胞突變相反，本實驗例中觀察到全基因體CNV會影響數千個基因(每個PDX腫瘤約5000個基因)。如圖3A所示，PDX腫瘤的幾個染色體區域顯示有很長的DNA片段(甚至為arm-level)異常擴增(CNV增加)或缺失(CNV缺失)。有趣的是，在本實驗例中發現在五個NPC-PDX，其中有四個具有細胞週期素D1(cyclin D1)的CNV增加(CCND1，chr11-q13)，且三個NPC-PDX具有CNV缺失的細胞週期蛋白依賴型激酶抑制蛋白2A(cylin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A，chr9-p21)。CCND1蛋白與細胞週期蛋白依賴型激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)4/6形成複合體，隨後使視網膜母細胞瘤蛋白(phosphorylates retinoblastoma protein)磷酸化，導致進入細胞週期中的S 期。CDKN2A蛋白，也稱為p16，具有細胞週期抑制蛋白的作用，與CDK4結合並透過阻止細胞週期G1/S期的轉變，阻斷cyclin D1/CDK4/pRb軸。因此，CCND1的擴增和CDKN2A的缺失是NPC腫瘤的常見改變，這可能協同促進細胞快速生長。
實驗例二：PDX對親代人類鼻咽癌腫瘤具有高度的基因體保真度(fidelity)
如圖3B所示，親代NPC轉移性腫瘤和PDX異種移植物均攜帶EBV(對於Epstein-Barr編碼區域具有陽性染色，EBER)。為了確定患者(福馬林固定，石蠟包埋，FFPE)中PDX和原發轉移性鼻咽癌腫瘤的基因組成是否相似，本實驗例中比較了從全外顯子定序(含18,070個細胞基因)和超深度定序癌症基因組409(ACTOnco CP-409，包含409個選擇的癌基因和腫瘤抑制基因)。成對比較顯示WES(Pearson相關係數，r=0.62；圖3C)和CP-409(r=0.96；圖3D)中FFPE-骨頭和PDX-骨頭的CN圖譜之間具有高度相關性。當比較CP-409中FFPE-LN和PDX-LN的CN圖譜時(r=0.92；圖4A至4C)，獲得了可比較的結果。FFPE樣本的CN圖譜與PDX腫瘤之間的高度相關性顯示PDX腫瘤保留了親代NPC腫瘤的基因組成。由於每個NPC-PDX腫瘤樣本中的體細胞突變有限，本實驗例中併入282個基因中鑑定的所有SNV以及CCND1和CDKN2A以進行路徑分析(Metacore)。在下表1中總結了在NPC PDX腫瘤中鑑定的改變的癌症相關路徑；並且受影響最大的路徑是細胞週期。本實驗例中的發現顯示特定細胞週期調節因子CCND1和CDKN2A的擴增及/或缺失可能與鼻咽癌發生的顯著異常相關。
Figure 107123190-A0101-12-0019-1
Figure 107123190-A0101-12-0020-2
實驗例三：透過WES和CNV基因研究證實CCND1過度表現
如圖5A所示，在五個PDX中，微陣列分析證實有四個具有cyclin D1過度表現和CDKN2A、2B靜默。在NPC細胞株(HK1)和五個PDX腫瘤中觀察到CCND1 mRNA過度表現(RT-PCR)(圖5B)。免疫組織化學分析進一步驗證了在親代轉移性NPC腫瘤和PDX-骨頭和PDX-LN中CCND1蛋白的過度表現(圖5C和5D)。
實驗例四：NPC-PDXs藥物篩選
基於NPC-PDXs基因體整合分析發現的突變，本實驗例中欲測試細胞週期抑制劑是否可以用作本實驗例中建立的NPC-PDX株中的抗癌藥物。在本實驗例中選擇了FDA批准的目前用於乳癌的細胞週期抑制劑「帕博西尼」(palbociclib，PAL，CDK4/6抑制劑)。有報導顯示，鼻咽癌中表觀遺傳修飾因子，Enhancer of Zeste homolog 2(EZH2)又稱為蛋白質甲基轉移酶(protein methyltransferase)和DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)的過度表現與NPC腫瘤發生相關；因此，在 本實驗例的NPC-PDX藥物篩選模型中，選擇了EZH2抑制劑「GSK126」和DNA甲基化抑制劑「帝希他濱」(一種DNMT1的核苷酸類似物)，還包括常規NPC化療藥物「吉西他濱」(GEM，核苷酸類似物)作為比較。首先將這四種藥物(GEM，GSK，DEC和PAL)在EBV陽性細胞株C666-1中進行測試。PAL和GSK在C666-1細胞中的IC50值介於10~100μM範圍內(如圖6A所示)。然後，將這四種藥物用於PDX-C666.1異種移植物中，與DMSO對照組相比，這四種藥物對C666-1異種移植物生長都產生了抑制作用(如圖6B和6C所示)。儘管DEC在一定程度上表現出毒性，包括在治療期間誘導小鼠體重變化大於20%或死亡(如圖6D所示)。為了證實PAL可誘導G0G1期的生長停滯，本實驗例用0.1、0.5和1μM PAL處理C666-1細胞48小時，然後進行流式細胞儀分析。與對照組(DMSO)相比，PAL處理的細胞中G0G1期的細胞百分比以劑量依賴性方式增加(如圖6E所示)，顯示PAL阻斷NPC細胞進入S期。在NPC-PDX-13-F4(PDX-骨頭第4代)株中，這四種測試藥物均顯著抑制小鼠的腫瘤尺寸(圖7A~7C)和腫瘤總重量(圖7D)，相對於DMSO具有可容許的體重變化(圖7E)。與單獨處理GEM或PAL的組別相比，用PAL和GEM進行的組合處理誘發了累加效應(additive effect)。藥物治療後CCND1 IHC染色顯示PAL處理後CCND1蛋白質表現量並未顯著減少，(圖7F)，這意味著此藥物作用不於減少CCND1的表現量，而是作用在其它細胞週期分子上，以達到使癌細胞的細胞週期停滯在G1/S期。在NPC-PDX-02-F11(PDX-LN第11代)株中，GEM和PAL均對異種移植物生長有顯著的抑制作用，但GSK無顯著抑制作用(圖7G和7H)。雖然DEC在PDX-LN中表現出抗腫瘤生長，但是其誘導毒性並導致大於20%的體重損失(如圖8C所示)。因此，GEM和PAL在兩種NPC-PDX模型中具有抗腫瘤活性，且幾乎沒有副作用(如圖8A~8B所示)。
實驗例五：鼻咽癌PDX-B與各種藥物治療的轉錄體分析
為了比較PDX-骨頭中不同藥物治療前後的9個選擇的細胞週期相關基因，將每千鹼基每百萬個讀值(reads per kilobase million，RPKM；圖9A，上圖)標準化，標準化RPKM與對照組(DMSO)的倍數變化(圖 9A，中圖)，並確定Q-RT-PCR RNA表現確效的倍數變化(圖9A，下圖)。由於CDKN2A和2B基因(灰色柱)在NPC PDX-骨頭中缺失，因此沒有檢測到RNA轉錄物(圖9A，上圖)。不同藥物處理後的基因表現倍數變化透過RNA-序列測定的與使用Q-RT-PCR評估的結果相當。在本實驗例中觀察到GSK處理後九個基因的表現沒有顯著的倍數變化，顯示EZH2抑制劑不靶向本實驗例所選擇的細胞週期基因。用GEM，DEC和PAL處理誘導細胞停滯標誌物CDKN1A(p21)的表現增加3至5倍。此外，PAL或GEM+PAL處理後，RNA-序列和Q-RT-PCR數據顯示細胞週期活化因子CDK2，E2F1，PCNA，CCNE2和RB1的表現減少50%~80%。如圖9B所示，與WES和RNA表現的數據一致，本實驗例在PDX-骨頭腫瘤中沒有觀察到CDKN2A蛋白的表現。在GEM和PAL處理後，PDX-骨頭中的細胞週期活化因子的水平明顯降低，包括高度磷酸化的RB(RB-p)，總RB，E2F1和CDK2。CDK6和PCNA蛋白水平則略有下降。另一方面，細胞停滯標記CDKN1A(p21)的蛋白質表現顯著增加。如圖9C所示，用兩種藥物處理48小時後在C666-1中觀察到類似的結果。本實驗例的數據共同顯示PAL阻斷CDK活性並同時降低幾種關鍵細胞週期活化因子的蛋白質水平，導致體內試驗中PDX-骨頭腫瘤生長被有效抑制。
實驗例六：NPC患者血漿中CCND1和CDKN2A的CNV與EBV DNA量的相關性
血漿EBV DNA病毒量被用作監測NPC腫瘤狀態的病毒標誌物；血液中EBV DNA量的提高通常與癌症復發/轉移有關。EBV DNA量可能與CCND1的CNV增加和CDKN2A的缺失有關。在這種情況下，PAL可能在具有CCND1擴增和CDKN2A缺失基因背景的NPC腫瘤中有效地阻斷細胞週期。故在液體活體組織切片中檢測CCND1和CDKN2A的CNV和EBV DNA量可能具有臨床價值。因此，本實驗例中建立了快速的基於PCR的測試來確定游離DNA中兩種細胞週期調節因子的CNV。在檢查NPC患者血漿前，本實驗例使用從5種PDX腫瘤中分離的基因體DNA和匹配患者的PBMC進行Q-PCR擴增。在CCND1，CDKN2A和RAD52(對照組)上獲得的數據與使用WES確定的CNV結果具相關性。兩種方法之間的相 關性高達0.89~0.95(如下表2所示)，顯示Q-PCR測定可有效用於建立細胞基因的拷貝數。
Figure 107123190-A0101-12-0023-4
隨後從收集自兩個不同時間點的11例鼻咽癌患者和收集自24例鼻咽癌患者的24個低EBV DNA拷貝數(<5,000拷貝數/毫升)的血漿，選擇22個高EBV DNA拷貝數(>5,000拷貝數/毫升)的血漿。將從血漿分離的游離DNA用於CCND1，CDKN2A和RAD52的Q-PCR分析。PCR結果用健康個體PBMC樣本的結果標準化。對於低量EBV DNA的血漿(0~3,000拷貝數/毫升)，EBV DNA量與CCND1的CNV之間呈弱的正相關(r=0.396)，但低量EBV DNA與(a)CDKN2A的CNV(r=0.082)和(b)RAD52的CNV(r=0.25)之間沒有相關性(圖10A~10D)。上述三個基因的平均CNV約為2(圖10A)，顯示當血漿中有低量EBV DNA時(小於5000拷貝數/毫升)，CDKN2A和RAD52的CNV保持不變(約2)但CCND1的CNV即使在低EBV拷貝數已經開始增加(大於2)。對於高量EBV DNA的血漿(大於5,000拷貝數/毫升)，RAD52的平均CNV仍保持約2，顯示EBV DNA量和RAD52的CNV之間沒有相關性(r=0.056)(如下表3A、3B所示)。然而，本實驗觀察到在高量EBV DNA的血漿組 別中，令人驚訝的是，CCND1 CNV的平均值可高達22；而CDKN2A的CNV則有輕微缺失(圖11A)。高量EBV DNA組別中(a)CCND1和(b)CDKN2A兩者的CNV與EBV DNA量的log值之間的相關係數分別為r=0.325(弱的正相關)和r=-0.488(中等的負相關)(如下表3A、3B所示)。在血漿中EBV DNA量大於100,000拷貝數/毫升時，游離DNA缺失一個CDKN2A拷貝的機會為70%(7個中有5個，下表3A、3B)。有趣的是，本實驗例中使用相同樣本中CCND1和CDKN2A的CNV數據，運用兩個基因之間[CCND1/CDKN2A]的「CNV比值」或於之前單獨個別基因的CNV相較，「CNV比值」與血漿中高量EBV DNA log值具有更好的正相關性(r=0.576)(圖11B和下表3A、3B)。此新的相關性圖式顯示鼻咽癌腫瘤細胞週期調節因子CCND1和CDKN2A異常CNV的風險取決於循環中EBV DNA量的增加。根據線性回歸方程式，y=11.11 x-36.93(其中x和y分別代表EBV DNA量的對數值和[CCND1/CDKN2A]的「CNV比值」；圖11B)，當血漿中EBV DNA量為5,000拷貝數/毫升時，CNV比值約為4，此結果意味著腫瘤釋出游離DNA有高比例發生CCND1的擴增及/或CDKN2A的缺失。因此，血漿中EBV DNA量愈高時，會促進CCND1(細胞週期促進因子)的CNV增加及CDKN2A(細胞週期制因子)的缺失，導致EBV陽性NPC腫瘤過度增生無法有效調控細胞的生長。
Figure 107123190-A0101-12-0024-5
Figure 107123190-A0101-12-0025-6
Figure 107123190-A0101-12-0025-7
Figure 107123190-A0101-12-0026-8
實驗例七：CCND1表現的提高是鼻咽癌預後不良的標誌且表示PAL可能為潛在的治療方案
長庚醫院(2002~2016年)139例鼻咽癌FFPE樣本中CCND1表現的檢測結果顯示，只有9例樣本(6.5%)檢測不到CCND1，而130例樣本中CCND1過度表現(93.5%)。在CCND1過度表現的樣本中，116個樣本(83.4%)顯示強烈的CCND1染色結果(2+和3+)(如下表4所示)。如圖12B和12C所示，CCND1細胞的表現密度和陽性百分比與存活率呈負相關，且具有統計學顯著差異。此外，cyclin D1在原發部位腫瘤(87.9%)和局部復發(93.3%)樣本中高度過度表現。在91個轉移性NPC FFPE樣本中，81個具有匹配的血漿EBV DNA數據。此外，來自81個樣本的細胞週期素D1密度等級與平均EBV DNA量相關(p=0.046，如下表5)。此外，EBV DNA量的限值為5,000或10,000拷貝數/毫升是81例轉移性NPC樣本中總體存活率的預後因子(如圖10C和10D)。一般來說，EBV病毒量越高，CCND1表現越高，總體存活率越低。
Figure 107123190-A0101-12-0026-60
1.IHC染色：陰性：等級
Figure 107123190-A0101-12-0027-68
1且細胞群<5%；陽性：等級>1且細胞群≧5%。2.LN1：淋巴結；T/N2：原發部位或局部區域淋巴結復發
Figure 107123190-A0101-12-0027-10
￥ G+P：吉西他濱+順鉑(gemcitabine+cisplatin)。# P/U/L+(B/M)：順鉑+UFT+calcium folinate+(博來黴素或絲裂黴素-c)。*在91名轉移性鼻咽癌患者中，只有81名患者有血漿EBV DNA(拷貝數/毫升)數據(患者的血液在收到轉移部位組織證據後收集)。
一名接受局部CCRT治療的鼻咽癌患者發生肝、肺和骨頭轉移，細胞週期素D1表現量高(圖12A)。雖然患者接受了五種緩和性化 學治療，但都未能改善病情。作為最後的嘗試，患者進一步用兩個療程的PAL單獨治療，並且顯示出最大的2級骨髓抑制並降低了血漿EBV DNA量(圖12D)。且後續的PET掃描顯示疾病穩定(圖12D和12E)。本實驗例的數據顯示PAL作為挽救治療在一定程度上顯示出抗癌功效。
綜上所述，本發明的方法能用來評估癌症病人是否適合例如CDK抑制劑之癌症標靶藥物。本發明透過活體外樣本檢測CCND1基因和CDKN2A基因的CNV比值。用來作為CDK抑制劑藥物個人精準用藥建議參考。另外由於這些標靶藥物價格貴，因此醫師可透過本發明的方法快速篩選合適的病人(例如CNV比值高)，作為建議用藥的輔助依據。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
<110> 長庚大學
<120> 評估罹癌個體是否適用抗癌藥物的方法
<160> 6
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCND1-正向引子
<400> 1
Figure 107123190-A0101-12-0029-61
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCND1-反向引子
<400> 2
Figure 107123190-A0101-12-0029-62
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CDKN2A-正向引子
<400> 3
Figure 107123190-A0101-12-0029-64
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CDKN2A-反向引子
<400> 4
Figure 107123190-A0101-12-0030-65
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RAD52-正向引子
<400> 5
Figure 107123190-A0101-12-0030-66
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RAD52-反向引子
<400> 6
Figure 107123190-A0101-12-0030-67
S01~S03‧‧‧步驟

Claims (20)

  1. 一種評估一罹癌個體是否適用一抗癌藥物的方法，其中該抗癌藥物為一週期蛋白依賴型激酶抑制劑(CDK inhibitor)，該方法包括：於活體外檢測該罹癌個體的一活體外樣本中的一第一基因的拷貝數及一第二基因的拷貝數，藉此分別得出一第一基因拷貝數變異值與一第二基因拷貝數變異值，由該第一基因拷貝數變異值及該第二基因拷貝數變異值得出一拷貝變異數比值，其中該第一基因編碼有一細胞週期素(cyclin)，且該第二基因編碼有一週期蛋白依賴型激酶抑制蛋白(cyclin dependent kinase inhibitor，CDKN)；以及由該拷貝變異數比值評估該罹癌個體是否適用該CDK抑制劑。
  2. 如請求項1的方法，其中該罹癌個體係罹患乳癌、食道癌(esophageal squamous-cell carcinoma，ESCC)、肝癌(HCC)、肺腺癌、黑色素癌(melanoma)、大腸癌(colon cancer)、攝護腺癌(prostate cancer)、卵巢癌(ovary cancer)、腎臟癌(kidney cancer)、或白血病(leukemia)。
  3. 如請求項1的方法，其中該第一基因為CCND1。
  4. 如請求項1的方法，其中該第二基因為CDKN2A或CDKN2B。
  5. 如請求項4的方法，其中該第一基因為CCND1，且該第二基因為CDKN2A。
  6. 如請求項1的方法，其中該抗癌藥物為週期蛋白依賴型激酶4/6抑制劑(CDK 4/6 inhibitor)。
  7. 如請求項6的方法，其中該抗癌藥物為帕博西尼(palbociclib)、ribocilib、或abemaciclib。
  8. 如請求項7的方法，其中當該拷貝變異數比值大於4時，則認定該罹癌個體為適用該抗癌藥物。
  9. 如請求項1的方法，其中於活體外檢測該第一基因及該第二基因各自的拷貝數，係經由一定量聚合酶連鎖反應(Q-PCR)來進行。
  10. 如請求項1的方法，其中該活體外樣本為一癌組織樣本或一血液樣本。
  11. 如請求項10的方法，其中該活體外樣本為該血液樣本中的一游離DNA(cell free DNA，cfDNA)。
  12. 如請求項1的方法，其中該罹癌個體係罹患鼻咽癌(nasopharynx cancer，NPC)，且該方法進一步包括於活體外檢測該罹癌個體的一鼻咽癌EB病毒量之一步驟，且該罹癌個體是否適用該抗癌藥物是根據該拷貝變異數比值與該鼻咽癌EB病毒量來共同評估。
  13. 如請求項12的方法，其中該第一基因為CCND1。
  14. 如請求項12的方法，其中該第二基因為CDKN2A或CDKN2B。
  15. 如請求項14的方法，其中該第一基因為CCND1，且該第二基因為CDKN2A。
  16. 如請求項12的方法，其中該抗癌藥物為週期蛋白依賴型激酶4/6抑制劑(CDK 4/6 inhibitor)。
  17. 如請求項16的方法，其中該抗癌藥物為帕博西尼(palbociclib)、ribocilib、或abemaciclib。
  18. 如請求項17的方法，其中當該鼻咽癌病毒量大於5000顆/毫升且該拷貝變異數比值大於4時，則認定該罹癌個體為適用該抗癌藥物。
  19. 如請求項12的方法，其中該活體外樣本為一癌組織樣本或一血液樣本。
  20. 如請求項19的方法，其中該活體外樣本為該血液樣本中的一游離DNA(cfDNA)。
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