CN102329846B - 复合酶水解法制备大豆与蚕蛹复合寡肽的清洁生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合酶水解法制备大豆与蚕蛹复合寡肽的清洁生产方法，属于酶工程和农产品加工技术领域。该方法以大豆分离蛋白与脱脂蚕蛹粉为原料，采用去离子水将二者按2.5:1~3.5:1的比例配制成8~10%(wt)的醪液，85~95℃加热8~12min使蛋白适度变性，迅速冷却后，加入2.5~3.5%(wt)（占底物干重的百分比）的复合酶于50~55℃酶解5~6h，然后升温至85~95℃维持10~15min进行灭酶，采用板框过滤与袋式精滤进行固液分离，滤液再依次进行超滤分级、纳滤浓缩、喷雾干燥，得到不同分子量的寡肽。本发明采用复合酶对大豆分离蛋白与脱脂蚕蛹粉进行水解，采用膜技术进行分级分离与浓缩，生产全程无需酸碱，无脱盐与脱色工艺，实现了寡肽的清洁生产。

Description

复合酶水解法制备大豆与蚕蛹复合寡肽的清洁生产方法

技术领域

本发明涉及复合酶水解大豆分离蛋白与脱脂蚕蛹制备复合寡肽的清洁生产方法，属于酶工程和农产品加工技术领域。

背景技术

随着生命科学和生物技术的发展，一些活性肽的结构和生理功能逐渐明确，推动了活性肽的研究，促进了大豆寡肽与蚕蛹寡肽的研究与开发。大豆与蚕蛹复合寡肽是根据植物蛋白与动物蛋白的氨基酸组成差异，将大豆分离蛋白与脱脂蚕蛹按照特定的比例进行混配，使其氨基酸组成接近人体需要的理想氨基酸组成，然后采用蛋白酶进行适度水解，并经分离与精制而得到的蛋白质深度水解产物，其成分主要是2～6个氨基酸组成的小分子肽和少量游离氨基酸。与大豆和蚕蛹蛋白相比，复合寡肽具有消化吸收率高、降低胆固醇、降血压和促进脂肪代谢的生理功能，并且具有无腥臭味、无蛋白变性、酸性不沉淀、加热不凝固、易溶于水、流动性好等良好的加工性能；同时，与游离氨基酸相比，复合低聚肽更易于消化吸收，生物效价和营养价值更高。

目前大豆寡肽研究与生产的较多，蚕蛹寡肽研究与生产相对较少，更无大豆蛋白与脱脂蚕蛹同时水解生产复合寡肽的先例。大豆与蚕蛹复合寡肽的生产存在两种方式，即：a）大豆蛋白与脱脂蚕蛹分别水解生产出大豆寡肽与蚕蛹寡肽，然后将二者再按比例进行混合复配；b）大豆分离蛋白与脱脂蚕蛹按比例投料同时进行水解，直接生产出复合寡肽。与前者相比，后者具有以下优点：（1）蚕蛹壳可作为助滤剂，大豆分离蛋白与脱脂蚕蛹同时水解后，板框过滤时无需加入硅藻土，既节约了生产成本，也减少了因硅藻土对寡肽的吸附作用而导致的收率降低；而大豆分离蛋白单独水解后，板框过滤是需加入硅藻土做助滤剂。（2）大豆分离蛋白与脱脂蚕蛹在酶解过程中得到了充分的混合，且液态下的混合不仅均匀，而且无粉尘；相比之下，方法a）需要额外的混合工序将大豆寡肽与蚕蛹寡肽混合均匀，不仅增加生产成本，而且固体粉末相混合能耗高，均匀度低，会有粉尘产生，污染工作环境。所以，本工艺采用大豆分离蛋白与脱脂蚕蛹同时水解的方式生产复合寡肽。

目前大豆寡肽与蚕蛹寡肽普遍采用的生产工艺是：蛋白原料加水调浆、加热变性、降温至酶解温度、加盐酸或氢氧化钠调整至合适pH值、加入蛋白酶进行酶解、酶解结束后加入盐酸进行大分子蛋白的酸沉、升温至90℃维持10min进行灭酶、冷却后进行固液分离，滤液再经离子交换脱盐、双效真空浓缩与活性炭脱色后进行喷雾干燥，得到成品。该工艺存在如下问题啓需解决：（1）对各种蛋白酶对大豆分离蛋白与蚕蛹蛋白的水解能力缺乏系统比较，在酶的选择、配伍、用法与用量上都存在不合理之处；所使用的酶制剂均为普通食品级产品，其载体多为淀粉、葡萄糖、NaCl等糖类或盐类物质，使用时不但会增加产品的灰分含量，还会因羰基与氨基之间的美拉德反应而增加产品色度；（2）酶解液pH值调节、大分子物质酸沉、酸沉后pH值回调等工艺需要耗费大量的酸碱，不但增加成本，腐蚀设备，而且还会因生成盐类而增加产品的灰分；（3）与膜技术相比，双效真空浓缩不仅耗能大，而且还因为温度高，美拉德反应生产较多的有色物质，导致产品色度增加；（4）脱盐工艺中离子交换树脂的再生需要消耗大量的酸碱，脱色工艺需要使用大量的活性炭，这不利于清洁生产与环境保护。这些技术问题的解决是实现寡肽清洁生产的关键。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种复合酶水解法制备大豆与蚕蛹复合寡肽的清洁生产方法。

本发明，以大豆分离蛋白与脱脂蚕蛹粉为原料，首先将其配制成一定浓度的醪液，搅拌均匀后对其进行加热变性，冷却后加入一定量的复合酶进行水解，然后采用板框过滤与袋式精滤进行固液分离，滤液再依次进行超滤分级、纳滤浓缩、喷雾干燥，得到不同分子量的大豆与蚕蛹复合寡肽，其生产工艺包括以下步骤：

1) 生产用水的处理：采用反渗透法制备无离子水；

2）将大豆分离蛋白与脱脂蚕蛹按2.5:1~3.5:1配制成底物浓度为8~10%(wt)的料液，搅拌均匀，85~95℃加热8~12min，使蛋白质适度变性；

3) 溶液冷却后，保持pH值自然，无需调节pH值；加入复合酶，加酶量为2.5~3.5%(wt)（占底物干重的百分比），于50~55℃酶解5~6h；然后升温至85℃~95℃维持10~15min进行灭酶，然后迅速冷却至45~50℃；

4) 酶解完毕后，采用板框过滤与袋式精滤进行固液分离，得到澄清的滤液；

5) 将得到的澄清滤液采用截断分子量为5000Da超滤膜进行超滤，分子量大于5000Da的组分被截留，这一组分回流至酶解罐在下一批次继续酶解；透过截断分子量为5000Da超滤膜的组分继续采用截断分子量为2000Da超滤膜进行分级分离；

6) 分子量大于2000Da的组分被截断分子量为2000Da超滤膜截留，这一组分直接进行喷雾干燥；透过截断分子量为2000Da超滤膜的组分继续采用截断分子量为1000Da超滤膜进行分级分离；

7) 分子量大于1000Da的组分被截断分子量为1000Da超滤膜截留，这一组分直接进行喷雾干燥；透过截断分子量为1000Da超滤膜的组分进一步采用纳滤膜进行浓缩；

8) 氨基酸与小肽等组分被纳滤膜截留，直接进入喷雾干燥；水和无机盐可以透过纳滤膜；

9) 将步骤6)至8)得到的各级截留物分别进行喷雾干燥得到不同分子量的生物活性肽粉；所述各级截留物为步骤6)透过截断分子量为5000Da超滤膜但未通过截断分子量为2000Da超滤膜的液体，步骤7）通过截断分子量为2000Da超滤膜但未通过截断分子量为1000Da超滤膜的液体，步骤8）纳滤浓缩后的通过截断分子量为1000Da超滤膜的液体；所述喷雾干燥的条件为：料液温度为50-55℃，进口温度为180-200℃，出口温度为70-80℃。

本发明所述的复合酶的酶系组成是碱性蛋白酶80000~100000u/g、中性蛋白酶30000~35000u/g和风味蛋白酶100~127LAPU/g，所述复合酶可由市售单酶配制而成，其载体采用精制硅藻土。

上述制得的产品水解度测定方法为甲醛滴定法；总氮测定方法为凯氏定氮法；蛋白质含量测定方法为Folin-酚试剂法。

本发明的有益效果：

1）、本发明对大豆分离蛋白与脱脂蚕蛹同时进行水解，蚕蛹壳可作为助滤剂，板框过滤时无需加入硅藻土，既节约了生产成本，也减少了因硅藻土对寡肽的吸附作用而导致的收率降低；二者在酶解过程中得到了充分的混合，无需要额外的混合工序将大豆寡肽与蚕蛹寡肽混合均匀，不仅降低生产成本，而且均匀度高，无粉尘产生，不污染工作环境；

2）、本发明采用自然pH值进行酶解，无需用酸碱调节pH值，节约了生产成本，同时避免了酸碱对设备损害与对环境的污染，避免了酸碱中可能存在的有害成分进入产品；

3）、本发明采用截断分子量为5000Da的超滤膜分离水解度低的大分子物质，取代了传统工艺中的酸沉工艺，避免了因采用氢氧化钠回调pH值而产生大量的氯化钠，从而无需采用脱盐工艺，节约了大量的酸碱，有利于设备维护与环境保护；

4）、本发明采用多级超滤与纳滤的方式对产品进行分级分离和浓缩，取代了传统工艺中的双效真空浓缩工艺，一方面节约了能源，另一方面因无需加热，避免了色素的大量产生，无需采用脱色工艺；

5）、本发明采用复合酶是专门为寡肽清洁生产工艺而研制的专用酶制剂，其酶系组成是碱性蛋白酶80000~100000u/g、中性蛋白酶30000~35000u/g、风味蛋白酶100~127LAPU/g，即每克复合酶中的碱性蛋白酶的活力为80000~100000u、中性蛋白酶的活力30000~35000u、风味蛋白酶的活力100~127LAPU，其中碱性蛋白酶与中性蛋白酶的酶活力检测方法参照GB/T 23527-2009《蛋白酶制剂》，风味蛋白酶酶活力检测参照丹麦诺维信公司的检测方法AF298/1，1LAPU（亮氨酸氨基肽酶单位）即每分钟水解1mmol L-亮氨酸-对硝基苯胺所需的酶量；所述复合酶可由市售单酶配制而成，复合酶的载体采用精制硅藻土，不含淀粉、葡萄糖、氯化钠等糖类与无机盐，不仅避免了因加入酶而增加产品灰分含量，同时避免了因糖类与氨基酸发生梅拉德反应而产生色素——这也是本发明可以省略脱盐与脱色工艺的原因之一；

6）、本工艺无脱盐与脱色环节，简化了工艺流程，避免了因离子交换树脂的再生与活性炭脱色而导致环境污染，实现了清洁生产；

7）、本工艺通过多级膜分级分离，得到了不同分子量且纯度较高的大豆与蚕蛹复合寡肽。

具体实施方式

实施例中使用的大豆分离蛋白由山东万得福实业集团有限公司提供；脱脂蚕蛹粉由泰安信得利生物工程公司提供；复合酶由济宁和美生物工程有限公司提供；5000Da超滤膜、2000Da超滤膜、1000Da超滤膜采用上海过滤器厂提供的SG-UA系列产品；纳滤膜采用上海过滤器厂提供的SG-UD-F200系列产品。

实施例1、规模化制备大豆与蚕蛹复合寡肽

1）、原料称取： 5m³的酶解罐一次投入的原料数量为300kg大豆分离蛋白和100kg脱脂蚕蛹粉。具体可根据泡沫情况进行增减，以保证投料后加热时泡沫不溢出罐外为准；

2）、加水投料：向酶解罐中加入去离子水，采用反渗透法制备的无离子水，根据料水比计算需加入的水量。料水重量比为1∶9。开动搅拌，缓缓倒入大豆分离蛋白与脱脂蚕蛹粉，搅拌均匀，尽量避免结块；

3）、加热变性：夹套通蒸汽，升温至90℃，维持10分钟。然后夹套通冷水降温至55℃；

4）、调整pH值：采用自然pH值进行酶解，无需调节pH值。自然pH值水解时水解速度稍微变慢，但对最终水解度没有显著影响；

5）、复合酶解：加入10-12公斤的复合酶，于50~55℃恒温水解5~6h；

6）、升温灭酶：酶解结束后，升温至85~95℃，维持10~15min进行灭酶，然后迅速降温至45~50℃；

7）、板框过滤：过滤过程中先自流，然后慢慢升压，不需要助滤剂。过滤完毕后，泵入清水进行洗糟；

8）、超滤分级：将得到的澄清滤液采用截断分子量为5000Da超滤膜进行超滤，截留液回流至酶解罐在下一批次继续酶解，透过液继续依次采用截断分子量为2000Da与截断分子量为1000Da超滤膜进行分级分离；

9）、纳滤浓缩：分子量小于1000Da的组分采用纳滤膜进行浓缩；水与无机盐可以透过纳滤膜；

10）、喷雾干燥：各级超滤截留液与纳滤浓缩液分别于料温55-65℃，进口温度180-200℃，出口温度70-80℃的条件下进行喷雾干燥得到不同分子量的大豆与蚕蛹复合寡肽。

实施例2、试验室制备大豆与蚕蛹复合寡肽

1）、准确称取75g 大豆分离蛋白与25g脱脂蚕蛹粉，置于2000ml的具塞三角瓶中，加入900ml去离子水，搅拌均匀；

2）水浴加热至90℃，维持10min使蛋白质适度变性，然后冷却至55℃；

3）加入3g的复合酶，于自然pH值、50~55℃恒温水解5~6h；

4）迅速升温至90℃并保温10min进行灭酶，然后冷水浴迅速降温至50℃以下；

5）酶解液真空抽滤至滤饼干裂，收集澄清滤液；

6）将滤液分别采用截断分子量为5000Da、截断分子量为2000Da与截断分子量为1000Da的实验室用平板式超滤膜进行分级分离。分子量小于1000Da的透过液采用实验室用平板式纳滤膜进行浓缩；

7）、各级超滤截留液与纳滤浓缩液分别于料温55-65℃，进口温度180-200℃，出口温度70-80℃的条件下采用实验室微型喷雾干燥机进行喷雾干燥，得到不同分子量的大豆与蚕蛹复合寡肽产品。

Claims (2)

1.一种复合酶水解法制备大豆与蚕蛹复合寡肽的清洁生产方法，其特征在于：以大豆分离蛋白与脱脂蚕蛹粉为原料，首先将其配制成一定浓度的醪液，搅拌均匀后对其进行加热变性，冷却后加入一定量的复合酶进行水解，然后采用板框过滤与袋式精滤进行固液分离，滤液再依次进行超滤分级、纳滤浓缩、喷雾干燥，得到不同分子量的大豆与蚕蛹复合寡肽，其生产工艺包括以下步骤：

1) 采用去离子水，将大豆分离蛋白与脱脂蚕蛹粉按2.5:1~3.5:1配制成为8~10%(wt)的醪液，搅拌均匀后于85~95℃加热8~12min使蛋白质进行变性；

2) 溶液冷却后，将复合酶添加到料液中，按底物干料计加入2.5~3.5%(wt)的复合酶，于50~55℃酶解5~6h，然后升温至85~95℃维持10~15min进行灭酶，灭酶后迅速冷却至45~50℃，所述的复合酶的酶系组成是碱性蛋白酶80000~100000u/g、中性蛋白酶30000~35000u/g、风味蛋白酶100~127LAPU/g，所述复合酶由市售单酶配制而成，其载体采用精制硅藻土；

3) 酶解完毕后，采用板框过滤与袋式精滤进行固液分离，得到澄清的滤液；

4) 滤液采用截断分子量为5000Da超滤膜进行超滤，分子量大于5000Da的组分被截留，这一组分回流至酶解罐在下一批次继续酶解；透过截断分子量为5000Da超滤膜的组分继续采用截断分子量为2000Da超滤膜进行分级分离；

5）分子量大于2000Da的组分被截断分子量为2000Da超滤膜截留，这一组分直接进行喷雾干燥；透过截断分子量为2000Da超滤膜的组分继续采用截断分子量为1000Da超滤膜进行分级分离；

6）分子量大于1000Da的组分被截断分子量为1000Da超滤膜截留，这一组分直接进行喷雾干燥；透过截断分子量为1000Da超滤膜的组分进一步采用纳滤膜进行浓缩，氨基酸与小肽等组分被纳滤膜截留，直接进入喷雾干燥；水和无机盐可以透过纳滤膜；

7) 将各级截留物分别进行喷雾干燥得到不同分子量的生物活性肽粉；所述喷雾干燥的条件为：料液温度为50-55℃，进口温度为180-200℃，出口温度为70-80℃。

2.根据权利要求1所述的复合酶水解法制备大豆与蚕蛹复合寡肽的清洁生产方法，其特征在于：步骤1) 所述的去离子水是采用反渗透法生产的去离子水。