CN102327255A - 左旋樟脑在制备防治缺血性中风药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
左旋樟脑在制备防治缺血性中风药物中的应用，涉及医药领域。左旋樟脑在制备防治中风药物中的应用，所说的药物是由左旋樟脑和药学上可接受的载体组成的组合物。左旋樟脑人的使用剂量约为0.3mg/kg~0.9mg/kg 。所述药物的组合物可制成注射液、滴丸、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂或口服液。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及左旋樟脑在制备预防与治疗缺血性中风药物中的用途。
背景技术
缺血性中风是常见病、多发病, 死亡率与致残率很高, 严重威胁人类的生命与生存质量，这些构成了一个严重的社会问题。缺血性中风的病理特征之一是神经细胞损害引起的神经功能障碍，因此, 对缺血性神经细胞有保护作用的药物是治疗缺血性中风有效的药物，见文献：Tuttolomondo A, Di Sciacca R, Di Raimondo D, Arnao V, Renda C, Pinto A, Licata G. Neuron protection as a therapeutic target in acute ischemic stroke. Curr Top Med Chem. 2009; 9 (14):1317-34）。文献Wu D. Neuroprotection in experimental stroke with targeted neurotrophins. NeuroRx. 2005; 2(1):120-8，证明了脑源性神经营养因子、血红蛋白具有神经保护作用。但外源性补充大分子脑源性神经营养和血红蛋白不易通过血脑屏障，而限制了大分子脑源性神经营养和血红蛋白在临床的应用。小分子化合物由于分子量小容易透过血脑屏障，直接作用于脑内神经细胞发挥作用，与大分子脑源性神经营养和血红蛋白相比，更有广泛的应用前景。因此开发和研制保护缺血性神经细胞的小分子化合物是研制防治缺血性中风药物的重要途径。
醒脑静注射液是临床上广泛用于治疗急性中风疗效显著的中成药，是国家中医药管理局指定的临床急救必备药品。《卫生部颁药品标准（中药成方制剂第十七册）》中醒脑静注射液的处方与制法如下：麝香7.5g，郁金30g，冰片1g，栀子30g。以上四味，郁金、栀子加水约1500ml进行蒸馏，收集蒸馏液1000ml；将麝香加入上述蒸馏液中，并加蒸馏水250ml进行蒸馏，收集蒸馏液1000ml，备用；取冰片，加入8g聚山梨酯80，研匀，加入蒸馏液中，混匀，加入注射用氯化钠8g，搅拌使溶解，混匀，放置；冷藏过夜，滤过,灌封，灭菌，即得。醒脑静注射液有保护缺血性神经细胞作用，研究显示醒脑静注射液的临床应用相对安全、可靠。但近年来，随着人们用药安全意识的提高以及醒脑静注射液的广泛使用，醒脑静注射液不良反应病例有所增加。而这些不良反应的发生主要是由于中药注射液醒脑静有效成分不清晰，作用机制不明。
目前防治缺血性中风有效的药物还不多，临床上所用的溶栓药如组织型纤溶酶原激活剂等治疗缺血性脑卒中, 在缺血性脑卒中发作后3小时内用药，虽收到较好效果，但尚未解决脑出血等问题。可见，研究开发有效的抗缺血性脑损伤药物，无疑是药学研究的重要课题之一。有些保护缺血性神经细胞药物，诸如钙离子拮抗剂、兴奋性氨基酸拮抗剂、自由基清除剂等, 但疗效不甚理想。所以有必要开发有效的保护缺血性神经细胞药物用于防治缺血性中风。
樟脑为小分子化合物。英文名Camphor，化学名为莰酮－[2]，分子式为C10H16O，本品为1,7,7-三甲基二环[2.2.1]庚烷-2-酮，系自樟科植物中提取得天然樟脑，天然樟脑大多为右旋化合物，而化学合成法制得的合成樟脑多为消旋化合物，是左旋樟脑与右旋樟脑的混合物。
樟脑在医药领域一般都作外用药,用作皮肤刺激药。如樟脑醑，用于瘙痒性皮肤炎、冻疮或局部发赤。樟脑的药效作用，主要有兴奋与强心，消炎、镇痛、抗菌，止咳，促渗等作用。未见有报道樟脑有其它的医药用途。
发明内容
本发明的目的是提供左旋樟脑在制备防治缺血性中风药物中的应用。
左旋樟脑在制备防治中风药物中的应用，所说的药物是由左旋樟脑和药学上可接受的载体组成的组合物。
所说的左旋樟脑的结构式是
别名：(-)-樟脑, (1S)-1,7,7-三甲基二环[2.2.1]庚烷-2-酮，分子量：152.23，旋光度是-44.2°。
本发明所述左旋樟脑人的使用剂量约为0.3 mg/kg ~ 0.9 mg/kg。
所述药物的组合物可制成注射液、滴丸、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂或口服液等。
本发明是在细胞水平上, 筛选樟脑中保护缺血性神经细胞损伤的活性成分过程中，发现左旋樟脑有抗神经细胞损伤作用，其神经保护作用与抑制神经细胞凋亡作用有关。在局灶性脑缺血损伤大鼠整体模型上, 并与临床治疗急性中风有效制剂醒脑静注射液进行比较，发现左旋樟脑有降低脑缺血大鼠死亡率，减轻大鼠局灶性脑缺血后的行为学异常，减少脑缺血梗塞面积的作用。左旋樟脑对大鼠局灶性脑缺血急性损伤有保护作用, 其有效剂量指能起到降低脑缺血大鼠死亡率，减轻大鼠局灶性脑缺血后的行为学异常，减少脑缺血梗塞面积的起效剂量范围，其为2 mg/kg~6 mg/kg。
以下通过试验证明本发明所说的左旋樟脑用于制备防治缺血性中风药物中应用。
试验例1
采用体外培养肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（简称PC12细胞）和大鼠大脑皮层神经细胞, 建立血清饥饿、过氧化氢和谷氨酸损伤神经细胞模型，以噻唑蓝（简称MTT比色）法测定细胞存活率、流式细胞术测定细胞凋亡为药效评价指标, 并与神经细胞保护有效醒脑静注射液进行比较。
(一) 材料和方法
1 材料
药物 左旋樟脑、右旋樟脑、合成樟脑购于sigma公司，醒脑静注射液由无锡济民可信山禾药业股份有限公司生产。
2 方法
2.1 肾上腺嗜铬细胞瘤细胞培养
将肾上腺嗜铬细胞瘤细胞按1×106/cm2接种于培养瓶，5%的二氧化碳、37℃孵箱培养。培养液为含10%马血清、5%胎牛血清、1%青链霉素的高糖DMEM，3天后更换培养液，2-3天换液1次，当肾上腺嗜铬细胞瘤细胞汇合80%时，用含0.25%胰酶室温消化2-3 分钟，按1×104/cm2传代。细胞长至生长对数期时行各种处理。
2.2 皮质神经元原代培养
出生3天以内的新生Wistar大鼠乳鼠，常规消毒后无菌条件下断头取脑，在预冷的D-Hanks液中解剖分离大脑皮层，去除脑膜和血管，D—Hanks液洗2～3次，剪成lmm×lmm×lmm 左右的小块，0．125 胰蛋白酶37℃ 消化20分钟，取出吹打，并用含20% 胎牛血清的DMEM／F12培养基终止反应。200目筛网过滤，取滤液1000r／分钟离心10分钟，弃上清液，用D-Hanks液洗1次，再离心，弃上清液，用含20％胎牛血清的DMEM／F12培养基调节细胞悬液浓度为5×105／ml，接种于经0.01% 多聚赖氨酸包被过夜的培养板中，放入37 ℃恒温的CO2 培养箱内培养。48 小时后全量换液，72 小时后加入终浓度为5 ug／ml的阿糖胞苷作用24 小时，抑制胶质细胞的增殖。以后根据培养基颜色变化，每2～3天半量换液1次。细胞培养至7 天，经神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学法鉴定，神经元占全部细胞总数的80 % 以上，仅少数细胞是星型细胞和其它胶质细胞。取培养10 天的神经细胞进行实验。
2.3 血清饥饿诱导肾上腺嗜铬细胞瘤细胞损伤模型
将细胞种入96孔板或6孔板，并将细胞分为正常对照组、模型组、醒脑静注射液1μl/ml和10μl/ml、药物组3μg/ml及药物组30μg/ml。细胞种入培养板24小时贴壁后，吸出培养上清，换用各种工作液。正常对照组加入血清培养液，模型组加入无血清培养液和溶媒，药物组在加入无血清培养液的同时分别加入3μg/ml以及30μg/ml的药物、醒脑静注射液1μl/ml和10μl/ml。3天后行噻唑蓝检测、膜联蛋白-V流式细胞术、免疫印记检测。
2.4 过氧化氢诱导肾上腺嗜铬细胞瘤细胞损伤模型
将细胞种入96孔板，并将细胞分为正常对照组、模型组、药物组3μg/ml及药物组30μg/ml。细胞种入培养板24小时贴壁后，吸出培养上清，换用各种工作液。0.4 mM 过氧化氢 损伤三小时后，换血清培养，同时加药，24小时后测定噻唑蓝检测。
2.5 谷氨酸诱导肾上腺嗜铬细胞瘤细胞损伤模型
将细胞种入96孔板或6孔板，并将细胞分为正常对照组、模型组、药物组3μg/ml及药物组30μg/ml。细胞种入培养板24小时贴壁后，吸出培养上清，换用各种工作液。100μM/l谷氨酸作用肾上腺嗜铬细胞瘤三小时后，换无血清培养，同时药物组加入各种药物，24小时后行噻唑蓝检测、膜联蛋白-V流式细胞术、免疫印记检测。
2.6 谷氨酸诱导皮质神经元凋亡模型
将细胞种入96孔板或6孔板，并将细胞分为正常对照组、模型组、药物组3μg/ml及药物组30μg/ml。细胞种入培养板24小时贴壁后，吸出培养上清，换用各种工作液。100μm/l 谷氨酸作用皮质神经元三小时后，换无血清培养，同时药物组加入各种药物，24小时后检测噻唑蓝检测, 膜联蛋白-V流式细胞术。
2.7 噻唑蓝检测测定肾上腺嗜铬细胞瘤细胞存活率
每孔加入终浓度为5 g/L的噻唑蓝 20μl，继续培养4小时后，吸弃半量培养基，每孔加入二甲基亚砜100μl，振荡10 分钟，溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶标仪测定570nm波长处吸光度值(O天值)，以此作为参考，判定肾上腺嗜铬细胞瘤细胞细胞的活性。每组5孔，3次独立实验。
2.8 膜联蛋白-V流式细胞术双染流式细胞术检测细胞凋亡率
离心收集细胞，重悬于结合缓冲液中，加入5μl膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素和1μl碘化丙锭，室温闭光染色10分钟，流式细胞仪检测细胞凋亡率。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞为（异硫氰酸荧光素-/碘化丙锭-）；右上象限是坏死细胞，为（异硫氰酸荧光素+/碘化丙锭+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（异硫氰酸荧光素+/碘化丙锭-）。正常的活细胞不被膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素和碘化丙锭染色，凋亡早起的细胞仅被膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素染色，坏死细胞和凋亡晚期细胞可以同时被膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素和碘化丙锭染色。每组复孔，3次独立实验。
2.9 免疫印记 法检测酪氨酸受体激酶A
离心收集细胞，加入适量蛋白裂解液及酶抑制剂，高速低温离心，提取细胞蛋白。取蛋白样品，加6×上样缓冲液，100℃煮，离心，取20μl上样，行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶5%，分离胶10%，于80-100V电泳80分钟。将分离胶完整取下，于转移缓冲液静置30分钟后，转移夹靠PVDF膜，排除气泡，以31mA转移60分钟。取出PVDF膜，TTBS洗5分钟3次，5%脱脂牛奶封闭30 分钟，加一抗β-actin， 酪氨酸激酶A（1：500稀释），4℃过液，次日用TTBS洗PVDF膜3次后，加1：5000二抗（兔抗小鼠、羊抗兔IgG-小时RP），室温反应1小时。TTBS洗10分钟 3次，超敏发光液反应5分钟，X光片感光，显影，定影，Quantity one扫描条带光密度值。每组3张片，3次独立实验。
2.10 统计学分析
实验数据均以（平均数+标准误）表示。应用SPSS17.0医用统计软件包进行方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
(二)结 果
1、左旋樟脑抗血清饥饿诱导肾上腺嗜铬细胞瘤细胞损伤
噻唑蓝结果表1显示，模型组与正常对照组比较细胞吸光度明显下降, 提示了无血清培养肾上腺嗜铬细胞瘤细胞三天后诱导了损伤的发生。 左旋樟脑30μg/ml组细胞活性与模型组相比明显提高，P<0.05，提示左旋樟脑能抗血清饥饿诱导肾上腺嗜铬细胞瘤细胞损伤; 而右旋樟脑两个剂量与模型组相比均没有明显差异, 提示右旋樟脑没能抗血清饥饿诱导肾上腺嗜铬细胞瘤细胞损伤。樟脑30μg/ml组细胞活性与模型组相比明显提高，P<0.05，推测可能是由其中含有的左旋樟脑所导致。
结论：左旋樟脑抗血清饥饿诱导肾上腺嗜铬细胞瘤细胞损伤。
表1 左旋樟脑抗血清饥饿诱导肾上腺嗜铬细胞瘤细胞损伤
注：＃ P < 0.05，与正常对照比较，* P < 0.05与血清饥饿比较。
2、 左旋樟脑抗过氧化氢诱导肾上腺嗜铬细胞瘤细胞损伤
噻唑蓝结果表2显示，模型组与正常对照组比较细胞活性明显下降, 提示了过氧化氢培养肾上腺嗜铬细胞瘤细胞后诱导了损伤的发生。左旋樟脑组细胞活性与模型组相比明显提高，P<0.05，可见左旋樟脑能抗过氧化氢诱导肾上腺嗜铬细胞瘤细胞损伤。
结论：左旋樟脑抗过氧化氢诱导肾上腺嗜铬细胞瘤细胞损伤。
表2 左旋樟脑抗过氧化氢诱导肾上腺嗜铬细胞瘤损伤剂量效应
注： ＃ P<0.05，与正常对照比较，*P<0.05与过氧化氢比较。
3、 左旋樟脑抗谷氨酸诱导肾上腺嗜铬细胞瘤细胞损伤
噻唑蓝结果表3显示，模型组与正常对照组比较细胞活性明显下降, 提示了谷氨酸培养肾上腺嗜铬细胞瘤细胞后诱导了损伤的发生。 左旋樟脑组细胞活性与模型组相比明显提高，P<0.05。
结论：左旋樟脑能抗谷氨酸诱导肾上腺嗜铬细胞瘤细胞损伤。
表3 左旋樟脑抗谷氨酸诱导肾上腺嗜铬细胞瘤损伤
注：＃ P < 0.05，与正常对照比较，* P< 0.05与谷氨酸比较。
4、膜联蛋白V/碘化丙啶双染流式细胞术检测肾上腺嗜铬细胞瘤细胞凋亡率
膜联蛋白V/碘化丙啶流式细胞术结果进一步证实了左旋樟脑具有抗谷氨酸诱导肾上腺嗜铬细胞瘤细胞凋亡的能力。流式结果显示，正常对照组、模型组、左旋樟脑组(3μg/ml)、左旋樟脑组（30μg/ml)的凋亡率为9%、50%、20%、11%，左旋樟脑(3μg/ml)、左旋樟脑(30μg/ml)与模型组相比，P<0.05；左旋樟脑(30μg/ml)与左旋樟脑(3μg/ml)相比，p <0.05。表明了左旋樟脑能明显降低谷氨酸诱导肾上腺嗜铬细胞瘤细胞凋亡率，并呈剂量依赖性。
结论：左旋樟脑能降低谷氨酸诱导肾上腺嗜铬细胞瘤细胞凋亡。
5、 左旋樟脑抗谷氨酸诱导皮质神经元损伤
噻唑蓝结果表4显示，模型组与正常对照组比较细胞活性明显下降, 提示了谷氨酸培养皮质神经元后诱导了损伤的发生。左旋樟脑组细胞活性与模型组相比明显提高，P<0.05。可见左旋樟脑能抗谷氨酸诱导皮质神经元损伤。
结论：左旋樟脑能抗谷氨酸诱导皮质神经元损伤。
表4 左旋樟脑抗谷氨酸诱导皮质神经元损伤
注：＃P<0.05，与正常对照比较，*P<0.05与谷氨酸比较。
6、膜联蛋白V/异硫氰酸荧光素双染流式细胞术检测皮质神经元凋亡率
膜联蛋白V/异硫氰酸荧光素流式细胞术结果进一步证实了左旋樟脑具有抗谷氨酸诱导皮质神经元凋亡的能力。流式结果显示，正常对照组、模型组、C组(3μg/ml)、C组（30μg/ml)的凋亡率为2%、26%、8%、3%，左旋樟脑(3μg/ml)、左旋樟脑(30μg/ml)与模型组相比，P<0.05；左旋樟脑(30μg/ml)与左旋樟脑(3μg/ml)相比，p<0.05。表明了左旋樟脑能明显降低谷氨酸诱导皮质神经元凋亡率，并呈剂量依赖性。
结论：左旋樟脑具有抗谷氨酸诱导皮质神经元凋亡。
7、 左旋樟脑上调肾上腺嗜铬细胞瘤细胞酪氨酸激酶A表达
为在蛋白水平上探讨左旋樟脑的抗凋亡机理，我们检测了酪氨酸激酶A的表达水平。酪氨酸激酶A在生长因子剥离而诱导的凋亡中扮演着关键性的角色。免疫印记结果显示，血清饥饿模型组酪氨酸激酶A的表达水平为未检测水平，左旋樟脑低剂量组和高剂量组表达上调。结果表明左旋樟脑以剂量依赖性上调血清饥饿诱导凋亡肾上腺嗜铬细胞瘤细胞酪氨酸受体激酶A表达。
结论：左旋樟脑上调肾上腺嗜铬细胞瘤细胞酪氨酸激酶A表达。
试验例2 左旋樟脑对脑缺血大鼠脑保护活性
在局灶性脑缺血损伤（急性中风）大鼠整体模型上, 以脑缺血大鼠死亡率、大鼠神经功能缺损积分、脑缺血梗塞面积和细胞凋亡为药效评价指标,并与临床治疗急性中风有效醒脑静注射液进行比较，评价左旋樟脑对脑缺血大鼠脑保护活性。
(一) 材料和方法
1、材料
实验动物：纯种SD大鼠，清洁级，雌雄各半，月龄4～7个月，体重250～300g。左旋樟脑、右旋樟脑、合成樟脑购于sigma公司，制备成1mg/mL的注射剂。醒脑静注射液由无锡可信山禾药业股份有限公司生产。
2、大脑中动脉线栓法脑缺血再灌注模型
取大鼠，用10%水合氯醛腹腔麻醉仰卧手术台上，颈正中切开，分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，电热烧灼器烧断颈外动脉的分支，结扎并游离颈外动脉主干一段，沿颈内动脉向下分离翼颚动脉，穿线沿起点结扎。在颈外动脉剪一小口注入0.03ml浓度为2.4×106U/L肝素钠溶液，将制备好的直径0.205mm日本制尼龙线插入颈外动脉，通过颈内动脉入颅至大脑前动脉，尼龙线插入深度平均为18.5+0.5mm。以阻断该侧大脑中动脉的血流。此时大鼠左眼虹膜颜色变浅。出现右侧horner’s综合征，右侧眼裂变小，瞳孔缩小出现左侧偏瘫，以左上肢为明显，提尾悬拉后出现左转圈、跌倒。再灌注时外拉尼龙线使其球端回至ECA内即可恢复大脑中动脉血供。
3、实验分组
实验大鼠分为脑缺血模型组，醒脑静注射液低剂量组和高剂量组、左旋樟脑低剂量组和高剂量组，每组动物数20只。醒脑静注射液组于造模后给予鼠尾静脉注射醒脑静注射液，醒脑静注射液低剂量组0.5ml/次，高剂量组1.5ml/次，1次/天，连续10天;左旋樟脑组于造模后给予鼠尾静脉注射左旋樟脑，左旋樟脑低剂量组0.5mg/次，高剂量组1.5mg/次，1次/天，连续10天; 脑缺血模型组则给予鼠尾静脉注射等体积溶媒。第10 天 后大鼠断头取脑，分别进行梗塞面积，细胞凋亡，免疫组织化学染色和免疫印记 分析。
4 、观察指标
4．1 死亡率
观察脑缺血治疗10天过程中大鼠死亡率。
4．2 神经病学评分
参考Zea Longa 评定神经功能缺损程度的五级4分法标准：0分，无神经功能缺损症状；1分，轻微神经功能缺损，不能完全伸展左侧前爪；2分，中度局灶性神经功能缺损，向左侧转圈；3分，重度局灶性神经功能缺损，向左侧倾倒；4分，不能自发行走，意识水平下降。分别测定脑缺血后10天大鼠的神经功能缺损积分。
4．3 四氮唑红染色测定梗塞面积
第10 天 后大鼠断头取脑，去除嗅球，自额极至小脑作冠状切片，每片厚2 mm。四氮唑红染色30 分钟，图像处理求出梗塞面积。
4．4 缺口末端标记法测定细胞凋亡
第10 天所有大鼠麻醉后，40g/L多聚甲醛主动脉灌注固定，取脑并按大鼠编号逐一加以标记,置同样固定液固定3-4 小时,,常规石蜡包埋，３um厚组织切片，进行细胞凋亡检测，步聚如下：切片常规脱蜡入水,新鲜3%过氧化氢,室温处理10分钟,蒸馏水洗涤2分钟3次；滴加胰酶消化液10分钟,0.01MTBS洗2分钟3次；标本片加标记缓冲液370C水浴箱2小时, 0.01MTBS洗2分钟3次；加山羊血清封闭液室温30分钟,甩掉不洗加入抗体生物素化抗地高辛(1:100)置于370C水浴箱30分钟, 0.01MTBS洗2分钟3次；滴加SABC370C水浴箱30分钟, TBS洗5分钟4次；DAB显色,水洗,苏木素轻度复染,蒸馏水洗,脱水,透明,封片,显微镜观察。结果判定：细胞中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。每张切片随机选取10个100倍视野，计算其中阳性细胞数和总细胞数，求出百分比，分析结果。所有数值输入spp10.0统计软件采用方差分析检验，P<0.05为有统计学意义。
4．5 免疫组织化学染色检测酪氨酸激酶A的表达
脑作常规石蜡包埋，３um厚组织切片，切片常规脱蜡入水,新鲜3%过氧化氢,室温处理10分钟,蒸馏水洗涤2分钟3次，滴加正常山羊血清室温下孵育20 分钟后,分别加一抗兔抗大鼠多克隆抗体酪氨酸激酶A (稀释度1∶400) , 4 ℃孵育过夜,再加二抗，即生物素化羊抗兔IgG（稀释度1∶500）室温下孵育30 分钟，然后加SABC溶液室温下孵育20 分钟，DAB显色，PBS浸洗2次,每次5 分钟。蒸馏水洗，风干，封片。阴性对照以PBS代替一抗，光镜下观察并对酪氨酸激酶A阳性细胞计数，每个标本取切片5张计数取平均值。
4．6 免疫印记法检测酪氨酸激酶A蛋白表达
方法同上。
5、统计学分析
实验数据均以平均数+标准误表示。应用SPSS17.0医用统计软件包进行方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
(二)结 果
1、左旋樟脑降低脑缺血大鼠死亡率
死亡率结果见表5,左旋樟脑组和醒脑静注射液组的死亡率明显低于模型组，它们之间有显著差异性（P<0.05）。
结论：左旋樟脑降低脑缺血大鼠死亡率。
表5 左旋樟脑降低脑缺血大鼠死亡率
2、 左旋樟脑改善脑缺血行为学表现
神经病学评分结果表6显示，脑缺血治疗10天后，模型组大鼠神经功能缺损积分明显高于左旋樟脑组和醒脑静注射液组，它们之间有显著差异性（P<0.05）。结果提示左旋樟脑改善脑缺血行为学表现。
结论：左旋樟脑改善脑缺血行为学表现。
表6 左旋樟脑改善脑缺血大鼠行为学表现
注：* P < 0.05与模型组比较。
3、 左旋樟脑减少脑缺血梗塞面积
四氮唑红染色结果见表7显示，左旋樟脑组和醒脑静注射液组的梗塞面积明显小于模型组，它们之间有显著差异性（P<0.05）。
结论：左旋樟脑减少脑缺血梗塞面积。
表7 左旋樟脑减少脑缺血大鼠梗塞面积
注：* P < 0.05与模型组比较。
4 、左旋樟脑减少脑缺血皮层神经细胞凋亡
细胞凋亡缺口末端标记法染色结果见表8显示，模型组皮层神经细胞凋亡的数量明显多于左旋樟脑和醒脑静注射液组，它们之间有显著差异性（P<0.05）。左旋樟脑组皮层区有不同程度神经细胞肿胀，凋亡细胞数量少；模型组的皮层区细胞凋亡情况严重。正常对照组细胞凋亡数量极少。结果表明左旋樟脑以剂量依赖性减少皮层神经细胞凋亡。
结论：左旋樟脑减少脑缺血皮层神经细胞凋亡。
表8 左旋樟脑减少脑缺血大鼠皮层神经细胞凋亡率
注： * P < 0.05与模型组比较。
5、 左旋樟脑促进脑缺血皮层神经细胞酪氨酸激酶A的表达
免疫组织化学细胞阳性率分析表9，左旋樟脑组的皮层神经细胞酪氨酸激酶A阳性细胞显著多于模型组，具有显著的差异性（P<0.01）。免疫印记 结果显示，正常组酪氨酸激酶A表达明显，模型组表达下降，左旋樟脑低剂量组和高剂量组表达上调。结果表明左旋樟脑以剂量依赖性上调皮层酪氨酸受体激酶A表达。
结论：左旋樟脑促进脑缺血皮层神经细胞酪氨酸激酶A的表达。
表9 酪氨酸激酶A阳性细胞率
| 模型组 | 左旋樟脑0.5 ml/天 | 左旋樟脑1.5 ml/天 | |
| 酪氨酸激酶A阳性细胞率（%） | 15 %±3.2 | 26%±3.7* | 42 %±4.0* |
注： * P < 0.05与模型组比较。
以上试验表明左旋樟脑可以用于制备防治缺血性中风药物。从大鼠有效剂量范围2mg/kg~6mg/kg,折算出人体有效剂量约为0.3mg/kg~0.9mg/kg。为了患者服用的方便和根据化合物的特性，可将左旋樟脑添加制备不同剂型时所需的各种常规辅料，按常规的中药制剂工艺制成任何一种口服制剂如片剂、硬胶囊、软胶囊、颗粒剂、咀嚼片，含片，滴丸剂或缓释片等，也可制成注射剂。
从以上结果，可以得出本发明的优点在于：
(1) 左旋樟脑有抗血清饥饿，过氧化氢诱导，谷氨酸诱导肾上腺嗜铬细胞瘤细胞和皮质神经细胞损伤作用，其神经保护作用与抑制神经细胞凋亡作用和上调酪氨酸激酶A的表达有关。
(2) 左旋樟脑对大鼠（急性中风）局灶性脑缺血急性损伤有保护作用, 其有效剂量为2 mg/kg-6 mg/kg, 与临床治疗急性中风有效制剂醒脑静注射液作用基本相仿。其神经保护作用与减少脑缺血皮层神经细胞凋亡作用有关。
下面通过具体实施例阐述本发明的技术方案。
具体实施方式
实施例1 左旋樟脑滴丸的制备
取左旋樟脑10g，加入乙醇10ml中溶解；将80℃熔融的聚乙二醇-4000 20g和聚乙二醇-6000 70g混合物加入药物中，混匀，气泡散尽后，吸取药液以适宜的滴速滴入液体石蜡等冷却剂中，静置成型后取出，干燥即可。即制成含左旋樟脑 10％的滴丸。
实施例2 左旋樟脑注射剂的制备
取左旋樟脑1g，用0.5ml乙醇完全溶解，加吐温－80 8g混合均匀，将氯化钠9g溶于500ml水中，和以上药液混合均匀后，定容至1000ml，灌装入安瓿瓶中，拉丝封口，高压灭菌,制成1mg·ml-1左旋樟脑的注射液。
实施例3 左旋樟脑口服液的制备
取左旋樟脑10g、吐温15g、蔗糖10g，加水至1000ml，配置成浓度为1％水溶液，混合均匀后，过滤，装入玻璃瓶中密封，压盖，高温灭菌，即制得口服液每1ml含左旋樟脑约10mg。
实施例4 左旋樟脑软胶囊剂的制备
取左旋樟脑5g，加入植物油100g，加热至熔融，研磨均匀放入药液贮槽中得内容物；另取明胶、甘油、水，置适宜容器中加热至80℃溶解，滤过，已制好的明胶液60℃保温放入明胶贮槽中，取上述内容物和胶皮溶液，用软胶囊生产设备压制成型，干燥即得,制得软胶囊约125g。每粒重约0.5g,含20mg左旋樟脑。
实施例5 硬胶囊剂
取β-环糊精130g，溶于55℃的水2500ml中，保温。另取左旋樟脑20g，加适量乙醇溶解，在搅拌下缓慢加左旋樟脑溶液于β-环糊精溶液中，滴完后继续搅拌30分钟，冰箱放置24小时，抽滤，蒸馏水洗涤，40℃干燥，即得得β-环糊精包含物.将β-环糊精包含物与糖粉按1：3混合，制成颗粒约600g，装入硬胶囊，即得。每粒重约0.3g,含左旋樟脑约10mg。
实施例6 片剂
取β-环糊精150g，溶于55℃的水4000ml中，保温。另取左旋樟脑20g，加适量乙醇溶解，进行包含，在搅拌下缓慢加左旋樟脑溶液于β-环糊精溶液中，滴完后继续搅拌30分钟，冰箱放置24小时，抽滤，蒸馏水洗涤，40℃干燥，即得得β-环糊精包含物；再加乳糖300g，滑石粉50g，混合均匀，制成颗粒约500g。将硬脂酸镁6.5g与整粒的颗粒混合均匀，用压片机压制成片，即得。每片重约0.25g,含左旋樟脑约10mg。
Claims (1)
1.左旋樟脑在制备防治缺血性中风药物中的应用，所说的药物是由左旋樟脑和药学上可接受的载体组成的组合物。
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