CN102325904B

CN102325904B - 纤维样变性易感基因及其应用

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Publication number: CN102325904B
Application number: CN201080008683.5A
Authority: CN
Inventors: 阿莱恩·德赛因; 维奥莱尼·阿努德; 克里斯托弗·切维拉尔德
Original assignee: France National Medical Association Of Health And Research; Universite de la Mediterranee Aix Marseille II
Current assignee: France National Medical Association Of Health And Research; Aix Marseille Universite
Priority date: 2009-02-19
Filing date: 2010-02-18
Publication date: 2016-03-30
Anticipated expiration: 2030-02-18
Also published as: BRPI1008936B8; CN102325904A; KR101748679B1; EP2221387A1; US20120135403A1; EP2398911A1; CA2752802A1; JP2016047045A; JP5837825B2; WO2010094740A1; US9297044B2; BRPI1008936B1; EP2398911B1; KR20120004971A; CA2752802C; US20160230232A1; JP2012524520A; BRPI1008936A2; CN105907843A

Abstract

本发明公开了纤维样变性易感基因座—CTGF基因座的鉴定，其可用于检测纤维样变性的易感性、纤维样变性的诊断和预后以及治疗活性药物的筛选。具体来说，本发明涉及的方法包含在来自对象的样品中检测CTGF基因座中是否存在变异，所述变异的存在表明纤维样变性的存在或易感性。

Description

纤维样变性易感基因及其应用

发明领域

总的来说，本发明涉及遗传学和医学领域。具体来说，本发明公开了人类纤维样变性易感基因的鉴定，其可用于肝病、肝硬化、皮肤瘢痕疙瘩、肥胖症和任何纤维样变性疾病中发生的纤维样变性的诊断或预后，或用于纤维样变性易感性的诊断。更具体来说，本发明公开了6号染色体上CTGF基因的某些等位基因，其与纤维样变性的易感性相关，并代表了用于筛选治疗活性药物的新靶点。更具体来说，本发明涉及CTGF基因和表达产物中的特定突变以及基于这些突变的诊断工具和试剂盒。本发明还可用于在所有人类纤维样变性疾病中发生的纤维样变性的预防和/或治疗。

发明背景

纤维样变性是在器官、其任何部分或组织中，例如在肝脏、其任何部分或组织中，尤其是对损伤做出响应而发生的纤维结缔组织的过度生长。

异常纤维样变性发生在各种不同病因的慢性肝脏炎症中，例如在肝炎病毒和血吸虫感染中。以前显示，某些被血吸虫感染的对象缓慢形成纤维样变性，而其他对象快速形成纤维样变性，这部分取决于位于Chr6q22-q23上的主要基因(Dessein等，1999；Mohamed-Ali等，1999)。

血吸虫病由在其宿主的血管系统中发育并产卵的蠕虫引起，一些蠕虫被载运到肝脏，它们在那里引发门静脉周间隙中的炎症。因为蠕虫在其人类宿主中生活数年，因此在被感染对象中常见慢性肝脏炎症并伴有大量组织破坏。组织修复需要在受损组织中沉积细胞外基质蛋白(ECMP)，它们晚些时候被正常肝细胞更新代替。在一些患者中，ECMP积累在门静脉周间隙中，形成纤维样变性沉积物，其减少血流，引起静脉曲张、腹水。在慢性或重复损伤数月或数年后，纤维样变性变得永久和不可逆。对象死于纤维样变性的结果。

在南方国家，据估计3.5亿被感染对象中的5至10％可能发展严重肝纤维样变性。在血吸虫感染的对象中没有良好的标志物允许对肝纤维样变性的进展进行预测和跟踪。

肝纤维样变性的诊断主要基于肝脏活检、弹性测定法(Boursier等，2008；Macias等，2008)以及超声波分析(Richter等，2001；Lambertucci等，2004；King等，2003)。

取决于临床背景，活检样品通过经皮、经颈静脉的放射照相引导的细针或腹腔镜途径获得。组织病理学检查能够使临床医生对坏死性炎症的严重性进行评级并对纤维样变性程度进行分级。Metavir评分系统在如下的1-4量级上对纤维样变性的阶段进行评分：F0＝无纤维样变性，F1＝不具有隔膜的门静脉纤维样变性，F2＝门静脉纤维样变性并具有少量隔，F3＝具有大量隔而没有肝硬化，F4＝肝硬化(Bedossa等，1996)。肝脏活检是侵入性和高花费的操作，并且只对肝脏的一小部分取样。因此，它不能提供肝纤维样变性的全面评估，并易受取样变动和观察者间和观察者内误差的影响。此外，肝脏活检伴有3％的显著发病率和0.03％的死亡率(Garcia-Tsao等，1993)。潜在的并发症包括与活检相关的局部血肿、感染和疼痛。

非侵入性测试(例如血清学标志物、组织弹性测定法、超声波分析)也被使用，但是尚未准备好用于常规临床使用。

已经在主要是患有慢性丙型肝炎或由丙肝病毒引起的肝硬化的患者中对血液标志物组进行了测试。这些研究表明，这些血清标志物能够在约35％的患者中判断出或排除纤维样变性(Sebastiani等，2006)。然而，当对患者个体进行考察时，这些标志物不能可靠地区分纤维样变性的各种不同阶段。更近的研究将三组血清标志物合并以设计改进诊断精确度的算法(Parkes等，2006)。被评估的三个组是APRI(天冬氨酸转氨酶与血小板比率指数)、Forns指数(血小板、γ-谷氨酰转肽酶、胆固醇)和Fibrotest(GGT、触珠蛋白、胆红素、载脂蛋白A、α-2-巨球蛋白)。由APRI继之以Fibrotest所构成的算法将纤维样变性的诊断精确度提高至超过90％。该研究组估计，使用这种算法能够避免高达50％的肝脏活检需要。然而，使用这种算法不能辨别纤维样变性的各个阶段。这些血清标志物的限制是当存在高度活动的肝脏炎症时假阳性的可能性。

Fibroscan是用于对肝纤维样变性进行分级的另一项革新方法，其基于弹性成像，提供了肝组织平均刚度的快速测量(Ziol等，2005)。使用探头将低频低振幅的振动传送到肝脏中。该振动波触发弹性剪切波，其通过肝脏的速度与以千帕斯卡(kPa)计的组织刚度成正比。与肝脏活检相比，Fibroscan技术的灵敏度在79至95％的范围内，特异性为78至95％。然而，该技术的限制与弹性波在流体或脂肪组织中的衰减相关，这种衰减将损害患者中纤维样变性的评估。此外，Fibroscan是极其昂贵的仪器。

然而，不存在对纤维样变性的发展和治疗效果进行预后的有效方法。

已经测试了大量分子用于肝纤维样变性治疗。例如，已使用皮质类固醇在自体免疫和酒精性肝炎中抑制肝脏炎症(Czaja等，2003)。已证明，熊去氧胆酸通过结合胆酸从而也降低肝脏炎性在PBC患者中增加存活率(Poupon等，1997)。使用特异性受体拮抗剂(TNF-α、IL-1受体拮抗剂)和前列腺素E中和炎性细胞因子，已经在鼠类模型中测试，但尚未在人类中测试(Bruck等，1997)。

缩减肝纤维样变性的另一个有吸引力的靶点是肝脏星形细胞活化的下调。将γ-干扰素与病毒唑组合使用来治疗丙肝感染。据推断，干扰素的抗纤维样变性效应可能部分与星形细胞活化的下调相关。该机制能够解释在患有病毒性丙型肝炎、对α-干扰素没有病毒学响应的患者中所描述的纤维样变性的改善(Poynard等，1998)。

目前正在人类中进行抗氧化剂(N-乙酰半胱氨酸、α-生育酚)试验。血管紧张肽II受体在星形细胞活化中上调，因此血管紧张肽转化酶抑制剂和血管紧张肽受体抑制剂已在体外和动物中被证明具有抗纤维样变性活性。这一点还没有在人类中重复(Jonsson等，2001)。通过基质金属蛋白酶促进基质降解，是在鼠类模型中显示出有益的抗纤维样变性策略(Iimuro等，2003)。肝脏星形细胞的特异性凋亡是另一个有趣的理论想法，但是还没有被调查(Gressner等，1998)。旨在逆转纤维样变性的治疗通常对于长期使用来说毒性太强(即皮质类固醇、青霉胺)或没有证实过的效果(即秋水仙素)。

总而言之，目前缺乏有效且良好耐受的抗纤维样变性药物，并且当前的纤维样变性治疗限于有毒因子的去除。

以前已经报道，纤维样变性发展受到Chr6q23上主要基因座的显著影响(Dessein等，1999)。还已提出，CTGF基因通过与各种前纤维形成生长因子包括PGDF、VEGF和主要纤维形成分子TGF-β的协同增效作用，造成纤维样变性增加(Leask等，2006)。更具体来说，CTGF起到TGF-β下游调节剂的作用(Leask等，2006；Leask等，2003)。它增加TGF-β与其受体的结合，干扰对TGF-β的Smad-7负反馈回路(Wahab等，2005)；它抑制主要的TGF-β拮抗剂BPM-7的受体结合(Abreu等，2002)。CTGF对TGF-β作用的重要结果是刺激肝脏星形细胞和其他实质细胞转移分化到参与进行性纤维样变性过程的产ECMP的肌成纤维细胞中(Kalluri等，2003；Neilson等，2005)。据认为，CTGF还通过其与ECMP上的纤连蛋白结构域结合的能力增加ECMP联网(Gressner等，2007；Yoshida等，2007)。CTGF由各种细胞产生，所述各种细胞包括肝细胞(Kobayashi等，2005；Gressner等，2007)、肝脏星形细胞、肌成纤维细胞和内皮细胞(Gressnet等，2008)。在受不同病因来源的纤维样变性影响的不同组织包括肝脏中，已报道CTGF转录本的过表达(Rachfal等，2003)。在大鼠中进行的实验工作已显示，通过siRNA抑制CTGF阻止或减轻了组织纤维样变性(Li等，2006；George等，2007)。

然而，控制人类纤维样变性易感性的遗传因子以及它们对纤维样变性进展的影响，还没有被鉴定。

发明概述

本发明的目的是提供用于纤维样变性预后和治疗的新的遗传方法。本发明现在公开了人类纤维样变性易感基因座——CTGF基因座(CCN2)的鉴定，其可用于检测纤维样变性、特别是肝纤维样变性的易感性及其诊断和预后，以及用于治疗活性药物的筛选。具体来说，本发明涉及的方法包含在来自对象的样品中检测CTGF基因座(CCN2)中是否存在变异，所述变异的存在表明纤维样变性的存在或易感性。

本发明的具体目的在于检测对象中发生纤维样变性的易感性或对纤维样变性进行诊断和/或预后的体外方法，所述方法包含在来自所述对象的样品中检测CTGF基因或多肽是否存在变异，所述变异的存在表明纤维样变性的存在或纤维样变性的易感性。本发明的具体目的在于评估(预测)纤维样变性的进展的方法。

在优选实施方案中，所述变异位于CTGF基因的起始密码子上游20kb和CTGF基因的3’UTR下游20kb之内。

优选情况下，变异位于CTGF基因的起始密码子上游15.3kb区域和CTGF基因的非翻译区(3’UTR)下游14.1kb区域的附近序列中。

在另一个优选实施方案中，所述变异是一个或多个碱基的突变、插入或缺失。在更优选实施方案中，所述变异是与纤维样变性相关的一个或几个单核苷酸多态性(SNP)或SNP的单倍型。优选情况下，所述单核苷酸多态性是CTGF基因两侧的SNP，其是与CTGF基因位置接近的等位基因变体。

本发明的方法允许对发生在选自肝病纤维样变性、肝硬化、皮肤瘢痕疙瘩、增生性瘢痕和肥胖症的人类纤维样变性疾病中的纤维样变性进行检测和预后。尤其是，肝纤维样变性可以由甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒(HCV)、日本血吸虫(Schistosomajaponicum)(S.japonicum)或曼氏血吸虫(Schistosomamansoni)(S.mansoni)感染引起。

在具体实施方案中，方法包含在感染HCV的对象的生物样品中检测CTGF基因座中是否存在SNPrs9402373和/或rs6918698，其中在rs9402373位置处存在等位基因C和/或在rs6918698位置处存在等位基因G，指示对象中发生肝纤维样变性的风险或肝纤维样变性的发生或肝纤维样变性的不良预后。

优选情况下，CTGF基因座中的变异通过执行选择性杂交测定法、序列测定法、微测序测定法和/或等位基因特异性扩增测定法来确定。

在本发明的另一方面，CTGF基因中的所述变异通过限制性酶消化来确定，至少一个所述SNP的检测指示纤维样变性。

本发明还涉及为患有纤维样变性或对发生纤维样变性易感的对象选择治疗化合物的方法，所述方法包含将测试化合物与CTGF多肽或基因或其片段相接触，并确定所述测试化合物增强或降低与CTGF基因相关的途径的生物活性或功能的能力。

附图说明

图1：渔民中CTGF(＝CCN2)基因座的关联性组(Correlationbin)。

如材料和方法中所述，在70位不相关对象上对33个标志物进行基因分型。使用Haploview软件确定SNP之间的关联性(r2值)。最深的颜色表示最强的关联性。关联性组(r2＞0.05)如下：SNPrs9321314、rs6940184、rs12523697、rs9493149和rs12529636在1组中；SNPrs12527705和rs12526196在2组中；SNPrs9399005、rs6918698和缺失/插入(D/I)rs3037970在3组中；SNPrs2151532和SNPrs1931002在4组中；SNPrs9493150、rs928501、rs11966728、rs12198610和新的插入/缺失(132319925-/GAAA)在5组中；SNPrs7747601、rs7768619和rs9402373在6组中；SNPrs12527379和rs2095252在7组中。

在8个病例和2个对照中，对CCN2(3.2kb)和起始密码子上游15.3kb以及3’UTR区中14.1kb进行了测序。它揭示出61个SNP，其中50个以前已被描述。

因为发明人正在寻找具有主要效应的基因，因此他们集中于研究MAF＞20％的53个SNP。在70位渔民上对MAF＞20％的33个SNP进行了基因分型。使用Haploview软件确定SNP之间的关联性(r2值)。下图显示r²值x100。最深的颜色表示最强的关联性。在该图上方，提供了带有每个标志物的相对位置的物理图谱。这些标志物被分组在7个关联性(r2＝0.5)组(I至VII)中。

SNPrs9321314、rs6940184、rs12523697、rs9493149和rs12529636在1组中；SNPrs12527705和rs12526196在2组中；SNPrs9399005、rs6918698和D/Irs3037970在3组中；SNPrs2151532和SNPrs1931002在4组中；SNPrs9493150、rs928501、rs11966728、rs12198610和新的插入/缺失(132319925-/GAAA)在5组中；SNPrs7747601、rs7768619和rs9402373在6组中SNPrs12527379和rs2095252在7组中。

在全部渔民样品(201个对照和99个病例)中对22个SNP进行进一步基因分型。单变量分析的结果显示在图1顶部和表1和4中。与肝纤维样变性相关的SNP是组II中的SNPrs12527705(p＝0.02，OR＝2.3)和SNPrs12526196(p＝0.02，OR＝2.2)、组III中的SNPrs9399005(p＝0.02，OR＝2.2)、SNPrs6918698(p＝0.02，OR＝2)和D/Irs3037970(p＝0.003，OR＝2.6)、组IV中的SNPrs1931002(p＝0.004，OR＝2.3)和rs2151532(p＝0.02，OR＝1.98)以及组VI中的SNPrs9402373(p＝0.015，OR＝2)。将分析根据性别(p＜0.001)、暴露(捕鱼年数：p＜0.001，生于船上：p＜0.01)和治疗次数(p＜0.01)进行了调整。

在本分析中，在同时测试两个SNP的多变量分析中，D/Irs3037970排除rs6918698。同样地，SNPrs1931002排除SNPrs2151532；SNPrs1256196排除SNPrs12527705和SNPrs9399005。这表明SNP或缺失rs12526196、rs30337970、rs1931002、rs9402373与肝纤维样变性(HF)具有最强相关性。当在相同的回归模型中对所有4种SNP进行测试时(表4下部)，SNPrs12526196(p＝0.007，OR＝3)、rs9402373((p＝0.002，OR＝2.8)和rs1931002(p＝0.002，OR＝2.8)显示出与HF独立相关。存在于53.9％的对照和67.5％的病例中的单倍型1002C、6196T与HF相关(p＜0.005)。发明人还测试了与具有门静脉高血压迹象的晚期HF相关的表型。他们发现(154个对照和151个病例)的rs9402373(p＝0.005，OR＝2.6)和rs3037970(p＝0.05，OR＝2)与该表型相关，SNPrs1256196显示出与该更严重疾病表型相关的趋势(p＝0.12)。性别(p＝0.001)作为协变量进入模型。这表明rs9402373和rs3037970两者可能对严重疾病具有更重要的贡献。

图2A：电泳迁移率变动分析揭示出核因子与SNPrs12526196和rs9402373的等位基因特异性结合。

按照材料和方法，使用刺激过的人类肝细胞系(HEPG2)的核提取物执行EMSA。12526196T等位基因以与C等位基因相比更高的亲和性结合核因子(复合物1)。SNPrs9402373C等位基因结合核因子(复合物2)，该核因子不被G等位基因结合。使用SNPrs12527705和SNPrs1931002没有观察到等位基因特异性结合。

图2B：rs9402373多态性的竞争性电泳迁移率变动分析。

竞争性反应使用100或200fmol无生物素酰化的rs9402373G和C探针来进行。使用浓度为200fmol的无生物素酰化的rs9402373C探针而不是无生物素酰化的rs9402373G进行的竞争性反应，竞争生物素酰化的rs9402373C探针的结合。

图3显示了在HCV或血吸虫感染的对象中SNPrs9402373与肝纤维样变性的关联性的后设分析。

发明详述

本发明鉴定了纤维样变性发生中最关键的步骤，并提供了有价值的遗传标志物来预测纤维样变性、特别是肝纤维样变性中的疾病进展。

纤维样变性的早期检测和纤维样变性的定期监测，将允许启动能够停止和甚至逆转该过程的抗纤维样变性治疗。这将反过来阻止人类纤维样变性疾病例如肝纤维样变性或肝硬化的发展和该病症造成的发病和死亡。这些各种早期纤维样变性检测技术的开发良好预示了患有肝病患者的未来护理。

本发明人现在已经鉴定了与人类纤维样变性相关的主要基因。他们已经显示，在分别感染有日本血吸虫和曼氏血吸虫的两个中国人、一个苏丹人和一个巴西人组群中的纤维样变性，显著依赖于位于CTGF基因中的等位基因变体。这些变体中的两种影响核因子结合。

对来自患有纤维样变性的个体的各种核酸样品进行了特殊分析过1)。最后，对22个SNP或遗传变异进行基因分型，用于进一步分析。将这22个加入到在前期步骤中测试的三个SNP中。

在CTGF基因座的这些25个SNP或遗传变异(22+3)中，8个遗传变异被鉴定为在人类对象中与肝纤维样变性相关(rs12527705、rs12526196、rs9399005、rs6918698、rs3037970、1931002、rs2151532和rs9402373)。因此，本发明的具体目的在于检测纤维样变性的易感性和/或对纤维样变性进行预后的方法，所述方法包含检测一个或几个选自rs12527705、rs12526196、rs9399005、rs6918698、rs3037970、1931002、rs2151532和rs9402373的SNP和变异的存在。

在这些SNP中，rs9402373的C等位基因或rs12526196的T等位基因特异性结合核因子SRY、Lyf-1、CdxA、CP2、Ik-2或Nkx-2。

在HCV感染的对象中，SNPrs6918698和rs9402373被显示为与肝纤维样变性相关。具体来说，rs9402373的C等位基因被显示为有害，即它与严重肝纤维样变性强烈相关。

尽管取决于所测试的群体，由本发明人收集的实验数据不允许验证某些等位基因的相关性，但本发明不限于在所有被测试群体中发现的与纤维样变性显著相关的具体SNP。事实上，几个原因能够解释在某些群体中验证显著关联性的失败，包括组群不足、混杂变量的评估不完全、所述群体中SNP的低频率等。

定义

在本发明的上下文中，“纤维样变性”是指在所有人类纤维样变性疾病例如肝脏疾病、肝硬化、皮肤瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、硬皮病、肥胖症和任何纤维样变性疾病中发生的所有类型的人类纤维样变性。

在本发明的上下文中，“肝纤维样变性”或“HF”是指在肝脏、其组织或其组织的任何部分中发生的所有类型的纤维样变性。肝纤维样变性尤其在对损伤做出响应时发生。肝纤维样变性可以是对慢性肝损伤的共同响应，最终导致肝硬化及其并发症、门静脉高血压、肝功能衰竭和肝细胞癌。肝纤维样变性是过度旺盛的伤口愈合，其中过量结缔组织堆积在肝脏中。细胞外基质被过量产生、降解不足或二者同时发生。触发物是慢性损伤，特别是如果存在炎性组分的话。各种类型的慢性肝损伤能够引起纤维样变性，例如化学性纤维样变性(CCl₄)、细菌性(即布鲁氏杆菌病)、寄生虫性(即裂体吸虫病/由血吸虫属(Schistosoma)物种引起的血吸虫病；或棘球蚴病感染)或病毒性(即由甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)感染引起的肝炎)。

在本发明的上下文中，“皮肤瘢痕疙瘩”是瘢痕组织在皮肤上的过度生长。更具体来说，瘢痕疙瘩和增生性瘢痕(HSc)是人类独有的在创伤、炎症、手术、烧伤后以及有时自发发生的皮肤纤维增殖性障碍。它们的特征为胶原蛋白在真皮和皮下组织中的过量沉积。与正常伤口修复的细纹瘢痕特征相反，瘢痕疙瘩和HSc的旺盛瘢痕形成典型地引起毁容、挛缩、瘙痒和疼痛。在黑人、西班牙人和东方人中，瘢痕疙瘩发生在具有家族性沉积症的个体中。与HSc不同，瘢痕疙瘩的瘢痕扩大并伸展到原始伤口的边界之外，并很少退回。这些障碍代表了伤口愈合基本过程的畸变，其包括细胞迁移和增殖、炎症、细胞因子和细胞外基质(ECM)蛋白的合成和分泌增加以及新合成基质的重塑。在生物学上，瘢痕疙瘩是纤维样变性组织，其特征为过量沉积有细胞外基质组分特别是胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白和蛋白多糖的非典型成纤维细胞的集合。一般来说，瘢痕疙瘩含有相对无细胞的中心和在病损深层皮肤部分中形成结节的浓密、丰富的胶原蛋白束。在愈合的炎性阶段中生长因子的释放和激活是瘢痕形成过程的先决条件，所述瘢痕形成过程包括血管发生、上皮再形成、成纤维细胞的募集和增殖以及基质沉积。然后，调控性细胞因子包括CTGF活性的异常产生可能造成瘢痕疙瘩的发生。

在本发明的上下文中，“CTGF基因座”(结缔组织生长因子)、也称为CCN2基因座，是指细胞或生物体中所有的序列或产物，包括CTGF编码序列、CTGF非编码序列(例如内含子)、控制转录和/或翻译的CTGF调控序列(例如启动子、增强子、终止子等)、所有对应的表达产物例如CTGFRNA(例如mRNA)和CTGF多肽(例如蛋白前体和成熟蛋白)，以及CTGF基因起始密码子上游20kb区域、优选为15.3kb区域以及非翻译区(3’UTR)下游20kb区域、优选为14.1kb区域的周围序列。例如，CTGF基因座包含含有由测序鉴定的61个SNP(图1)、特别是表1的8个SNP的周围序列。然而，在具体实施方案中，大多数变异不在启动子序列中。

在本发明的上下文中，术语“预后”包括在成人、儿童和胎儿中，在各种不同阶段、包括早期无症状阶段和晚期阶段时检测、监测、服药(dosing)、比较等。预后典型地包括纤维样变性进展的评估(预测)和对象的定性以确定最适合的治疗(药学-遗传学)等。本发明提供了确定由CTGF基因座中的突变或多态性引起的纤维样变性或相关障碍的进展速度的预后方法。分析和预测对治疗或药物的响应或对治疗和药物的副作用的预后，旨在确定个体是否应该用特定治疗药物治疗。例如，如果预后指示个体将对特定药物的治疗做出阳性响应的可能性，可以向个体给药药物。相反，如果预后指示个体可能对特定药物的治疗做出阴性响应，那么可以提供可选治疗过程。阴性响应可以被定义为不存在有效响应或存在有毒副作用。临床药物试验代表了CTGF基因座SNP的另一种应用。一个或多个表明了对药物或对药物副作用的响应的CTGFSNP，可以使用上面描述的方法来鉴定。然后，可以对这种药剂临床试验的潜在参与者进行筛选，以鉴定更可能对药物做出有利响应的个体，并排除可能经历副作用的个体。通过这种方式，可以在对药物做出阳性响应的个体中测量药物治疗的有效性，而不会由于包含了不太可能在研究中做出阳性响应的个体引起测量值的降低，并且没有不想要的安全性问题的风险。

变异

变异可以在CTGFDNA、RNA或多肽水平上确定。任选地，通过对CTGF基因座的全部或一部分进行测序，或通过对CTGF基因座的全部或一部分进行选择性杂交或扩增来进行检测。更优选情况下，在变异鉴定步骤之前进行CTGF基因座特异性扩增。CTGF基因座中的变异可以是单独或各种不同组合的基因座的编码和/或非编码区中的任何形式的突变、缺失、重排和/或插入。更具体来说，突变包括点突变。缺失可以涵盖基因座的编码或非编码部分中任何两个或多个残基的区域，例如从两个残基多至整个基因或基因座。典型的缺失影响较小的区域，例如结构域(内含子)或重复序列或少于约50个连续碱基对的片段，尽管较大的缺失也可能发生。插入可以涵盖基因座的编码或非编码部分中一个或几个残基的添加。插入典型地可以包含在基因座中添加1至50个碱基对。重排包括序列的倒置。CTGF基因座变异可以导致产生终止密码子、移码突变、氨基酸取代、特定RNA剪接或加工、产物不稳定性、截短的多肽产生等。变异可能导致具有改变的功能、稳定性、定向或结构的CTGF多肽的产生。变异也可以引起蛋白表达的降低或可选地所述生产的增加。

在优选实施方案中，所述变异是一个或多个碱基的突变、插入或缺失。在本发明的方法的具体实施方案中，CTGF基因座中的变异选自CTGF基因或相应表达产物中的点突变、缺失和插入，更优选为点突变和缺失。变异可以在CTGFDNA、RNA或多肽水平上确定。

本发明的具体目的是检测对纤维样变性的易感性和/或纤维样变性的预后的方法，所述方法包含检测一个或几个选自下列的变异或SNP的存在：rs9402373、rs1931002、rs12526196、rs1257379、rs12527705、rs9399005、rs6918698、rs3037970、rs2151532、rs9321314、rs9321315、rs6910279、rs6940184、rs12523697、rs9493149、rs12529636、rs6917644、rs9493150、rs928501、rs11966728、rs7747601、rs12198610、132319925D/I、rs9483364、rs2095252、rs6926879、rs34118837、rs1931003、rs12191459、rs12206863、rs7768619、rs10872386和rs2327184。

132319925D/I(缺失/插入)多态性是以前从未描述过的新的多态性。为了能够鉴定该多态性，发明人按照坐标系统的位置给出名称，并且D/I表示该多态性诱导了缺失或插入。该多态性也可以写成132319925-/GAAA。

优选情况下，所述与纤维样变性相关的变异或SNP选自rs12527705、rs12526196、rs9399005、rs6918698、rs3037970、rs1931002、rs2151532和rs9402373。更优选情况下，所述rs9402373C和rs12526196T等位基因优选结合核因子。

这些变异/SNP报告在下面的表1中。

表1：CTGF基因座中的纤维样变性相关变异

CTGF基因中的变异可以通过确定改变的CTGFRNA表达的存在来检测。改变的RNA表达包括存在改变的RNA序列、存在改变的RNA剪接或加工、存在改变的RNA量等。它们可以通过本技术领域中已知的各种技术来检测，包括例如通过对CTGFRNA的全部或部分进行测序或通过对所述RNA的全部或部分进行选择性杂交或选择性扩增。

在其他变化形式中，方法包含检测改变的CTGF多肽表达的存在。改变的CTGF多肽表达包括存在改变的多肽序列、存在该表的CTGF多肽量、存在改变的组织分布等。它们可以通过本技术领域中已知的各种技术来检测，包括例如通过测序和/或与特异性配体(例如抗体)的结合。

正如上面指出的，可以使用本技术领域中已知的各种技术对改变的CTGF基因或RNA的表达或序列进行检测或定量，这些技术包括测序、杂交、扩增和/或与特异性配体(例如抗体)的结合。其他适合的方法包括等位基因特异性寡核苷酸(ASO)、等位基因特异性扩增、Southern印迹(用于DNA)、Northern印迹(用于RNA)、单链构象分析(SSCA)、PFGE、荧光原位杂交(FISH)、凝胶迁移、夹具式变性凝胶电泳、异源双链体分析、RNase保护、化学错配切割、ELISA、放射免疫测定法(RIA)和免疫-酶学测定法(IEMA)。这些方法中的一些(例如SSCA和CGGE)是基于核酸的电泳迁移率作为存在改变序列的结果而发生的变化。根据这些技术，通过在凝胶上迁移率的变动来观察改变的序列。然后可以对片段进行测序以验证变异。一些其他方法基于来自对象的核酸与特异性针对野生型或改变的CTGF基因或RNA的探针之间的特异性杂交。探针可以在悬液中或固定化在基质上。探针典型地被标记以便于杂交体的检测。这些方法中的一些特别适合用于评估多肽序列或表达水平，例如Northern印迹、ELISA和RIA。后者需要使用特异性针对多肽的配体，更优选为特异性抗体。

在优选实施方案中，方法包含在来自对象的样品中检测改变的CTGF基因表达情况的存在。正如上面提指出的，更优选情况下，这可以通过对所述样品中存在的核酸进行测序、选择性杂交和/或选择性扩增来实现。

测序

测序可以使用本技术领域公知的技术，使用自动测序仪来进行。测序可以在完整的CTGF基因座上，或更优选情况下在其特定结构域、典型为已知或怀疑携带有害突变或其他变异的结构域上执行。

扩增

扩增是基于互补核酸序列之间用于引发核酸复制的特异性杂交体的形成。扩增可以根据本技术领域已知的各种技术来进行，例如通过聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。这些技术可以使用可商购的反应试剂和流程来进行。优选的技术使用等位基因特异性PCR或PCR-SSCP。扩增通常需要使用特异性核酸引物来启动反应。可用于从CTGF基因座扩增序列的核酸引物能够与CTGF基因座上位于所述基因座靶区域两侧的部分特异性杂交，所述靶区域在某些患有纤维样变性或相关障碍的对象中发生改变。这样的靶区域的实例提供在表2中。本发明的另一个具体目的在于可用于从CTGF基因或基因座包括周围区域扩增序列的核酸引物。这样的引物优选与CTGF基因座中的核酸序列互补并特异性杂交。特定引物能够与CTGF基因座上位于所述基因座靶区域两侧的部分特异性杂交，所述靶区域在某些患有纤维样变性或相关障碍的对象中发生改变。可用于扩增包含表2中鉴定的SNP的CTGF靶区域的引物，可以根据其序列或CTGF的基因组序列来设计。

本发明还涉及核酸引物，所述引物与CTGF基因座编码序列(例如基因或RNA)中在某些患有纤维样变性或相关障碍的对象中变化的部分互补并特异性杂交。就此而言，本发明的特定引物特异性针对在CTGF基因座或RNA中改变的序列。通过使用这样的引物，扩增产物的检测表明在CTGF基因座中存在变异。相反，不存在扩增产物表明样品中不存在特定变异。本发明还考虑到了将如上所述的核酸引物或核酸引物对使用在检测对象中纤维样变性或相关障碍的存在或其易感性的方法中，或使用在评估对象对纤维样变性或相关障碍的治疗的响应的方法中。

选择性杂交

杂交检测方法是基于互补核酸序列之间用于检测核酸序列变异的特异性杂交体的形成。具体检测技术涉及使用特异性针对野生型或改变的CTGF基因或RNA的核酸探针，然后检测杂交体的存在。探针可以在悬液中或固定化在基质或支持物上(如同在核酸阵列或芯片技术中那样)。探针典型被标记以便于杂交体的检测。就此而言，本发明的具体实施方案包含将来自对象的样品与特异性针对改变的CTGF基因座的核酸探针相接触，并评估杂交体的形成。在特别优选实施方案中，方法还包含将样品与分别特异性针对野生型CTGF基因座及其各种改变形式的一组探针同时相接触。在该实施方案中，有可能在样品中直接检测CTGF基因座中各种变异形式的存在。此外，来自各个对象的各种不同样品可以并行处理。

在本发明的上下文中，探针是指与CTGF基因或RNA(的靶部分)互补并能与其特异性杂交的多核苷酸序列，并且它适合于检测与CTGF等位基因相关的多核苷酸多态性，所述等位基因对纤维样变性易感或与纤维样变性相关。探针优选与CTGF基因、RNA或其靶部分完全互补。探针典型地包含单链核酸，其长度在8至1000个核苷酸之间，例如在10至800、更优选在15至700、典型在20至500个核苷酸之间。应该理解，更长的探针也可以使用。本发明的优选探针是长度为8至500个核苷酸的单链核酸分子，其能够与CTGF基因座或RNA的带有变异的区域特异性杂交。

本发明的方法使用了特异性针对改变的(例如突变的)CTGF基因或RNA的核酸探针，即与所述改变的CTGF基因或RNA特异性杂交、并且基本上不与缺少所述变异的CTGF基因或RNA杂交的核酸探针。特异性表示与靶序列的杂交产生了可以与通过非特异性杂交产生的信号相区分的特异性信号。优选使用完全互补的序列设计本发明的探针。然而，应该理解，可以忍受一定的错配，只要特异性信号可以与非特异性杂交相区分即可。

这种探针的具体实例是与包含CTGF基因座或RNA的基因组区域中带有上述表1中列出的点突变的靶部分互补的核酸序列。更具体来说，探针可以包含选自SEQIDNO1至8或其包含SNP的片段的序列或其互补序列。

探针序列可以源自于本申请中提供的CTGF基因和RNA的序列。可以进行核苷酸取代以及探针的化学修饰。可以执行这样的化学修饰以增加杂交体的稳定性(例如嵌入基团)或标记探针。标记物的典型实例包括但不限于放射性、荧光、发光、酶标记等。本发明还考虑到了将如上所述的核酸探针使用在检测对象中纤维样变性或相关障碍的存在或其易感性的方法中，或使用在评估对象对纤维样变性或相关障碍的治疗的响应的方法中。

特异性配体结合

正如上面所指出的，CTGF基因座中的变异也可以通过在CTGF多肽的序列或表达水平上筛选变异来检测。就此而言，还描述了将样品与特异性针对CTGF多肽的配体相接触，并测定复合物的形成。可以使用不同类型的配体，例如特异性抗体。在具体实施方案中，将样品与特异性针对CTGF多肽的抗体相接触，并测定免疫复合物的形成。可以使用用于检测免疫复合物的各种方法，例如ELISA、放射免疫测定法(RIA)和免疫-酶学测定法(IEMA)。在本发明的上下文中，抗体是指多克隆抗体、单克隆抗体及其基本上具有相同抗原特异性的片段或衍生物。片段包括Fab、Fab’2、CDR区域等。衍生物包括单链抗体、人源化抗体、多功能抗体等。特异性针对CTGF多肽的抗体是指选择性结合CTGF多肽的抗体，即针对CTGF多肽或其含有表位的片段产生的抗体。尽管可能发生针对其他抗原的非特异性结合，但与靶CTGF多肽的结合以更高亲和性发生，并可以与非特异性结合可靠地区分开。

还公开了诊断试剂盒，其包含用于在来自对象的样品中检测是否存在CTGF基因座或多肽、CTGF基因或多肽的表达和/或CTGF活性的变异的产品和试剂。所述诊断试剂盒包含本发明中描述的任何引物、任何引物对、任何核酸探针和/或任何配体、优选为抗体。所述诊断试剂盒还可以包含用于执行杂交、扩增或抗原-抗体免疫反应的试剂和/或规程。

连锁不平衡

一旦在目标基因组区域、更具体为CTGF基因座中鉴定到第一个SNP后，可以鉴定与该第一个SNP连锁不平衡的其他附加SNP。事实上，与第一个与纤维样变性或相关障碍相关的SNP连锁不平衡的任何SNP，将与该性状相关。因此，一旦给定SNP与纤维样变性之间的关联性已被证实，与该性状相关的其他SNP的发现可能是极为重要的，以便增加该特定区域中SNP的密度。与给定SNP连锁不平衡的其他SNP的鉴定包括：(a)从多个个体扩增来自包含或围绕第一个SNP的基因组区域的片段；(b)在含有或围绕所述第一个SNP的基因组区域中鉴定第二个SNP；(c)在所述第一个SNP与第二个SNP之间执行连锁不平衡分析；以及(d)当与所述第一个标志物连锁不平衡时，选择所述第二个SNP。还考虑到了包含步骤(b)和(c)的子组合。这些处于连锁不平衡的SNP也可用于本发明的方法、更具体为本发明的诊断方法中。

原因性突变

CTGF基因座中造成纤维样变性的突变，可以通过将来自于表现出纤维样变性或相关障碍的患者与对照个体的CTGF基因座序列进行比较来鉴定。根据鉴定到的CTGF的SNP的关联性，可以对鉴定到的基因座进行扫描以寻找突变。在优选实施方案中，对CTGF基因座的功能性区域例如外显子和剪接位点、启动子和其他调控区进行扫描以寻找突变。优选情况下，表现出纤维样变性的患者携带有显示出与纤维样变性相关的突变，对照个体不携带与纤维样变性相关的突变或等位基因。也有可能表现出纤维样变性的患者与对照个体相比，以更高的频率携带有显示出与纤维样变性相关的突变。用于检测这种突变的方法一般包含下列步骤：从来自表现出纤维样变性的患者和对照个体的CTGF基因座DNA样品，扩增CTGF基因座中包含与纤维样变性相关的SNP或一组SNP的区域；对扩增到的区域进行测序；将来自表现出纤维样变性或相关障碍的患者和对照个体的CTGF基因的DNA序列进行比较；确定表现出纤维样变性的患者特有的突变。

药物筛选

还描述了用于筛选药物候选物或先导物的新方法。这些方法包括结合测定法和/或功能测定法，并可以在体外、细胞系统、动物等中进行。本发明的具体目的在于筛选生物活性化合物的方法，所述方法包含在体外将测试化合物与本发明的CTGF基因或多肽相接触，并测定所述测试化合物结合所述CTGF基因或多肽的能力。与所述基因或多肽结合，为化合物调节所述靶的活性、从而影响对象中导致纤维样变性的途径的能力提供了指示。在优选实施方案中，方法包含在体外将测试化合物与本发明的CTGF多肽或其片段相接触，并测定所述测试化合物结合所述CTGF多肽或片段的能力。片段优选包含CTGF多肽的结合位点。优选情况下，所述CTGF基因或多肽或其片段是改变或突变的CTGF基因或多肽或其包含变异或突变的片段。本发明的具体目的在于筛选对纤维样变性有活性的化合物，所述方法包含在体外将测试化合物与本发明的CTGF多肽或其含有结合位点的片段相接触，并测定所述测试化合物结合所述CTGF多肽或其片段的能力。优选情况下，所述CTGF多肽或其片段是改变的或突变的CTGF多肽或其包含变异或突变的片段。用于筛选药物候选物的方法包含将表达本发明的CTGF多肽的重组宿主细胞与测试化合物相接触，并测定所述测试化合物结合所述CTGF并调节CTGF多肽活性的能力。优选情况下，所述CTGF多肽或其片段是改变的或突变的CTGF多肽或其包含变异或突变的片段。结合的测定可以通过各种技术来进行，例如通过测试化合物的标记、通过与标记的参比配体的竞争等。筛选生物活性化合物的方法还包含在体外将测试化合物与CTGF多肽相接触，并测定所述测试化合物调节所述CTGF多肽活性的能力。优选情况下，所述CTGF多肽或其片段是改变的或突变的CTGF多肽或其包含变异或突变的片段。

为患有纤维样变性或对发生纤维样变性易感的对象选择生物活性化合物的方法，还包含在体外将测试化合物与本发明的CTGF基因相接触，并测定所述测试化合物调节所述CTGF基因的表达的能力。优选情况下，所述CTGF基因或其片段是改变的或突变的CTGF基因或其包含变异或突变的片段。

筛选、选择或鉴定活性化合物、特别是对纤维样变性有活性的化合物的方法，还包含将测试化合物与包含报告构建物的重组宿主细胞相接触，所述报告构建物包含CTGF基因启动子控制下的报告基因，以及选择调节(例如激活或抑制)报告基因的表达的测试化合物。优选情况下，所述CTGF基因启动子或其片段是改变的或突变的CTGF基因启动子或其包含变异或突变的片段。

上述的筛选测定方法可以在任何适合的装置中，例如平板、管、碟、摇瓶等中进行。典型情况下，测定在多孔板中进行。几种测试化合物可以并行测定。此外，测试化合物可以是各种不同来源的、天然的或合成的。它可以是任何有机或无机物质，例如脂类、肽、多肽、核酸、小分子等，其可以是孤立地或与其他物质混合。化合物可以是例如产物组合文库的全部或一部分。

药物组合物，疗法

还描述了药物组合物，其包含(i)如上所述的CTGF多肽或其片段、编码CTGF多肽或其片段的核酸、载体或重组宿主细胞，以及(ii)可药用载体或介质。本发明还涉及在对象中治疗或预防纤维样变性或相关障碍的方法，所述方法包含向所述对象给药功能性(例如野生型)CTGF多肽或编码CTGF基因座的核酸。还描述了在对象中治疗或预防纤维样变性的方法，所述方法包含向所述对象给药调节、优选为激活或模拟本发明的CTGF基因座或蛋白的表达或活性的化合物。所述化合物可以是CTGF的激动剂或拮抗剂、CTGF的反义寡核苷酸或RNAi、特异性针对CTGF多肽的抗体或其片段或衍生物。在方法的具体实施方案中，调节是抑制。在方法的另一个具体实施方案中，调节是激活。

还公开了本发明的功能性CTGF多肽、编码CTGF基因座的核酸或调节CTGF基因或蛋白的表达或活性的化合物，在制备用于在对象中治疗或预防纤维样变性药物组合物中的应用。所述化合物可以是CTGF的激动剂或拮抗剂、CTGF的反义寡核苷酸或RNAi、特异性针对CTGF多肽的抗体或其片段或衍生物。在方法的具体实施方案中，调节是抑制。在方法的另一个具体实施方案中，调节是激活。

本发明证实了纤维样变性与CTGF基因座之间的关联性。因此，本发明提供了治疗性干预的新靶点。可以考虑各种方法来恢复或调节对象、特别是带有改变的CTGF基因座的对象中的CTGF活性或功能。预计向这些对象提供野生型功能，将在病理细胞或生物体中抑制纤维样变性的表型表达。这种功能的提供可以通过基因或蛋白治疗或通过给药调节或模拟CTGF多肽活性的化合物(例如在上述筛选测定法中鉴定的激动剂)来实现。

可以使用上述的载体将野生型CTGF基因或其功能性部分导入到需要其的对象的细胞中。载体可以是病毒载体或质粒。基因也可以作为裸露的DNA导入。可以提供基因以将其整合在受体宿主细胞的基因组中，或保留在染色体之外。整合可以随机发生或发生在精确确定的位点处，例如通过同源重组。具体来说，可以通过同源重组插入CTGF基因的功能性拷贝以代替细胞中的变异的版本。其他技术包括基因枪、脂质体介导的转染、阳离子脂质介导的转染等。基因治疗可以通过直接基因注射或通过给药表达功能性CTGF多肽的离体制备的遗传修饰细胞来实现。

也可以使用其他具有CTGF活性的分子(例如肽、药物、CTGF激动剂或有机化合物)来恢复对象中的功能性CTGF活性，或抑制细胞中的有害表型。细胞中功能性CTGF基因座功能的恢复，可用于阻止纤维样变性的发生或减缓所述疾病的发展。

本发明的其他特点和优点将公开在下面的实验部分中，其应该被视为说明性的，而不限制本申请的范围。

材料和方法

统计分析

使用多变量逻辑回归来分析个体发生纤维样变性的概率与遗传变体、包括血吸虫感染的对象中已知影响疾病进展的主要协变量之间的关系。将统计学SPSS软件(10.0版)用于该分析。在回归模型中检验年龄和性别，当它们显示出与疾病的相关性(p＜0.05)时将其保留。因为组群的性别和年龄匹配，这些协变量对遗传变异体与疾病之间的关联性几乎没有影响。当协变量、即吡喹酮治疗的次数、HBV感染和暴露于感染，如同在中国渔民(暴露、治疗次数)或中国农民(HBV感染、出生地点)中那样可以被精确评估时，将它们包含在回归模型中。

DNA提取

将5至15ml血液等份试样收集在柠檬酸钠上并保持在-20℃下。使用标准的盐析方法提取DNA(Sambrook等，1989)。一些对象拒绝采血。在这种情况下，使用泡沫头涂药器收集颊细胞样品，并按照Whatman描述的规程(http://www.whatman.co.uk/)将其施加到FTA1指示卡上。将FTA1指示卡放置在清洁干燥的平面表面上。用独特的鉴别名称或号码标记FTA1卡。从保护性包装中取出一个泡沫头涂药器。握住涂药器的塑料柄，将泡沫头置于口中并将泡沫头的一侧在颊的内部摩擦30秒。使用泡沫头的相反一侧重复摩擦另一侧颊。将泡沫头沿着龈线和颊的皱褶并在舌下移动，吸收尽可能多的唾液。从口中取出涂药器。小心揭开FTA1指示卡的覆盖纸，并将平的圆形涂药器泡沫头压在样品区上。不要将泡沫头从卡上抬起。使用三次左右移动(每个方向上908)挤压泡沫头以使样品区完全饱和。在样品转移后，样品区将变白。将FTA1卡置于清洁表面上干燥。允许卡在室温下干燥至少1小时。然后将卡片穿孔在200μlFTA纯化缓冲液和TE缓冲液中清洗三次。

DNA扩增

所有从FTA卡纯化的DNA在基因分型前进行预扩增。聚合酶链反应(全基因组扩增)在50μl反应中进行，其中含有一个生物样品卡片穿孔(FTA1结合的颊细胞DNA)或100ng基因组DNA、1.5OD15个碱基的全简并随机引物(Genetix，Paris，法国)、200mMdNTP、5mMMgCl2、5ml10xPCR缓冲液和0.5单位高保真TaqDNA聚合酶(BIOTAQDNA聚合酶，BiolineLondon，英格兰)。样品在多模块热循环仪中如下进行扩增：94℃3分钟的预变性步骤，50个由94℃1分钟、37℃2分钟和1分钟升温(37-55℃)构成的循环，以及55℃4分钟。最后在72℃下进行5分钟的延伸步骤。

测序

使用ABIPrismBigDyeTerminator循环测序系统(PEAppliedBiosystems，FosterCity，U.S.A.)在ABIPrism自动测序仪上对纯化的PCR产物进行测序。测序反应由GATCbiotech公司(GATC，MarseilleFrance)在两条链上进行。测序引物描述在表2中。在8个病例和两个对照中对CCN2(3.2kb)和起始密码子上游的15.3kb以及3’UTR区中的14.1kb进行的测序揭示出61个SNP(图1)，其中50个以前已被描述过。

使用特异性TaqMan探针通过PCR进行多态性基因分型

使用TaqMan探针测定法(AppliedBiosystems，LafayetteUSA)对等位基因差异进行评估。每个反应含12.5ng基因组DNA、TaqManUniversalPCRMasterMix(AppliedBiosystems，LafayetteUSA)、900nM每种引物和200nM每种荧光标记的杂交探针，总体积为5μl。RT-PCR在ABIPrism序列检测系统7900(AppliedBiosystems，LafayetteUSA)中，使用下列条件进行：50℃2分钟，95℃10分钟和40个循环的扩增(95℃变性15秒，60℃退火/延伸1分钟)。通过这种方法对下列SNP或变异进行了基因分型：rs9321314、rs9321315、rs6910279、rs6940184、rs12523697、rs9493149rs12529636、rs12527705、rs12526196、rs6917644、rs9399005、rs6918698、rs9493150、rs2151532、rs3037970、rs928501、rs11966728、rs7747601、rs12198610、rs9402373、132319925D/I、rs1931002、rs12527379、rs9483364、rs2095252。

通过PCR和限制性酶消化进行多态性基因分型

通过在酶的制造商(Euromedex，Mundolsheim，法国或NewEnglandBiolabs，Beverly，USA)所描述的标准条件下进行限制性酶分析，对多态性(rs6926879、rs34118837、rs1931003、12191459、rs12206863、7768619、rs10872386和rs2327184)进行基因分型。聚合酶链反应(PCR)扩增在robocyclergradient96(Stratagene，LaJolla，U.S.A.)上按照标准规程进行。将每个消化产物在琼脂糖或丙烯酰胺凝胶上分离，用溴乙锭染色并通过UV观察。引物描述在表2中。

核提取物制备

从用地塞米松(1mM)刺激1小时的人类肝细胞系(HEPG2)制备核提取物，因为在肝纤维样变性(HF)中(Kobayashi等，2005；Gressner等，2007)肝细胞与肝脏星形细胞、内皮细胞和肌成纤维细胞(Gressner等，2008)一起产生CTGF。提取物使用来自Pierce的核和细胞质提取试剂(NE-PER；Pierce，Rockford，IL，USA)来制备。

电泳迁移率变动分析(EMSA)

商业合成了如下的跨越变体核苷酸任一侧约10bp的互补单链寡核苷酸：

rs9402373CGCTCTCAAAACTAAGCCCAACTC(SEQIDNO：33)

rs9402373GGAGTTGGGCTTAGTTTTGAGAGC(SEQIDNO：34)

rs12527705AGTAATATAGAAGATGGGTCTA(SEQIDNO：35)

rs12527705TGTAATATAGATGATGGGTCTA(SEQIDNO：36)

rs12526196CGAATATACAACGAATATGGGC(SEQIDNO：37)

rs12526196TGAATATACAATGAATATGGGC(SEQIDNO：38)

rs1931002ATGGATGATTCAAACAACTTGG(SEQIDNO：39)

rs1931002GTGGATGATTCGAACAACTTGG(SEQIDNO：40)

通过将反应(寡核苷酸正义链和寡核苷酸反义链)置于沸水中10分钟并允许其冷却到室温，使互补链退火。使用LightShift化学发光EMSA试剂盒(Pierce，Rockford，IL，USA)建立结合反应。将20fmol互补DNA的等份试样与4mg核提取物在10mMTris、50mMKCl、1mMDTT、2.5％甘油、5mMMgCl₂、50ng/μlpolyd(I-C)、0.05％NP-40、pH7.5中，在室温下温育20分钟。然后将反应物上样到8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上，在110V下运行150分钟。将游离DNA和DNA/蛋白复合物通过毛细作用转移到尼龙N+膜上。按照制造商的说明书(Pierce，Rockford，IL，USA)检测结合。

表2：用于制备测序用模板的引物

实施例

实施例1

在两个中国人群体样品中CTGF基因座中的SNP与严重肝纤维样变性(HF)之间的相关性

提供了两个独立的中国人样品(生活在日本血吸虫流行区域的渔民和农民)的数据。疾病表型包括材料和方法中描述的晚期肝纤维样变性(渔民)，或腹水和前期出血(农民)。

首先使用单变量分析(表4的上部)、其次通过多变量分析(表4的下部)对基因型与肝纤维样变性(HF)表型之间的关联性(描述在材料和方法中)进行了测试，包括当针对来自相同组的SNP进行测试时显示出最强关联性的SNP或变异rs12526196、rs1931002、rs3037970和rs9402373。组是关联性(r2＞0.5)组，基因型是加重基因型，OR＝比值比，CI＝OR的置信区间。

渔民样品：n＝300，99个病例和201个对照；协变量：捕鱼年数，出生在船上，性别，吡喹酮治疗次数。中国农民样品：n＝294，113个对照和181个病例；协变量：出生地是否为流行区域，HBV感染是治愈还是活动(p＝0.05，OR＝2.38)。

在渔民群体中影响纤维样变性发生的各种因素的分析显示，性别、暴露于受感染的水和使用吡喹酮进行抗血吸虫治疗与纤维样变性的风险显著相关。几种协变量的测试显示，“捕鱼年数”和“出生于渔船上”是度量暴露的最佳协变量。“治疗”协变量是在过去20年间吡喹酮治疗的次数。

研究样品

中国渔民是在大型野外研究期间在船上征集的(渔民样品)，而农民(农民样品)是根据医院记录(病例)从直接他们的农场或从村庄(对照)征集的。渔民住在船上或小岛上并捕鱼多年。他们大量暴露于感染，而大多数农民在很久以前感染，因为田间寄生虫传播在15至20年前已被中断。渔民和农民源自不同地理区域。渔民主要来自于江苏省，少数来自于湖北和江西。农民在湖南省已生活几代，他们中的一些来自于山区。

按照在(Arnaud等，2008)中所指出的进行了修改的WHO准则，对肝纤维样变性(HF)进行评估。渔民样品包含300个对象(201个对照，99个病例)。病例表现出严重CentF(中央纤维样变性：CLH、D、E或F)或严重ParF(实质纤维样变性：GNH或GW)或CLM和GNM两者。对照具有较轻疾病：CentFib≤CLL和ParF≤GNL。在渔民中可能影响肝纤维样变性的协变量是是暴露和吡喹酮治疗次数。暴露包括两个协变量：捕鱼年数和出生在船上。中国农民样品包括294个对象(113个对照和181个病例)。病例具有严重HF(与渔民病例定义相同)和腹水和/或静脉曲张。可以在该样品中评估HBV和HCV感染；3个对象感染有HCV，因此被排除，而＞60％的病例具有活动或治愈的HBV感染。HBV感染是分析中的显著协变量(p＜0.03)，暴露和治疗数量不能在中国农民中准确评估。

发明人选择了几个SNP用于基因分型，包括每组两个SNP和组内或组外通过计算机分析确定的可能具有功能效应的任何SNP(参见图1)。然后在更大的450个个体的中国渔民组群中对这些SNP进行基因分型。

表4中呈现了显示出与纤维样变性阳性或建议性关联性的SNP。应用于这些数据的校正系数是＜20(参见材料和方法)。因为不能准确记录所有对象的治疗，因此我们分别显示了使用我们已知暴露的450个对象和使用暴露和治疗都是已知的380个对象所获得的数据。

发明人首先在日本血吸虫高度流行的中国中部洞庭湖的渔民中检查HF。影响HF发生的协变量是性别、暴露和抗血吸虫治疗。使用这些协变量，我们在201个对照和99个病例上测试了CCN2和IFNGR1中的SNP(每个基因3个SNP)是否与HF相关。与CCN2接近的SNPrs9399005显示出与HF的关联性(p＝0.02)。对CCN2(3.2kb)和起始密码子上游的15.3Kb以及3’UTR区域中的14.1Kb进行的测序揭示出61个SNP(图1)，其中50个以前已被描述。将MAF＞20％的53个SNP分组成7个关联性(r2＝0.5)组(I至VII)(图1)。我们选择了22个SNP用于进一步基因分型，其包括每个组至少两个SNP以及通过计算机分析评估为可能具有功能效应的组外的SNP(n＝4)。与HF相关的SNP(表4)是组II中的SNPrs12527705(p＝0.02，OR＝2.3)和SNPrs12526196(p＝0.02，OR＝2.2)，组II中的SNPrs9399005(p＝0.02，OR＝2.2)、SNPrs6918698(p＝0.02，OR＝2)和D/Irs3037970(p＝0.003，OR＝2.6)，组IV中的SNPrs1931002(p＝0.004，OR＝2.3)和rs21551532(p＝0.02，OR＝1.98)和组VI中的SNPrs9402373(p＝0.015，OR＝2)。将分析根据性别(p＜0.001)、暴露(捕鱼年数：p＜0.001，生于船上：p＜0.01)和治疗次数(p＜0.01)进行了调整。在同时测试两个SNP的多变量分析中，缺失/插入(D/I)rs3037970排除rs6918698。同样地，SNPrs1931002排除SNPrs2151532；SNPrs1256196排除SNPrs12527705和SNPrs9399005。这表明SNPrs12526196、rs30337970、rs1931002、rs9402373与肝纤维样变性(HF)具有最强相关性。当在相同的回归模型中对所有4种SNP进行测试时(表4下部)，SNPrs12526196(p＝0.007，OR＝3)、rs9402373((p＝0.002，OR＝2.8)和rs1931002(p＝0.002，OR＝2.8)显示出与HF独立相关。存在于53.9％的对照和67.5％的病例中的单倍型1002C、6196T与HF相关(p＜0.005)。发明人还测试了与具有门静脉高血压迹象的晚期HF相关的表型。他们发现(154个对照和151个病例)的rs9402373(p＝0.005，OR＝2.6)和D/Irs3037970(p＝0.05，OR＝2)与该表型相关，SNPrs1256196显示出与该更严重疾病表型相关的趋势(p＝0.12)。性别(p＝0.001)作为协变量进入模型。这表明rs9402373和D/Irs3037970两者可能对严重疾病具有更重要的贡献。

发明人试图在田间工作时被日本血吸虫感染并根据当地医院的记录征集的其他独立的中国农民样品中重复该结果。将在渔民样品中显示出与HF相关的一些迹象的SNP，在农民样品(113个对照，181个病例)中进行基因分型。单变量分析显示出严重HF与SNPrs9402373(p＝0.003，OR＝2.23)和SNPrs1256196(p＝0.02，OR＝1.85)之间的关联性。其他SNP不相关(p＞0.1)。多变量分析表明，SNPrs9402373(p＝0.03，OR＝2.26)和rs1256196(p＝0.02，OR＝1.88)两者都单独与严重纤维样变性相关。协变量是出生地(流行或非流行地区，p＝0.03)和HVB感染(p＝0.05)。

实施例2

在被曼氏血吸虫感染的苏丹人和巴西人中CTGF基因座中的SNP与严重肝纤维样变性(HF)之间的关联性

引起HF的两种主要血吸虫株是亚洲的日本血吸虫和非洲和南美的曼氏血吸虫。我们调查了在苏丹和巴西的曼氏血吸虫流行区域中HF是否也受CTGF等位基因变体的影响。将在中国渔民中与HF相关的CTGF多态性(表4)在两个样品中进行基因分型。表型是苏丹人中的严重HF伴有门静脉高血压或巴西人中的显著次级门静脉分支增厚，其中巴西人中感染比苏丹人中低得多，因为在巴西人样品中与苏丹人样品中相比传播更低。

首先使用单变量分析(表5上部)、其次通过多变量分析(表5下部)测试了基因型与HF表型(描述在材料和方法中)之间的关联性，包括SNPrs12526196、rs12527705和rs9402373。基因型是加重基因型，OR＝比值比，CI＝OR的置信区间。

苏丹农民：314人：219个对照和95个病例。巴西人：133位：60个病例和73个对照。

研究样品

苏丹人样品(314个对象，95个病例和219个对照)从住在苏丹WadMedani地区村庄的农民中征集(Dessein等，1999)。严重表型与HF相关(级别≥C)，具有门静脉高血压的迹象，如同(Dessein等，1999)中所述。所有对象大量暴露于曼氏血吸虫感染，并且未接受或接受很少吡喹酮治疗。然而，在该样品中，暴露和治疗数量不能准确评估。

巴西人样品(133个对象，73个对照和60个病例)在巴西东北部的村庄中，在经常接触被曼氏血吸虫侵染的蜗牛所污染的河流的成年对象中征集。在巴西人中与在中国人和苏丹人中相比，感染少得多，正如在青少年中通过血吸虫卵排泄所评估的。在不到2％的人群中观察到严重的HF，具有门静脉高血压。所有显示出次级门静脉分支的门静脉周增厚的明显迹象的对象作为病例，而其他与河流具有类似接触的对象作为对照。

发明人调查了在曼氏血吸虫感染的巴西人中肝纤维样变性是否也受CTGF等位基因变体的影响。巴西人组群为本研究专门征集，并且以前从未进行过基因分型。我们对在中国渔民中产生与纤维样变性的明显或提示性关联性的CTGF多态性进行了基因分型。在该关联性研究中，病例是具有门静脉次级分支壁增厚迹象的对象。唯一的混杂变量是患者的年龄。选择了具有多年暴露于感染的证据的所有对象。

发明人接下来调查了在苏丹和巴西流行地区对象中由曼氏血吸虫引起的HF是否也受CTGF等位基因变体的影响。将在中国渔民中与HF相关的CTGF多态性在两个样品中进行基因分型。表型是苏丹人中的严重HF伴有门静脉高血压或巴西人中的显著次级门静脉分支增厚，其中巴西人中感染比苏丹人中低得多。

结论：

在苏丹人(219个对照，95个病例)的单变量分析(表5左部)显示，SNPrs9402373(p＝0.02，OR＝2.7)、rs1256196(p＝0.044，OR＝3.2)和rs12527705(p＝0.05，OR＝3)与严重HF相关。加重的基因型在苏丹人和中国人中一致(表4和5)。多变量分析表明SNPrs9402373(p＝0.03，OR＝2.7)和SNPrs1256196(p＝0.03，OR＝3.5)与没有其他协变量的HF单独相关。

巴西人(73个对照，60个病例)的基因分型数据的单变量分析显示出(表5右部)SNPrs9402373(p＝0.02，OR＝2.57)和SNPrs6918698(p＝0.008，OR＝3)与没有其他协变量的HF之间的关联性。对于两种SNP来说，与疾病相关的基因型与中国人和苏丹人中的相同(表4和5)。多变量分析表明，在巴西人中SNPrs9402373和rs6918698与HF独立相关(p＜0.001，OR＞4)。

计算机分析表明，等位基因变体SNPrs9402373和rs12526196可能结合不同的核因子。我们使用EMSA证实了这一点：rs9402373C等位基因结合的核因子不被G等位基因结合(图2A)。该结合受到特异性的未生物素酰化的探针的竞争(图2B)。EMSA还显示出核因子对rs12526196T等位基因的更高的结合亲和性(图2A)。EMSA没有显示出对rs12527705和rs1931002多态性的等位基因特异性结合(图2A)。

然后将SNPrs9402373在所有四个测试过的样品中与HF相关联。这种关联性是在中国人和苏丹人中使用严格的纤维样变性表型或更严重的表型(HF+门静脉高血压迹象)观察到的。在中国人和苏丹人中，SNPrs1256196也与HF独立相关。我们的EMSA数据表明SNPrs1256196和SNPrs9402373的等位基因变体与核因子差异结合，表明他们可能影响基因转录的调控或转录本的稳定性。

在中国农民的分析中HBV感染是显著的协变量，表明HBV可能对严重疾病有显著贡献。这还表明SNPrs1256196和SNPrs9402373可能也调节由HBV引起的HF。

总的来说，本研究显示了多态性与纤维样变性的关联性，并鉴定了疾病发生中最关键的步骤，指明了新的治疗性靶点。它还提供了HF发展的有价值的标志物。

实施例3：在HCV感染的对象中CTGF基因座中的SNP与肝纤维样变性(HF)之间的关联性

在HCV感染的法国对象中CTGF遗传变体的分析

实施例1描述了在中国人群体样品中CTGF编码基因中的SNP关联性组(r2＞0.8)。它们在整个基因和10Kb的3’和5’侧翼区域中被确定。只分析了次要等位基因频率＞20％的SNP。在被日本血吸虫感染的中国渔民中存在7个组，其中4个(组II、III、IV和VI)与血吸虫卵引起的肝纤维样变性显示出一定关联性。在实施例3中，发明人在HCV感染的法国人样品中，对这四个组每个中的两个SNP以及附加的SNPrs9399005(其与血吸虫纤维样变性显示出提示性关联性)进行基因分型，并确定它们中的任何SNP是否与晚期肝纤维样变性相关。他们在组III和VI中发现了关联性证据，但是在组II和IV中没有发现。组IV中的SNPrs6918698(p＝0.03)和SNPrs3037970(p＝0.04)与肝纤维样变性相关。SNPrs6918698的CG和GG基因型与疾病加重相关(OR＝2.1，CI＝1.1-4.0)。

组VI只包含也在法国人样品中与肝纤维样变性相关(p＝0.007)的SNPrs9402373。CC基因型使疾病加重(OR＝2.54；1.3-4.96)。有趣的是，纯合C/C对象与纯合GG对象相比，显示出严重肝纤维样变性风险平均4倍的增加(OR＝4.1CI＝1.1-14)。包含SNPrs6918698和SNPrs9402373的多变量逻辑回归分析表明，后者与肝纤维样变性关联性最强。尽管如此，在SNPrs9402373存在下，SNPrs6918698仍然显示出与肝脏疾病相关的趋势，表明SNPrs9402373不能解释SNPrs6918698与疾病的全部关联性。因此，发明人得出结论，两种SNP与纤维样变性独立相关。

在HCV感染的巴西人中CTGF遗传变体也与肝纤维样变性相关

然后，发明人试图通过在HCV感染的巴西人中测试来自同样4个组的SNP，来验证上述发现。它们发现SNPrs6918698(p＝0.0004)与肝纤维样变性明显相关。SNPrs3037970显示出关联性趋势(p＝0.07)，程。检查了4个患有肝纤维样变性的群体，尤其是感染有日本血吸虫的中国中部洞庭湖渔民的群体以及居住在湖南省也感染有日本血吸虫的农民群体。

还包含了另外两个感染有曼氏血吸虫的群体(苏丹人和巴西人群体)。该分析过程导致在所述群体中鉴定到在患有肝纤维样变性的对象中出现比例过高的特定单核苷酸多态性SNP。

本发明人首先在中国中部岳阳市附近洞庭湖的渔民中检查纤维样变性。对在渔民群体中影响纤维样变性发生的各种因子进行的分析显示，性别、暴露于受感染的水和用吡喹酮进行抗血吸虫治疗与纤维样变性的风险显著相关。几种协变量的检验显示，“捕鱼年数”和“出生在渔船上”是度量暴露的最佳协变量。“治疗”协变量是在过去20年内吡喹酮治疗的次数。

使用这些协变量，发明人在群体样品(N＝300)上测试了12个候选基因(两个6q23区域中的基因(IFNGR1、CTGF)和10个该区域外的基因)中的SNP(每个基因三种)是否与纤维样变性的风险相关。一个靠近CTGF基因的SNPrs9399005产生了提示性的与纤维样变性的关联性(p＝0.02)。

然后，发明人在8个病例和2个对照(渔民群体)中，对CTGF基因的3.2kb和起始密码子上游的15.3kb以及3’UTR区中的14.1kb进行了测序。记录到61个SNP，其中50个以前已被描述。五十三个SNP(53个SNP)具有＞20％的MAF。因为发明人正在寻找具有主要影响的基因，因此他们选择了MAF＞20％的SNP。在70位渔民上对53个SNP中的33个进行了基因分型。

使用来自于HapMap计划的数据，他们发现了7个关联性组(r2＝0.5)，在组I到组VII中分别包括5、2、3、2、5、3、2个SNP(图并SNPrs6918698是造成SNPrs3037970关联性的原因。SNPrs6918698加重基因型是G/G(OR2.94；1.5-7.7)。与在法国人样品中相同，发明人观察到在巴西人样品中，组VI中的SNPrs9402373与肝纤维样变性强烈(p＝0.003)相关(OR＝2.94，1.45-5.97)。值得注意的是，在该样品中，与在法国人样品中相同，C/C加重疾病。因为带有G/G基因型的对象很少，发明人不能对纯合对象之间的严重纤维样变性风险进行比较。最后，发明人还显示了SNPrs9399005与肝纤维样变性的关联性的趋势(p＝0.06)。

逻辑回归分析显示，SNPrs9402373(p＝0.029)和SNPrs6918698(p＝0.03)两者以可比的相对风险(OR＝2.4-2.5)独立地造成肝纤维样变性，并且在存在两种其他SNP的情况下SNPrs9399005与纤维样变性的关联性丧失，表明该SNP与肝纤维样变性的关联性可能完全是由它与SNPrs9402373和SNPrs6918698的关联性引起的。然而，不能完全排除SNPrs9399005也可能与肝纤维样变性独立相关。

然后，发明人对使用SNPrs9402373在HCV感染的法国人和巴西人中获得的数据进行了后设分析。

没有使用SNPrs6918698进行这样的分析，因为在法国人(G/G+C/G)和巴西人(G/G)中与纤维样变性相关的基因型是不同的。发明人发现，SNPrs9402373CC基因型与HCV引起的肝纤维样变性相关(p＝0.00005，OR＝2.72；1.67-4.43)。

因为在上述实施例中显示出SNPrs9402373的该相同CC基因型与肝纤维样变性相关，发明人还执行了研究的后设分析，所述研究测试了该SNP与HCV诱导的HF(两项研究)和血吸虫诱导的HF(4项研究)的关联性。该后设研究的结果呈现在图3中，并显示出在具有显著不同的遗传背景的群体(中国人、苏丹人、巴西人和法国人)中，SNPrs9402373的CC与由不同病原体(HCV、曼氏血吸虫和日本血吸虫)引起的严重肝纤维样变性强烈相关(p＜10^-9)(OR＝2.47；1.8-3.25)。

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Claims

1.CTGF基因座中的变异在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒用于检测对象中发生肝纤维样变性或肝硬化的易感性或对肝纤维样变性或肝硬化进行诊断和/或预后，其中所述CTGF基因座在所述对象的生物样品中，以及其中所述变异为rs9402373。

2.权利要求1的应用，其中所述试剂盒用于评估肝纤维样变性的进展。

3.权利要求1或2的应用，其中所述肝纤维样变性由甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、日本血吸虫(Schistosomajaponicum)或曼氏血吸虫(Schistosomamansoni)感染引起。

4.权利要求1的应用，其中在感染HCV的对象的生物样品中的CTGF基因座的变异包含SNPrs9402373，其中在rs9402373位置处存在等位基因C，指示对象中发展肝纤维样变性的风险或指示肝纤维样变性的发展或指示肝纤维样变性的不良预后。

5.权利要求1的应用，其中CTGF基因座中变异的存在通过测序、选择性杂交和/或选择性扩增来检测。

6.权利要求1的应用，其中SNP的存在通过限制性酶消化来检测，至少一个所述SNP的检测指示纤维样变性。