CN102325874A - 通过使细胞增殖与海藻产品生产分离来最优化海藻产品的生产 - Google Patents

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Abstract

在海藻中，用于最佳的生物量生产的条件与用于油/脂质生产的最佳条件不同。常规的方法需要同时优化两个步骤，这一定是不理想的。本发明提供了用于分别和独立地优化每种类型的生产的体系和方法，由此改进油、脂质和其他有用产品的总生产。这种方法是有利的，因为其允许在从生物量至油的生产中优化单独的步骤和生长期。这允许对于不同方法步骤使用不同的给料。

Description

通过使细胞增殖与海藻产品生产分离来最优化海藻产品的生产
相关申请的引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2008年12月19日提交的第61/201,635号美国临时专利申请的优先权，该申请的全部内容以引用的形式并入本文中。
发明背景
海藻是最多产和分布最广的地球生物体群之一。目前已知有超过150,000种海藻，并且可能更多的海藻仍有待发现。虽然可能对于在总的生命分类学中如何区别所有不同的海藻种还存在某些未知的事项，但是对于大多数海藻种类，其基本的识别特征和特点是已知的。
海藻(包括许多具有不同大小和颜色的植物样形式，硅藻以及蓝细菌)组成了地球上生物的最重要的种类之一，其是形成我们的大部分环境的原因以及形成许多其他生命形式的食物链的基础。完整的生态体系根据海藻进化或与海藻共生，并且海藻环境包括食物源、食肉动物、病毒和许多其他通常与高等生命形式有关的环境元素。
尽管已知海藻的范围和重要性，但直接的人类使用是有限的。海藻经生长或收获，作为食物，尤其在亚洲通常以“海草”的形式。它们也广泛用于生产多种配料，例如着色剂和食品添加剂。也已经将海藻用于工业生产以浓缩并除去重金属元素污染，称为硅藻土的硅藻残留物用作过滤培养基和用于其他应用。
海藻也产生油、淀粉和气体，其能被用于生产柴油、醇(例如乙醇)以及氢气或甲烷气体。
尽管其他生物材料也能够产生这些燃料，但海藻的区别是它们的高产率和低理论成本。海藻能够比其他植物形式生长快10至100倍。在海藻产生期望的油或淀粉时，其也能够非常多产，在某些情况下在这些形式中其产生它们自身重量的约60％。除了高产率的优势，将海藻用于生物产品也不与农业竞争耕地，其既不需要农田也不需要新鲜的水。此外，海藻以最基本的输入达到了所有这些，在大多数情况下当海藻是光合自养生物时，其仅需要阳光、水、空气、二氧化碳和简单的营养物质。
尽管海藻有作为燃料源的清晰潜在优势，但因为许多原因，在过去，实际上实现这种潜力被证明是沮丧的和困难的。例如，最优化的海藻细胞增殖的条件与最优化的油/脂质产生的那些条件不同。常规方法需要两个步骤同时被最优化，这对于每一步骤的子优化是必须的。
发明概述
本发明提供了用于分别地和独立地最优化生物产品(例如油)的各类基于海藻的生产的体系和方法，由此改善油、脂质和其他有用产品的总产量。这种方法是有利的，因为它允许在从生物量到油的生产中最优化单个步骤和生长期。这也允许使用用于不同工序步骤的不同给料和生长条件。
因此，本发明的第一方面提供了生长用于生产海藻产品的海藻的方法，其包括：(1)在第一异养或光能异养生长条件下生长海藻以增加海藻细胞分裂的速率和海藻细胞数量；(2)在第二生长条件下生长海藻以生产海藻产品；其中在所述第二生长条件下海藻细胞数量没有显著增加。
在某些实施方案中，第一生长条件包括具有最佳的细胞数量增长所需的非限制水平的营养物质和痕量元素的培养基。所述营养物质可以包括一种或多种C、N、P、S和/或O源。
在某些实施方案下，所述培养基可以包含需要时任选用另外的营养物质补充的厌氧生物消化物的液体分离。所述厌氧生物消化物可以产生于动物内脏、牲畜粪便、食物加工废料、城市废水、酒糟水(thin stillage)、酒糟(distiller’s grain)或其他有机材料的厌氧消化。
在某些实施方案中，所述营养物质的浓度对细胞分裂和/或生长是无毒的。
在某些实施方案中，所述第一生长条件包括用于细胞分裂的最佳温度，非嗜热海藻的最佳温度范围为约0℃-40℃，或者嗜热海藻的最佳温度范围为约40℃-95℃或60℃-80℃。
在某些实施方案中，所述第一生长条件包括一种或多种生长激素或其模拟物。所述生长激素可以包括选自生长素、细胞分裂素、赤霉素和/或其混合物的至少一种、两种、三种、四种、五种或多种生长激素。优选地，生长激素包括来自选自生长素、细胞分裂素或赤霉素的每一种类/类别的激素的至少一种或两种。
例如，所述生长素可以包括吲哚乙酸(IAA)和/或1-萘乙酸(NAA)。其他生长素模拟物可以为2，4-D；2，4，5-T；吲哚-3-丁酸(IBA)；2-甲基-4-氯苯氧基乙酸(MCPA)；2-(2-甲基-4-氯苯氧基)丙酸(甲氯丙酸，MCPP)；2-(2，4-二氯苯氧基)丙酸(2，4-滴丙酸，2，4-DP)；或(2，4-二氯苯氧基)丁酸(2，4-DB)。
在某些实施方案中，所述赤霉素包括GA3。
在某些实施方案中，所述细胞分裂素为腺嘌呤类的细胞分裂素或苯基脲类的细胞分裂素。例如，腺嘌呤类的细胞分裂素或模拟物可以包括激动素、玉米素和/或6-苄基氨基嘌呤，并且苯基脲类的细胞分裂素可以包括二苯脲和/或噻二唑苯基脲(TDZ)。
在某些实施方案中，所述第一生长条件进一步包括维生素B1或其类似物/模拟物。
在某些实施方案中，生长素与细胞分裂素的比率(w/w)为约1∶2-2∶1，优选为约1∶1。
在某些实施方案中，生长素与赤霉素的比率(w/w)为约1∶2-2∶1，优选为约1∶1。
在某些实施方案中，生长素与维生素B1的比率(w/w)为约1∶4-1∶1，优选为约1∶2。
在某些实施方案中，所述模拟物为苯氧基乙酸化合物。
在某些实施方案中，所述第二生长条件包括限氮培养基(nitrogen-limited medium)(例如，约1.5mgN/L-15mgN/L)或具有使海藻产品合成最优化的氮水平的培养基。
在某些实施方案中，所述第二生长条件可以包括油刺激因子。
在某些实施方案中，所述油刺激因子包括腐植酸(humate)，例如灰黄霉酸或腐植酸(humic acid)。
在某些实施方案中，在所述第一生长条件下，在第一生物反应器中培养海藻，并在所述第二生长条件下，在第二生物反应器中培养海藻。优选地，所述第一生物反应器适于最优化的细胞数量增长。例如，可以在无菌条件下在所述第一生物反应器(例如，所述第一生物反应器适于灭菌)中异养或光能异养生长海藻细胞。优选地，所述第二生物反应器适于海藻产品的最优化生产。
在某些实施方案中，在到达静止生长期之前(例如在指数生长期内)，将海藻从所述第一生长条件转换至所述第二生长条件。例如，当所述第一生长条件中的一种或多种营养物质基本消失时，可以将海藻从所述第一生长条件转换至所述第二生长条件。例如，当海藻培养物的细胞密度达到约5×107细胞/mL时，也可以将海藻从所述第一生长条件转换至所述第二生长条件。当海藻培养物的蛋白浓度达到约0.5-1g/l，或约0.8g/l时，也可以将海藻从所述第一生长条件转换至所述第二生长条件。当海藻培养物的色素浓度达到约0.005mg/L(对于叶绿素a或叶绿素b)，或约0.02mg/L(对于总叶绿素)时，也可以将海藻从所述第一生长条件转换至所述第二生长条件。
在某些实施方案中，可以通过在所述第一生长条件下收获用于在所述第二生长条件下生长的海藻细胞来将海藻从所述第一生长条件转换至所述第二生长条件。
在某些实施方案中，不将海藻转移至新的容器。反而改变培养基以引起生长条件的转换。例如，在某些实施方案中，停止向培养基中添加氮将使生物体改变其培养基组成(例如耗尽氮)，而不需要第二个生长容器和相关的海藻培养物的转移。
在某些实施方案中，通过连续稀释在所述第一生长条件下在第一生物反应器中生长的海藻培养物，并收集用于在所述第二生长条件下在第二生物反应器中生长的置换(displaced)海藻培养物来将海藻从所述第一生长条件转换至所述第二生长条件。
在某些实施方案中，在所述第一生长条件下的海藻细胞数量增加的速率基本等于稀释速率，使得在所述第一生物反应器中的海藻细胞数量基本保持不变。
在某些实施方案中，在所述第一生长条件下的海藻细胞数量增加至少约2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍、1010倍或更多。
在某些实施方案中，海藻细胞分裂的速率增加至少约20％、50％、75％、100％、200％、500％、1,000％等或更多。
在某些实施方案中，在所述第一生长条件下的海藻培养物的群体倍增时间为约0.05日-2日。
在某些实施方案中，在所述第一生长条件下的所述海藻产品的累积量是不显著的或是未达最佳标准的。优选地，在所述第一生长条件下的海藻产品小于海藻生物量的约65％、30％、20％或甚至小于10％(w/w)。
在某些实施方案中，在所述第二生长条件下的海藻细胞数量增加不多于1个对数级(或约10倍)、300％、200％、100％或50％。
在某些实施方案中，在所述第二生长条件下的海藻生物量大大增加。在某些实施方案中，如本文所述，海藻生物量增加包括从活海藻细胞中提取的或分泌的那些海藻产品。
在某些实施方案中，由于累积所述海藻产品，海藻生物量大量增加。
在某些实施方案中，在所述第二生长条件下的海藻生物量增加至少约2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或200倍、500倍、1000倍、1500倍或2000倍。
在某些实施方案中，在所述第二生长条件下的海藻产品为海藻生物量的至少约45％、55％、65％、75％、85％、90-95％(w/w)或甚至更多。
在某些实施方案中，所述海藻产品为油或脂质。在其他实施方案中，所述海藻产品为淀粉(或多糖)。
在某些实施方案中，海藻在异养、光能异养或自养条件下新陈代谢。
在某些实施方案中，海藻为绿藻门(Chlorophyte)或硅藻门(Bacilliarophyte)(硅藻属(diatom))或纤维藻门(Ankistrodesmu)。
本发明的另一方面提供了在异养条件下用于生长海藻的培养基，其包含表1所列的成分，其中培养基中每一所列成分的最终浓度与表1中所列的最终浓度的偏差在约50％(增加或降低)、40％、30％、20％、10％或5％内。在某些实施方案中，所述培养基为表1的异养生长培养基(HGM)。
在某些实施方案中，在基本相同的条件下，对于原壳小球藻(Chlorella protothecoide)，所述培养基基本支持与表1的HGM培养基相比的相同的生长速率。
本发明的另一方面提供了适于本发明的海藻生长方法的体系。优选地，可将适于第一生长阶段的生物反应器灭菌以在异养和光能异养条件下促进纯性(axenic)海藻生长。
在任何适用的情况下，预期本文所述的所有实施方案可与其他实施方案的特征结合。
附图简述
图1示出在存在或不存在植物生长调节剂组合的情况下，原壳小球藻的示例性生长曲线。
图2示出在存在或不存在植物生长调节剂组合的情况下，原壳小球藻的示例性生长曲线。
图3示出在存在或不存在植物生长调节剂组合的情况下，原壳小球藻的示例性生长曲线。
图4示出在存在或不存在植物生长调节剂组合的情况下，原壳小球藻的示例性生长曲线。
发明详述
本发明部分基于下述发现：在合适的生长条件下，海藻能够使用简单的预制有机分子(例如糖)作为它们的碳源来进行光能异养和异养生长。
本发明还部分基于下述发现：能够在两阶段生长中进行增值型生物产品(例如油)的基于海藻的生产，其中所述第一阶段主要促进细胞分裂和海藻增殖(“生长阶段”)。在海藻细胞已经达到指数生长后(但在静止期之前)，可将细胞转换至第二生长条件以主要集中在产品生产上(“生产阶段”)。通过例如使用其中一种或多种营养物质(诸如氮源)受限的培养基可引起期望的海藻产品的生产。在第二生长条件中生长的海藻细胞将大多数的能量和资源花费在生产期望的海藻产品，而不是进一步的细胞分裂/增殖中。这种两阶段生长允许生长阶段和生产阶段的分离的最优化，由此确保生物产品的最大效率和最佳生产。
通过在第一(生长)阶段中异养或光能异养(与自养相反)生长海藻，能够最优化细胞生产，这极大地改善了经济状况，这是由于自养第一生长阶段限制了能够生产的生物量的总量以及生产所述生物量的速率。为了补偿这些无效率，使用自养第一生长阶段的培养设备的总尺寸必须是巨大的，由此进一步降低了效率并增加了运行基于海藻的生物产品设备的成本。
使用异养或光能异养第一生长阶段的另一优势在于其允许培养容器的无菌。与单种藻培养物相反，这允许海藻培养物以纯性培养物的形式在无菌条件下生长。这降低了生物反应器中的种间竞争，并允许最佳的营养物质利用和海藻产品生产。
如本文所用的“纯性(培养物)”是指不被任何其他培养物或生物体污染的纯的培养物。例如纯性海藻培养物仅有一个海藻种，并且没有或基本没有任何其他微生物，例如细菌、真菌、病毒或其他竞争/不期望的海藻种。纯性培养物可以为单细胞或多细胞生物体，只要其没有任何与其结合的污染生物体。相反地，“单种藻(培养物)”可以仅包含一种海藻，但在相同的培养物中也可以存在细菌或其他微生物。
本发明的另一方面部分基于下述发现：海藻培养物能够被由厌氧消化物得到的液体分离物有利地支持，所述厌氧消化物由许多传统上被认为是“废料”的有机材料的厌氧消化产生。这样的“废料”的实例包括(但不限于)：动物内脏、牲畜粪便、食物加工废料、城市废水、酒糟水、酒糟或其他有机材料等。这不仅提供了使用消化物的有用方式，而且显著降低了生产期望海藻产品的成本。
因此，本发明提供了生长用于生产海藻产品的海藻的方法，其包括：(1)在第一异养或光能异养生长条件下生长海藻以增加海藻细胞分裂的速率和海藻细胞数量；(2)在第二生长条件下生长海藻以生产海藻产品；其中在所述第二生长条件下海藻细胞数量没有显著增加。
如本文所用的“没有显著增加”包括总海藻细胞数量增加少于约1个数量级或约10倍(例如8或16倍或约3-4轮细胞分裂)的情况。在指数生长阶段期间，海藻细胞数量的增加超过104-109倍(或4-9个对数级)是寻常的，这部分取决于起始培养物的细胞数量。到将海藻细胞从指数生长期转换至生产期时为止，在第二生长条件下，许多海藻细胞稳定在再分裂至少又一轮(通常再3-4轮)。因此，与在指数第一生长阶段期间的显著性的细胞数量增加相比，在第二生长条件下仅有1个对数级或10倍左右的细胞数量增加是非常不显著的。
多种不同的培养基可以用于支持海藻生长。通常，适当的培养基可以包含氮、痕量金属(例如磷、钾、镁和铁等)的无机盐、维生素(例如硫胺)等，它们是生长所必须的。例如，可以使用诸如VT培养基、C培养基、MC培养基、MBM培养基(参见Sorui Kenkyuho，ed.by Mitsuo Chiharaand Kazutoshi Nishizawa，Kyoritsu Shuppan(1979))和MDM培养基、OHM培养基(参见Fabregas等人，J.Biotech.，Vol.89，pp.65-71(2001))、BG-11培养基及其改良物的培养基。适当的培养基的其他实例包括，但不限于Luria肉汤、淡盐水、添加了营养物质的水、乳品废水(dairy runoff)、盐度小于或等于1％的培养基、盐度大于1％的培养基、盐度大于2％的培养基、盐度大于3％的培养基、盐度大于4％的培养基，及其组合。最优选的培养基包括任选补充了另外的营养物质的厌氧生物消化物的液体分离物。可以通过机械方法将液体从厌氧生物消化物中分离，例如通过使用螺旋压力机或通过离心将液体从厌氧生物消化物中分离。液体理想地包含不多于5％-10％的固体含量，优选不多于8％的固体含量。
可以根据这些培养基的作用(例如期望的海藻产品的生长或诱导)选择它们。例如，对于最佳的细胞分裂/增殖，使用具有大量氮源成分的培养基(例如，丰富培养基：用氮表示，包含至少约0.15g/L)。对于海藻产品生产，具有少量氮源成分的培养基(例如，用氮表示，包含小于约0.02g/L)是优选的。另外，可以使用包含这些培养基的中间浓度氮源的培养基(低营养物质培养基：用氮表示，包含至少0.02g/L至小于0.15g/L)。
换言之，在第一生长条件期间，培养基优选具有最佳的细胞数量增加所需的非限制水平的营养物质(包括一种或多种C、N、P、S和/或O源)和痕量元素。优选地，营养物质的浓度对细胞分裂和/或生长是无毒的。
可根据要接种的海藻的量及其期望生长速率来确定氮浓度、磷浓度和培养基的其他性质。例如，当将约105个细胞每毫升的海藻数接种在低营养物质(例如氮)培养基中时，海藻将生长至某种程度，但因为氮源的量太小，生长将停止。这样的低营养物质培养基适用于在单一步骤中连续进行生长和海藻产品生产(例如以批次方式)。此外，通过将N/P摩尔比调节至约10-30，优选15-25的值，或者通过将C/N摩尔比调节至约12-80的值(例如较低的N含量)，可诱导水藻生产期望的生物产品(例如油)。在用于接种的海藻数较高的情况下，可以使用丰富培养基来进行上述培养。这样，考虑到不同的条件，可以确定培养基的组成。
在海藻生长培养基中的氮源或氮补充物可以包括硝酸盐、氨、脲、亚硝酸盐、铵盐、氢氧化铵、硝酸铵、谷氨酸一钠、可溶蛋白、不可溶蛋白、水解蛋白、动物副产物、乳品废料、酪蛋白、乳清、水解酪蛋白、水解乳清、豆产品、水解豆产品、酵母、水解酵母、玉米浆、玉米浸泡液(corn steep water)、玉米浆固体(corn steep solids)、酒糟、酵母提取物、氮的氧化物、N2O或其他适当来源(例如其他肽、寡肽和氨基酸等)。碳源或碳补充物可包括糖、单糖、二糖、糖醇、脂肪、脂肪酸、磷脂、脂肪醇、酯、寡糖、多糖、混合糖、甘油、二氧化碳、一氧化碳、淀粉、水解淀粉或其他适当来源(例如其他5碳糖等)。
另外的培养基配料或补充物可包括缓冲液、矿物质、生长因子、防沫剂、酸、碱、抗生素、表面活性剂或抑制不期望的细胞生长的物质。
可在开始添加所有营养物质，或者在开始添加某些营养物质并在生长过程期间以单一后续添加的形式添加某些营养物质，在海藻生长期间以连续进料的形式添加某些营养物质，在生长期间以多剂量的相同或不同营养物质的形式添加某些营养物质，或者以这些方法的组合的形式添加某些营养物质。
如果期望，可在开始或生长期间通过使用缓冲液或通过添加酸或碱来控制或调节培养物的pH。在某些情况下，可在相同或不同时间在反应器不同区域或相同区域中使用酸和碱二者以实现期望的控制pH程度。缓冲体系的非限制性实例包括单盐基磷酸、二盐基磷酸或三盐基磷酸、TRIS、TAPS、N-二(羟乙基)甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、HEPES、TES、MOPS、PIPES、卡可酸盐、MES和乙酸盐。酸的非限制性实例包括硫酸、HCl、乳酸和乙酸。碱的非限制性实例包括氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铵、氨、碳酸氢钠、氢化钙和碳酸钠。这些酸和碱的某些除了修饰pH之外还可以充当细胞的营养物质。在生长的整个期间内，培养物的pH能够控制至大约恒定的值，或者能够在生长期间变化。这样的变化可用于启动或终止不同的分子路径以促进生产一种特定的产品，以促进累积诸如脂肪、染料或生物活性化合物的产品，以抑制其他微生物的生长，以抑制或促进泡沫产生，以促进细胞休眠，以使它们从休眠恢复，或者为了某些其他目的。
在某些实施方案中，优选在培养期间将pH保持在约4-10，或约6至8。
同样地，在某些实施方案中，培养物的温度可被控制或调节至近似的特定值，或者在生长期间为了如pH变化所列的相同或不同的目的其可被改变。例如，在第一生长条件下，对于非嗜热海藻，细胞分裂的最佳温度可以为约0℃-40℃、20℃-40℃、15℃-35℃或约20℃-25℃；对于嗜热海藻，细胞分裂的最佳温度可以为约40℃-95℃，优选为约60℃-80℃。
在某些这样的实施方案中，提供了温度控制元件，其包括在体系内检测温度的温度(例如培养基温度)测量元件，和能够控制响应于测量的温度的控制元件。所述控制元件可包括淹没的线圈或培养容器的边上或下盘上的保温套。
在某些实施方案中，在第一生长条件下，可以向海藻培养物中添加一种或多种生长激素/调节剂或其模拟物，例如植物生长激素/调节剂或其模拟物，以促进细胞分裂或增殖。
植物激素影响植物的基因表达和转录水平、细胞分裂和生长。人们合成了大量的相关化合物，并将其用于调节栽培植物、杂草和体外生长的植物和植物细胞的生长。这些人造化合物也称为植物生长调节剂或简称为PGR。如本文所用的“生长激素(或其模拟物)”包括天然植物激素和人造/合成调节剂、模拟物或其衍生物。优选地，生长激素/调节剂或其模拟物刺激海藻生长至少在一个浓度下，优选在类似于或等于诸如实施例3-7的下面的实施例中所用的条件下。术语“生长激素”和“生长调节剂”在本文中可以交互使用。
通常，植物激素和调节剂被分为五种主要类别，某些类由结构可从一种植物到另一植物不同的许多不同化学制剂组成。根据化学制剂的结构相似性及其对植物生理学的影响将每一化学试剂归为这些类别的一类。其他植物激素和生长调节剂不能简单归为这些类。它们天然存在或由人类或其他生物体合成，其包括抑制植物生长或阻碍植物内生理学过程的化学制剂。
五种主要类别为：脱落酸(也称为ABA)；生长素；细胞分裂素；乙烯；以及赤霉素。其他识别的植物生长调节剂包括：芸苔素内酯(化学上类似于动物类固醇激素的植物类固醇。它们促进细胞延长和细胞分裂、木质组织分化并抑制落叶)；水杨酸(激活某些植物的产生帮助抵御疾病入侵的化学制剂的基因)；茉莉酮酸酯(由脂肪酸产生并好像促进用于抵挡入侵生物体的防御蛋白的产生。它们也被认为在种子萌芽中起作用，并影响种子中蛋白的储存，并好像影响根生长)；植物肽激素(涵盖所有的涉及细胞到细胞信号传导的小分泌肽。这些小的肽激素在包括防御机制、控制细胞分裂和扩张、花粉自交不相容的植物生长和发育中起决定作用)；聚胺(在迄今研究的所有生物体中都被发现了的低分子量强碱性分子。它们是植物生长和发育必不可少的，并影响有丝分裂和减数分裂过程)；一氧化氮(NO)(充当激素和抵御应答的信号)；独角金萌发素内酯(Strigolactone)(涉及抑制枝条分支)。
PGR的脱落酸类包括一种源自叶绿体的通常在植物叶片中产生的，尤其是当植物在压力下时产生的化合物。通常，其作为影响芽生长、种子和芽休眠的抑制性化合物。
生长素是正面影响细胞增大、芽形成和发根的化合物。它们也促进其他激素的产生，它们与细胞分裂素协同，控制茎、根和果实的生长，并将茎转变为花。生长素通过改变细胞壁可塑性影响细胞延长。生长素在光照时降低，并在黑暗时增加。生长素在浓度大时对植物有毒性；它们对双子叶植物毒性最大，对单子叶植物毒性较小。因为这种性质，已经开发了包括2，4-D和2，4，5-T在内的合成的生长素灭草剂，并将其用于杂草控制。当扦插植物时，也通常将生长素，尤其是1-萘乙酸(NAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)，用于刺激根生长。在植物中发现的最常见的生长素是吲哚乙酸或IAA。
生长素家族的重要成员是吲哚-3-乙酸(IAA)。它在完整植物中产生大部分生长素效应，并且是最强的天然生长素。然而，IAA分子在水溶液中是化学不稳定的。其他天然产生的生长素包括4-氯-吲哚乙酸、苯基乙酸(PAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)。常见的合成生长素类似物包括1-萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和其他。几个示例性(非限制的)的可立即用于本发明的天然和合成生长素如下所示。
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细胞分裂素或CK是影响细胞分裂和幼苗形成的一组化学制剂。它们也帮助延缓衰老或老化组织，它们在植物内起介导生长素运输的作用，并影响节间长度和叶片生长。它们具有与生长素相呼应的高度协同作用，并且这两组植物激素的比例在植物一生中影响大多数主要生长周期。细胞分裂素对抗由生长素导致的顶端优势；它们与乙烯协同促进除去叶片、花器部分和果实。
有两类细胞分裂素：以激动素、玉米素和6-苄基氨基嘌呤为代表的腺嘌呤类细胞分裂素，以及苯基脲类细胞分裂素，如二苯脲或噻二唑苯基脲(TDZ)。
Figure BPA00001423037700141
乙烯是存在于所有细胞中的通过杨氏循环(Yang Cycle)从甲硫氨酸分解形成的气体。其作为植物激素的效力依赖于其生产速率与其流入大气速率的比。在快速的生长和细胞分裂中，尤其是在黑暗中以较快速率产生乙烯。新的生长和新发芽的幼苗产生比能够离开植物的更多的乙烯，这导致升高量的乙烯，抑制了叶片扩张。当新幼苗暴露于光下时，植物细胞中光敏色素导致的反应产生了用于降低乙烯生产的信号，允许叶片扩张。乙烯影响了细胞生长和细胞形状；当还在地下的生长的幼苗遇到障碍物时，乙烯生产大量增加，阻止了细胞延长并导致茎膨胀。所得的较厚的茎能够对阻止其到表面的路径的物体施加更大的压力。如果幼苗没有到达表面，并且乙烯刺激变为持续的，这影响茎垂直生长的天然向地性反应，使其围绕物体生长。研究似乎表明乙烯影响茎的直径和高度：当树的茎被缠绕时，导致侧面压力，发生更多的乙烯生产，导致了更厚的、更强壮的树干和树枝。乙烯影响果实成熟：正常地，当种子成熟时，乙烯生产增加并在果实内增加，导致刚好在种子传播前发生跃变事件。核蛋白ETHYLENE INSENSITIVE2(EIN2)是受乙烯生产调节的，并且反过来调节包括ABA和压力激素在内的其他激素。
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赤霉素或GA包括在植物内天然产生的和由真菌产生的大范围的化学制剂。在种子萌发中赤霉素是重要的，其影响调动用于生长新细胞的食物产生的酶的产生。这通过调节染色体转录完成。在谷物(大米、小麦、玉米等)种子中，称为糊粉层的细胞层包裹在胚乳组织周围。由种子吸收水分导致GA产生。将GA运至糊粉层，其通过产生分解胚乳内储存的食物储备的酶进行响应，幼苗生长利用这些酶。GA产生玫瑰花环形成植物的抽苔，增加节间长度。它们促进开花、细胞分裂和萌芽后的种子生长。赤霉素也逆转幼苗生长抑制和由ABA诱导的休眠。
所有已知的赤霉素都是由质体的萜类化合物路径合成的，然后在内质网和胞液内修饰直到它们达到它们的生物活性形式的二萜酸。所有的赤霉素都来自对映赤霉素烷骨架，但通过对映贝壳杉烯合成。赤霉素以发现顺序称为GA1....GAn。首个被描述结构的赤霉素的赤霉酸是GA3。到2003年为止，有从植物、真菌和细菌识别的126个GA。赤霉素是四环二萜酸。根据存在19个碳或20个碳有两个种类。19-碳赤霉素，例如赤霉酸，丢失了碳20，并且在恰当的位置具有连接碳4和碳10的五元内酯桥。19-碳形式通常是赤霉酸的生物活性形式。羟基化作用也对赤霉酸的生物活性具有重要影响。通常，生物活性最大的化合物是二羟基化的赤霉酸，其在碳3和碳13上都具有羟基。赤霉酸是二羟基化的赤霉酸。典型的(非限制性的)赤霉酸如下所示：
Figure BPA00001423037700151
Figure BPA00001423037700161
可用于本发明的示例性的生长激素/调节剂或其模拟物包括在生长素家族、细胞分裂素家族和/或赤霉酸家族中的那些。
例如，用于本发明的生长素和模拟物包括(无限制)：吲哚乙酸(IAA)；2，4-D；2，4，5-T；1-萘乙酸(NAA)；吲哚-3-丁酸(IBA)；2-甲基-4-氯苯氧基乙酸(MCPA)；2-(2-甲基-4-氯苯氧基)丙酸(甲氯丙酸，MCPP)；2-(2，4-二氯苯氧基)丙酸(二氯丙酸，2，4-DP)；(2，4-二氯苯氧基)丁酸(2，4-DB)；4-氯-吲哚乙酸(4-Cl-IAA)；苯基乙酸(PAA)；2-甲氧基-3，6-二氯苯甲酸(麦草畏)；4-氨基-3，5，6-三氯甲基吡啶甲酸(毒莠定或百草枯)；α-(对-氯苯氧基)异丁酸(PCIB，抗生长素)，或其混合物。当用作混合物时，有效量的IAA(当单独使用时)或有效量的IAA+NAA的混合物优选具有等效的生物活性(例如，在基本相同的生长条件下，刺激海藻细胞生长到基本相同的程度，优选在基本相等量的时间内)。参见例如下面实施例中使用的条件。
用于本发明的细胞分裂素及其模拟物可以为腺嘌呤类或苯基脲类，并且可以包括(非限制)激动素、玉米素、6-苄基氨基嘌呤(6-BA或6-BAP)、二苯基脲、噻二唑苯基脲(TDZ)或其混合物。优选地，使用腺嘌呤类的细胞分裂素，例如激动素、玉米素、6-苄基氨基嘌呤(6-BA或6-BAP)或其混合物。当用作混合物时，有效量的激动素+6-BA的混合物优选具有等效的生物活性(例如，在基本相同的生长条件下，刺激海藻细胞生长到基本相同的程度，优选在基本相等量的时间内)。参见例如下面实施例中使用的条件。
用于本发明的赤霉素及其模拟物可以为任何本文所述的或本领域已知的赤霉素，例如GA3。优选地，有效量的GA3的赤霉素、模拟物或衍生物或其混合物具有等效的生物活性(例如，在基本相同的生长条件下，刺激海藻细胞生长到基本相同的程度，优选在基本相等量的时间内)。参见例如下面实施例中使用的条件。
模拟物也可以为苯氧基乙酸化合物。
为了实现最佳的生长刺激效果，培养基中总生长素与总细胞分裂素的(重量)比可以调节至约1∶2至2∶1，优选约1∶1。
当存在赤霉素时，培养基中总生长素与总细胞分裂素的(重量)比可以调节至约1∶4至1∶1，优选约1∶2。
在某些实施方案中，可以存在维生素B1或其模拟物、衍生物或功能等价物。优选地，培养基中总生长素与总维生素B1的(重量)比可以调节至约1∶2至2∶1，优选约1∶1。
在某些实施方案中，在生长培养基中生长素的总浓度为约0.01-0.04μg/L、约0.003-0.12μg/L、约0.002-0.2μg/L，或约0.001-0.4μg/L。
在某些实施方案中，在生长培养基中细胞分裂素的总浓度为约0.01-0.04μg/L、约0.003-0.12μg/L、约0.002-0.2μg/L，或约0.001-0.4μg/L。
在某些实施方案中，在生长培养基中赤霉素的总浓度为约0.01-0.04μg/L、约0.003-0.12μg/L、约0.002-0.2μg/L，或约0.001-0.4μg/L。
在某些实施方案中，在生长培养基中维生素B1化合物的总浓度为约0.02-0.08μg/L、约0.006-0.24μg/L、约0.004-0.4μg/L，或约0.002-0.8μg/L。
在某些实施方案中，可以使用乙烯、芸苔素内酯、水杨酸、茉莉酮酸酯、植物肽激素、聚胺、氧化氮和/或独角金内酯。
在某些实施方案中，可以使用乙烯、芸苔素内酯、茉莉酮酸酯、植物肽激素和/或聚胺。
在某些实施方案中，优选在诸如实施例3-7的实施例中的一种生长条件下，一种或多种激素/调节剂的存在使海藻增殖增加了约15％(例如1.4至1.6)、20％、25％、30％、35％或更多。
可以在第一生物反应器中在第一生长条件(例如第一步骤/阶段)下生长海藻培养物，并在第二生物反应器中在第二生长条件(例如第二步骤/阶段)下生长海藻培养物。在批次方法中可以使用单独的培养罐或容器独立进行第一步骤和第二步骤。还可能在第一步骤结束时洗涤并收集生长的海藻，将海藻放回相同的培养罐，然后进行第二步骤。在某些实施方案中，洗涤是任选的，并且可以必须或可以不必须依赖于第一反应器的培养基。
可以批次方式、连续方式或半连续方式运行开放的池或封闭的(优选可灭菌的)生物反应器。例如，在批次方式中，用新鲜的和/或循环的培养基和接种物填充池/生物反应器至适当水平。然后使这种培养物生长直到期望的生长程度。在此时，收获产品。在一个实施方案中，收获所有池/生物反应器内容物，然后，如果需要可以对池/生物反应器进行清洁和消毒(例如对生物反应器灭菌)，并用培养基和接种物再次填充。在另一实施方案中，仅收获一部分的内容物，例如约50％，然后加入培养基以再次填充池/生物反应器，并且继续生长。
或者，在连续方式中，连续给予池/生物反应器新鲜的和/或循环的培养基和新鲜的接种物，同时连续收获细胞材料。在连续操作中，可存在起始启动阶段，其中推迟收获以允许建立充足的细胞浓度。在这种启动阶段期间，可以中断培养基进料和/或接种进料。或者，可以向池/生物反应器中添加培养基和接种物，并当池/生物反应器到达期望的液体体积时，开始收获。如果期望以满足操作需求，并且适于特定产品生物体和生长培养基，可以使用其他启动技术。其中在第一池/生物反应器中生长培养物，可以将培养物的约10％-90％或20％-80％或30％-70％转移至第二池/生物反应器，剩余的内容物作为用于第一池/生物反应器的后续生长的启动培养物。或者，将培养物的约100％转移至第二池/生物反应器，同时从新的来源接种第一池/生物反应器。
可以“搅拌方式”或“塞流方式”或“组合方式”允许连续池/生物反应器培养。在搅拌方式中，添加培养基和接种物并将其混合成池/生物反应器的总体积。混合的设备包括，但不限于以垂直、水平或组合方向运行的搅拌叶轮、螺旋桨、涡轮机、浆或气升式搅拌器(airlift)。在某些实施方案中，可通过由添加培养基或接种物产生的涡流实现或促进混合。细胞和培养基成分的浓度在池/生物反应器的水平区域没有显著变化。在塞流方式中，在池/生物反应器的一端添加培养基和接种物，并在另一端收获。在塞流方式中，培养物通常从培养基入口流向收获位置。当培养物从入口流向收获处发生细胞生长。可通过下述方法实现培养物的移动，包括但不限于倾斜池/生物反应器，混合设备、泵，在池/生物反应器的表面上气吹，以及与在池/生物反应器一端添加材料并在另一端除去有关的移动。在池/生物反应器的多个位置添加培养基成分以提供用于不同的细胞生长期的不同的生长条件。同样地，在池/生物反应器的不同位置，培养物的温度和pH可以变化。任选地，可在多个位置提供逆向混合。可以通过使用搅拌器、浆、隔板或其他适当技术实现活性混合。
在组合方式中，池/生物反应器的一部分将以塞流方式运行，并且一部分以搅拌方式运行。例如，可向搅拌区添加培养基以建立“自体播种”或“自体接种”体系。含有生长细胞的培养基从搅拌区移至塞流区，其中细胞继续生长直至收获。根据期望的效果，在池/生物反应器的起始端、中间或接近末端放置搅拌区。除了建立自体播种培养，可以使用这样的搅拌区，其目的包括但不限于提供将细胞暴露于具体条件或特定试剂或培养基成分的浓度下的具体的停留时间。可通过使用隔板、栅栏、分流器和/或混合装置实现这样的搅拌区。
可通过使用起始量的培养基和接种物装填池/生物反应器来运行半连续培养。随着生长继续，连续或不时添加另外的培养基。
在某些优选的实施方案中，海藻培养物可以在一种或多种封闭的(优选为可灭菌的)生物反应器中生长。这样的封闭式的培养和收获体系可为灭菌的，由此显著降低来自污染海藻、细菌、病毒和消耗微生物的海藻，和/或其他外来物种的问题。
如本文所用的“灭菌”包括有效杀死或消除来自表面、设备、食物或药物物体或生物培养基的可传染物(例如真菌、细菌、病毒、孢子形式等)的任何方法。可通过使用热、化学制剂、放射、高压、过滤或其组合实现灭菌。存在至少两个宽类别的灭菌：物理和化学。物理灭菌包括：热灭菌、放射灭菌、高压气体灭菌(超临界CO2)。化学灭菌包括：环氧乙烷、臭氧、氯漂白剂、戊二醛甲醛、过氧化氢、过乙酸或70％乙醇、70％丙醇等。通过放射进行的灭菌包括使用紫外(UV)光。本文所述的所有方法和本领域已知的那些方法适于使本发明使用的培养罐、容器和器皿灭菌。
在某些实施方案中，这样的生物反应器可以设计成在户外环境中安装和运行，在此将其暴露于环境光线和/或温度下。仪器、体系和方法可以设计成提供用于将温度保持在与最佳生长和油生产相容的范围内的改进的热量调节。在某些实施方案中，可以在对耕种标准农作物(例如玉米、小麦、大豆、油菜、大米)不重要或没用的土地上建造和运行这些体系。
在某些实施方案中，可以至少在某些阶段，在可以为或可以不为灭菌的开放的池中生长海藻。例如，在某些实施方案中，可以在户外在盐水基培养基中生长异养嗜盐海藻(halophillic algae)，所述条件基本限制了所有其他细胞的生长。类似地，在某些实施方案中，可以在限制基本所有其他生物体生长的温度下生长嗜热异养海藻。
在某些实施方案中，在本发明中使用的生物反应器不包括沟槽和沟渠，或适于户外操作的其他类似结构。
对于耕种绿藻的最简单的装置没有特别限制，只要该装置能够在异养生长条件下提供二氧化碳和任选用光照射培养悬浮液。例如，在小规模培养的情况下，可以优选使用扁平的培养瓶。在大规模培养的情况下，如果需要，可以使用由玻璃、塑料等制成的透明板组成的、装有放射性装置和搅拌器的培养罐或容器。这样的培养罐的实例包括平板培养罐(plate culture tank)、管型培养罐、空气室型培养罐和中空圆柱型培养罐。无论如何，密封器皿是优选使用的。
虽然天然光可以用于自养(例如在第二生长期)和光能异养生长，人造光源也可以用于本发明。在某些实施方案中，引导光源(起源为天然或人造)可以用于本发明。例如，太阳能集热器可以用于聚集天然阳光，其反过来可以通过波导(例如光纤)传播至具体位点(生物反应器)。优选的人造光源为LED，由于LED可以在能够为最大化细胞利用而变化的非常具体的波长处提供光，所以其提供了最有效的光能源之一。在某些实施方案中，可以使用波长为约400nm-500nm和/或600nm-700nm的LED发射光。
对于不同的海藻生长阶段可以使用多种碳源。例如，对于第一和第二生长阶段之一或二者，简单的糖可以用作碳源。或者，CO2可以用作碳源。
如果将CO2用作碳源，则可例如通过水培养基鼓泡将其引入封闭的体系生物反应器。在优选的实施方案中，可以通过穿孔的氯丁橡胶膜鼓入气体来引入CO2，其产生用于最大交换的具有高面容比的小泡。在更优选的实施方案中，可以在水柱底部引入气泡，其中水以与气泡移动相反的方向流动。这种对流式安排也通过增加气泡暴露于水培养基的时间来最大化气体交换。为了进一步增加CO2溶解，可以增加水柱的高度以延长气泡暴露于培养基的时间。CO2溶解在水中以产生H2CO3，接着可以通过光合海藻来将其“固定”以产生有机化合物。例如，可提供浓度为约1％-3％(v/v)，速率为约0.2vvm-2vvm的二氧化碳。当使用平板培养罐时，也可通过提供二氧化碳来搅拌培养悬浮液，使得绿藻能够被光均匀照射。
一旦培养物在第一生长条件下达到充足的生长程度，可将细胞转换至用于产生期望的海藻产品(例如油)的第二生长条件。第二生长条件包括在有限的氮供应(例如1.5-7mg N/L)下生长海藻细胞，或在具有使海藻产品合成最优化的氮水平(例如1.5-7mg N/L)的培养基中生长海藻细胞。优选地，在达到静止生长期之前，将海藻从第一生长条件转换至第二生长条件。
存在数个参数，当确定在第一和第二生长条件间的转换时机时可以使用。在某些实施方案中，当第一生长条件的一种或多种营养物质(例如氮)基本耗尽时，将海藻从第一生长条件转换至第二生长条件。这可通过调节起始培养基氮源的量，或在第一生长条件下生长期间加入海藻培养物的氮量来控制。
在其他实施方案中，当海藻培养物的细胞密度达到某种预定水平，例如约5×107个细胞/mL时，可以将海藻从第一生长条件转换至第二生长条件。
在又一实施方案中，当海藻培养物的蛋白浓度达到约0.5g/L-1g/L，或约0.8g/L时，将海藻从第一生长条件转换至第二生长条件。当海藻培养物的色素浓度达到约0.005mg/L(对于叶绿素a和叶绿素b)，或约0.02mg/L(对于总叶绿素)时可以进一步将海藻从第一生长条件转换至第二生长条件。
也可以根据许多其他标准或其组合(例如培养时间、每ml生物量(例如约4g/L)、细胞产品(例如在线检测的色素，如约0.005mg/L的叶绿素a和叶绿素b，或0.02mg/L的总叶绿素等)浓度、光学密度(678nm)＞3等)将海藻培养物从第一生长条件转换至第二生长条件。
为了将海藻培养物在不同的生长条件之间转换，可物理收获海藻并将其从培养基中分离。可从池/生物反应器中直接收获，或在将培养物转移至储存罐之后收获。收获步骤可包括从大部分培养基分离细胞的步骤，和/或再次使用培养基用于其他批次海藻培养物的步骤。
或者，可通过连续稀释在第一生长条件下、在第一生物反应器中生长的海藻培养物，并收集用于在第二生物条件下、在第二生物反应器中生长的置换海藻培养物来实现转换。优选地，在第一生长条件下海藻细胞数量增加的速率基本等于稀释速率，使得第一生物反应器内的海藻细胞数基本保持不变。
优选地，对于油的生产，第二生长条件还可以包括添加油刺因子，例如腐植酸(例如，灰黄霉酸或腐植酸)。
根据本发明的方法，在第一生长条件下，海藻细胞数增加至少约2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍(3个对数级)、104倍(4个对数级)、105倍(5个对数级)、106倍(6个对数级)、107倍(7个对数级)、108倍(8个对数级)、109倍(9个对数级)、1010倍(10个对数级)或更多。
优选地，在第一生长条件下，海藻细胞分裂的速率增加至少约20％、50％、75％、100％、200％、500％、1,000％或更多。
优选地，在第一生长条件下，海藻培养物的群体倍增时间为约0.05日-2日。
由于第一生长阶段的目的是增加细胞数量和/或细胞分裂速率，在第一生长条件下累积的海藻产品是不显著的或未达最佳标准的。例如，在第一生长条件下，海藻产品可以小于海藻生物量的约65％、30％、20％或甚至小于10％(w/w)。
同时，由于在第二条件下生长的主要目的是生产期望的海藻产品，海藻细胞数量的进一步增加可浪费有价值的资源或能量，因此不是期望的。优选地，第二生长期/条件期间的海藻细胞数量增加至多为1个对数级(或约10倍)、300％、200％、100％或50％。
优选地，在第二生长条件下海藻生物量大大增加。例如，由于累积海藻产品，海藻生物量可以明显增加。在某些实施方案中，在第二生长条件下，海藻生物量增加至少约2倍、5倍、10倍、20倍或50倍。例如，如果细胞的海藻产品(例如油、脂质等)比例从1％增加到99％，实现了大体上19-20倍的海藻生物量增加。
在某些实施方案中，在第二生长条件下，累积的海藻产品增加至少约10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、1500倍、2000倍、2500倍或更多。例如，如果细胞的非海藻产品生物量(例如核、细胞质等)从1％增加到99％，则实现了大体上1900倍的海藻生物量增加。
在两阶段生长结束时，可从生长容器(池和生物反应器)中回收海藻。可以许多方式完成大部分水/培养基的细胞团块分离。非限制性实例包括筛选、离心、旋转真空过滤、压力过滤、水力旋流、浮选、撇取、筛分和重力沉降。也可与这些技术协同使用其他技术，例如添加沉淀剂、絮凝剂或凝结剂。也可使用两个或多个分离阶段。当使用多个阶段时，它们可基于相同或不同的技术。非限制性实例包括筛选大部分海藻培养物内容物，然后过滤或离心来自第一阶段的流出物。
例如，可以使用如下所讨论的长期漩涡循环、收获涡流和/或吸管从培养基部分分离海藻。或者，可以使用大容量的工业规模的商用离心机来补充或取代其他分离方法。这样的离心机可以购自已知的商业来源(例如Cimbria Sket或IBG Monforts，德国；Alfa Laval A/S，丹麦)。也可以使用离心、过滤和/或沉淀来纯化来自其他海藻成分的油。可以通过添加絮凝剂促进海藻从水培养基的分离，所述絮凝剂例如黏土(例如，粒径小于2微米)、硫酸铝或聚丙烯酰胺。在絮凝剂存在的情况下，可以通过简单的重力沉降分离海藻，或者可以通过离心更简单地分离海藻。例如，在第20020079270号美国专利申请公布中公开了基于絮凝剂的海藻分离，所述专利以引用的形式并入本文。
技术人员将意识到可以使用本领域用于从液体培养基中分离诸如海藻的细胞的任何已知方法。例如，第20040121447号美国专利申请公布和第6,524,486号美国专利公开了用于从水培养基部分分离海藻的切向流过滤装置和仪器，所述专利都以引用的形式并入本文。在第5,910,254和6,524,486号美国专利中已经公开了用于从培养基分离海藻的其他方法，所述专利都以引用的形式并入本文。也可以使用用于海藻分离和/或提取的其他公开方法。参见例如Rose等人，Water Science andTechnology 25：319-327，1992；Smith等人，Northwest Science 42：165-171，1968；Moulton等人，Hydrobiologia 204/205：401-408，1990；Borowitzka等人，Bulletin of Marine Science 47：244-252，1990；Honeycutt，Biotechnology and Bioengineering Symp.13：567-575，1983。
一旦收获了细胞团块，则可通过使用机械方法、化学(例如酶)方法和/或溶剂提取破坏(例如细胞溶解)海藻细胞来释放海藻产品(例如油)。
用于细胞破坏的机械方法的非限制性实例包括多种类型的挤压，例如螺旋压(expeller press)、间歇压(batch press)、过滤压、冷压、法式压(French press)；降压设备；降压均质器、胶体磨、珠磨机或球磨机、机械剪切设备(例如高剪切混合器)、热冲击、热处理、渗压冲击、声裂法或超声波处理、压榨、冲压、研磨、蒸汽喷发、转子分裂机(rotor-statordisruptor)、阀型加工器(valve-type processor)、固定的几何处理器(fixedgeometry processor)、氮减压或任何其他已知方法。高能商用细胞粉碎机可以购自已知来源(例如GEA Niro Inc.，Columbia，MD；Constant SystemsLtd.，Daventry，England；Microfluidics，Newton，MA)。例如第6,000,551号美国专利已经公开了破坏水悬浮液中微海藻的方法，所述专利以引用的形式并入本文。
化学方法的非限制性实例包括使用酶、氧化剂、溶剂、表面活性剂和螯合剂。根据使用的技术的确切确性质，破坏可以在干燥下完成，或者可以存在溶剂、水或蒸汽。
可用于破坏或促进破坏的溶剂包括但不限于己烷、庚烷、醇、超临界流体、氯化溶剂、醇、丙酮、乙醇、甲醇、异丙醇、醛、酮、氯化溶剂、氟化-氯化溶剂及其组合。示例性的表面活性剂包括但不限于洗涤剂、脂肪酸、偏甘油酯、磷脂、溶血磷脂、醇、醛、聚山梨酯化合物及其组合。示例性的超临界流体包括二氧化碳、乙烷、乙烯、丙烷、丙烯、三氟甲烷、氯三氟甲烷、氨、水、环己烷、正戊烷和甲苯。也可通过并入水或某些其他化合物修饰超临界溶剂以修饰流体的溶剂性质。用于化学破坏的适当的酶包括蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、磷脂酶、溶菌酶、多糖酶及其组合。适当的螯合剂包括但不限于EDTA、卟吩、DTPA、NTA、HEDTA、PDTA、EDDHA、葡庚糖酸盐、磷酸盐离子(不同质子化的和非质子化的)及其组合。在某些情况下，溶剂提取可与如本文所述的机械或化学细胞破坏组合。也可使用化学和机械方法的组合。
通过多种技术可完成从含产品的部分或阶段中分离破坏细胞。非限制性实例包括离心、水力旋流、过滤、浮选和重力沉降。在某些情况下，期望包括溶剂或超临界流体，例如为了溶解期望的产品，减少产品与破坏的细胞间的相互作用，降低分离后留在破坏的细胞中的产品量，或者为了提供进一步降低损耗的洗涤步骤。为了这种目的的适当溶剂包括但不限于己烷、庚烷、超临界流体、氯化溶剂、醇、丙酮、乙醇、甲醇、异丙醇、醛、酮和氟化-氯化溶剂。示例性的超临界流体包括二氧化碳、乙烷、乙烯、丙烷、丙烯、三氟甲烷、氯三氟甲烷、氨、水、环己烷、正戊烷、甲苯及其组合。也可通过并入水或某些其他化合物修饰超临界流体溶剂以修饰流体的溶剂性质。
然后对于其期望用途，可适当地进一步加工这样分离的产品，例如通过除去溶剂、干燥、过滤、离心、化学修饰、酯交换反应、进一步纯化或通过步骤的某些组合来进一步加工这样分离的产品。
例如，可从生物量分离脂质/油，然后使用形成生物柴油的已知方法将其用于形成生物柴油。例如，使用本文所述的任何方法能够挤压生物量和分离所得富脂质的液体。然后可使用诸如熟知的Connemann法(参加例如第5,354,878号美国专利，其整体以引用的形式并入本文)的标准酯交换技术将分离的油加工成生物柴油。
例如，可以收获海藻，从液体培养基中将其分离，破坏并分离(如上)油内容物。海藻产生的油将富含甘油三酯。使用诸如Connemann法(参加例如第5,354,878号美国专利，其以引用的形式并入本文)的熟知方法可以将这样的油转化成生物柴油，所述方法是已为大家接受的用于从诸如菜子油的植物来源生产生物柴油的方法。标准酯交换反应方法涉及甘油三酯和醇(通常为甲醇)之间的碱催化的酯交换反应。将甘油三酯的脂肪酸转化为甲醇，产生烷基酯(生物柴油)，并释放甘油。除去甘油并可将其用于其它目的。
与批次反应方法(例如J.Am.Oil Soc.61：343，1984)相反，Connemann法使用反应混合物通过反应器柱的连续流动，其中流动速率比甘油的下沉速率低。这导致甘油从生物柴油中连续分离。可以通过进一步的反应器柱加工反应混合物以完成酯交换反应过程。可以通过水提取除去剩余的甲醇、甘油、游离脂肪酸和催化剂。
然而，技术人员将意识到可以使用用于从包含甘油三酯的油生产生物柴油的任何本领域已知方法，例如如第4,695,411号；第5,338,471号；第5,730,029号；第6,538,146号；第6,960,672号美国专利所公开的，所述每一专利以引用的形式并入本文。也可以使用不涉及酯交换的替换方法。例如，通过高温分解、气化或热化学液化(参见例如Dote，Fuel 73：12，1994；Ginzburg，Renewable Energy 3：249-252，1993；Benemann和Oswald，DOE/PC/93204-T5，1996)。
虽然存在数以千计的已知天然海藻的种类，可以使用许多(如果不是大多数)用于油/脂质/生物柴油生产和形成其他产品。这些海藻可以在异养、光能异养或自养条件下新陈代谢。可以用于本发明的特别优选的海藻包括绿藻门或硅藻门(硅藻属)。
在某些实施方案中，可以遗传修饰/工程化海藻以进一步增加每单位英亩的生物柴油给料的生产。使用本领域熟知的技术，用于特定产品输出的海藻的遗传修饰是相对直接的。但是，可以将本文公开的培养、收获和产品提取的低成本方法，用于遗传修饰的(例如转基因，非转基因的)海藻。技术人员将意识到不同的藻种将表现出不同的生长和油生产力，并且在不同的条件下，体系可以包含单一菌株的海藻或具有不同性质的菌株的混合物，或加上共生细菌的藻类菌株。可以用地理位置、温度敏感度、光强度、pH敏感度、盐度、水质量、营养物质可利用性、温度或光的季节差异、从海藻得到的期望的终产品和多种其他因素使所用的海藻物种最优化。
在某些实施方案中，可以在遗传学上改造(例如转基因或由定点突变产生等)用于生产油/生物柴油的海藻以包含一种或多种分离的核酸序列，该序列增加油的生产或提供用于海藻培养、生长、收获或使用的其他特征。稳定转化海藻物种的方法和包含使用的分离的核酸的组合物是本领域已知的，并且任何这样的方法和组合物可以用于本发明的实践。示例性的使用的转化方法可包括微粒轰击、电穿孔、原生质融合、PGE-介导的转化、DNA-涂覆的碳化硅晶须或使用病毒介导的转化(参见例如Sanford等人，1993，Meth.Enzymol.217：483-509；Dunahay等人，1997，Meth.Molec.Biol.62：503-9；第5,270,175号美国专利；第5,661,017号美国专利，其以引用的形式并入本文)。
例如，第5,661,017号美国专利公开了用于含叶绿素C的海藻的海藻转化方法，所述含叶绿素C的海藻例如硅藻纲(Bacillariophyceae)、金藻纲(Chrysophyceae)、褐藻纲(Phaeophyceae)、黄藻纲(Xanthophyceae)、针胞藻纲(Raphidophyceae)、土栖藻纲(Prymnesiophyceae)、隐藻纲(Cryptophyceae)、小环藻属(Cyclotella)、舟形藻属(Navicula)、细柱藻属(Cylindrotheca)、褐指藻属(Phaeodactylum)、双眉藻属(Amphora)、角毛藻属(Chaetoceros)、菱形藻属(Nitzschia)或海链藻属(Thalassiosira)。也公开了包含使用的核酸(诸如乙酰辅酶A羧化酶)的组合物。
在多种实施方案中，可选择的标记物可以并入分离的核酸或载体以选择转化的海藻。使用的可选择的标记物可包括新霉素磷酸转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、氨基糖苷乙酰基转移酶、氯霉素乙酰基转移酶、潮霉素B磷酸转移酶、博来霉素连接蛋白、草胺磷乙酰基转移酶、溴苯腈水解酶(溴苯腈水解酶)、抗草甘膦的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶、抗小穗苎麻素的核糖体蛋白S14、抗依米丁的核糖体蛋白S14、抗磺酰脲的乙酰乳酸合酶、抗咪唑啉酮的乙酰乳酸合酶、抗链霉素的16S核糖体RNA、抗壮观霉素的16S核糖体RNA、抗红霉素的23S核糖体RNA或抗甲基苯并咪唑的微管蛋白。增加转基因表达的调节性核酸序列是已知的，例如隐小环藻(C.cryptica)乙酰辅酶A羧化酶5’-未翻译的调节控制序列、隐小环藻乙酰辅酶A羧化酶3’-未翻译的调节控制序列及其组合。
实施例
已经大体上描述了本发明，提供了下列具体实施例仅用于示例本发明的某些方面。这些实施例不意图以任何方面限制，虽然实施例中描述的某些特征可以通常应用于所述发明。
实施例1在静止和震摇生长条件下，小球藻(Chlorella vulgaris)在1期异养反应器中的生长与在1期自养反应器中的生长的对比
将玻璃生物反应器(一式三份)灭菌并用无菌自养生长培养基(Bristol’s培养基)或无菌异养生长培养基(用1g/L酵母提取物和5g/L葡萄糖改良的Bristol’s培养基)填充。然后使三个生物反应器静止，使三个生物反应器温和震动以促进混合。在16/8光/暗循环下照亮(27-30uEinsteins/cm2)所有培养物。在第7天，收获细胞，并确定干重、每毫升细胞数量和总叶绿素。
示例性的Bristol’s培养基如下所列：
Figure BPA00001423037700281
为了制备1L Bristol’s培养基，可以使用下列步骤：
1.在连续搅拌的同时，以规定的顺序向约900mL的dH2O中加入上面每一成分。
2.用dH2O将总体积加至1L(*对于1.5％的琼脂培养基，向烧瓶中加入15g的琼脂；不混合)。
3.盖上培养基并将其高压蒸汽灭菌。
4.在冰箱温度下储存。
本文所用的照明条件通常可用于本发明的光能异养生长。
在下表中，明显地，异养生长导致显著的和大量的(至少1个数量级)生物量、细胞数量和叶绿素的增加。这种生长改善了进一步用于生产海藻产品的海藻生物量生产的经济性。
Figure BPA00001423037700291
实施例2在静止和震摇生长条件下，布朗纤维藻(Ankistrodesmusbraunii)在1期异养反应器中的生长与在1期自养反应器中的生长的对比
将玻璃生物反应器(一式三份)灭菌并用无菌自养生长培养基(Bristol’s培养基)或无菌异养生长培养基(用1g/L酵母提取物和5g/L葡萄糖改良的Bristol’s培养基)填充。用布朗纤维藻接种生物反应器，并按下述方法孵育。然后使三个生物反应器静止，使三个生物反应器温和震摇以促进混合。在16/8光/暗循环下照亮(27-30uEinsteins/cm2)所有培养物。在第7天，收获细胞，并确定干重、每毫升细胞数量和总叶绿素。
本文所用的照明条件通常可用于本发明的光能异养生长。
在下表中，明显地，异养生长导致显著的和大量的(至少1个数量级)生物量、细胞数量和叶绿素的增加。这种生长改善了进一步用于生产海藻产品的海藻生物量生产的经济性。
Figure BPA00001423037700301
实施例3使用或不使用生长因子的某种组合的原壳小球藻的生长的对比
所用的原液配方为0.25g激动素、0.25g 6-BA、0.5g NAA、0.5gGA3、1.0g维生素B1、1.0L dH2O。向250mL的HGM(参见下表)中加入19.5nL以产生配方2。用原壳小球藻接种烧瓶以得到0.04吸光度单位的起始光密度。在异养(黑暗)条件下，将烧瓶放置在震摇器上，转速为125rpm。温度保持在约23℃。每日检测光密度。将结果总结在图1中。
表1.异养生长培养基(HGM)
Figure BPA00001423037700302
注1：NaEDTA.2H2O，075g/L；FeCl3.6H2O，0.097g/L；MgCl2.4H2O，0.041g/L；硼酸，0.011g/L；ZnCl2，0.005g/L；CoCl2.6H2O，0.002g/L；CuSO4，0.002g/L；Na2MoO4.H2O，0.002g/L。
注2：HGM是改良的Bristol’s培养基，其具有增加的NaNO3浓度(从2.94mM终浓度至8.82mM终浓度)，和另外的成分，包括0.4％的酵母提取物(Bacto)、2.0％的葡萄糖和痕量金属的混合物(参见注1)。因为在光合营养条件下海藻生长使用光合作用来产生诸如碳水合物的有机化合物，所以在传统的Bristol’s培养基中不存在葡萄糖。
注3：将培养基放置在Nephelo烧瓶(250ml)中，并在121℃下灭菌20分钟。
据显示，配方1产生生物量的速率比对照异养生长培养基快。对照和配方1的具体生长速率μ分别为1.4和1.8。
实施例4使用或不使用生长因子的某种组合的原壳小球藻的生长的对比
所用的原液配方为0.25g激动素、0.25g 6-BA、0.5g NAA、0.5gGA3、1.0g维生素B1、1.0L dH2O。向250mL的HGM(参见上表)中加入4.7nL以产生配方2。用原壳小球藻接种烧瓶以得到0.04吸光度单位的起始光密度。在异养(黑暗)条件下，将烧瓶放置在震摇器上，转速为125rpm。温度保持在约23℃。每日检测光密度。将结果总结在图2中。
据显示，配方2产生生物量的速率比对照异养生长培养基快。对照和配方2的具体生长速率μ分别为1.4和1.6。
实施例5使用或不使用生长因子的某种组合的原壳小球藻的生长的对比
所用的原液配方为0.25g激动素、0.25g 6-BA、0.25g NAA、0.25g IAA、0.5g GA3、1.0g维生素B1、1.0L dH2O。向250mL的HGM(参见上表)中加入19.5nil以产生配方3。用原壳小球藻接种烧瓶以得到0.04吸光度单位的起始光密度。在异养(黑暗)条件下，将烧瓶放置在震摇器上，转速为125rpm。温度保持在约23℃。每日检测光密度。将结果总结在图3中。
据显示，配方3产生生物量的速率比对照异养生长培养基快。对照和配方3的具体生长速率μ分别为1.4和1.8。
实施例6使用或不使用生长因子的某种组合的原壳小球藻的生长的对比
所用的原液配方为0.25g激动素、0.25g 6-BA、0.25g NAA、0.25g IAA、0.5g GA3、1.0g维生素B1、1.0L dH2O。向250mL的HGM(参见上表)中加入4.7nL以产生配方4。用原壳小球藻接种烧瓶以得到0.04吸光度单位的起始光密度。在异养(黑暗)条件下，将烧瓶放置在震摇器上，转速为125rpm。温度保持在约23℃。每日检测光密度。将结果总结在图4中。
据显示，配方4产生生物量的速率比对照异养生长培养基快。对照和配方4的具体生长速率μ分别为1.4和1.8。
上面使用的调节剂浓度总结在下表2中。
表2.植物生长调节剂刺激的海藻生长总结
实施例7光能异养和异养生长
在斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)和原壳小球藻生长期间评估光暴露的影响。两种海藻的生长速率都在光能异养生长条件下较高。斜生栅藻在光能异养生长条件下生长速率高约86.7％。同时，当在光能异养生长下进行生长时，原壳小球藻生长速率增加39.07％。这些实验结果总结下下表3-6中。
表3.不同激素浓度对在光能异养条件下培养48小时的斜生栅藻生长速率的影响
表4.不同激素浓度对在异养条件下培养48小时的斜生栅藻生长速率的影响
Figure BPA00001423037700332
表5.不同激素浓度对在光能异养条件下培养48小时的原壳小球藻生长速率的影响
表6.不同激素浓度对在异养条件下培养48小时的原壳小球藻生长速率的影响
Figure BPA00001423037700341

Claims (46)

1.生长用于生产海藻产品的海藻的方法，其包括：
(1)在第一异养或光能异养生长条件下生长所述海藻以增加海藻细胞分裂的速率和海藻细胞数量；
(2)在第二生长条件下生长所述海藻以生产所述海藻产品；
其中在所述第二生长条件下海藻细胞数量没有显著增加。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一生长条件包括具有最佳的细胞数量增长所需的非限制水平的营养物质和痕量元素的培养基。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述营养物质包括一种或多种C、N、P、S和/或O源。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述培养基包含任选用另外的营养物质补充的厌氧生物消化物的液体分离物。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述厌氧生物消化物产生于动物内脏、牲畜粪便、食物加工废料、城市废水、酒糟水、酒糟或其他有机材料的厌氧发酵。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述营养物质的浓度对细胞分裂和/或生长是无毒的。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述第一生长条件包括用于细胞分裂的最佳温度，非嗜热海藻的最佳温度范围为约0℃-40℃，嗜热海藻的最佳温度范围为约40℃-95℃或约60℃-80℃。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述第一生长条件包括一种或多种生长激素或其模拟物。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述生长激素包括选自生长素、细胞分裂素、赤霉素和/或其混合物的至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种生长激素。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述生长素包括吲哚乙酸(IAA)和/或1-萘乙酸(NAA)。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述赤霉素包括GA3。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述细胞分裂素为腺嘌呤型的细胞分裂素或苯基脲型的细胞分裂素。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述腺嘌呤型的细胞分裂素或模拟物包括激动素、玉米素和/或6-苄基氨基嘌呤，并且所述苯基脲型的细胞分裂素包括二苯脲和/或噻二唑苯基脲(TDZ)。
14.如权利要求8所述的方法，其中所述第一生长条件进一步包括维生素B1或其类似物/模拟物。
15.如权利要求9所述的方法，其中生长素与细胞分裂素的比率(w/w)为约1∶2至2∶1，或为约1∶1。
16.如权利要求9所述的方法，其中生长素与赤霉素的比率(w/w)为约1∶2至2∶1，或为约1∶1。
17.如权利要求8所述的方法，其中所述模拟物为苯氧基乙酸化合物。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述第二生长条件包括限氮培养基(例如，约1.5mgN/L-15mgN/L)或具有使海藻产品的合成最优化的氮水平的培养基。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述第二生长条件包括油刺激因子。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述油刺激因子包括腐植酸，例如灰黄霉酸或腐植酸。
21.如权利要求1所述的方法，其中在所述第一生长条件下、在第一生物反应器中培养所述海藻，并在所述第二生长条件下、在第二生物反应器中培养所述海藻。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述第一生物反应器适于最佳的细胞数量增加。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述第一生物反应器适于灭菌。
24.如权利要求21所述的方法，其中所述第二生物反应器适于海藻产品的最佳生产。
25.如权利要求1所述的方法，其中在到达静止生长期之前，将所述海藻从所述第一生长条件转换至所述第二生长条件。
26.如权利要求25所述的方法，其中当所述第一生长条件的一种或多种营养物质基本消失时，将所述海藻从所述第一生长条件转换至所述第二生长条件。
27.如权利要求25所述的方法，其中通过在所述第一生长条件下收获用于在所述第二生长条件下生长的海藻细胞来将所述海藻从所述第一生长条件转换至所述第二生长条件。
28.如权利要求25所述的方法，其中当海藻培养物的细胞密度达到至少约5×107个细胞/mL时，将所述海藻从所述第一生长条件转换至所述第二生长条件。
29.如权利要求25所述的方法，其中当所述海藻培养物的蛋白浓度达到至少约0.8g/l时，或当对于叶绿素a和叶绿素b，所述海藻培养物的色素浓度达到至少约0.005mg/L，或对于总叶绿素，海藻培养物的色素浓度达到至少约0.02mg/L时，将所述海藻从所述第一生长条件转换至所述第二生长条件。
30.如权利要求25所述的方法，其中通过连续稀释在所述第一生长条件下在第一生物反应器中生长的所述海藻培养物，并收集用于在所述第二生长条件下在第二生物反应器中生长的置换海藻培养物来将所述海藻从所述第一生长条件转换至所述第二生长条件。
31.如权利要求30所述的方法，其中在所述第一生长条件下，海藻细胞数量增加的速率基本等于稀释速率，使得在所述第一生物反应器中的海藻细胞数量基本保持不变。
32.如权利要求1所述的方法，其中在所述第一生长条件下，海藻细胞数量增加至少约2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍、1010倍或更多。
33.如权利要求1所述的方法，其中海藻细胞分裂的速率增加至少约20％、50％、75％、100％、200％、500％、1,000％或更多。
34.如权利要求1所述的方法，其中在所述第一生长条件下，所述海藻培养物的群体倍增时间为约0.05日-2日。
35.如权利要求1所述的方法，其中在所述第一生长条件下，所述海藻产品的累积量是不显著的或是未达最佳水平的。
36.如权利要求1所述的方法，其中在所述第一生长条件下，所述海藻产品小于海藻生物量的约65％、30％、20％或甚至小于10％(w/w)。
37.如权利要求1所述的方法，其中在所述第二生长条件下，海藻细胞数量增加不多于1,000％、300％、200％、100％或50％。
38.如权利要求1所述的方法，其中在所述第二生长条件下，海藻生物量显著增加。
39.如权利要求38所述的方法，其中海藻生物量增加主要由于累积所述海藻产品。
40.如权利要求1所述的方法，其中在所述第二生长条件下，海藻生物量或生物产品增加至少约10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、1500倍或2000倍。
41.如权利要求1所述的方法，其中所述海藻产品为油或脂质。
42.如权利要求1所述的方法，其中在所述第二生长条件下，所述海藻在异养、光能异养或自养条件下新陈代谢。
43.如权利要求1所述的方法，其中所述海藻为绿藻门或硅藻门(硅藻属)。
44.在异养条件下用于生长海藻的培养基，其包含表1所列的成分，其中所述培养基中每一所列成分的最终浓度与表1中所列的最终浓度的偏差在约50％(增加或降低)、40％、30％、20％、10％或5％内。
45.如权利要求44所述的培养基，其为表1的异养生长培养基(HGM)。
46.如权利要求44所述的培养基，在基本相同的条件下，对于原壳小球藻，基本支持与表1的所述HGM培养基相比相同的生长速率。
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