MX2011006619A - Optimizacion de la produccion de productos de algas mediante el desacoplamiento de la proliferacion celular y produccion del producto de algas. - Google Patents

Optimizacion de la produccion de productos de algas mediante el desacoplamiento de la proliferacion celular y produccion del producto de algas.

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Abstract

En las algas, las condiciones para la producción óptima de biomasa son diferentes de las condiciones óptimas para la producción de aceites/lípidos. Los procesos convencionales requieren que ambas etapas sean optimizadas simultáneamente lo que necesariamente no es lo óptimo. La invención proporciona sistemas y procesos para optimizar cada tipo de producción por separado e independientemente, mejorando la producción general de aceite, lípidos y otros productos útiles. Este proceso es ventajoso debido a que permite la optimización de las etapas individuales y las fases de crecimiento en la producción de aceite a partir de la biomasa. Esto permite el uso de diferentes materias primas para diferentes etapas del proceso.

Description

OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE PRODUCTOS DE ALGAS MEDIANTE EL DESACOPLAMI ENTO DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR Y PRODUCCIÓN DEL PRODUCTO DE ALGAS Referencia a solicitud relacionada Esta solicitud reivindica el beneficio de la fecha de presentación, en virtud del artículo 119(e) del Título 35 del Código de los Estados Unidos, de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos No. 61/201.635, presentada el 19 de diciembre de 2008, cuyo contenido se incorpora a la presente a modo de refere nci a .
Campo de la Invención La invención proporciona sistemas y procesos para optimizar cada tipo de producción por separado e independientemente, mejorando la producción general de aceite, lípidos y otros productos útiles. Este proceso es ventajoso debido a que permite la optimización de las etapas individuales y las fases de crecimiento en la producción de aceite a partir de la biomasa. Esto permite el uso de diferentes materias primas para diferentes etapas del proceso.
Antecedentes de la invención Las algas son unos de los grupos más prolíficos y extendidos .de los organismos de la tierra. Actualmente se conocen más de 150.000 especies de algas y posiblemente haya muchas que no han sido descubiertas. Para la mayoría de las especies de MEl 9355676v.l t algas se conocen las características y cualidades de identificación básicas, aunque no hay seguridad con respecto a cómo clasificar las diferentes especies de algas en la taxonomía general de la vida .
Las algas (incluidas formas similares a plantas de muchos tamaños y colores diferentes, diatomeas y cianobacterias) constituyen uno de los tipos más importantes de vida en la tierra, responsables de la mayor parte de la atmósfera, así como también de la formación de la base de la cadena alimenticia para muchas otras formas de vida. Ecosistemas enteros han evolucionado alrededor de las algas o simbióticamente con las algas y el medio de algas incluye fuentes de alimentos, depredadores, virus y muchos otros elementos ambientales que generalmente asociamos con formas superiores de vida.
A pesar del alcance y la importancia de las algas, el uso humano directo ha sido limitado. Las algas se cultivan o cosechan como alimentos, especialmente en Asia, a menudo en forma de "alga marina". También se utilizan mucho para producir varios ingredientes, tales como colorantes y aditivos para alimentos. Las algas también se han utilizado en procesos industriales para concentrar y eliminar la contaminación de metales pesados y los residuos de diatomeas, conocidos como tierra diatomácea, se utilizan como un medio de filtración y para otras aplicaciones.
Las algas también pueden producir aceite, almidón y gas, el cual se ha utilizado en la producción de combustible diésel, J alcohol (por ejemplo, etanol) e hidrógeno o gas metano.
Aunque también otros materiales biológicos pueden proporcionar estos combustibles, lo que distingue a las algas es su alta productividad y su bajo costo teórico. Las algas pueden crecer de 10 a 100 veces más rápido que otras formas de plantas. Las algas también pueden ser muy prolíficas en su producción de aceites y almidones deseados, produciendo en algunos casos 60% de su propio peso en estas formas. Además de los beneficios de una alta producción, el uso de algas para bioproductos no compite con la agricultura por la tierra cultivable, dado que no necesita ni de tierras de cultivo ni de agua dulce. Más aun, las algas logran todo esto con la inversión más básica, ya que necesitan en la mayoría de los casos sólo luz del sol, agua, aire, dióxido de carbono y nutrientes simples, dado que son fotoautótrofas.
A pesar de los claros posibles beneficios de las algas como una fuente de combustibles, alcanzar este potencial en la práctica ha resultado ser frustrante y difícil en el pasado debido a varias razones. Por ejemplo, las condiciones para la proliferación celular óptima de las algas son diferentes de aquellas óptimas para producción de aceite/lípidos. Los procesos convencionales requieren que ambas etapas se optimicen simultáneamente, lo cual es necesariamente subóptimo para cada etapa.
Breve Descripción de la Invención La invención proporciona sistemas y procesos para optimizar cada tipo de producción en base a algas de bioproductos (tales como aceite) por separado y de manera independiente, mejorando así la producción general de aceite, lípidos y otros productos útiles. Este proceso es ventajoso debido a que permite la optimización de las etapas y fases de crecimiento individuales en la producción de aceite a partir de aceite de biomasa. Esto también permite el uso de diferentes cargas de alimentación y condiciones de cultivo para las diferentes etapas del proceso.
Por lo tanto, un aspecto de la invención proporciona un método de cultivo de algas para producir un producto de algas que comprende: (1) cultivar las algas en una primera condición de crecimiento heterótrofo o fotoheterótrofo para aumentar la velocidad de división celular de las algas y el número de células de algas; (2) cultivar las algas en una segunda condición de crecimiento para producir el producto de algas; en donde el número de células de algas no aumenta considerablemente en la segunda condición de crecimiento. En ciertas realizaciones, la primera condición de crecimiento comprende un medio con niveles no restrictivos de nutrientes y elementos traza necesarios para un aumento óptimo del número de células. Los nutrientes pueden incluir una o más fuentes de C, N, P, S y/u O.
En ciertas realizaciones, el medio puede comprender una separación líquida de un biodigerido anaeróbico, opcionalmente complementada con nutrientes adicionales cuando sea necesario. El biodigerido anaeróbico puede resultar de la digestión anaeróbica de despojos animales, estiércol de ganado, desechos de procesamiento de alimentos, aguas residuales municipales, residuos finos, granos de destilado u otros materiales orgánicos.
En ciertas realizaciones, las concentraciones de los nutrientes son no tóxicas para la división y el crecimiento celular.
En ciertas realizaciones, la primera condición de crecimiento comprende una temperatura óptima para la división celular en el rango de aproximadamente 0-40°C para algas no termófilas y aproximadamente 40-95°C o 60-80°C para algas termófilas.
En ciertas realizaciones, la primera condición de crecimiento comprende una o más hormonas de crecimiento o miméticos de las mismas. Las hormonas de crecimiento pueden incluir al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o más hormonas de crecimiento seleccionadas de: una auxina, una citoquinina, una giberelina y/o mezclas de las mismas. Preferiblemente, las hormonas de crecimiento incluyen al menos una o dos de cada categoría/clase de hormona seleccionadas de auxina, citoquinina o giberelina.
Por ejemplo, la auxina puede comprender ácido indolacético (IAA) y/o ácido 1 -naftalenoacético (NAA). Otros miméticos de auxina pueden ser 2,4-D; 2,4.5-T; Ácido indol-3-butírico (IBA); Ácido 2-metil-4-clorofenoxiacético (MCPA); Ácido 2-(2-metil-4-clorofenoxi)propiónico (mecoprop, CPP); Ácido 2-(2,4-diclorofenoxi) propiónico (dicloroprop, 2,4-DP); o Ácido (2,4-diclorofenoxi)butírico (2,4-DB).
En ciertas realizaciones, la giberelina comprende GA3.
En ciertas realizaciones, la citoquinina es una citoquinina tipo adenina o una citoquinina tipo fenilurea. Por ejemplo, la citoquinina tipo adenina o mimético puede comprender kinetina, zeatina y/o 6-bencilaminopurina y la citoquinina tipo fenilurea puede comprender difenilurea y/o tidiazurón (TDZ).
En ciertas realizaciones, la primera condición de crecimiento también comprende vitamina B1 o análogo/miméticos de la misma.
En ciertas realizaciones, la relación (p/p) entre auxina y citoquinina es aproximadamente 1:2 - 2:1. preferiblemente aproximadamente 1 :1.
En ciertas realizaciones, la relación (p/p) entre auxina y giberelina es aproximadamente 1:2 - 2:1. preferiblemente aproximadamente 1:1.
En ciertas realizaciones, la relación (p/p) entre auxina y la vitamina B es aproximadamente 1:4 - 1:1. preferiblemente aproximadamente 1 :2.
En ciertas realizaciones, el mimético es un compuesto fenoxiacético.
En ciertas realizaciones, la segunda condición de crecimiento comprende un medio con nitrógeno limitado (por ejemplo, aproximadamente 1.5-15 mgN/L) o un medio con un nivel de nitrógeno optimizado para la síntesis de productos de algas.
En ciertas realizaciones, la segunda condición de crecimiento puede comprender un factor estimulador de aceite.
En ciertas realizaciones, el factor estimulador de aceite comprende un humato, tal como ácido fúlvico o ácido húmico.
En ciertas realizaciones, las algas se cultivan en un primer biorreactor en la primera condición de crecimiento y en un segundo biorreactor en la segunda condición de crecimiento. Preferiblemente, el primer biorreactor se adapta para un aumento óptimo del número de células. Por ejemplo, las células de algas pueden cultivarse de manera heterótrofa o fotoheterótrofa en el primer biorreactor en condiciones estériles (por ejemplo, el primer biorreactor es pasible de esterilización). Preferiblemente, el segundo biorreactor se adapta para la producción óptima del producto de algas.
En ciertas realizaciones, las algas se cambian de la primera condición de crecimiento a la segunda condición de crecimiento antes de que se alcance la fase de crecimiento estacionario (por ejemplo, durante la fase de crecimiento exponencial). Por ejemplo, las algas pueden cambiarse de la primera condición de crecimiento a la segunda condición de crecimiento cuando se agotan considerablemente uno o más nutrientes en la primera condición de crecimiento. Por ejemplo, las algas también pueden cambiarse de la primera condición de crecimiento a la segunda condición de crecimiento cuando la densidad de las células del cultivo de algas alcanza aproximadamente 5 ? 107 células/mL. Adicionalmente, las algas pueden cambiarse de la primera condición de crecimiento a la segunda condición de crecimiento cuando la concentración de proteínas del cultivo de algas alcanza aproximadamente 0.5 - 1 g/l o aproximadamente 0.8 g/l. Las algas también pueden cambiarse de la primera condición de crecimiento a la segunda condición de crecimiento cuando la concentración de pigmento del cultivo de algas alcanza aproximadamente 0.005 mg/L (para clorofilas a o b), o aproximadamente 0.02 mg/L (para clorofila total) En ciertas realizaciones, las algas pueden cambiarse de la primera condición de crecimiento a la segunda condición de crecimiento cosechando las células de algas en la primera condición de crecimiento para cultivar en la segunda condición de crecimiento.
En ciertas realizaciones, las algas no se cambian a un nuevo recipiente. Por el. contrario, el medio se altera para producir el cambio de condición de crecimiento. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, detener la adición de nitrógeno al medio permitirá que los organismos cambien la composición del medio por sí mismos (por ejemplo, agotando nitrógeno) sin necesidad de un segundo recipiente de cultivo y la transferencia asociada del cultivo de algas.
En ciertas realizaciones, las algas se cambian de la primera condición de crecimiento a la segunda condición de crecimiento diluyendo continuamente el cultivo de algas que crece en la primera condición de crecimiento en un primer biorreactor y recolectando el cultivo de algas desplazado para cultivarlo en un segundo biorreactor en la segunda condición de crecimiento.
En ciertas realizaciones, la velocidad de aumento del número de células de algas en la primera condición de crecimiento es considerablemente igual a la velocidad de dilución, de forma tal que el número de células de algas en el primer biorreactor permanece considerablemente constante.
En ciertas realizaciones, el número de células de algas aumenta al menos aproximadamente 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 500 veces, 1000 veces, 1 O4 veces, 105 veces, 105 veces, 107 veces, 108 veces, 109 veces, 1010 veces o más en la primera condición de crecimiento.
En ciertas realizaciones, la velocidad de división de las células de algas aumenta en al menos aproximadamente 20%, 50%, 75%, 100%, 200%, 500%, 1.000%, etc. o más.
En ciertas realizaciones, el tiempo de duplicado de la población para el cultivo de algas en la primera condición de crecimiento es de aproximadamente 0.05 - 2 días.
En ciertas realizaciones, la acumulación de dicho producto de algas en la primera condición de crecimiento es insignificante o es subóptima. Preferiblemente, el producto de algas es menos de aproximadamente 65%, 30%, 20%, o incluso menos de 10% (p/p) de biomasa de algas en la primera condición de crecimiento.
En ciertas realizaciones, el número de células de algas aumenta no más de un logaritmo (aproximadamente 10 veces), 300%, 200%, 100% o 50% en la segunda condición de crecimiento.
En ciertas realizaciones, la biomasa de algas aumenta considerablemente en la segunda condición de crecimiento. En ciertas realizaciones, como se utiliza en la presente, el aumento de biomasa de algas incluye los productos de algas extraídos o excretados de células de algas vivas.
En ciertas realizaciones, la biomasa de algas aumenta en gran medida como resultado de la acumulación de dicho producto de algas.
En ciertas realizaciones, la biomasa de algas aumenta al menos aproximadamente 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, o 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 1500 veces o 2000 veces en la segunda condición de crecimiento.
En ciertas realizaciones, el producto de algas es al menos aproximadamente 45%, 55%, 65%, 75%, 85%, 90-95% (p/p) o incluso más de biomasa de algas en la segunda condición de crecimiento.
En ciertas realizaciones, el producto de algas es aceite o lípido. En otras realizaciones, el producto de algas es almidón (o un polisacárido).
En ciertas realizaciones, las algas se metabolizan en condiciones heterótrof as, fotoheterótrofas o autótrofas.
En ciertas realizaciones, las algas son Chlorophytes o Bacilliarophytes (diatomeas) o Ankistrodesmus.
Otro aspecto de la invención proporciona un medio de cultivo de algas en condiciones heterótrofas que comprende los componentes enumerados en la tabla 1. en donde la concentración final para cada componente enumerado en el medio es de aproximadamente 50% (mayor o menor), 40%, 30%, 20%, 10% o 5% de la concentración final enumerada en la tabla 1. En ciertas realizaciones, el medio es un medio de cultivo heterótrofo (HGM) de la tabla 1.
En ciertas realizaciones, el medio, cuando se compara con el medio HGM de la tabla 1. soporta básicamente la misma velocidad de crecimiento para Chlorella protothecoides en básicamente las mismas condiciones.
Otro aspecto de la invención proporciona un sistema adaptado para el proceso de de cultivo de algas de la invención. Preferiblemente, el biorreactor adecuado para la primera etapa de crecimiento puede esterilizarse para facilitar el cultivo de algas axénico en condiciones heterotrofas y fotoheterotrofas.
Se contempla que todas las realizaciones descritas en la presente puedan combinarse con características en otras realizaciones donde sean aplicables.
Breve Descripción de las figuras La figura 1 muestra una curva de crecimiento ejemplar de Chlorella protothecoides en presencia o ausencia de una combinación de reguladores del crecimiento vegetal.
La figura 2 muestra una curva de crecimiento ejemplar de Chlorella protothecoides en presencia o ausencia de una combinación de reguladores del crecimiento vegetal.
La figura 3 muestra una curva de crecimiento ejemplar de Chlorella protothecoides en presencia o ausencia de una combinación de reguladores del crecimiento vegetal.
La figura 4 muestra una curva de crecimiento ejemplar de Chlorella protothecoides en presencia o ausencia de una combinación de reguladores del crecimiento vegetal.
Descripción Detallada de la Invención La invención se basa en parte en el descubrimiento de que, en las condiciones correctas de crecimiento, las algas pueden crecer de forma fotoheterótrofa y heterótrofa utilizando moléculas orgánicas preformadas simples (tales como azucares) como fuentes de carbono.
La invención también se basa en parte en el descubrimiento de que la producción en base a algas de bioproductos con valor agregado (tal como aceite) puede llevarse a cabo en un crecimiento de dos etapas, en donde la primera etapa principalmente promueve la división celular y la proliferación de algas ("la etapa de crecimiento"). Después de que las células de algas han alcanzado un crecimiento exponencial (pero antes de la fase estacionaria), las células pueden cambiarse a una segunda condición de crecimiento para centrarse principalmente en la producción del producto ("la etapa de producción"). La producción del producto de algas deseado puede inducirse, por ejemplo, utilizando un medio limitado en una o más fuentes de nutrientes, tal como la fuente de nitrógeno. Las células de algas que crecen en la segunda condición de crecimiento gastan la mayor parte de la energía y los recursos en la producción de los productos de algas deseados, en vez de en más división/proliferación celular. Este cultivo de dos etapas permite una optimización separada de la etapa de crecimiento y la etapa de producción, asegurando asi una eficiencia máxima y producción óptima del bioproducto.
Cultivar algas de manera heterótrofa o fotoheterótrofa (en oposición a autótrofa) en la primera etapa (de crecimiento) permite optimizar la producción celular, lo que aumenta la economía considerablemente, debido a que una primera etapa de crecimiento autótrofo limita la cantidad total de biomasa que puede producirse así como también la velocidad de producción de dicha biomasa. Para compensar estas ineficiencias, el tamaño general de las instalaciones de cultivo que utilizan una primera etapa de crecimiento autótrofo debe ser enorme, lo que disminuye aun más la eficiencia y aumenta el costo del funcionamiento de las instalaciones de bioproducción en base a algas.
Otra ventaja de utilizar una primera etapa de crecimiento heterótrofo o fotoheterótrofo es que permite la esterilización del recipiente de cultivo. Esto permite que el cultivo de algas crezca en condiciones estériles como un cultivo axénico, en oposición a un cultivo unide algas. Esto reduce la competencia entre especies en el biorreactor y permite una utilización óptima de los nutrientes y de la producción del producto de algas.
Como se utiliza en la presente, "(cultivo) axénico" se refiere a un cultivo puro que no se contamina con ningún otro cultivo u organismo. Por ejemplo, un cultivo de algas axénico solo tiene una especie de algas y está libre o considerablemente libre de cualquier otro microorganismo, como por ejemplo bacterias, hongos, virus y otras especies de algas competitivas/indeseables. Un cultivo axénico puede ser de organismos simples o multicelulares, en la medida que no tenga organismos contaminantes asociados. Por el contrario, un "(cultivo) unide algas" puede contener solo un tipo de alga, pero puede tener también bacterias u otros microorganismos presentes en el mismo cultivo.
Otro aspecto de la invención se basa en parte en el descubrimiento de que el cultivo de algas puede estar sólidamente respaldado por una separación líquida obtenida de digerido anaeróbico, que resulta de la digestión anaeróbica de muchos materiales orgánicos tradiciona Imente considerados como "desechos". Ejemplos de dichos "desechos" incluyen (a modo no taxativo): despojos animales, estiércol de ganado, desechos de procesamiento de alimentos, aguas residuales municipales, residuos finos, granos de destilado u otros materiales orgánicos, etc. Esto no solo proporciona una manera útil de utilizar el digerido, sino que también reduce considerablemente el costo de producción de los productos de algas deseados.
Por lo tanto, la invención proporciona un método de cultivo de algas para producir un producto de algas que comprende: (1) cultivar las algas en una primera condición de crecimiento heterótrofo o fotoheterótrofo para aumentar la velocidad de división de células de algas y el número de células de algas; (2) cultivar las algas en una segunda condición de crecimiento para producir el producto de algas; en donde el número de células de algas no aumenta considerablemente en la segunda condición de crecimiento.
Como se utiliza en la presente, "no aumenta considerablemente" incluye la situación donde el número de células de algas aumenta menos de aproximadamente 1 orden de magnitud o aproximadamente 10 veces (por ejemplo, 8 a 16 veces, o aproximadamente 3-4 divisiones celulares). Durante el paso de crecimiento exponencial, no son de extrañar aumentos del número de células de algas de más de 104 - 109 veces (o 4-9 logaritmos), dependiendo en parte del número de células en el cultivo inicial. Para el momento en que las células de algas se cambian de fase de crecimiento exponencial al paso de producción, muchas células de algas están preparadas para dividirse al menos una ronda más (frecuentemente 3-4 rondas más) en la segunda condición de crecimiento. Por lo tanto, el mero aumento del número de células de un logaritmo o de 10 veces aproximadamente en la segunda condición de crecimiento es insignificante en comparación con el drástico aumento en el número de células durante el primer paso de crecimiento exponencial.
Pueden utilizarse una variedad de diferentes medios para respaldar el crecimiento de algas. Generalmente, un medio adecuado puede contener nitrógeno, sales inorgánicas de metal traza (por ejemplo, fósforo, potasio, magnesio y hierro, etc.), vitaminas (por ejemplo, tiamina), y similares, que pueden ser esenciales para el crecimiento. Por ejemplo, pueden utilizarse medios tales como medio VT, medio C, medio MC, medio MB y medio MDM (ver Sorui Kenkyuho, ed. por Mitsuo Chihara y Kazutoshi Nishizawa, Kyoritsu Shuppan (1979)), el medio OHM (ver Fabregas et'al., J. Biotech., Vol. 89, págs. 65-71 (2001 )), el medio BG-11 y modificaciones de los mismos. Otros ejemplos de medios adecuados incluyen, a modo no taxativo, caldo Luria, agua salobre, agua que tiene nutrientes agregados, residuos líquidos lácteos, medios con salinidad menor o igual a 1%, medios con salinidad mayor a 1%, medios con salinidad mayor a 2 % , medios con salinidad mayor a 3%, medios con salinidad mayor a 4% y combinaciones de los mismos. El medio más preferido incluye una separación líquida de un biodigerido anaeróbico, opcionalmente complementada con nutrientes adicionales. El líquido puede separarse del biodigerido anaeróbico por medios mecánicos, tal como por medio del uso de una prensa de husillo o por medio de centrifugación. El líquido idealmente no comprende más de 5-10% de contenido sólido, preferiblemente no más de 8% de contenido sólido.
Estos medios pueden seleccionarse dependiendo de sus fines, tales como crecimiento o inducción del producto de algas deseado. Por ejemplo, para una división/proliferación celular óptima, se utiliza un medio que tiene una gran cantidad de componentes que sirven como fuente de nitrógeno (por ejemplo, medio rico: que contiene al menos aproximadamente 0.15 g/L expresados en términos de nitrógeno). Para la producción de productos de algas, se prefiere un medio que tenga una pequeña cantidad de componentes que sirven como fuente de nitrógeno (por ejemplo, que contienen menos de aproximadamente 0.02 g/L expresados en términos de nitrógeno). Alternativamente, puede utilizarse un medio que contenga una fuente de nitrógeno a una concentración intermedia entre estos medios (medio bajo en nutrientes: que contiene al menos 0.02 g/L y menos de 0.15 g/L expresados en términos de nitrógeno).
En otras palabras, durante la primera condición de crecimiento, el medio preferiblemente tiene niveles no restrictivos de nutrientes (incluida una o más fuentes de C, N, P, S y/u O) y elementos traza necesarios para un aumento óptimo del número de células. Preferiblemente, las concentraciones de los nutrientes son no tóxicas para la división y/o el crecimiento celular.
La concentración de nitrógeno, la concentración de fósforo y otras propiedades del medio pueden determinarse dependiendo de la cantidad de algas que se inoculan y su velocidad esperada de crecimiento. Por ejemplo, cuando se inocula un recuento de algas en el orden de 105 células por milímetro en un medio bajo en nutrientes (por ejemplo, nitrógeno), las algas crecerán en cierta medida, pero el crecimiento se detendrá debido a que la cantidad de la fuente de nitrógeno es muy pequeña. Dicho medio bajo en nutrientes es adecuado para que se desarrolle el crecimiento y la producción de los productos de algas continuamente en un único paso (por ejemplo, en lotes). Asimismo, ajustando la relación en mol de N/P con un valor de aproximadamente 10-30. preferiblemente 15-25, o ajustando la relación en mol de C/N con un valor de aproximadamente 12-80 (por ejemplo, un contenido más bajo de N), el alga puede inducirse para producir el bioproducto deseado (por ejemplo, aceite). En caso de que el recuento de algas para inoculación sea superior, puede emplearse el medio rico para realizar la cultivación descrita anteriormente. De este modo, la composición del medio puede determinarse teniendo en cuenta varias condiciones.
Fuentes de nitrógeno o complementos de nitrógeno en los medios de crecimiento de algas pueden incluir nitratos, amoníaco, urea, nitritos, sales de amonio, hidróxido de amonio, nitrato de amonio, glutamato monosódico, proteínas solubles, proteínas insolubles, proteínas hidrolizadas, subproductos . animales, residuos lácteos, caseína, suero, caseína hidrolizada, suero hidrolizado, productos de soja, productos de soja hidrolizada, levadura, levadura hidrolizada, licor de maceración de maíz, agua de maceración de maíz, sólidos de maceración de maíz, granos de destilación, extracto de levadura, óxidos de nitrógeno, N20 u otras fuentes adecuadas (por ejemplo, otros péptidos, oligopéptidos y aminoácidos, etc.)- Las fuentes de carbono o complementos de carbono pueden incluir azúcares, monosacáridos , disacáridos, alcoholes de azúcar, ácidos grasos, fosfolípidos, alcoholes grasos, ésteres, oligosacáridos, polisacáridos , sacáridos mixtos, glicerol, dióxido de carbono, monóxido de carbono, almidón, almidón hidrolizado u otras fuentes adecuadas (por ejemplo, otros azúcares de 5 carbonos, etc.) Ingredientes o complementos de medios adicionales pueden incluir soluciones amortiguadoras, minerales, factores de crecimiento, antiespumantes, ácidos, bases, antibióticos, tensioacti vos o materiales para inhibir el crecimiento de células no deseables.
Pueden agregarse todos los nutrientes al comienzo o algunos al comienzo y otros durante el transcurso del proceso de crecimiento como una adición posterior única, como una alimentación continua durante el crecimiento de algas, como dosificación múltiple del mismo o de diferentes nutrientes durante el transcurso del crecimiento o como una combinación de estos métodos.
El pH del cultivo, si se desea, puede controlarse o ajustarse a través del uso de una solución amortiguadora o por medio de la adición de un ácido o base al comienzo o durante el transcurso del crecimiento. En algunos casos, tanto un ácido como una base pueden utilizarse en diferentes zonas del reactor o en la misma zona en el mismo o en diferentes momentos con el fin de lograr un grado deseado de control del pH. Ejemplos no taxativos de sistemas amortiguadores incluyen fosfato mono, di o tribásico, TRIS, TAPS, bicina, tricina, HEPES, TES, MOPS, PIPES, cacodilato, MES y acetato. Ejemplos no taxativos de ácidos incluyen ácido sulfúrico, HCI, ácido láctico y ácido acético. Ejemplos no taxativos de bases incluyen hidróxido de potasio, hidróxido de sodio, hidróxido de amonio, amoníaco, bicarbonato de sodio, hidróxido de calcio y carbonato de sodio. Algunos de estos ácidos y bases, además de modificar el pH, pueden servir como nutriente para las células. El pH del cultivo puede controlarse para aproximarse a un valor constante en todo el transcurso del crecimiento o puede cambiarse durante el crecimiento. Dichos cambios pueden utilizarse para iniciar o finalizar vías moleculares diferentes, para forzar la producción de un producto particular, para forzar la acumulación de un producto tal como grasas, tintes o compuestos bioactivos, para suprimir el crecimiento de otros microorganismos, para suprimir o motivar la producción de espuma, para que las células entren en estado de reposo, para revivirlas del reposo o para algunos otros fines.
En ciertas realizaciones, es preferible que el pH se mantenga en aproximadamente 4-10 o aproximadamente 6 a 8 en todo el período de cultivación.
Del mismo modo, la temperatura del cultivo puede en algunas realizaciones controlarse o ajustarse para aproximarse a un valor particular o puede cambiarse durante el transcurso del crecimiento para el mismo o diferentes fines como se enumera para los cambios de pH. Por ejemplo, durante la primera condición, la temperatura óptima para la división celular puede estar en el rango de aproximadamente 0-40°C, 20-40°C, 15-35°C o aproximadamente 20-25°C para algas no termófilas; y aproximadamente 40-95°C, preferiblemente aproximadamente 60-80°C, para algas termófilas.
En ciertas de esas realizaciones se proporciona un componente de control de temperatura que mide una temperatura dentro del sistema, tal como una temperatura del medio, y un componente de control que puede controlar la temperatura en respuesta a la medición. El componente de control puede comprender un espiral sumergido o una cubierta sobre el lado o la pared de fondo del recipiente de cultivo.
En ciertas realizaciones, pueden agregarse al cultivo de algas una o más hormonas/reguladores del crecimiento, o miméticos de los mismos, tales como hormonas/reguladores del crecimiento vegetal o miméticos de los mismos, para impulsar la división o proliferación celular en la primera condición de crecimiento.
Las hormonas vegetales afectan los niveles de expresión y de transcripción de los genes, la división celular y el crecimiento en plantas. Un gran número de compuestos químicos relacionados son sintetizados por humanos y se han utilizado para regular el crecimiento de las plantas cultivadas, hierbas, plantas cultivadas in vitro y células vegetales. Estos compuestos fabricados por el hombre también se denominan Reguladores del Crecimiento Vegetal o PGR en su forma abreviada. "Hormonas de crecimiento (o miméticos de las mismas)" como se utiliza en la presente incluye tanto hormonas naturales vegetales como los reguladores fabricados por el hombre/sintéticos, miméticos o derivados de los mismos. Preferiblemente, las hormonas/reguladores de crecimiento, o miméticos de los mismos, estimulan el crecimiento de algas al menos en una concentración, preferiblemente en una condición similar o idéntica a la que se utiliza en los ejemplos a continuación, tales como los Ejemplos 3-7. Las expresiones "hormona de crecimiento" y "regulador del crecimiento" pueden utilizarse indistintamente en la presente.
En general, las hormonas y reguladores vegetales se clasifican en cinco clases principales, algunas de las cuales están constituidas por muchos productos químicos diferentes que pueden variar en estructura entre una planta y otra. Cada uno de los productos químicos se agrupa en una de estas clases en base a sus similitudes estructurales y a sus efectos sobre la fisiología vegetal. Otras hormonas y reguladores del crecimiento vegetales no se agrupan fácilmente en estas clases. En cambio, existen naturalmente o son sintetizados por humanos u otros organismos, incluidos productos químicos que inhiben el crecimiento vegetal o interrumpen los procesos fisiológicos dentro de las plantas.
Las cinco clases principales son: Ácido abscísico (también denominado ABA); auxinas; citoquininas; Etileno; y giberelinas. Otros regulares del crecimiento vegetal identificados incluyen: Brasinólidos (esteroides vegetales que son químicamente similares a hormonas esteroides animales. Promueven la elongación celular y la división celular, la diferenciación de tejidos de xilema, e inhiben la abscisión de las hojas); Ácido salicílico (activa los genes en algunas plantas que producen productos químicos que auxilian en la defensa contra invasores patogénicos); Jasmonatos (producidos a partir de ácidos grasos y parecen promover la producción de proteínas de defensa que se utilizan para frenar los organismos invasores. También se cree que tienen un rol en la germinación de semillas y afectan el almacenamiento de proteína en semillas y parecen afectar el crecimiento de las raíces); hormonas de péptidos vegetales (comprende todos los péptidos secretados pequeños que están involucrados en la señalización célula a célula. Estas hormonas de péptidos pequeños juegan papeles cruciales en el crecimiento y desarrollo vegetal, incluidos mecanismos de defensa, el control de la división y expansión celular y la autoincompatibilidad de polen); Poliaminas (moléculas muy básicas con bajo peso molecular que se han encontrado en todos los organismos estudiados hasta ahora. Son esenciales para el crecimiento y desarrollo vegetal y afectan el proceso de mitosis y meiosis); Óxido nítrico (NO) (sirve como señal en respuestas hormonales y de defensa); Estrigolactonas (implicadas en la inhibición de la ramificación de los brotes).
La clase de ácido abscísico de PGR está compuesta por un compuesto químico normalmente producido en las hojas de las plantas, que se origina de cloroplastos, especialmente cuando las plantas están bajo estrés. En general, actúa como un compuesto químico inhibidor que afecta el crecimiento de brotes y el reposo de semillas y brotes.
Las auxinas son compuestos que influyen positivamente en la ampliación celular, la formación de brotes y la iniciación de raíces. También promueven la producción de otras hormonas y, junto con las citoquininas, controlan el crecimiento de los tallos, raíces y frutos, y convierten los tallos en flores. La auxinas afectan la elongación celular alterando la plasticidad de las paredes celulares. Las auxinas disminuyen a la luz y aumentan cuando está oscuro. Las auxinas son tóxicas para las plantas en grandes concentraciones; son más tóxicas para las dicotiledóneas y menos para las monocotiledóneas. Debido a esta propiedad, se han desarrollado y utilizado herbicidas de auxina sintéticos que incluyen 2,4-D y 2,4.5 - T para el control de las hierbas. Las auxinas, especialmente Ácido 1 -naftalenoacético (NAA) y Ácido ¡ndol-3-butírico (IBA), también se aplican comúnmente para estimular el crecimiento de las raíces cuando se toman cortes de plantas. La auxina más común encontrada en plantas es ácido indolacético o IAA.
Un miembro importante de la familia de las auxinas es ef ácido indol-3-acético (IAA). Genera la mayoría de efectos de las auxinas en plantas intactas y es la auxina nativa más potente. Sin embargo, las moléculas de IAA son químicamente alterables en solución acuosa. Otras auxinas naturales incluyen ácido 4-cloro-¡ndolacético, ácido fenilacético (PAA) y ácido indol-3-butírico (IBA) Análogos de auxinas sintéticas comunes incluyen ácido 1-naftalenoacético (NAA), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y otros. Siete auxinas sintéticas y naturales ejemplares que pueden utilizarse en la presente invención se muestran a continuación.
Acido indol-3-acético (IAA); Acido lndol-3-butirico (IBA); Acido 4-cloroindol-3-acético (4-CI-IAA); Acido 2-fenilacético (PAA); O O OH Cl Ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) Ácido 2,4.5-triclorofenoxi acético (2,4.5-T); Ácido a-naftalenoacético (a-NAA); Ácido 2-metoxi-3,6-diclorobenzoico (dicamba); Ácido 4-amino-3.5, 6-tricloropicolínico (tordon o piclora m ) ; Ácido a-(p-clorofenoxi) isobutírico (PCIB, una antiauxina).
Las citoquininas o CK son un grupo de productos químicos que influyen en la división celular y la formación de brotes. También ayudan a retrasar la senescencia o envejecimiento de los tejidos, son responsables de mediar el transporte de auxinas en toda la planta y afectan el largo internodal y el crecimiento de las hojas. Tienen un efecto altamente sinergistico en combinación con auxinas y las relaciones de estos dos grupos de hormonas vegetales afectan la mayoría de los períodos importantes durante la vida de una planta. Las citoquininas hacen frente a la dominancia apical inducida por auxinas; en conjunto con etileno promueven la abscisión de las hojas, partes de flores y frutos.
Hay dos tipos de citoquininas: citoquininas de tipo adenina representadas por kinetina, zeatina y 6-be n ci I a m i n o pu rí n a , así como también citoquininas tipo fenilurea como difenilurea o tidiazurón (TDZ).
Kinetina; N 6-Bencilaminopurina, benciladenina o BAP. El etileno es un gas que se forma a través del ciclo de Yang a partir de la descomposición de metionina, que se encuentra en todas las células. Su efectividad como hormona vegetal depende de su velocidad de producción con respecto a su velocidad de escape en la atmósfera. El etileno se produce a una velocidad más rápida en células de crecimiento y división rápidos, especialmente en la oscuridad. Las plántulas de reciente crecimiento y germinación producen más etileno que el que puede escapar de la planta, lo que provoca cantidades elevadas de etileno, inhibiendo la expansión de las hojas. Cuando el nuevo brote se expone a la luz, las reacciones del fitocromo en las células de las plantas producen una señal para que disminuya la producción de etileno, permitiendo la expansión de las hojas. El etileno afecta el crecimiento celular y la forma celular; cuando un brote en crecimiento se enfrenta a un obstáculo mientras está bajo la tierra, la producción de etileno aumenta en gran medida, evitando la elongación celular y haciendo que el tallo se hinche. El tallo más grueso resultante puede ejercer más presión contra el objeto que impide su camino a la superficie. Si el brote no alcanza la superficie y el estímulo de etileno se hace prolongado, afecta la respuesta geotrópica natural de los tallos, la cual consiste en crecer hacia arriba, dejándolo crecer alrededor de un objeto. Los estudios parecen indicar que el etileno afecta el diámetro y la altura del tallo: cuando los tallos de árboles se someten al viento, causando estrés lateral, ocurre una mayor producción de etileno, lo que resulta en troncos y ramas de árbol más robustos. El etileno afecta la maduración de los frutos: normalmente, cuando las semillas maduran, la producción de etileno aumenta y se acumula dentro del fruto, resultando en un acontecimiento climatérico justo antes de la dispersión de las semillas. La proteína nuclear INSENSIBLE AL ETILENO 2 (EIN2) es regulada por la producción de etileno y, a su vez, regula otras hormonas, incluidas las hormonas ABA y de la tensión.
H H \ / C=C H H Etileno Las giberelinas o GA incluyen un gran rango de químicos que se producen naturalmente dentro de las plantas y por los hongos. Las giberelinas son importantes en la germinación de semillas, afectando la producción de enzimas que moviliza la producción de alimentos para el crecimiento de nuevas células. Esto se realiza modulando la transcripción cromosómica. En las semillas de grano (arroz, trigo, maíz, etc.), una capa de células denominada la capa de aleurona envuelve el tejido del endospermo. La absorción de agua por parte de la semilla causa la producción de GA. La GA se transporta a la capa de aleurona, que responde produciendo enzimas que rompen las reservas de alimento almacenado dentro del endospermo, las cuales son utilizadas por la plántula de crecimiento. Las GA producen un crecimiento acelerado de plantas formadoras de rosetas, aumentando el largo internodal. Promueven el florecimiento, la división celular y, en las semillas, el crecimiento después de la germinación. Las giberelinas también revierten la inhibición del crecimiento y reposo de brotes inducido por ABA.
Todas las giberelinas conocidas son ácidos diterpenoides que son sintetizados por la vía terpenoide en plástidos y luego son modificadas en el retículo endoplásmico y citosol hasta que alcanzan su forma biológicamente activa. Todas las giberelinas derivan del esqueleto ent-giberelano, pero se sintetizan por medio de ent-kaureno. Las giberelinas se denomina GAl . GAn en orden de descubrimiento. El ácido giberélico, que fue la primera giberelina caracterizada estructuralmente, es GA3. Al 2003, había 126 GA identificadas de plantas, hongos y bacterias. Las giberelinas son ácidos de diterpeno tetracíclico. Hay dos clases en base a la presencia de 19 carbonos o 20 carbonos. Las giberelinas de 19 carbonos, tales como el ácido giberélico, perdieron el carbono 20 y, en su lugar, poseen un puente de lactona de cinco miembros que une los carbonos 4 y 10. Las formas de 19 carbonos son, en general, las formas biológicamente activas de las giberelinas. La hidroxilación también tiene un gran efecto sobre la actividad biológica de la giberelina. En general, los compuestos más biológicamente activos son giberelinas dihiroxiladas que poseen grupos hidroxilo tanto en el carbono 3 como en el carbono 13. El ácido giberélico es giberelina dihidroxilada. A continuación se muestran giberelinas representativas (a modo no taxativo): GA3; ent-Giberelano; ent-Kaureno.
Hormonas/reguladores del crecimiento ejemplares o miméticos de los mismos que pueden utilizarse en la presente invención incluyen aquellos de la familia de las auxinas, la familia de las citoquininas y/o la familia de las giberelinas.
Por ejemplo, auxinas y miméticos útiles para la invención incluyen (a modo no taxativo): un ácido indolacético (IAA); 2,4-D; 2,4.5-T; ácido 1 -naftalenoacético (NAA); ácido indol-3-butírico (IBA); ácido 2-metil-4-clorofenoxiacético (MCPA); ácidos 2-(2-met¡l-4-clorofenoxi)propión¡cos (mecoprop, MCPP); ácido 2-(2,4- d¡clorofenox¡)propión¡co (dicloroprop, 2,4-DP); ácido (2,4-diclorofenoxi)butírico (2,4-DB); ácido 4-cloro-indolacético (4-CI-IAA); ácido fenilacético (PAA); ácido 2-metoxi-3l6-diclorobenzoico (dicamba); ácido 4-amino-3.5,6-tricloropicolínico (tordon o picloram); ácido a-(p-clorofenoxi)isobutírico (PCIB, una antiauxina) o mezclas de los mismos. Cuando se utiliza como una mezcla, la mezcla preferiblemente tiene actividad biológica equivalente (por ejemplo, básicamente en las mismas condiciones de crecimiento, estimula el crecimiento celular de las algas básicamente en la misma medida, preferiblemente básicamente en la misma cantidad de tiempo) como una cantidad efectiva de IAA (cuando se utiliza solo) o una cantidad efectiva de IAA + NAA. Ver, por ejemplo, las condiciones utilizadas en los ejemplos más adelante. citoquininas y miméticos útiles para la invención pueden ser de un tipo adenina o de un tipo fenilurea, y pueden incluir (a modo no taxativo) kinetina, zeatina, 6-bencilaminopurina (6-BA o 6-BAP), difenilurea, tidiazurón (TDZ), o mezclas de los mismos. Preferiblemente, se utilizan citoquininas tipo adenina, tales como kinetina, zeatina, 6-bencilaminopurina (6-BA o 6-BAP), o mezclas de los mismos. Cuando se utilizan como una mezcla, la mezcla preferiblemente tiene actividad biológica equivalente (por ejemplo, básicamente en las mismas condiciones de crecimiento, estimula el crecimiento celular de las algas básicamente en la misma medida, preferiblemente básicamente en la misma cantidad de tiempo) como una cantidad efectiva de kinetina + 6-BA. Ver, por ejemplo, J J las condiciones utilizadas en los ejemplos más adelante.
Las giberelinas y miméticos útiles para la invención pueden ser cualquiera de las giberelinas descritas en la presente o conocidas en la técnica, tales como GA3. Preferiblemente, las giberelinas, miméticos o derivados o mezclas de las mismas tienen una actividad biológica equivalente (por ejemplo, básicamente en las mismas condiciones de crecimiento, estimula el crecimiento celular de las algas básicamente en la misma medida, preferiblemente básicamente en la misma cantidad de tiempo) como una cantidad efectiva de GA3. Ver, por ejemplo, las condiciones utilizadas en los ejemplos más adelante.
Los miméticos también pueden ser un compuesto fenoxiacético.
Para lograr un efecto estimulador de crecimiento óptimo, la relación (en peso) entre el total de auxina y el total de citoquinina en el medio puede ajustarse para ser de aproximadamente 1:2 a 2:1. preferiblemente aproximadamente 1:1.
Cuando están presentes las giberelinas, la relación (en peso) entre el total de auxina y el total de giberelina en el medio puede ajustarse para ser de aproximadamente 1:4 a 1:1. preferiblemente aproximadamente 1:2.
En ciertas realizaciones puede estar presente la vitamina B1 o sus miméticos, derivados o equivalentes funcionales. Preferiblemente, la relación (en peso) entre el total de auxina y el total de vitamina B1 en el medio puede ajustarse para ser de aproximadamente 1:2 a 2:1. preferiblemente aproximadamente 1:1.
En ciertas realizaciones, la concentración total de las auxinas en el medio de crecimiento es aproximadamente 0.01 -0.?4 pg/L, aproximadamente 0.003 - 0.12 pg/L, aproximadamente 0.002 - 0.2 pg/L, o aproximadamente 0.001 - 0.4 pg/L.
En ciertas realizaciones, la concentración total de las citoquininas en el medio de crecimiento es aproximadamente 0.01 - 0.04 pg/L, aproximadamente 0.003 - 0.12 pg/L, aproximadamente 0.002 - 0.2 pg/L, o aproximadamente 0.001 - 0.4 pg/L.
En ciertas realizaciones, la concentración total de las giberelinas en el medio de crecimiento es aproximadamente 0.01 -0.04 pg/L, aproximadamente 0.003 - 0.12 pg/L, aproximadamente 0.002 - 0.2 pg/L, o aproximadamente 0.001 - 0.4 pg/L.
En ciertas realizaciones, la concentración total de los compuestos de vitamina B1 en el medio de crecimiento es aproximadamente 0.02 - 0.08 mg/L, aproximadamente 0.006 - 0.24 mg/L, aproximadamente 0.004 - 0.4 pg/L, o aproximadamente 0.002 - 0.8 pg/L.
En ciertas realizaciones, puede utilizarse etileno, brasinólidos, ácido salicílico, jasmonatos, hormonas de péptidos vegetales, poliaminas, óxido nítrico y/o estrigolactonas.
En ciertas realizaciones, puede utilizarse etileno, brasinólidos, jasmonatos, hormonas de péptidos vegetales y/o poliaminas.
En ciertas realizaciones, la presencia de una o más hormonas/reguladores aumenta la proliferación de algas aproximadamente un 15% (por ejemplo, 1.4 a 1.6), 20%, 25%, 30%, 35% o más, preferiblemente en condiciones de crecimiento en los ejemplos, por ejemplo, Ejemplos 3-7.
El cultivo de algas puede cultivarse en un primer biorreactor en la primera condición de crecimiento (por ejemplo, la primera etapa/el primer paso), y en un segundo biorreactor en la segunda condición de crecimiento (por ejemplo, la segunda etapa/el segundo paso). La primera etapa y la segunda etapa pueden realizarse independientemente en lotes utilizando tanques o recipientes de cultivo separados. También es posible lavar y recoger las algas cultivadas al final de la primera etapa, colocar las algas nuevamente en el mismo tanque de cultivo, y llevar a cabo luego la segunda etapa. En ciertas realizaciones, el lavado es opcional, y puede ser necesario o no dependiendo del medio en el primer reactor.
Estanques abiertos o biorreactores cerrados (preferiblemente esterilizados) pueden operarse en lotes, de forma continua o en forma semícontinua. Por ejemplo, en lotes, el estanque/biorreactor se llenaría hasta el nivel apropiado con medios nuevos y/o reciclados e inóculos. Este cultivo se dejaría crecer hasta que ocurra el grado deseado de crecimiento. En este punto, ocurriría la cosecha del producto. En una realización, todo el contenido del estanque/biorreactor se cosecharía, luego se limpiaría y esterilizaría el estanque/biorreactor (por ejemplo, se esterilizaría para el biorreactor) según sea necesario, y se rellenaría con medios e inóculos. En otra realización, solo se cosecharía una porción del contenido, por ejemplo, aproximadamente 50%, luego los medios se agregarían para rellenar el estanque/biorreactor y continuaría el crecimiento.
Alternativamente, en un modo continuo, los medios, nuevos y/o reciclados, y los inóculos nuevos se alimentan continuamente en el estanque/biorreactor mientras ocurre continuamente la cosecha de material celular. En una operación continua, puede haber una fase de arranque inicial donde la cosecha se retrasa para permitir que se produzca una concentración celular suficiente. Durante esta etapa de arranque, puede interrumpirse la alimentación de los medios y/o la alimentación de los inóculos. Alternativamente, los medios e inóculos pueden agregarse al estanque/biorreactor y cuando el estanque/biorreactor llega al volumen de líquido deseado, comienza la cosecha. Pueden utilizarse otras técnicas de arranque como se desee para cumplir con los requisitos operacionales y de la manera apropiada para el organismo de producto y el medio de crecimiento particulares. Cuando un cultivo se deja crecer en un primer estanque/biorreactor, aproximadamente 10-90%, o 20-80%, o 30-70% del cultivo puede transferirse al segundo estanque/biorreactor, sirviendo el contenido residual como un cultivo de partida para el crecimiento posterior en el primer estanque/biorreactor. Alternativamente, aproximadamente 100% del cultivo se transfiere al segundo estanque/biorreactor, mientras que el primer estanque/biorreactor se inocula a partir de una nueva fuente.
Un cultivo continuo en estanque/biorreactor puede operarse en un "modo agitado" o un "modo de flujo pistón" o un "modo de combinación". En un modo de agitación, los medios e inóculos se agregan y se mezclan en el volumen general del estanque/biorreactor. Los dispositivos de mezcla incluyen, a modo no taxativo, rueda de paletas, propulsor, turbina, paleta o desplazamiento de aire que operan en dirección vertical, horizontal o combinada. En algunas realizaciones, el mezclado puede lograrse o ser asistido por la turbulencia creada agregando los medios o inóculos. La concentración de células y componentes del medio no varía mucho en toda el área horizontal del estanque/biorreactor. En modo de flujo pistón, los medios e inóculos se agregan en un extremo del estanque/biorreactor, y la cosecha ocurre en el otro extremo. En el modo de flujo pistón, el cultivo en general se mueve desde la entrada de los medios hasta el punto de cosecha. El crecimiento celular ocurre a medida que el cultivo se mueve desde la entrada a la ubicación de la cosecha. El movimiento del cultivo puede lograrse a través de medios que incluyen, a modo no taxativo, inclinar el estanque/biorreactor, los dispositivos de mezcla, las bombas y el gas soplado en la superficie del estanque/biorreactor, y el movimiento asociado con la adición de material en un extremo del estaque/biorreactor y la remoción en el otro. Los componentes de los medios pueden agregarse en varios punto del estanque/biorreactor para proporcionar diferentes condiciones de crecimiento para diferentes fases del crecimiento celular. De manera similar, la temperatura y el pH del cultivo pueden variar en diferentes puntos del estanque/biorreactor. Opcionalmente, se puede volver a mezclar en varios puntos. El mezclado activo puede lograrse a través del uso de mezcladoras, paletas, deflectores u otras técnicas apropiadas.
En un modo de combinación, una porción del estanque/biorreactor operará en un modo de flujo pistón y una porción operaría en un modo de agitación. Por ejemplo, los medios pueden agregarse en una zona de agitación para crear un sistema de "autosembrado" o "autoinoculación". Los medios con células en crecimiento se moverían desde la zona agitada a una zona de flujo pistón donde las células continuarían creciendo hasta el punto de cosecha. Las zonas agitadas pueden colocarse al comienzo, en el medio o hacia el extremo del estanque/biorreactor dependiendo del efecto deseado. Además de crear un cultivo de autosembrado, dichas zonas de agitación pueden utilizarse para fines incluidos, a modo no taxativo, proporcionar un tiempo de residencia específico en el que se expone a las células a condiciones o concentraciones específicas de reactivos particulares o componentes de los medios. Dichas zonas de agitación pueden alcanzarse a través del uso de paletas, barreras, desviadores y/o dispositivos de mezcla.
Un cultivo semicontinuo puede operarse cargando el estanque/biorreactor con una cantidad inicial de medios e ¡nóculos. A medida que el crecimiento continúa, se agregan medios adicionales continuamente o a intervalos.
En ciertas realizaciones preferidas, el cultivo de algas puede hacerse crecer en uno o más biorreactores cerrados (preferiblemente esterilizables). Dichos sistemas de cultivo y cosecha cerrados pueden esterilizarse, reduciendo así en gran medida los problemas de contaminación de algas, bacterias, virus y microorganismos consumidores de algas y/u otras especies extrañas.
Como se utiliza en la presente, "esterilización" incluye cualquier proceso que mata o elimina efectivamente agentes trasmisibles (tales como hongos, bacterias, virus, formas de esporas, etc.) de una superficie, equipo, artículo de alimento o medicación, o medio de cultivo biológico. La esterilización puede lograrse a través de la aplicación de calor, químicos, irradiación, alta presión, filtración o combinación de los mismos. Hay al menos dos categorías amplias de esterilización: física y química. La esterilización física incluye: esterilización por calor, esterilización por radiación, esterilización por gas de alta presión (C02 s upercrítico) . La esterilización química incluye: óxido de etileno, ozono, blanqueador de cloro, formaldehído de glutaraldehído, peróxido de hidrógeno, ácido peracético o etanol al 70% , propanol al 70%, etc. La esterilización por medio de radiación incluye el uso de luz ultravioleta (UV). Todos los medios descritos en la presente y los que se conocen en la técnica pueden adaptarse para esterilizar los tanques, recipientes y contenedores de cultivo utilizados en la presente invención.
En ciertas realizaciones, dichos biorreactores pueden diseñarse para instalarse y operarse en un entorno al aire libre, donde estén expuestos a la luz y/o temperatura ambiental. El aparato, el sistema y los métodos pueden diseñarse para proporcionar una mejor regulación térmica útil para mantener la temperatura dentro del rango compatible con un crecimiento y producción de aceite óptimos. En ciertas realizaciones, estos sistemas pueden construirse y operarse en tierra marginal o inútil para el cultivo estándar (por ejemplo, maíz, trigo, soja, cañóla, arroz).
En ciertas realizaciones, las algas pueden cultivarse, al menos durante ciertos pasos, en estanques abiertos que pueden ser o no esterilizables. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las heterótrofas halófilas pueden cultivarse al aire libre en un medio a base de salmuera, cuyas condiciones limitarían considerablemente el crecimiento de todas las otras células. De manera similar, en ciertas realizaciones, las algas termófilas heterótrofas pueden cultivarse a una temperatura que limitaría considerablemente el crecimiento de todos los otros organismos.
En ciertas realizaciones, el biorreactor utilizado en la presente invención no incluye canales y canaletas, y otros establecimientos similares adecuados para operación al aire libre.
No hay ninguna limitación particular en el aparato más simple para cultivar algas verdes, mientras que el aparato sea capaz de proporcionar dióxido de carbono y, opcionalmente de irradiar una suspensión de cultivo con luz en condiciones de crecimiento heterótrofo. Por ejemplo, en el caso de un cultivo a escala pequeña, preferiblemente puede utilizarse un matraz de cultivo plano. En el caso de un cultivo a gran escala, puede utilizarse un tanque o recipiente de cultivo que está constituido por una placa transparente hecha de vidrio, plástico o similar, que está equipada con un aparato de irradiación y un agitador, en caso de que sea necesario. Ejemplos de dicho tanque de cultivo incluyen un tanque de cultivo de placa, un tanque de cultivo tipo tubo, un tanque de cultivo tipo cúpula de aire y un tanque de cultivo tipo cilindro hueco. En cualquier caso se prefiere el uso de un contenedor sellado.
A pesar de que la luz natural puede utilizarse para el crecimiento autótrofo (por ejemplo, durante el segundo paso de crecimiento) y fotoheterótrofo, también pueden utilizarse fuentes de luz artificial en la presente invención. En ciertas realizaciones, puede utilizarse en la presente invención una fuente de luz guiada (ya sea de origen natural o artificial). Por ejemplo, pueden utilizarse recolectores solares para recoger la luz natural del sol, que a su vez puede trasmitirse a través de una guia de ondas (por ejemplo, cables de fibra óptica) hasta un sitio específico (biorreactor). Una luz artificial preferida es LED, que proporciona una de las fuentes de energía de luz más eficientes, dado que LED puede proporcionar luz a una longitud de onda muy específica que puede adaptarse para una utilización celular máxima. En ciertas realizaciones, pueden utilizarse luces de emisión LED con una longitud de onda de aproximadamente 400-500 nm y/o 600-700 nm.
Pueden utilizarse varias fuentes de carbono para diferentes pasos del crecimiento de algas. Por ejemplo, un azúcar simple puede utilizarse como fuente de carbono, para el primer o segundo paso de crecimiento o ambos. Alternativamente, puede utilizarse C02 como fuente de carbono.
Si se utiliza C02 como fuente de carbono, puede introducirse en el biorreactor de sistema cerrado, por ejemplo, burbujeado a través del medio acuoso. En una realización preferida, puede introducirse C02 burbujeando el gas a través de una membrana de neopreno perforada, que produce pequeñas burbujas con una alta relación de superficie con volumen para un intercambio máximo. En una realización más preferida, las burbujas de gas pueden introducirse en el fondo de una columna de agua en la cual el agua fluye en la dirección opuesta al movimiento de las burbujas. Esta disposición de contraflujo también maximiza el intercambio de gas aumentando el tiempo en que las burbujas se exponen al medio acuoso. Para aumentar más la disolución de C02, la altura de la columna de agua puede aumentarse para alargar el tiempo en que las burbujas se exponen al medio. El C02 se disuelve en agua para generar H2C03, que puede luego "fijarse" por medio de algas fotosintéticas para producir compuestos orgánicos. El dióxido de carbono puede suministrarse a una concentración de aproximadamente 1-3% (v/v), a una velocidad de aproximadamente 0.2-2 vvm, por ejemplo. Cuando se utiliza un tanque de cultivo de placa, la suspensión de cultivo también puede agitarse suministrando dió ido de carbono para que las algas verdes puedan irradiarse uniformemente con la luz.
Una vez que el cultivo haya alcanzado un grado suficiente de crecimiento en la primera condición de crecimiento, las células pueden cambiarse a la segunda condición de crecimiento para producir el producto de algas deseado (por ejemplo, aceite). La segunda condición de crecimiento comprende el crecimiento de células de algas en un suministro limitado de nitrógeno (por ejemplo, 1.5 -7 mg N/L), o en un medio con un nivel de nitrógeno (por ejemplo, 1.5 -7 mg N/L) optimizado para la síntesis del producto de algas. Preferiblemente, las algas se cambian de la primera condición de crecimiento a la segunda condición de crecimiento antes de que se alcance la fase estacionaria de crecimiento.
Se pueden utilizar varios parámetros cuando se determinan los tiempos de cambio entre la primera y la segunda condición de crecimiento. En ciertas realizaciones, las algas pueden cambiarse de la primera condición de crecimiento a la segunda condición de crecimiento cuando se agotan considerablemente uno o más nutrientes (por ejemplo, nitrógeno) en la primera condición de crecimiento. Esto puede controlarse ajustando la cantidad de la fuente de nitrógeno en el medio de partida, o la cantidad de nitrógeno agregada al cultivo de algas durante el crecimiento en la primera condición de cultivo.
En otras realizaciones, las algas también pueden cambiarse de la primera condición de crecimiento a la segunda condición de crecimiento cuando la densidad celular del cultivo de algas alcanza cierto nivel predeterminado, tal como aproximadamente 5 ? 1 O7 células/mL.
Aun en otras realizaciones, las algas pueden cambiarse de la primera condición de crecimiento a la segunda condición de crecimiento cuando la concentración de proteínas del cultivo de algas alcanza aproximadamente 0.5 - 1 g/l o aproximadamente 0.8 g/l. Las algas también pueden cambiarse de la primera condición de crecimiento a la segunda condición de crecimiento cuando la concentración de pigmento del cultivo de algas alcanza aproximadamente 0.005 mg/L (para clorofila a y b) o aproximadamente 0.02 mg/L (para clorofila total).
El cultivo de algas también puede cambiarse de la primera condición de crecimiento a la segunda condición de crecimiento dependiendo de una serie de criterios o combinaciones de las mismos, tales como tiempo de cultivo, biomasa por mi (por ejemplo, aproximadamente 4 g/L), concentración del producto celular (por ejemplo, pigmento, tal como clorofila a y b a aproximadamente 0.005 mg/L, o clorofila total a 0.02 mg/L, etc. medidos en línea), densidad óptica (678 nm) >3, etc.
Para cambiar el cultivo de algas entre diferentes condiciones de crecimiento, las algas pueden cosecharse físicamente y separarse del medio. La cosecha puede ocurrir directamente desde el estanque/biorreactor o después de la transferencia del cultivo a un tanque de almacenamiento. Las etapas de cosecha pueden incluir las etapas de separación de células de la masa de los medios, y/o re u ti I izació n del medio para otros lotes de cultivos de algas.
Alternativamente, el cambio puede efectuarse diluyendo continuamente el crecimiento del cultivo de algas en la primera condición de crecimiento en un primer biorreactor, y recogiendo el cultivo de algas desplazado para su crecimiento en un segundo biorreactor en la segunda condición de crecimiento. Preferiblemente, la velocidad de aumento del número de células de algas en la primera condición de crecimiento es considerablemente igual a la velocidad de dilución, de forma tal que el número de células de algas en el primer biorreactor permanece considerablemente constante.
Preferiblemente, para la producción de- aceite, la segunda condición de crecimiento puede comprender también la adición de un factor estimulador de aceite, tal como humato (por ejemplo, ácido fúlvico o ácido húmico).
De acuerdo con los métodos de la invención, el número de células de algas aumenta al menos aproximadamente 2-veces, 5-veces, 10-veces, 20-veces, 50-veces, 100-veces, 500-veces, 1000-veces (3 logaritmos), 10 -veces (4 logaritmos), 105-veces (5 logaritmos), 106-veces (6 logaritmos), 107-veces (7 logaritmos), 108-veces (8 logaritmos), 109-veces (9 logaritmos), 1010-veces (10 logaritmos) o más en la primera condición de crecimiento.
Preferiblemente, la velocidad de división celular de algas aumenta al menos aproximadamente 20%, 50%, 75%, 100%, 200%, 500%, 1.000% o más en la primera condición de crecimiento.
Preferiblemente, el tiempo de duplicación de la población para el cultivo de algas en la primera condición de crecimiento es aproximadamente 0.05-2 días.
Debido a que el objetivo del primer paso de crecimiento es aumentar el número celular y/o la velocidad de división celular, la acumulación del producto de algas en la primera condición de crecimiento es insignificante o subóptima. Por ejemplo, el producto de algas puede ser menos de aproximadamente 65%, 30%, 20%, o incluso menos de 10% (p/p) de biomasa de algas en la primera condición de crecimiento.
Mientras tanto, dado que el objetivo principal del crecimiento en la segunda condición es producir el producto de algas deseado, un aumento adicional del número de células de algas puede implicar un gasto de recursos o energía valiosos y por lo tanto no es deseable. Preferiblemente, el aumento del número de células de algas durante la segunda fase/condición de crecimiento es de no más de un logaritmo (o aproximadamente 10 veces), 300%, 200%, 100% o 50%.
Preferiblemente, la biomasa de algas aumenta considerablemente en la segunda condición de crecimiento. Por ejemplo, la biomasa de algas puede aumentar en gran medida como resultado de la acumulación de producto de algas. En ciertas realizaciones, la biomasa de algas aumenta al menos 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces o 50 veces en la segunda condición de crecimiento. Por ejemplo, si la proporción del producto de algas (por ejemplo, aceite, lípidos, etc.) de la célula aumenta hasta 99% desde 1 %, la biomasa de algas aumentará aproximadamente 19-20 veces.
En ciertas realizaciones, el producto de algas acumulado aumenta al menos aproximadamente 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 1500 veces, 2000 veces, 2500 veces o más en la segunda condición de crecimiento.' Por ejemplo, si la biomasa no de algas (por ejemplo, núcleo, citoplasma, etc.) de la célula aumenta hasta 99% desde 1%, el producto de algas aumentará aproximadamente 1900 veces.
Al final del crecimiento de dos etapas se pueden recuperar las algas de los recipientes de crecimiento (estanques y biorreactores). La separación de la masa celular del grueso del agua/medio puede lograrse de varias formas. Ejemplos no taxativos incluyen cernidura, centrifugación, filtración rotatoria al vacio, filtración por presión, separación por hidrociclón, flotación, despumación, cribado y asentamiento por gravedad. También pueden utilizarse otras técnicas conjuntamente con estas técnicas, tales como adición de agentes de precipitado, agentes floculantes o agentes coagulantes, etc. También pueden usarse dos o más etapas de separación. Cuando se utilizan múltiples etapas, éstas pueden basarse en la misma técnica o en técnicas diferentes. Ejemplos no taxativos incluyen cribado del grueso del contenido del cultivo de algas con posterior filtración o centrifugación del efluente de la primera etapa.
Por ejemplo, las algas pueden separarse parcialmente del medio utilizando una circulación por remolino de pie, vórtice de cosecha y/o tubos de succión, como se describe más adelante. Alternativamente, pueden utilizarse centrifugadoras comerciales de escala industrial con gran capacidad de volumen para complementar o en lugar de los otros métodos de separación. Dichas centrifugadoras pueden obtenerse de fuentes comerciales conocidas (por ejemplo, Cimbria Sket o IBG Monforts, Alemania; Alfa Laval A/S, Dinamarca). También puede usarse centrifugación, filtrado y/o sedimentación para purificar aceite de otros componentes de algas. La separación de algas del medio acuoso puede simplificarse mediante la adición de floculantes tales como arcilla (por ejemplo, con un tamaño de partícula menor que 2 micrones), sulfato de aluminio o poliacrilamida. En presencia de floculantes, las algas pueden separarse mediante sedimentación gravitacional simple o pueden separarse más fácilmente por centrifugación. La separación de algas en base a floculantes se describe, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 20020079270. incorporada a la presente a modo de referencia.
El experto en la materia se dará cuenta de que puede utilizarse cualquier método conocido en la técnica para separar células, tales como algas, de medios líquidos. Por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 20040121447 y la Patente de los Estados Unidos No. 6.524.486, cada una incorporada a la presente a modo de referencia, describen un dispositivo de filtración de flujo tangencial y un aparato para separar parcialmente algas de un medio acuoso. Otros métodos para la separación de algas del medio se han descrito en las Patentes de los Estados Unidos No. 5.910.254 y 6.524.486, cada una incorporada a la presente a modo de referencia. También pueden utilizarse otros métodos publicados para la separación y/o extracción de algas. Ver, por ejemplo, Rose et al., Water Science and Technology 25: 319-327, 1992; Smith et al., Northwest Science 42: 165-171. 1968; Moulton eí al., Hydrobiologia 204/205: 401-408, 1990, Borowitzka eí al., Bulletin of Marine Science 47: 244-252, 1990; Honeycutt, Biotech nology and Bioengineering Symp. 13: 567-575, 1983.
Una vez que la masa celular se ha cosechado, el producto de algas (por ejemplo, aceite) puede liberarse mediante disrupcion (por ejemplo, Usado) de las células de algas utilizando medios mecánicos, medios químicos (por ejemplo, enzimáticos) y/o extracción de disolventes.
Ejemplos no taxativos de medios mecánicos para la disrupción celular incluyen distintos tipos de prensas, tales como una prensa de extracción, una prensa discontinua, una prensa filtradora, una prensa en frío o una prensa francesa; dispositivos de caída de presión; homogeneizadores de caída de presión, molinos coloidales, molinos de perlas o bolas, dispositivos mecánicos de corte (por ejemplo, mezcladoras de alto esfuerzo cortante), choque térmico, tratamiento con calor, choque osmótico, sonicación o ultrasonicación, expresión, prensado, molienda, explosión de vapor, disruptores de rotor-estator, procesadores tipo válvula, procesadores de geometría fija, descompresión de nitrógeno o cualquier otro método conocido. Los disruptores de células comerciales de alta capacidad pueden adquirirse de fuentes conocidas. (Por ejemplo, GEA Niro Inc., Columbia, MD; Constant Systems Ltd., Daventry, Inglaterra; Microfluidics, Newton, MA). Métodos para la ruptura de microalgas en suspensión acuosa se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 6.000.551. que se incorpora a la presente a modo de referencia .
Ejemplos no taxativos de medios químicos incluyen el uso de enzimas, agentes oxidantes, disolventes, tensíoactivos y agentes quelantes. Dependiendo de la naturaleza de la técnica exacta que se utilice, la disrupcion puede realizarse en seco o puede estar presente un disolvente, agua o vapor.
Los disolventes que pueden utilizarse para la disrupcion o para ayudar con la disrupcion incluyen, a modo no taxativo, hexano, heptano, alcoholes, fluidos supercríticos, disolventes clorados, acetona, etanol, metanol, isopropanol, aldehidos, cetonas, disolventes f luorados-clorados y combinaciones de los mismos. Ejemplos de tensioactivos incluyen, a modo no taxativo, detergentes, ácidos grasos, glicéridos parciales, fosfolípidos, lisofosfolípidos, alcoholes, aldehidos, compuestos de polisorbato y combinaciones de los mismos. Ejemplos de fluidos supercríticos incluyen dióxido de carbono, etano, etileno, propano, propileno, trifluorometano, clorotrifluorometano, amoníaco, agua, ciclohexano, n-pentano y tolueno. Los disolventes de fluidos supercríticos también pueden modificarse mediante la inclusión de agua o algún otro componente para modificar las propiedades disolventes del fluido. Enzimas adecuadas para la disrupcion química incluyen proteasas, celulasas, lipasas, fosfolipasas, lisozima, polisacarasas y combinaciones de las mismas. Agentes quelantes adecuados incluyen, a modo no taxativo, EDTA, porfina, DTPA, NTA, H EDTA, PDTA, EDDHA, glucoheptonato, iones de fosfato (diversamente protonados y no protonados) y combinaciones de los mismos. En algunos casos, la extracción de disolventes puede combinarse con la disrupcion celular mecánica o química como se describe en la presente. También pueden utilizarse combinaciones de métodos químicos y mecánicos.
La separación de las células rotas de la porción o fase que contiene el producto puede lograse mediante varias técnicas. Ejemplos no taxativos incluyen centrifugación, separación con h id roci cío n es , filtración, flotación y asentamiento por gravedad. En algunas situaciones, sería deseable incluir un disolvente o fluido supercrítico, por ejemplo, para solubilizar productos deseados, reducir la interacción entre el producto y las células rotas, reducir la cantidad de producto remanente con las células rotas luego de la separación o para proporcionar una etapa de lavado para reducir aún más las pérdidas. Disolventes adecuados con este fin incluyen, a modo no taxativo, hexano, heptano, fluidos supercríticos, disolventes clorados, alcoholes, acetona, etanol, metanol, isopropanol, aldehidos, cetonas y disolventes fluorados-clorados. Ejemplos de fluidos supercríticos incluyen dióxido de carbono, etano, etileno, propano, propileno, trifluorometano, clorotrifluorometano, amoníaco, agua, ciclohexano, n-pentano, tolueno y combinaciones de éstos. Los disolventes de fluidos supercríticos también pueden modificarse mediante la inclusión de agua o algún otro componente para modificar las propiedades disolventes del fluido.
El producto así aislado puede luego procesarse adicionalmente según sea apropiado para su uso deseado, tal como mediante remoción de disolventes, secado, filtración, centrifugación modificación química, transesterificación, purificación adicional o alguna combinación de etapas.
Por ejemplo, pueden aislarse lípidos/aceites de la biomasa y luego usarse para formar biodiésel utilizando métodos conocidos para formar biodiésel. Por ejemplo, la biomasa puede prensarse y separarse el líquido rico en lípidos resultante utilizando cualquiera de los métodos descritos en la presente. El aceite separado puede procesarse entonces para obtener biodiésel utilizando tecnologías de transesterif icación estándar, tales como el conocido proceso de Connemann (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5.354.878, cuyo texto en su totalidad se incorpora a la presente a modo de referencia).
Por ejemplo, las algas pueden cosecharse, separarse del medio líquido, someterse a disrupción y separarse el contenido de aceite (supra). El aceite producido a partir de las algas será rico en triglicéridos. Dichos aceites pueden convertirse en biodiésel utilizando métodos conocidos, tales como el proceso de Connemann (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5.354.878, incorporada a la presente a modo de referencia), que es un método bien establecido para la producción de biodiésel a partir de fuentes vegetales, tales como aceite de colza. Los procesos de transesterif icación estándar implican una reacción de transesterificación catalizada alcalina entre el triglicérido y un alcohol, típicamente metanol. Los ácidos grasos del triglicérido se transfieren a metanol, produciendo ésteres de alquilo (biodiésel) y liberando glicerol. El glícerol se retira y puede usarse con otros fines.
A diferencia de los modelos de reacción por lotes (por ejemplo, J. Am. Oil Soc. 61 : 343, 1984), el proceso de Connemann utiliza un flujo continuo de la mezcla de reacción a través de columnas de reacción, en las que la velocidad de flujo es menor que la velocidad de descenso de la glicerina. Esto resulta en la separación continua del biodiésel. La mezcla de reacción puede procesarse a través de columnas de reactor adicionales para completar el proceso de transesterificación. El metanol, la glicerina, los ácidos grasos libres y el catalizador residuales pueden retirarse mediante extracción acuosa.
Sin embargo, el experto en la técnica se dará cuenta de que puede utilizarse cualquier método conocido en la técnica para producir biodiésel a partir de aceites que contienen triglicéridos, por ejemplo, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.695.411. 5.338.471. 5.730.029, 6.538.146 y 6.960.672, cada una incorporada a la presente a modo de referencia. También pueden utilizarse métodos alternativos que no implican transesterificación. Por ejemplo, mediante pirólisis, gasificación o licuefacción termoquímica (ver, por ejemplo, Dote, Fuel 73: 12, 1994; Ginzburg, Renewable Energy 3: 249-252, 1993; Benemann and Oswald, DOE/PC/93204-T5, 1996).
Si bien existen miles de especies de algas naturales conocidas, muchas (si no la mayoría) pueden utilizarse para la producción de aceites/I ipidos/biodiésel y la formación de otros productos. Estas algas pueden metabolizarse en condiciones heterótrof as, fotoheterótrof as o autótrofas. Algas particularmente preferidas que pueden utilizarse para la presente invención incluyen Chiorophytes o Bacilliarophytes (diatomeas).
En ciertas realizaciones, las algas pueden modificarse/crearse por ingeniería para aumentar aún más la producción de materia prima de biodiésel por unidad de acre. La modificación genética de algas para producción de productos específicos es relativamente simple si se utilizan técnicas bien conocidas en la técnica. Sin embargo, los métodos económicos para cultivar, cosechar y extraer productos divulgados en la presente pueden utilizarse con algas genéticamente modificadas (por ejemplo, transgénicas, no transgénicas). El experto se dará cuenta de que diferentes cepas de algas exhibirán diferente crecimiento y producti idad de aceite y que, en distintas condiciones, el sistema puede contener una sola cepa de algas o una mezcla de cepas con distintas propiedades o cepas de algas más bacterias simbióticas. Las especies de algas pueden optimizarse para la ubicación geográfica, sensibilidad a la temperatura, intensidad de la luz, sensibilidad al pH, salinidad, calidad del agua, disponibilidad de nutrientes, diferencias estacionales de temperatura o luz, los productos finales deseados que han de obtenerse de las algas y otros varios factores.
En ciertas realizaciones, las algas utilizadas para producir aceite/biodiésel pueden desarrollarse genéticamente (por ejemplo, transgénicas o generadas por mutagénesis dirigida a sitios, etc.) para que contengan una o más secuencias de ácidos nucleicos aisladas que mejoren la producción de aceite o para que proporcionen otras características de uso para el cultivo, crecimiento o cosecha o uso de las algas. Los métodos para transformar establemente especies de algas y composiciones que comprenden ácidos nucleicos aislados utilizados son bien conocidos en la técnica y pueden utilizarse cualquiera de dichos métodos y composiciones para poner en práctica la presente invención. Ejemplos de métodos de transformación que pueden utilizarse incluyen bombardeo de microproyectiles, electroporación, fusión de protoplastos, transformación mediada por PEG, filamentos de carburo de silicio recubiertos con ADN o el uso de transformación mediada por virus (ver, por ejemplo, Sanford et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:483-509; Dunahay et al., 1997, Meth. Molec. Biol. 62:503-9; Patentes de los Estados Unidos No. 5.270.175 y 5.661.017, incorporadas a la presente a modo de referencia) .
Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5.661.017 revela métodos para la transformación de algas de algas que contienen clorofila C, tales como Bacillariophyceae, Chrysophyceae, Phaeophyceae, Xanthophyceae, Raphidophyceae, Prymnesiophyceae, Cryptophyceae, C ye I ote 11 a , Navícula, Cylindrotheca , Phaeodactylum, Amphora, Chaetoceros, Nitzschia o Thalasiosira. También se describen composiciones que comprenden ácidos nucleicos útiles, tales como acetil-CoA carboxilasa.
En distintas realizaciones puede incorporarse un marcador seleccionable en un ácido nucleico o vector aislado seleccionado para algas transformadas. Marcadores seleccionables útiles pueden incluir neomicina fosfotransf erasa , aminoglucósido fosfotransferasa , aminoglucósido acetiltransferasa , cloramfenicol acetil transferasa, higromicina B fosfotransferasa, proteína de unión a bleomícina, fosfinotricina acetiltransferasa, bromoxinil nitrílasa, 5-enolpiruvílshikimata-3-fosfato sintasa resistente a glifosato, proteína ribosomal S14 resistente a criptopleurina, proteína ribosomal S14 resistente a emetina, acetolactato sintasa resistente a sulfonilurea, acetolactato sintasa resistente a imidazolinona, ARN ribosomal 16S resistente a estreptomicina, ARN ribosomal 16S resistente a espectinomicina, ARN ribosomal 23S resistente a eritromicina o tubulina resistente a metil bencímidazol. Se conocen secuencias de ácidos nucleicos reguladoras para mejorar la expresión de un transgén, tales como secuencia de control reguladora de 5' no traducido de acetil-CoA carboxilasa de C. cryptica, una secuencia de control reguladora de 3' no traducido de acetil-CoA carboxilasa de C. cryptica y combinaciones de las mismas.
Ejemplos Habiéndose descrito la invención de forma general, se proporcionan los siguientes ejemplos específicos meramente a modo de ¡lustrar ciertos aspectos de la invención. No debe considerarse que estos ejemplos son limitantes en ningún sentido, aunque algunas características descritas en los Ejemplos pueden ser aplicables, en general, a la invención descrita.
Ejemplo 1 Comparación del crecimiento de Chlorella vulgaris en un reactor heterótrofo en etapa 1 y un reactor autótrofo en etapa 1 en condiciones de crecimiento estáticas y con agitación Se esterilizaron biorreactores de vidrio (por triplicado) y se llenaron con un medio de crecimiento autótrofo estéril (medio de Bristol) o con un medio de crecimiento heterótrofo estéril (medio de Bristol modificado con 1 g/L de extractos de levadura y 5 g/L de glucosa). Luego se dejaron tres biorreactores sin agitar y tres se agitaron suavemente para facilitar el mezclado. Todos los cultivos 2 se iluminaron (27-30 uEinsteins/cm ) en un ciclo de luz/oscuridad de 16/8. A los 7 días, las células se cosecharon y se determinaron los pesos en seco, la cantidad de células por mL y el total de clorofila.
A continuación se enumera un medio de Bristol de ejemplo: No. Componente Cantidad Sol. Concentración concentrada final (Fisher BP360- 10 g/400mL 1 10 mL/L 2,94 mM H2Od CaCI2-2H20 2 10 mL/L 1 g/400mL H2Od 0.17 mM (Sigma C-3881) gS04-7H20 3 (Sigma 10 m L/L 3 g/400ml_ H2Od 0.3 m M 230391 ) K2HP04 (Sigma 4 10 m L/L 3 g/400ml_ H2Od 0 .43 mM P 3786) KH2P04 (Sigma 5 10 m L/L 7 g/400mL H2Od 1 .29 mM P 0662) NaCI (Fisher 6 10 m L/L 1 g/400ml_ H2Od 0 .43 mM S271-500) Para obtener 1 L de medio de Bristol puede utilizarse el siguiente procedimiento: 1. A aproximadamente 900. mL de H2Od agregar cada uno de los componentes anteriores en el orden especificado mientras se revuelve constantemente. 2. Llevar el volumen total a 1 L con H2Od (*para medio de agar al 1.5% agregar 15 g de agar en el matraz; no mezclar) 3. Cubrir y esterilizar el medio en autoclave. 4. Almacenar a temperatura de refrigerador.
Las condiciones de luz utilizadas aquí pueden aplicarse, en general, al crecimiento f otoheterótrofo de la presente invención.
En la tabla que figura a continuación es evidente que el crecimiento heterótrofo condujo a aumentos significativos y abruptos (al menos 1 orden de magnitud) de biomasa, cantidad de células y clorofila. Este crecimiento mejora la economía de la producción de biomasa de algas para su uso adicional en la producción de productos de algas.
Ejemplo 2 Comparación del crecimiento de Ankistrodesmus braunii en un reactor heterotrofo en etapa 1 y un reactor autótrofo en etapa 1 en condiciones de crecimiento estáticas y con agitación Se esterilizaron biorreactores de vidrio (por triplicado) y se llenaron con un medio de crecimiento autótrofo estéril (medio de Bristol) o con un medio de crecimiento heterotrofo estéril (medio de Bristol modificado con 1 g/L de extractos de levadura y 5 g/L de glucosa). Los biorreactores se inocularon con Ankistrodesmus braunii y se incubaron de la siguiente manera. Luego se dejaron tres biorreactores sin agitar y tres se agitaron suavemente para facilitar el mezclado. Todos los cultivos se iluminaron (27-30 2 uEinsteins/cm ) en un ciclo de luz/oscuridad de 16/8. A los 7 días, las células se cosecharon y se determinaron los pesos en seco, la cantidad de células por mL y el total de clorofila.
Las condiciones de luz utilizadas aquí pueden aplicarse, en general, al crecimiento fotoheterótrofo de la presente invención.
En la tabla que figura a continuación es evidente que el crecimiento heterótrofo condujo a aumentos significativos y abruptos (al menos 1 orden de magnitud) de biomasa, cantidad de células y clorofila. Este crecimiento mejora la economía de la producción de biomasa de algas para su uso adicional en la producción de productos de algas.
Ejemplo 3 Comparación del crecimiento de Chlorella protothecoides con o sin cierta combinación de factores de crecimiento La fórmula concentrada utilizada fue 0.25 g de kinetina, 0.25 g de 6-BA, 0 5 g de NAA, 0.5 g de GA3, 1.0 g de Vitamina B1. 1.0 L de H2Od. Se agregaron 19.5 nL a 250 mL de HGM (ver la tabla a continuación) para crear la fórmula 2. Los matraces se inocularon con Chlorella protothecoides para proporcionar una densidad óptica de 0.04 unidades de absorbancia. Los matraces se colocaron en un agitador a 125 rpm en condiciones heterótrofas (oscuridad). La temperatura se mantuvo a aproximadamente 23°C. Las densidades ópticas se midieron diariamente. Los resultados se resumen en la figura 1.
Tabla 1. Medio de crecimiento heterótrofo (HGM) Sol. Componente Cantidad Conc. de Concentración concentrada solución final concentrada (400 mL1) 1 NaN03 30 mi 10g 8,82 mM 2 CaCI2.(2H20) 30 mi 19 0.17 mM 3 MgS04.(7H20) 30 mi . 3g 0.30 mM 4 K2HP04 30 mi 3g 0.43 mM ¦5 KH2P04 30 mi 7g 1.29 mM 6 NaCI 30 mi g 0.43 mM 7 Metal traza (sol) 18 mi Ver nota 1 8 Extracto de 4g ND 0.4 % levadura (Bacto) 9 20 g ND 2,0 % Nota 1: NaEDTA.2H20, 075 g/L; FeCI3.6H20, 0.097 g/L; MgCl2.4H20, 0.041 g/L; ácido bórico, 0.011 g/L; ZnCI2, 0.005 g/L; CoCI2.6H20, 0.002 g/L; CuS04. 0.002 g/L; Na2Mo04.H20, 0.002 g/L.
Nota 2: el HGM es un medio de Bristol modificado con mayor concentración de NaN03 (de 2,94 mM de concentración final a 8,82 mM de concentración final) y componentes adicionales, incluidos 0.4% de extracto de levadura (Bacto), 2,0% de glucosa y una mezcla de metales traza (ver Nota 1). La glucosa está ausente en el medio de Bristol tradicional porque las algas que crecen en condiciones fotótrofas utilizan fotosíntesis para producir compuestos orgánicos tales como hidratos de carbono.
Nota 3: El medio se colocó en matraces Nephelo (250 mi) y se esterilizó a 121°C durante 20 minutos.
Se vio que la fórmula 1 generó biomasa a una velocidad mayor que el medio de crecimiento heterótrofo control. Las velocidades de crecimiento específicas, µ, fueron 1.4 y 1.8 para el control y la fórmula 1. respectivamente.
Ejemplo 4 Comparación del crecimiento de Chlorella protothecoides con o sin cierta combinación de factores de crecimiento La fórmula concentrada utilizada fue 0.25 g de kinetina, 0.25 g de 6-BA, 0.5 g de NAA, 0.5 g de GA3, 1.0 g de Vitamina B1. 1.0 L de H2Od. Se agregaron 4.7 nL a 250 mL de HGM (ver la tabla anterior) para crear la fórmula 2. Los matraces se inocularon con Chlorella protothecoides para proporcionar una densidad óptica de 0.04 unidades de absorbancia. Los matraces se colocaron en un agitador a 125 rpm en condiciones heterótrofas (oscuridad). La temperatura se mantuvo a aproximadamente 23°C. Las densidades ópticas se midieron diariamente. Los resultados se resumen en la figura 2.
Se vio que la fórmula 2 generó biomasa a una velocidad mayor que el medio de crecimiento heterótrofo control. Las velocidades de crecimiento específicas, µ, fueron 1.4 y 1.6 para el control y la fórmula 2, respectivamente.
Ejemplo 5 Comparación del crecimiento de Chlorella protothecoides con o sin cierta combinación de factores de crecimiento La fórmula concentrada utilizada fue 0.25 g de kinetina, 0.25 g de 6BA, 0.25 g de NAA, 0.25 g de IAA, 0.5 g de GA3, 1.0 g de Vitamina B1. 1.0 L de H2Od. Se agregaron 19.5 nL a 250 mL de HGM (ver la tabla anterior) para crear la fórmula 3. Los matraces se inocularon con Chlorella protothecoides para proporcionar una densidad óptica de 0.04 unidades de absorbancia. Los matraces se colocaron en un agitador a 125 rpm en condiciones heterótrofas (oscuridad). La temperatura se mantuvo a aproximadamente 23°C.
Las densidades ópticas se midieron diariamente. Los resultados se resumen en la figura 3.
Se vio que la fórmula 3 generó biomasa a una velocidad mayor que el medio de crecimiento heterótrofo control. Las velocidades de crecimiento especificas, µ, fueron 1.4 y 1.8 para el control y la fórmula 3, respectivamente.
Eiemplo 6 Comparación del crecimiento de Chlorella protothecoides con o sin cierta combinación de factores de crecimiento La fórmula concentrada utilizada fue 0.25 g de kinetina, 0.25 g de 6BA, 0.25 g de NAA, 0.25 g de IAA, 0.5 g de GA3, 1.0 g de Vitamina B1. 1.0 L de H2Od. Se agregaron 4.7 nL a 250 mL de HGM (ver la tabla anterior) para crear la fórmula 4. Los matraces se inocularon con Chlorella protothecoides para proporcionar una densidad óptica de 0.04 unidades de absorbancia. Los matraces se colocaron en un agitador a 125 rpm en condiciones heterotrofas (oscuridad). La temperatura se mantuvo a aproximadamente 23°C.
Las densidades ópticas se midieron diariamente. Los resultados se resumen en la figura 4.
Se vio que la fórmula 4 generó biomasa a una velocidad mayor que el medio de crecimiento heterótrofo control. Las velocidades de crecimiento específicas, µ, fueron 1.4 y 1.8 para el control y la fórmula 4. respectivamente.
Las concentraciones de regulador utilizadas anteriormente se resumen en la tabla 2 a continuación.
Tabla 2. Resumen de crecimiento de algas estimulado con regulador del crecimiento vegetal Ejemplo 7 Crecimiento f otoheterótrofo y heterótrofo Se evaluó la influencia de la exposición a la luz durante el crecimiento de Scenedesmus obliquus y Chiorella protothecoides. Las velocidades de crecimiento de ambas algas fueron mayores en condiciones de crecimiento fotoheterótrofas. La velocidad de crecimiento de Scenedesmus obliquus fue aproximadamente 86,7% mayor que en el crecimiento fotoheterótrofo. Mientras tanto, la velocidad de crecimiento de Chiorella protothecoides aumentó un 39,07% cuando el crecimiento se llevó a cabo en condiciones de crecimiento fotoheterótrofo. Los resultados de estos experimentos se resumen en las Tablas 3-6 a continuación.
Tabla 3. Efecto de diferentes concentraciones de hormonas en la velocidad de crecimiento de Scenedesmus obliquus cultivada en condiciones f oto heterótrofas durante 48 horas Tabla 4. Efecto de diferentes concentraciones de hormonas en la velocidad de crecimiento de Scenedesmus obliquus cultivada en condiciones heterótrofas durante 48 horas Hormonas 100 ng 10 ng 1 ng 0.1 ng 0.01 ng Acido indol-3-acético 0.41±0.053 0.47±0.020 0.42±0.081 0.36±0.127 0.23±0.020 Acido 1-naftalenoacético 0.39±0.053 0.28±0.099 0.33±0.020 0.28±0.011 0.26±0.042 2,4-Diclorofenoxiacé-tico 0.23±0.040 0.24±0.081 0.31±0.020 0.23±0.040 0.28±0.030 Kinetina 0.28±0.076 0.31±0.028 0.36±0.042 0.26±0.076 0.28±0.061 6-Bencilaminopurina 0.33+0.104 0.36±0.092 0.39±0.092 0.32±0.061 0.28±0.081 Acido giberélico 0.42+0.064 0.36+0.050 0.43±0.020 0.50±0.046 0.44±0.083 Control 0.35±0.023 Tabla 5. Efecto de diferentes concentraciones de hormonas en la velocidad de crecimiento de Chlorella protothecoides cultivada en condiciones fotoheterotrofas durante 48 horas Tabla 6. Efecto de diferentes concentraciones de hormonas en la velocidad de crecimiento de Chlorella protothecoides cultivada en condiciones heterótrofas durante 48 horas Hormonas 100 ng 10 ng 1 ng 0.1 ng 0.01 ng Acido indol-3- 1.60±0.076 1.60±0.09S 1.49±0.122 1.61±0.072 1.62±0.133 acético Acido 1- 1.62±0.064 1.57±0.02£ 1.62±0.136 1.54+0.081 1.66±0.140 naftalenoacético 2,4- Diclorofenoxiacé- 1.50±0.081 1.31±0.087 1.43±0.069 1.53±0.069 1.40±0.061 tico Kinetina 1.58±0.061 1.60±0.07C 1.44±0.110 1.50+0.050 1.60±0.050 6- 1.46±0.150 1.52±0.117 1.50+0.012 1.54±0.081 1.48±0.121 Bencilaminopurina Acido giberéiico 1.46±0.050 1.52±0.09S 1.46±0.090 1.52±0.151 1.52+0.201 Control 1.54±0.080

Claims (46)

REIVINDICACIONES
1. Un método para cultivar algas para producir un producto de algas que comprende: (1) cultivar las algas en una primera condición de crecimiento heterótrofa o fotoheterótrofa para aumentar la velocidad de la división celular de las algas y el número de células de algas; (2) cultivar las algas en una segunda condición de crecimiento para producir el producto de algas; en donde el número de células de algas no aumenta considerablemente en la segunda condición de crecimiento.
2. El método de la reivindicación 1 , en donde la primera condición de crecimiento comprende un medio con niveles no restrictivos de nutrientes y elementos traza necesarios para un aumento óptimo del número de células.
3. El método de la reivindicación 2, en donde dichos nutrientes incluyen una o más fuentes de C, N, P, S y/u O.
4. El método de la reivindicación 2, en donde dicho medio comprende una separación líquida de un biodigerido anaeróbico, opcionalmente complementada con nutrientes adicionales.
5. El método de la reivindicación 4, en donde dicho biodigerido anaeróbico resulta de la digestión anaeróbica de despojos animales, estiércol de ganado, desechos de procesamiento de alimentos, aguas residuales municipales, residuos finos, granos de destilado u otros materiales orgánicos.
6. El método de la reivindicación 2, en donde la concentración de dichos nutrientes no es tóxica para la división y/o el crecimiento celular.
7. El método de la reivindicación 1, en donde la primera condición de cultivo comprende una temperatura óptima para la división celular en el rango de aproximadamente 0-40°C para algas no termofilas y aproximadamente 40-95°C o aproximadamente 60-80°C para algas termofilas.
8. El método de la reivindicación 1, en donde la primera condición de crecimiento comprende una o más hormonas de crecimiento o miméticos de las mismas.
9. El método de la reivindicación 8, en donde dichas hormonas de crecimiento incluyen al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o más hormonas de crecimiento seleccionadas de: una auxina, una citoquinina, una giberelina y/o mezclas de las mismas.
10. El método de la reivindicación 9, en donde la auxina comprende ácido indolacético (IAA) y/o ácido 1 -naftalenoacético (NAA).
11. El método de la reivindicación 9, en donde la giberelina comprende GA3.
12. El método de la reivindicación 9, en donde la citoquinina es una citoquinina tipo adenina o una citoquinina tipo fenilurea.
13. El método de la reivindicación 12, en donde la citoquinina tipo adenina o mimético comprende kinetina, zeatina y/o 6-benc¡laminopur¡na y la citoquinina tipo fenilurea comprende difenilurea y/o tidiazurón (TDZ).
14. El método de la reivindicación 8, en donde la primera condición de crecimiento comprende también vitamina B1 o análogo/mim éticos de la misma.
15. El método de la reivindicación 9, en donde la relación (p/p) entre auxina y citoquinina es aproximadamente 1:2 a 2:1 o aproximadamente 1:1.
16. El método de la reivindicación 9, en donde la relación (p/p) entre auxina y giberelina es aproximadamente 1:2 a 2:1 o aproximadamente 1:1.
17. El método de la reivindicación 8, en donde el mimético es un compuesto fenoxiacético.
18. El método de la reivindicación 1, en donde la segunda condición de crecimiento comprende un medio con nitrógeno limitado (por ejemplo, aproximadamente 1.5-15 mgN/L) o un medio con un nivel de nitrógeno optimizado para la síntesis de productos de algas.
19. El método de la reivindicación 1, en donde la segunda condición de crecimiento comprende un factor estimulador de aceite.
20. El método de la reivindicación 19, en donde el factor estimulador de aceite comprende un humato, tal como ácido fúlvico o ácido húmico.
21. El método de la reivindicación 1, en donde las algas se cultivan en un primer biorreactor en la primera condición de crecimiento y en un segundo biorreactor en la segunda condición de crecimiento.
22. El método de la reivindicación 21, en donde el primer biorreactor se adapta para un aumento óptimo del número de células.
23. El método de la reivindicación 21, en donde el primer biorreactor es pasible de esterilización.
24. El método de la reivindicación 21, en donde el segundo biorreactor se adapta para una producción óptima del producto de algas.
25. El método de la reivindicación 1, en donde las algas se cambian de la primera condición de crecimiento a la segunda condición de crecimiento antes de que se alcance la fase de crecimiento estacionario.
26. El método de la reivindicación 25, en donde las algas se cambian de la primera condición de crecimiento a la segunda condición de crecimiento cuando se agotan considerablemente uno o más nutrientes en la primera condición de crecimiento.
27. El método de la reivindicación 25, en donde las algas se cambian de la primera condición de crecimiento a la segunda condición de crecimiento cosechando las células de algas en la primera condición de crecimiento' para cultivar en la segunda condición de crecimiento.
28. El método de la reivindicación 25, en donde las algas se cambian de la primera condición de crecimiento a la segunda condición de crecimiento cuando la densidad celular del cultivo de algas alcanza aproximadamente 5 ? 107 células/mL.
29. El método de la reivindicación 25, en donde las algas se cambian de la primera condición de crecimiento a la segunda condición de crecimiento cuando la concentración de proteínas del cultivo de algas alcanza al menos 0.8 g/L o cuando la concentración de pigmento del cultivo de algas alcanza al menos aproximadamente 0.005 mg/L para las clorofilas a y b o al menos aproximadamente 0.02 mg/L para la clorofila total.
30. El método de la reivindicación 25, en donde las algas se cambian de la primera condición de crecimiento a la segunda condición de crecimiento diluyendo continuamente el cultivo de algas que crece en la primera condición de crecimiento en un primer biorreactor y recolectando el cultivo de algas desplazado para cultivarlo en un segundo biorreactor en la segunda condición de crecimiento.
31. El método de la reivindicación 30, en donde la velocidad de aumento del número de células de algas en la primera condición de crecimiento es básicamente igual a la velocidad de dilución, de forma tal que el número de células de algas en el primer biorreactor permanece básicamente constante.
32. El método de la reivindicación 1 , en donde el número de células de algas aumenta al menos aproximadamente 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 500 veces, 1000 I 74 veces, 10" veces, 105 veces, 106 veces, 107 veces, 108 veces, 109 veces, 1010 veces o más en la primera condición de reacción.
33. El método de la reivindicación 1, en donde la velocidad de división de las células de algas aumenta al menos aproximadamente 20%, 50%, 75%, 100%, 200%, 500%, 1000% o más.
34. El método de la reivindicación 1, en donde el tiempo de duplicado de la población para el cultivo de algas en la primera condición de crecimiento es de aproximadamente 0.05-2 días.
35. El método de la reivindicación 1, en donde la acumulación de dicho producto de algas en la primera condición de crecimiento es insignificante o es subóptima.
36. El método de la reivindicación 1, en donde dicho producto de algas es menos de aproximadamente 65%, 30%, 20% o incluso menos de 10% (p/p) de biomasa de algas en la primera condición de crecimiento.
37. El método de la reivindicación 1, en donde el número de células de algas aumenta no más de un 1.000%, 300%, 200%, 100% o 50% en la segunda condición de crecimiento.
38. El método de la reivindicación 1, en donde la biomasa de algas aumenta considerablemente en la segunda condición de crecimiento.
39. El método de la reivindicación 38, en donde la biomasa de algas aumenta en gran medida como resultado de la acumulación de dicho producto de algas.
40. El método de la reivindicación 1, en donde la biomasa o el bioproducto de algas aumenta al menos aproximadamente 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 1500 veces o 2000 veces en la segunda condición de crecimiento.
41. El método de la reivindicación 1, en donde el producto de algas es aceite o lípido.
42. El método de la reivindicación 1, en donde la segunda condición de crecimiento en la que las algas se están metabolizando es una condición heterótrof a , fotoheterótrofa o autótrofa.
43. El método de la reivindicación 1 , en donde las algas son Chiorophytes o Bacilliarophytes (diatomeas).
44. Un medio de cultivo de algas en condiciones heterotróficas que comprende los componentes enumerados en la tabla 1, en donde la concentración final para cada componente enumerado en el medio es de aproximadamente 50% (mayor o menor), 40%, 30%, 20%, 10% o 5% de la concentración final enumerada en la tabla 1.
45. El medio de la reivindicación 44. que es un medio de crecimiento heterotróf ico (HGM) de la tabla 1.
46. El medio de la reivindicación 44 que, cuando se compara con el medio HGM de la tabla 1, soporta básicamente la misma velocidad de crecimiento para Chiorella protothecoides en básicamente las mismas condiciones.
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