CN102321094B - 一种新的钩吻生物碱类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的钩吻生物碱类化合物及制备方法和应用，本发明以钩吻总生物碱粗提物为原料，以高速逆流色谱仪为分离设备，pH区带精制逆流色谱法从钩吻中分离目的化合物；本法便捷、制备量大、样品损耗少、可控性强、适合产业化生产。经高分辨质谱、紫外光谱、红外光谱、¹H、¹³C-NMR光谱、¹H-¹HCOSY谱、HSQC谱和HMBC谱确定新的钩吻生物碱类化合物为下式（I）的结构。药理试验表明，本发明化合物具有剂量依赖性强效镇痛作用，治疗指数远高于钩吻总生物碱，耐受性、成瘾性且副作用小，可用于制备强效低毒的新型治疗疼痛的药物或先导化合物，产业化前景明确。

（I）。

Description

一种新的钩吻生物碱类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种从植物钩吻中分离得到的新的钩吻生物碱类化合物。本发明也涉及该化合物的制备方法。本发明还涉及该化合物在制备药物方面的用途，特别是在制备镇痛药领域的应用。

背景技术

疼痛困扰着数以千万计的患者，据不完全统计，目前世界疼痛的发病率大约为35%~45%，老年人的发病率较高，约为75%~90%。疼痛严重影响患者的工作与生活。药物镇痛是目前临床上治疗病人疼痛的主要手段之一，其中吗啡等阿片类镇痛药和阿司匹林等解热镇痛抗炎药最为常用，年消耗量巨大（镇痛药吗啡近20年来产量增加10倍，现全球年产量超过20000公斤；全球解热镇痛药年产量已达20余万吨，年销售额逾百亿美元）。但是，阿片类镇痛药易产生耐受性、成瘾性、呼吸抑制等不良反应；解热镇痛抗炎药镇痛效力弱、胃肠道不良反应严重，临床应用受限。因此, 寻找高效低毒的新型治疗疼痛药物是当前研发热点，其重要研究途径之一是从动植物取材研发新药。

钩吻（Gelsemium elegans Benth.）为马钱科胡蔓藤属植物，药用历史悠久，如抗肿瘤、镇痛和消炎等[张兰兰，林敬明，吴忠. 钩吻化学成分与药理研究进展. 中药材，2003，26（6）：451-453]。经研究，钩吻植物的主要有效成分为钩吻生物碱。临床和基础研究表明，钩吻总生物碱具有显著的镇痛作用，效能仅次于吗啡，而高于其他生物碱，且其无成瘾性、耐受性，无明显副作用[谭建权，邱成之，郑林忠. 钩吻碱的镇痛作用和无依赖性. 中药药理与临床，1988，4（1）：24-28]；值得关注的是，其作用机制可能不同于阿片类或阿司匹林类镇痛药，提示钩吻生物碱具有开发为新型镇痛药的潜在价值。但钩吻总生物碱治疗量与中毒量较接近，如周名璐等[周名璐，黄聪，杨小平. 钩吻总碱的镇痛、镇静及安全性研究. 中成药.1998，20(1): 35-36]实验数据显示，钩吻总生物碱肌注对小鼠醋酸所致疼痛镇痛作用的半数有效量（ED₅₀）为1.1 mg/kg，而钩吻总生物碱肌注对小鼠的半数致死量（LD₅₀）为3.6 mg/kg，可算得钩吻总生物碱的治疗指数（TI, TI= LD₅₀/ ED₅₀）为3.3，治疗窗窄，因而钩吻总生物碱临床应用受到限制，然而钩吻生物碱单体毒性大小不一，药理活性也不尽相同，因此人们将关注点转向了钩吻生物碱单体。

到目前为止从钩吻中分得的生物碱超过50种，如钩吻素子、甲、己等以及胡蔓藤碱甲、乙、丙等，而且新的单体仍不断被发现 [Zhao QC, Hua W, Zhang L, et al. Two new alkaloids from Gelsemium elegans. J Asian Nat Prod Res., 2010, 12 (4): 273-277；Yamada Y, Kitajima M, Kogure N, et al. Seven new monoterpenoid indole alkaloids from Gelsemium elegans, Chem. Asian J., 2011, 6(1): 166-173]。但是，本发明所涉及的具有下式结构的化合物，迄今为止，尚未发现有专利或文献报道本发明公开了的化合物，一种新的钩吻生物碱单体及其制备方法，以及上述化合物在制备治疗疼痛药物中的应用。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种新的钩吻生物碱类化合物。

本发明的另一目的是提供一种从钩吻总生物碱粗提物中提取分离上述化合物的制备方法。

本发明的又一目的是提供上述化合物在制备治疗疼痛药物中的应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明从钩吻植物中首次提取分离得到一种新的钩吻生物碱单体，淡黄色晶体，高分辨质谱测定分子量为342.1655。UV光谱显示最大吸收峰波长（溶剂乙醇）位于215 nm、234 nm， IR光谱显示1713.25 cm^-1、1465.41 cm^-1、1617.14 cm^-1、756.41 cm^-1、2850-2960 cm^-1、1300-1000 cm^-1具有吸收。¹H、¹³C-NMR光谱数据见表1。结合¹H-¹HCOSY谱、HSQC谱以及HMBC谱最终确定新的钩吻生物碱类化合物结构为下式（I），分子式为C₁₉H₂₂N₂O₄；

                         （I） 。                       

表1  式(I)化合物的¹H-NMR、¹³C-NMR数据（600MHz）

编号	δH	δC
			N-OCH3	3.99, s	62.79
2		171.45
			3	3.78, s	78.88
5α	2.83, dd (J=16.4, 4.0 Hz)	35.39
			5β	2.27,dd (J=16.4, 2.5 Hz)
6	4.76, m	66.31
			7		54.10
8		130.15
			9	7.62, d (J=7.6 Hz)	124.25
10	7.20, td (J=7.6, 1.0 Hz)	123.92
			11	7.41, td (J=7.8, 1.0 Hz)	128.77
12	7.06, d (J=7.7 Hz)	107.12
			13		137.76
14α	3.49, d (J=8.3 Hz)	51.91
			14β
15	3.12, m	36.61
			16	4.45, m	65.84
17	4.45, m	59.03
			18	1.50, t (J=7.1 Hz）	7.26
19α	3.20, m	26.15
			19β	3.12, m
20		198.73

本发明所述的钩吻生物碱类化合物的制备方法，具体地说涉及pH区带精制逆流色谱法从钩吻中分离制备式(I)化合物的方法，包括如下步骤：

以钩吻总生物碱为原料，以高速逆流色谱仪为分离设备，以脂肪醚︰乙腈︰水为溶剂系统，配比为1~2︰0~2︰1~3, V/V，其中，乙腈可以不使用，即为0。上相加1-30 mmol/l碱调pH至8~10作为固定相，下相加1-30 mmol/l酸调pH至1~3作为流动相；固定相泵入高速逆流色谱仪至泵满，钩吻总生物碱用固定相和流动相的混合液溶解后，用盐酸调pH至6进样；泵入流动相，根据收集液pH值、检测器图谱结合高效液相色谱或薄层色谱，收集目的组分，经减压蒸干后重结晶获得高纯度的式(I)化合物。

所述的原料钩吻总生物碱，系参考经典的钩吻生物碱提取方法获得（参见陈忠良. 钩吻生物碱的提取与分离，中药通报，1987，12（5）：41；徐坚，梁崇真. 钩吻总生物碱提取方法的比较，药学通报，1988，23（6）：341-342；陈竞峰，袁慧. 钩吻总碱的提取、分离、鉴定及一般毒性，湖南农业大学学报（自然科学版），2003，29（5）：422-425）。

所述的分离设备高速逆流色谱仪，根据所需目标分离量的不同，可选择分析型、半制备型或制备型高速逆流色谱仪。

所述的溶剂体系优选甲基叔丁基醚︰乙腈︰水，优选配比为3︰1.5︰4, V/V；碱优选为三乙胺，所调的pH值优选9；酸优选为盐酸，所调的pH优选2。

作为唯一活性成分的式(I)化合物在制备治疗疼痛药物中的应用。药理实验显示式(I)化合物具有剂量依赖性强效镇痛作用，治疗指数远远高于钩吻总生物碱，耐受性、成瘾性且副作用小，表明式(I)化合物镇痛作用具有强效低毒的特点，其作用机制可能不同于临床常用的阿片类或阿司匹林类镇痛药。

本发明的优点是：

1．本发明公开的式（I）化合物骨架独特，为新的钩吻生物碱单体。

2. 本发明公开的式（I）化合物的制备方法与现有技术（硅胶柱层析、高速逆流色谱）相比，存在不可比拟的优点：较之硅胶柱层析，本法得率高，分离周期也明显缩短；较之高速逆流色谱，本法制备量比前者大5-10倍，经重结晶后纯度可达98.3%以上。本制备方法为式（I）化合物产业化制备奠定基础。

3．本发明式（I）化合物的制备方法是源于天然植物钩吻的提纯，钩吻植物在我国盛产，本制备方法推动相关药材产业的发展。

3. 本发明公开的式（I）化合物具有强效镇痛作用，治疗指数37，远远优于现有技术（钩吻总生物碱镇痛作用的治疗指数仅3.3），显著克服现有技术钩吻总生物碱临床应用受限制的缺陷，具有制备治疗疼痛药物或先导化合物的应用。

4. 本发明公开式（I）化合物在制备治疗疼痛药物中的应用，所述应用具有潜在的重大经济效应。如背景技术所述目前全球镇痛药市场巨大，但临床常用药各自有其缺陷，不是理想镇痛药物。本发明所述的式（I）化合物，是一种钩吻生物碱单体，较之钩吻总生物碱具有强效低毒的镇痛作用，无上述两类临床常用镇痛药的缺点，按照国家创新药物审批办法开发研制，有望成为镇痛疗效强、无耐受性与成瘾性且副作用小、有望成为我国独立自主知识产权、国家1类新型镇痛药，产业化前景明确。

附图说明

图1为本发明式（I）化合物的ESI-MS光谱图。

图2为本发明式（I）化合物的UV光谱图。

图3为本发明式（I）化合物的IR光谱图。

图4为本发明式（I）化合物的^IH-NMR光谱图。

图5为本发明式（I）化合物的¹³C-NMR光谱图。

图6为本发明式（I）化合物的¹H-¹HCOSY光谱图。

图7为本发明式（I）化合物的HSQC光谱图。

图8为本发明式（I）化合物的HMBC光谱图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，但不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1：式（I）化合物的制备

1、样品：钩吻总生物碱，系参考经典的钩吻生物碱提取方法[陈忠良. 钩吻生物碱的提取与分离，中药通报，1987，12（5）：41；徐坚，梁崇真. 钩吻总生物碱提取方法的比较，药学通报，1988，23（6）：341-342；陈竞峰，袁慧. 钩吻总碱的提取、分离、鉴定及一般毒性，湖南农业大学学报（自然科学版），2003，29（5）：422-425]从榕产钩吻根茎提取获得，浸膏真空干燥得棕红色粉末状钩吻总生物碱粗提物。

2、仪器：TBE-300A高速逆流色谱仪，上海同田生物技术有限公司。

3、方法：

3.1配制溶剂体系，甲基叔丁基醚︰乙腈︰水（3︰1.5︰4, V/V）共1400 ml，充分混匀后静置过夜分层。第二天分离分层的两相溶液，上相加三乙胺调pH至9为固定相，下相加盐酸调pH至2为流动相，超声半小时。

3.2 制备样品溶液：取钩吻总生物碱粗提物1.5 g，溶于体积比为1：1的上下相溶剂中（总体积少于20 ml），用盐酸调pH至6，超声10 min，备用。

3.3上样分离：固定相泵入高速逆流色谱仪至泵满，打开主机、恒温循环器和紫外检测器，样品溶液经六通阀进样，后泵入流动相，流动相流速2.0 ml/min，恒温循环器温度25℃，主机正转850 r/min，检测波长254 nm，N2000色谱工作站采集谱图，进样30 min后用自动部分收集器收集样品，6 ml/管，共收集23管，分别测量每管pH值。完毕后，将主机转速调至0，关闭主机和恒温循环器，用氮气将管道内溶剂推出，计算固定相保留率ρ为58.3% ，[ρ=V_固/ V_总×100%，其中V_总：管路总体积（ml）； V_固：分离结束后固定相剩余的体积（ml）]。

4、目标单体收集纯化：将收集到的各管组分用高效液相色谱检测。检测条件如下：色谱柱为依利特Hypersil ODS2高效液相色谱柱(5 μm，4.6 mm × 250 mm)，柱温25 ℃；流动相为甲醇︰水︰正丁胺（50︰50︰0.1，V/V）；流速为1.0 ml/min；紫外检测器，检测波长为256 nm。经检测，合并目的组分第18至21管，减压蒸干重结晶，得淡黄色晶体的目的化合物。

实施例2：式（I）化合物的鉴定

上述淡黄色晶体的目的化合物，在高分辨质谱ESI-MS(见图1)给出分子离子峰[M+H]⁺  m/z 343.1655，从而确定分子量为342.1655。UV光谱（见图2）中最大吸收峰波长λmax（乙醇溶剂）位于215 nm、234 nm，显示了吲哚环的特征吸收。IR光谱（见图3）1713.25cm^-1显示羰基吸收，1465.41cm^-1、1617.14cm^-1、756.41cm^-1显示苯环吸收，2850-2960cm^-1为甲基和亚甲基吸收，1300-1000cm^-1为醚键吸收。¹H-NMR（CDCl₃和CD₃OD）（见图4）显示四组芳香氢信号δ7.62 (1H, d, 9-H, J=7.6 Hz), 7.20 (1H, td, 10-H, J=7.6, 1.0 Hz), 7.41 (1H, td, 11-H, J=7.8, 1.0 Hz), 7.06 (1H, d, 12-H, J=7.7 Hz)；一个甲氧基信号δ3.99 (3H, s, N_a-OCH₃), 一组甲基信号δ1.50 (3H, t,7-H, J=7.1 Hz），三组亚甲基信号δ4.45 (2H, m, 17-H)，δ3.20 (1H, m, 19α-H)、3.12 (1H, m, 19β-H)，δ2.83 (1H, dd, 5α-H, J=16.4, 4.0 Hz)、2.27 (1H, dd,  5β-H，J=16.4, 2.5 Hz)。¹³C-NMR（CDCl₃和CD₃OD）（见图5）显示两个羰基碳δ171.45 (2-C)、198.73 (20-C)，六个芳香碳δ130.15 （8-C）、124.25 （9-C）、123.92 （10-C）、128.77（11-C）、107.12（12-C）、137.76（13-C），一个连氧伯碳δ62.79（N-OCH₃）。通过¹H-¹HCOSY谱（见图6）、HSQC谱（见图7）以及HMBC谱（见图8）使化合物的C、H归属得以确认。最终确定新的钩吻生物碱类化合物结构为下式（I）的化合物，分子式为C₁₉H₂₂N₂O₄;

（I）。

实施例3：式（I）化合物的急性毒性试验

1、药品和试剂：

式（I）化合物由上述方法制备，纯度为98.3%，精密称取式（I）化合物，用生理盐水稀释至下述各剂量组所需溶液。

2、动物

昆明种雄性小鼠，体重为18～22 g，清洁级，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。室温20～25℃，自由饮食，光暗周期12/12 h，适应实验室3天后用于正式实验。

3、方法

小鼠随机分为6组，每组10只，各组小鼠分别皮下注射给予0.7 mg/kg、0.49 mg/kg、0.343 mg/kg、0.24 mg/kg、0.168 mg/kg、0.118 mg/kg的式（I）化合物，观察7天并记录小鼠死亡情况，用Bliss法计算化合物的LD₅₀。

4、结果

各组小鼠注射式（I）化合物的死亡情况见表2。

表2  式（I）化合物对小鼠的急性毒性作用

剂量（mg/kg）	动物数（只）	死亡动物数（只）	死亡率（%）
				0.7	10	10	100
0.49	10	9	90
				0.343	10	6	60
0.24	10	7	70
				0.168	10	2	20
0.118	10	0	0

经计算，化合物（I）的LD₅₀为0.2 mg/kg，95%置信区间为0.2-0.3 mg/kg。

实施例4：式（I）化合物的镇痛作用

1、药品和试剂：

式（I）化合物由上述方法制备，纯度为98. 3%，精密称取式（I）化合物，用生理盐水稀释至下述各剂量组所需溶液。致痛剂为0.6%醋酸，用生理盐水配制。盐酸吗啡注射液（沈阳第一制药厂），用生理盐水稀释至下述剂量溶液。

2、动物

昆明种雄性小鼠，体重为18～22 g，清洁级，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。室温20～25℃，自由饮食，光暗周期12/12 h，适应实验室7天后用于正式实验。

3、方法

小鼠60只，随机分为5组：式（I）化合物高、中、低剂量处理组，阳性对照组和阴性对照组。各组小鼠分别皮下注射0.02 mg/kg式（I）化合物、0.004 mg/kg式（I）化合物、0.0008 mg/kg式（I）化合物、10 mg/kg吗啡和等体积生理盐水，30 min后，每只腹腔注射0.6%醋酸0.2 ml，记录给予致痛剂后15 min内小鼠的扭体次数，按下式计算疼痛抑制率，各组小鼠扭体次数以t检验进行显著性分析，P＜0.05为有显著差异。以抑制扭体50%为有效鼠数，计算半数有效量ED₅₀。

抑制率%=（对照组平均扭体数-用药组平均扭体数）/对照组平均扭体数×100%。

4、结果

阴性对照组小鼠腹腔注射醋酸后表现为显著的扭体次数多，表现出强烈的疼痛反应；式（I）反应（腹部内凹、躯干与后腿伸张、臀部高抬、身体扭曲），化合物（I）给药处理组小鼠的扭体次数剂量依赖性显著减少，即式（I）化合物剂量依赖性减轻疼痛反应，表明式（I）化合物对小鼠醋酸致痛具有显著镇痛作用。 

表3 式（I）化合物的镇痛作用 （

±SE，n=12）

组别	给药后扭体反应次数（次）	扭体抑制率（%）
			阴性对照组	28.0 ± 2.9
阳性对照组	0 ± 0**	100
			式（I）化合物处理组
0.02 mg/kg组	7.3 ± 2.6**	74.11
			0.004 mg/kg组	14.7 ± 3.1**	47.61
0.0008 mg/kg组	24.3 ± 2.7	13.11

^** P  <0.01，与阴性对照组比较

以抑制扭体50%为有效鼠数，计算式（I）化合物镇痛作用的半数有效量ED₅₀=0.0054 mg/kg。

根据实施例3、4数据，可知式（I）化合物半数致死量LD₅₀值为0.2 mg/kg，镇痛作用的半数有效量ED₅₀=0.0054 mg/kg，可计算式（I）化合物镇痛作用的治疗指数TI= LD₅₀/ ED₅₀=37，为现有技术钩吻总生物碱镇痛作用治疗指数（仅3.3，见背景技术的说明）的十多倍，因此式（I）化合物克服钩吻总生物碱的安全性缺陷，有开发成镇痛药物的前景。

Claims (2)

1.一种具有如下结构式的新的钩吻生物碱类化合物：

（I）

                                                           。

2.权利要求1所述的钩吻生物碱类化合物的制备方法，其特征是：以乙醇抽提、氯仿萃取得钩吻中的总生物碱粗提物为原料，以高速逆流色谱仪为分离设备，采用pH区带精制逆流色谱法分离出目的化合物，分离的溶剂系统为脂肪醚︰乙腈︰水，体积比为1~2︰0~2︰1~3，上相加碱调pH至8~10为固定相，下相加酸调pH至1~3为流动相；固定相泵入高速逆流色谱仪至泵满，钩吻总生物碱用固定相和流动相的混合液溶解后，用盐酸调pH至6进样；泵入流动相，根据收集液pH值、检测器图谱结合高效液相色谱或薄层色谱，收集目的组分，减压蒸干后重结晶获得高纯度的式(I)化合物。

3.根据权利要求2所述的钩吻生物碱类化合物的制备方法，其特征是：所述的溶剂体系为甲基叔丁基醚︰乙腈︰水，体积比为3︰1.5︰4；上相所加的碱为三乙胺，所调的pH值为9；下相所加的酸为盐酸，所调的pH值为2。

 4. 权利要求1所述的化合物作为唯一活性成份在制备治疗疼痛药物中的应用。

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