CN102316899A

CN102316899A - 抗-a和抗-b抗体经耗竭的免疫球蛋白g(igg)浓缩物在用于治疗由母体-胎儿关于abo系统的不相容性所引起的新生儿黄疸中的用途

Info

Publication number: CN102316899A
Application number: CN2009801569661A
Authority: CN
Inventors: M·埃尔扎阿比
Original assignee: LFB SA
Current assignee: LFB SA
Priority date: 2008-12-17
Filing date: 2009-12-16
Publication date: 2012-01-11
Also published as: CA2748562A1; JP2016041754A; EP2358391B1; IL213618A0; FR2939667B1; ES2528420T3; JP2012512235A; DK2358391T3; WO2010076496A1; BRPI0923032A2; KR20110128271A; AU2009334626A1; EP2358391A1; CN104721819A; PL2358391T3; US20120039886A1; FR2939667A1

Abstract

本发明涉及抗-A(AcaA)和抗-B(AcaB)抗体经耗竭的免疫球蛋白G(IgG)浓缩物在生产用于治疗由母体-胎儿关于ABO系统不相容性所引起的新生儿黄疸的药物中的用途。

Description

抗-A和抗-B抗体经耗竭的免疫球蛋白G(IGG)浓缩物在用于治疗由母体-胎儿关于ABO系统的不相容性所引起的新生儿黄疸中的用途

技术领域

本发明涉及抗-A(AcaA)和抗-B(AcaB)抗体经耗竭的免疫球蛋白G(IgG)浓缩物在制备用于治疗由母体-胎儿关于ABO系统的不相容性所引起的新生儿黄疸的药物中的用途。

在下面的描述中，括号内([])的参考文献是指在实施例之后给出的参考文献列表。

现有技术

新生儿溶血性疾病(NHD)是由于母亲的抗红细胞抗体与孩子的红细胞之间的不相容性所致的胎儿或者新生儿病症。抗红细胞抗体引起在子宫内已经发生的溶血，以及根据临床表现(clinical picture)的严重性(gravity)引起孩子的偶发性严重贫血。胆红素是在血液中转运的血红素(构成血红蛋白)的降解产物，所述表现范围可以从儿童的高胆红素血症伴有黄疸到非常严重的全身性水肿病状(胎儿水肿)以及分娩出死胎儿童。未经治疗的高胆红素血症可引起新生儿核黄疸。

关于所述临床表现及其诊断探索的知识极其重要，所有目前的有效手段更是如此，其可用于防止NHD(抗-D预防或者Rh因子)以及有效的治疗、子宫内/出生后交换输血法(exsanguino-transfusion)、UV新生儿疗法。

然而，所有这些方式仅在及时意识到风险时才可能实施，也就是说在怀孕之前(特别是通过确定母亲的血型以及可能地确定父亲的血型)，在怀孕开始时(可确认血型及查找同种抗体，包括抗-A/抗B免疫抗体)，或者在怀孕期间(每3-4周检查效价的变化)。此外，确定孩子父亲的血型可以是非常有用的(具有指标的表型用于得到可能的Rh基因型的结论)，因为这就可以由此推出孩子的可能血型。

NHD的真实风险可以根据母亲的血型或者同种抗体的低效价以及推断出的孩子的血型(从父亲的血型来确定)来进行估计。如果母亲构成了有风险血型的一部分(例如O型或者Rh D阴性)，无论如何不应放弃对效价变化的检查。

在罕见的情况中，当存在成群的类似风险时，可以指示从绒毛膜活组织检查中进行孩子血型的生物分子学测定。

ABO不相容性通常在母亲是O型血而孩子是A或B型血的情况中发生。

存在于自然状态的IgM同种型的抗ABO抗体不穿过胎盘屏障。尽管ABO系统在出生时还未完全发育和表现-在孩子6个月之前不应进行血型的明确确定-在怀孕早期可以在胎儿的红细胞上检测出A型或B型。这就是为什么即使在此群体中母亲的免疫也相对频繁。此外，抗-A和抗-B IgG免疫抗体可以由异种蛋白诱导，而不依赖于怀孕或者此前的输血。然而，在Rh不相容的情况中，抗-A或者抗-B IgG抗体与相似抗体相比几乎总是具有较低的溶血能力。因此，NHD的改变更审慎(discreet)。

黄疸在70％病例中在出生后24-72小时之间出现。其在所有病例中通过目测或者仪器检测到，经常在脐带血的结果显现之前，证明了光疗法的成功开始。只要未形成黄疸的诊断，早期获知血型结果并不导致治疗性、预防性或者治愈性的措施。其最多可引起对新生儿颜色的警觉增加。

黄疸是迄今为止在新生儿期间观测到的最常见的症状。

第一个特征是，与成人中不同，新生儿中的黄疸在绝大多数的病例中具有间接的胆红素(BR)。

通过在生物体中累积，这种色素将涉及所有器官，但特别是肝脏(其首要的负责这种累积)、血液(其部分地运输和贮存该色素)、皮肤和脑中，具有持续的胆红素脑病的潜在风险，这证明了进行诊断和治疗时最大严密性(rigour)的合理性。

传统上，通过静脉内免疫球蛋白(IVIG)和光疗法的手段来治疗儿童，在最严重的情况中通过交换输血治疗。

研究已经涉及通过高剂量IVIG(静脉内免疫球蛋白)的手段治疗受ABO和/或Rh不相容性溶血性疾病折磨的新生婴儿，并显示出施用IVIG降低了需要交换输血的儿童的数目，以及减少了通过光疗法治疗的持续时间(Gottstein et al.(2003)，Archives of Disease in Childhood；Fetal and NeonatalEdition；vol.88，no.1，p.F6-F10[2])。

还显示出通过强剂量IVIG的手段对患有ABO和/或Rh不相容性溶血性疾病的新生婴儿进行的治疗降低溶血、降低血清中胆红素水平以及减少对交换输血疗法的需求(Alplay et al(1999)，Acta Paediatrica，InternationalJournal of Paediatrics；vol.88，no.2，p.216-219[3])。

然而，研究表明，向Rh和ABO不相容性所引起的同种免疫性溶血性黄疸新生婴儿施用IVIG，会导致与ABO同种免疫作用的治疗相比，Rh同种免疫作用的治疗结果明显更好。这是因为与通过光疗法治疗相比，在通过施用IVIG治疗结束时，由于Rh不相容性而患有高胆红素血症的新生婴儿对交换输血的需求降低。另一方面，在具有ABO不相容性的新生婴儿病例中，光疗法和施用IVIG在结果方面未显示出差异(Nasseri et al.(2006)Saudi Med J.；27(12)：1827-30[4])。

此外，必须考虑到施用高剂量的IVIG在一些具有ABO不相容性的患者中是具有风险的治疗。这是因为IVIG是源自人血浆的免疫球蛋白的浓缩物，并且在这一点上会包括抗-A抗体和抗-B抗体。

许多科技出版物表明，注射通过常规分级分离技术如用乙醇沉淀或者通过辛酸沉淀(Steinbuch et al.(1969)Rev.Franc.Et.Clin，et Biol.，XIV，1054[5])获得的免疫球蛋白G(IgG)，在接受治疗的患者中可导致意外的溶血，包括一些严重溶血。例如可举证的有Buchta C.et al，Biologicals.33，2005，41-48([6])、Wilson J.R.et al，Muscle & Nerve，29(9)，1997，1142-1145([7])、Copelan E.A.et al，Transfusion，26，1986，410-412([8])和Misbah S.A.et al，Drug Safety，9，1993，254-262([9])等出版物。这些IgG对患有溶血患者血液的作用的研究，特别是通过直接Coombs测试(DCT)实施的研究，显示出红细胞被针对其表面上存在的A、B或D抗原的免疫球蛋白所覆盖，由此而导致其溶血。

这就是为什么目前可商购获得的IgG得自经选择的血浆的原因，以避免高效价抗-A或者抗-B的存在。

根据欧洲药典(方法2.6.20，也称作间接Coombs测试(ICT)，1997)，在体外间接Coombs测试(ICT)中，使用初始浓度调节至30g/l的以1/64稀释的IgG溶液，IVIG必须不会展示出A或者B红细胞凝集。换句话说，根据欧洲药典的方法2.6.20，欧洲药典允许的最大效价必须低于64(稀释度的倒数(结果作为完整的数字给出-稀释分数的分母部分)，也就是说稀释至1/64的IVIG组合物必须不会引起红细胞凝集。

ICT测试的阴性结果，也就是在根据欧洲药典稀释度低于1/64的IVIG溶液存在时没有红细胞凝集，证明了其所接受的抗-A和抗-B抗体的低水平。然而，即使IgG的浓度产生欧洲药典所规定的测试阴性结果，也就是其稀释度低于1/64的那些浓度，仍不能排除溶血反应的风险([6])。

此外，美国和日本药典不包括需要控制残余抗-A和抗-B抗体含量的任何规定。

抗-A和抗-B抗体在IgG浓缩物制备期间通过常规方法部分消除，例如乙醇分级分离方法，但是观测到残余含量可能高于欧洲药典的高标准限值。此外，根据本申请人开发并在其专利申请WO 02/092632中的描述的方法制备的浓缩物，含有多于通过乙醇分级分离获得的那些含量。一些批次的IgG浓缩物可具有高于欧洲药典对每种所认可的阈值的含量。

因此，有必要具有这样的疗法，用于治疗由母体-胎儿关于ABO系统不相容性所引起的新生儿黄疸，其可施用于患有ABO不相容性的新生婴儿，而不用担心会引起溶血。

发明描述

为了此目的，且在深入研究期间，本发明人令人惊奇地显示出，根据在体外的间接Coombs测试阴性结果具有抗-A和抗-B抗体相应(respective)效价的免疫球蛋白G组合物，可用于治疗由母体-胎儿关于ABO系统不相容性所引起的新生儿黄疸或者由ABO不相容性引起的新生儿溶血性疾病，而不引起现有技术的组合物中所发现的不期望的副作用。

因此，本发明涉及用于治疗用途的免疫球蛋白G(IgG)组合物，包含根据间接Coombs测试(欧洲药典的方法2.6.20)阴性结果的相应效价的抗A和抗B抗体，其作为药物用以治疗由母体-胎儿关于ABO系统不相容性所引起的新生儿黄疸或者由ABO不相容性所引起的新生儿溶血性疾病。

“免疫球蛋白G”在本发明中是指多克隆IgG，其可以得自已富集了IgG的血浆或者血浆级分。用于治疗性用途的IgG的组合物或者浓缩物有利地具有通常使用的IgG浓度，优选在50g/l至100g/l之间。

“治疗性用途”在本发明中是指目的在于改善患者的健康状态的用途，例如降低黄疸的毒力，或者使黄疸完全或者部分消失，或者甚至治愈患者。

“抗A和抗B抗体的相应效价”在本发明中是指欧洲药典(欧洲药典2.6.20)所定义的并且通过间接Coombs测试(ICT测试)测量的效价。换句话说，该效价是这样的稀释度，从其中根据欧洲药典的方法2.6.20检测到凝血(agglutination)。再换句话说，所述效价是从中观测到溶血(haemolysis)的稀释度。

所述ICT测试(欧洲药典的方法2.6.20)包括与本发明的IgG组合物接触将的红细胞悬浮液，针对人IgG单位的抗体(抗球蛋白)溶液。这些抗体被固定在附着于红细胞上的抗-A或者抗-B抗体上，由此通过IgG之间形成桥(bridges)而使其凝集。通过这种常规血液血清学测试(间接Coomb测试)直接进行包括查找抗-A或者抗-B抗体的测试。

在本发明的背景中，欧洲药典的方法2.6.20可以如下方式使用：在9g/l氯化钠溶液R中制备2个等同的本发明IgG组合物的系列稀释液。向第一系列的每个稀释液中加入预先用氯化钠溶液洗涤3次的等体积的5％V/V红细胞A悬浮液。向第二系列的每个溶液中加入预先用氯化钠溶液洗涤3次的等体积的5％V/V红细胞B悬浮液。将该悬浮液在37℃温育30分钟，然后用氯化钠溶液洗涤细胞。使每个悬浮液与多功能人抗球蛋白试剂接触30分钟。不用离心该混合物，通过显微镜检查来寻找任何凝集。如果在稀释前的所述IgG组合物具有高于30g/l的免疫球蛋白含量，必须进行稀释达到30g/l的这个浓度，以制备用于此测试中的稀释液。稀释至1/64不出现任何凝集迹象。

当IgG浓缩物中抗-A和抗-B的水平非常低时，ICT测试是阴性的，在欧洲药典条件下更是如此，考虑到红细胞凝集反应不再发生，即使加入人抗-IgG抗体，因为抗-A和抗-B抗体的密度太低以至于不能通过固定于红细胞的抗-A和抗-B抗体键在红细胞和人抗IgG抗体之间建立桥。

欧洲药典测试方法2.6.20或者ICT测试是在监管水平认可的唯一测试法，在欧洲上市的所有IVIG必须符合这个测试，也即是说在1/64稀释度不存在凝集。该药典允许的最大效价必须(稀释度的倒数(结果作为完整数字给出-稀释分数的分母部分))低于64(＜64)。也就是说，根据欧洲药典的方法2.6.20中的描述，在1/64稀释度，被测产物不引起凝集。

“间接Coombs测试的阴性结果”在本发明中是指，当将红细胞在多功能人抗球蛋白的存在下与本发明的IgG组合物接触时，根据欧洲药典的方法2.6.20测量不存在红细胞凝集。

本发明的免疫球蛋白G组合物因此可以有利地根据体外间接Coombs测试的阴性结果，具有64的相应抗-A和抗-B抗体效价，即稀释度的倒数(结果作为完整的数字给出(稀释分数的分母部分)，也即是说对于稀释度1/64是阴性的。

本发明的免疫球蛋白G组合物有利地具有在0(不包括0是有利的)至8之间的效价(稀释度的倒数(结果作为完整数字给出(稀释分数的分母部分)。在这些抗-A和抗-B抗体效价，本发明的IgG组合物具有依照ICT的结果，也即是说不存在凝集。也就是说，在0(未稀释，不包括0是有利的)至1/8之间的稀释度，根据欧洲药典的方法2.6.20中描述，本发明的IgG组合物不引起凝集。因此，8的效价是指在超过样品8倍稀释度(稀释至1/8)观测到凝集。0的效价表示即使当样品未稀释时也检测不到凝集。

有利地，以完整数字给出(稀释分数的分母部分)的抗-A抗体和抗-B抗体效价低于4，或者低于2。这种IgG组合物当各自稀释4倍(稀释至1/4)或者2倍(稀释至1/2)时不引起凝集。

因此，用于实现本发明的IgG组合物(或者浓缩物)具有略低于在标准IgG浓缩物中观测到的抗-A和抗-B效价，也就是通过乙醇分级分离和/或通过使用关联了层析而没有消除所述抗体的附加步骤的纯化技术所获得的那些。

此外，所述效价略低于欧洲药典所接受的阈值，其非常显著地限制了接受治疗的一些接受者中的溶血风险。用本发明的IgG组合物来实施间接Coombs测试，可以导致阴性结果，即使用的是原样的IgG样品未经稀释也是如此。

本发明的IgG浓缩物因而由明显不存在抗-A和抗-B抗体有效成分所限定，所述抗体有效成分针对红细胞上存在的表位。

本申请人已经发现所述的IgG组合物特别适于治疗由母体-胎儿关于ABO系统的不相容性所引起的新生儿黄疸。

有利地，本发明的免疫球蛋白G组合物因此可有利地具有等于64的相应抗-A和抗-B抗体效价，即稀释度的倒数(结果作为完整数字给出(稀释分数的分母部分)，或者在0-8之间，或者低于4，例如低于2。有利地，在这些情况中，使用初始浓度调节为30g/l的IgG溶液实施Coombs测试。

“由母体-胎儿关于ABO系统不相容性所引起的新生儿黄疸”在本发明中是指由于关于ABO系统不相容性所引起的黄疸伴随新生儿溶血性疾病(NHD)(也称作ABO溶血性疾病，ABO不相容性新生儿溶血性疾病或者由于ABO不相容性所致的同种免疫溶血性黄疸)。这种黄疸是由于胆红素在一些器官中累积所致，所述胆红素是在血液中运输的血红素的降解产物。

更特别地，可以施用所述IgG组合物的患者可以是早产的新生婴儿，或者足月产新生婴儿，例如从出生直至产后第28天。这些婴儿通常由于ABO溶血性疾病而呈现出高胆红素血症，对于抗球蛋白新生儿测试(间接Coombs测试)是阳性并且具有高网织红细胞计数(高于或等于10％)。这些婴儿可以是男孩或者女孩。

本发明的组合物因此也可用作药物用以治疗由ABO不相容性引起的新生儿溶血性疾病。

如上文定义的IgG组合物、IgG浓缩物可具有非常低的多反应性(polyréactive)IgG含量，其可以例如是在0.01％-0.1％之间，特别是在0.7％-0.1％之间。在这种背景下，多反应性IgG含量表示为摩尔百分比或者重量百分比。这个含量通过申请人在专利申请EP 1 059 088中描述的方法确定。

例如，本发明的免疫球蛋白G组合物可以有利地具有64的相应抗-A和抗-B抗体效价，即稀释度的倒数(结果作为完整数字给出(稀释分数的分母部分)，或者在0-8之间，或者低于4，例如低于2，使用初始浓度调节为30g/l的IgG溶液进行Coombs测试，多反应性IgG含量可以例如是在0.01％-0.1％之间，特别是在0.7％-0.1％之间。

“多反应性IgG”在本发明中是指上述IgG组合物中包含的IgG级分，相应于如下抗体的总和：非得自有意的免疫并对于自身抗原表现出可变亲和性的天然抗体、抗独特型抗体(也就是针对其它抗体的可变区)、以及在上述IgG组合物的纯化方法的不同步骤期间所接受的治疗之后变成多反应性的抗体。有利地，本发明中使用的IgG组合物通过其几乎完全不存在多反应性而与可商购的其它IgG组合物不同。然而，本申请人完全出乎意料地发现，在上述IgG组合物中几乎完全不存在多反应性，结合这些组合物中非常低的抗-A和抗-B抗体水平，这是治疗由母体-胎儿关于ABO系统不相容性所引起的新生儿黄疸或者由ABO不相容性所引起的新生儿溶血性疾病的一个重要特征。因此，本发明中使用的IgG组合物作为治疗由母体-胎儿关于ABO系统不相容性所引起的新生儿黄疸或者由ABO不相容性所引起的新生儿溶血性疾病的药物是有效的，同时避免了对于红细胞的不期望反应(特别是通过抗-A和抗-B抗体消耗)以及减少了多反应性IgG的存在而引起的继发反应(特别是发热、恶心和头痛)。

本发明的组合物也可以包含一或多种稳定剂。

“稳定剂”在本发明中是指长期保存所述IgG组合物的化合物。所述稳定剂可以特别使得所述IgG组合物保存指定的时间。此外，所述稳定剂与治疗用途有利地相容。

所述稳定剂可有利地是由申请人在其专利申请WO 2204/091656中所开发的那些稳定剂之一，即醇糖(优选甘露糖醇、山梨糖醇或者其异构体)、甘氨酸和非离子去污剂(如Tween^TM80、Tween^TM20、Triton^TM X100或者Pluronic^TMF68)的混合物，所有这三种化合物均是药物水平可接受的化合物。

所述IgG组合物中甘露糖醇的最终浓度可以在30g/l至50g/l之间，甘氨酸的浓度在7g/l至10g/l之间。这些化合物的浓度代表IgG组合物中最终浓度。

有利地，所述配制物的浓度已经由申请人确定，以稳定液体和/或冻干的形式。

本发明的组合物可以静脉内施用或者皮下施用。为此，本发明的IgG浓缩物必须是经病毒防护的，例如通过本领域已知的常规溶剂/去污剂处理，使用例如Tween^TM80/TnBP或者Triton^TMX 100/TnBP混合物，和/或进行过滤步骤以在需要时消除通过溶剂/去污剂杀病毒处理未除去的病毒和/或其它大分子，如朊病毒，这是导致播散性海绵状脑病的物质。

本发明的IgG浓缩物也可以进行纳米过滤步骤。

本发明的组合物可以配制为存在合适的稳定剂的液体或者冻干形式，或者贮存直至随后使用。

有利地，所述组合物可以静脉内注射。

在此实施方案中，本发明的组合物可以是用于注射的溶液，例如用于静脉内注射用途的5g/100ml(5％)正常人免疫球蛋白溶液。

有利地，用于注射的溶液剂量可以是1g/100ml(1％)，或者2g/100ml(2％)，或者3g/100ml(3％)，或者4g/100ml(4％)，或者5g/100ml(5％)。

有利地，所述可注射溶液的IgG剂量可以在1g/100ml至5g/100ml之间，或者在2g/100ml至5g/100ml之间，在3g/100ml至5g/100ml之间，或者等于5g/100ml。

用于实现本发明的组合物可以伴随光疗法施用或者与光疗法相继施用，例如施用量在500mg/kg-2000mg/kg之间。可以从施用500mg/kg开始，然后如果胆红素水平不降低(可以通过已知的胆红素血症测试来检测)，则以500mg/kg的剂量逐步增加直至胆红素水平正常化。施用可以重复进行。

可以施用用于实现本发明的组合物而不伴随光疗法。施用量可以在500mg/kg至2000mg/kg之间。可以从施用500mg/kg开始，然后如果胆红素水平不降低(可以通过已知的胆红素血症测试来检测)，则以500mg/kg的剂量逐步增加直至胆红素水平正常化。施用可以重复进行。

适于实施本发明的组合物可以等同于WO 2007/077365中所描述的组合物。

所述IgG组合物可以通过本领域技术人员已知的任何方法获得。

特别地，所述组合物可以通过包括如下步骤的方法获得：

a)通过乙醇分级分离和/或通过层析分离制备IgG组合物，包括病毒失活步骤，

b)通过将所述IgG组合物在载体混合物上渗滤进行免疫亲和性层析，所述载体混合物的基质用与血型A和B抗原性相似的寡糖基团接枝，以及

c)大小大于20nm的病毒和/或病毒颗粒的消除过滤。

有利地，这种方法在WO 2007/077365中描述。。

这种方法在工业化规模实施非常有利。此外，制备IgG组合物的步骤与消除抗-A和抗-B抗体的特定步骤的结合使得可以获得用于治疗用途的IgG组合物，也优选包含相对于总IgG含量低于0.1％水平的多反应性IgG。此外，这种组合物包含远低于欧洲药典中所述检测低限值的效价的不希望的AcaA和AcaB，即低于64(稀释度的倒数(结果作为完整数字给出-稀释分数的分母部分))，甚至使用这种未稀释的样品通过进行ICT测试而得到阴性结果，即效价等于0。

优选所述方法的步骤a)自己就可以是获得IgG浓缩物的方法，如本领域技术人员熟知的那些。其是由Cohn et al.(Cohn et al.1946，J.Am.Chem.Soc.68，459；Oncley et al.1949，J.Am.Chem.Soc.71，541[11])开发的乙醇分级分离的情况，或者例如在EP 0 703 922和WO 99/64462中描述的层析分离方法。特别优选由本申请人在专利申请WO 94/29334和WO 02/092632中开发的方法，特别是在02/092632中描述的方法。在这种情况中，本发明方法的步骤a)包括从富集IgG的血浆或者血浆级分中沉淀脂质污染物的预纯化、在阴离子交换树脂载体上于碱性pH进行的单次层析，以及通过合适缓冲液于pH4-7在一个步骤中选择性洗脱IgG。

“液体污染物”在本发明中是指血浆中除了免疫球蛋白之外的组分。

“富集IgG的血浆级分”在本发明中是指已经经历纯化步骤以增加此级分中IgG浓度的血浆级分。

“单次层析”在本发明中是指随后不再重复进行的层析步骤。

“在一个步骤中选择性洗脱IgG”在本发明中是指用于洗脱大部分免疫球蛋白G的洗脱步骤。

对于本发明的目的，用于在一个步骤中选择性洗脱IgG的缓冲液可以是本领域技术人员熟知的任何缓冲液。

所述方法的步骤a)包括病毒失活处理，优选通过溶剂/去污剂进行，如Horowitz在专利US 4 764 369中所述的。若需要时，在随后特别消除这种处理的化学残余物的层析步骤之前，要特别小心地来实施。

然后将这种浓缩物在与血型A和B抗原性相似的基团的两个接枝载体的混合物上进行免疫亲和性层析步骤，优选在填充了载体混合物的柱上进行。优选地，所述层析载体由琼脂糖型的交联天然聚合物制成的基质所构成，其上接枝间隔基团或者结合臂，接着接枝了寡糖，有利的是对应血型A和B的表位的三糖(寡糖)。

“与血型A和B抗原性相似的寡糖基团”在本发明中是指由与识别血型A和B相同的抗体或者相同免疫球蛋白所识别的寡糖基团。

特别地，使用这样的载体会获得非常好的结果，对应于血型A表位的其三糖具有N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)-半乳糖(Gal)-岩藻糖(Fuc)结构，以及对应于血型B的表位的那些，具有半乳糖-半乳糖-岩藻糖结构。这种载体非常有利地代表可商购的凝胶或者树脂，名称为购自GlycorexTransplantation AS(Sweden)的GLYCOSORB^TMABO。

举例来说，如果使用这种载体，相应于血型A的表位的三糖具有如下结构：

N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)

半乳糖(Gal)

岩藻糖(Fuc)

举例来说，如果使用这种载体，相应于血型B的表位的三糖具有如下结构：

“载体”在本发明中是指用于支持基质的惰性材料。有利地，携带有某类官能团即某类寡糖基团的基质与载体接枝。

这些载体为本领域技术人员熟知。

所述基质可以是任何合适的基质。这些基质为本领域技术人员熟知。特别举例的是Sepharose基质，如Glycosorb ABO(Glycorex Transplantation)。

可以使用Glycosorb ABO基质(Glycorex Transplantation)，其与血型A和B的三糖接枝。

“载体混合物”在本发明中是指载体的混合物，其中一些载体携带与血型A抗原性相似的寡糖接枝的基质，另一些载体携带与血型B抗原性相似的寡糖接枝的基质。

因此不同类型的基质可以是不同比例的。

有利地，与血型A和血型B抗原性相似的基团接枝的载体的混合物的比例在25/75至75/25(v/v)之间。事实上，可以将所述柱中两种载体的比例根据供体群血型分布来调节。在惯常的应用中，所述柱优选用上述每种特异性载体的50/50(v/v)混合物充填。可以使用长度为15-25cm及直径为0.5-1cm的分析柱。在试验规模中，可以使用长度为40-60cm及直径为40-60mm的柱。在此情况中，可以用600ml免疫亲和性载体加样所述柱。

这种载体在两个使用周期之间可以贮存在1M NaOH中。在使用之前用水洗涤。

然后在免疫亲和性层析柱中加样IgG浓缩物，优选每毫升载体0.2-4升，特别是1-2升浓缩物。这种载体的特异性不需要预先调节IgG级分，即通过现有技术领域中的血浆分级分离技术获得的IgG浓缩物的任何级分均可以是合适的。

渗滤所述浓缩物不包括洗脱机制。因此，无论以何种方式获得IgG浓缩物，其均可以通过柱渗滤，任选通过泵进行。这种渗滤使得AcaA和AcaB及多反应性IgG保留。有利地，然后用水洗涤该柱，从而回收仍存在于所述柱体积中的IgG。

在渗滤IgG浓缩物之后，获得在AcaA和AcaB中耗竭的IgG级分以及生产过程中产生的多反应性IgG。这是因为AcaA和AcaB保留在层析载体的抗原单位上，修饰其构象。

保留在二级方式(

secondaire)中的这些多反应性IgG的亲和性比AcaA和AcaB更大。在IgG通过之后，可以分级分离方式将其洗脱，使用含有如浓度为0.1-1.5M、pH3-8.6的碱土金属盐的洗脱缓冲液。

然后用酸溶液如甘氨酸-HCl pH 2.8洗涤层析柱和载体，以便使在载体上保留的AcaA和AcaB解吸附。然后用水清洗这种载体并用1M NaOH溶液处理。

然后将高度耗竭AcaA和AcaB的IgG浓缩物进行过滤，以消除经所述溶剂/去污剂处理抗性的病毒和/或大于20nm的其它颗粒，如朊病毒，在其生产步骤期间产生的IgG聚合物，微团中的脂多糖，核酸和聚集的蛋白质。这种处理有利地是纳米过滤，通过孔隙率从100nm降低至15nm的过滤器进行，特别是在系列排列的并保留阈值降低至100、50和20nm的三个滤器上进行。

有利地，所述方法包括病毒失活的步骤。

“病毒失活”在本发明中是指任何失活方法或者步骤，即有效地使病毒颗粒对血浆蛋白的功能变性。

所述病毒失活方法为本领域技术人员熟知。在这些方法中，病毒失活步骤可选自溶剂/去污剂步骤或者巴氏灭菌法。

有利地，病毒失活步骤可以通过溶剂/去污剂步骤进行。

由此收获的IgG级分已经充分浓缩，然后可以通过超滤和灭菌过滤进行额外的浓缩步骤。

所述方法在步骤b)之后可包括通过超滤和灭菌过滤而浓缩的步骤。

有利地，所述灭菌步骤可以通过纳米过滤进行。

所述方法在步骤c)之后可包括加入稳定剂的额外步骤，以便首先保证保存期间所述IgG浓缩物的稳定性，其次允许冻干以防止与之相关的各个阶段中所述IgG的变性。有利地，加入药物可接受的单一稳定配方，符合同时保证两种设想的保存形式即液体或者冻干形式的IgG稳定的目标，以及保留甚至改善这些IgG的治疗效力，如专利申请WO 2004/091656中所述。

所述IgG组合物任选进行随后的通过超滤的浓缩步骤，然后灭菌过滤，并可包装在瓶中，优选在大约4℃保存。

可使用分析方法来分析本发明描述的IgG组合物的抗-A和抗-B抗体。

这种分析所述IgG浓缩物中抗-A和/或抗-B抗体的方法可包括如下步骤：

a)制备并校准O型Rh+红细胞悬浮液，

b)在生物可接受的缓冲液中制备单克隆抗-D抗体溶液，浓度在0-200ng/ml范围，

c)使所述红细胞与单克隆抗-D抗体溶液接触，并将由此获得的红细胞混合物温育预定的时间，

d)在每种红细胞混合物中加入通过荧光染料标记的人抗-IgG抗体F(ab’)2片段，并温育所述红细胞，

e)对在步骤d)中获得的每种红细胞混合物进行流式细胞计量术，

f)产生抗-D单克隆抗体浓度与荧光关系的标准曲线。

然后可以通过使用如下方法分析抗-A抗体和抗-B抗体：

a)制备并校准血型A、B的红细胞悬浮液，

b)在生物可接受的缓冲液中制备单克隆抗-D抗体溶液，浓度范围为0-200ng/ml，

c)使所述红细胞与IgG溶液样品接触，将由此获得的红细胞混合物温育预定的时间，

g)通过抗-D标准曲线确定IgG浓缩物中抗-A和/或抗-B抗体效价，以纳克/毫升表示。

实施确定抗-A和/或抗-B抗体效价的这种方法的一种方式可以包括在PBS缓冲液中制备1％(v/v)的血型A、B和/或O的红细胞悬浮液，pH在7.0-7.4之间，含有0.8-1.5％重量的牛血清白蛋白BSA。所述红细胞悬浮液在正常流式细胞计量术装置中计数，其使用方法为本领域技术人员熟知，然后在37℃校准该悬浮液至43.106红细胞/ml悬浮液。制备单克隆抗-D抗体溶液，其浓度在0-200ng/ml悬浮液范围，优选PBS缓冲液，pH在7.0-7.4之间，含有适当的0.8-1.5％重量的牛血清白蛋白BSA。通过吸光测定法分析由此制备的溶液，以确定其摩尔消光系数()。

然后将所述IgG组合物通过PBS缓冲液调节为浓度范围为1-5mg/ml，优选1mg/ml，pH在7.0-7.4之间，含有0.8％-1.5％重量的牛血清白蛋白BSA。

将50-100μl体积的每个血型红细胞悬浮液置于微平板的每个孔中，例如96孔，然后在这个红细胞悬浮液中加入50-100μl的IgG溶液，或者在这个红细胞悬浮液中加入50-100μl抗-D抗体溶液。整体温育1小时30分钟至2小时30分钟，特别是2小时，温度通常在30℃-40℃之间，优选37℃。

然后优选用含有先前的BSA的PBS缓冲液洗涤由此获得的红细胞的不同混合物并离心，然后在微平板孔中含有的每个红细胞混合物中加入荧光染料如藻红蛋白标记的50-100μl人抗-IgG山羊F(ab’)2抗体，存在于PBS缓冲液中及先前所定义的BSA。

整体避光温育大约20-30分钟。

然后洗涤由此获得的红细胞的不同混合物，并使用任何合适的商购设备进行流式细胞计量术，包括对分析的化合物进行荧光检测的装置。

根据抗-D单克隆抗体浓度报道平均荧光强度(MFI)，通过Excel软件获得直线回归方程。然后，对于每个样品，使用线性直线回归方程获得相等的抗-D抗体浓度。一式三份分析样品，确定平均浓度并通过Excel软件计算变差系数。

从中推导本发明的IgG浓缩物中抗-A和抗-B抗体的含量，优选预先给出。

优选地，分析上述IgG浓缩物的AcaAs和AcaBs的方法通过适应于本发明的流式细胞计量术进行，其原理是基于根据要求的特别确定的AcaAs和AcaBs效价，使用人血型A或B的红细胞，检测荧光信号与这些抗体含量的比例。

这种分析方法包括如下步骤：

a)制备并校准血型A或B的红细胞悬浮液，

b)使所述红细胞与稀释的IgG溶液样品接触，温育由此获得的混合物一段时间，

c)使所述红细胞在存在由荧光染料标记的抗-IgG抗体的条件下温育，

d)将在步骤c)获得的红细胞悬浮液进行流式细胞计量术。

在PBS缓冲液中制备1％(v/v)的血型A或B的红细胞悬浮液，pH为7.0-7.4，含有0.8％-1.5％重量的牛血清白蛋白(BSA)。所述悬浮液的红细胞在本领域技术人员已知的正常流式细胞计量术装置中计数，然后校准该悬浮液为37-43.10红细胞/ml。

将50-100μl体积的悬浮液置于96孔微平板的每孔中，直至获得0.234g/l的IgG溶液。

将整体温育1小时30分钟至2小时30分钟，特别是2小时，温度通常在30℃至40℃之间，优选37℃。

然后用含有先前的BSA的PBS缓冲液洗涤所述红细胞并离心，然后在每个孔中加入用荧光染料如藻红蛋白标记的50-100μl人抗-IgG山羊F(ab’)2抗体。

整体(步骤c)避光温育大约20-30分钟。

然后洗涤由此获得的悬浮液，并进行流式细胞计量术，使用合适的商购设备，包括荧光检测分析的化合物的装置。

例如，称作B1、B2和B3的三种IgG浓缩物的抗-A和B抗体含量在下表1中示出，所述三种浓缩物分别是针对抗-A和抗-B耗竭而通过Cohn方法的乙醇分级分离(B1)、根据专利申请WO 02/092632(B2)及根据专利申请WO 02/092632所述随后免疫亲和性层析(B3)制备。结果示出样品B1的抗-A和抗-B抗体效价，这些抗体的比例已经任意定为1.

表1

样品	抗-A抗体含量	抗-B抗体含量
			B 1	1	1
B2	3.65	3.85
			B3	0.68	0.52

这个表的结果显示出根据Cohn的方法制备的IgG浓缩物(B1)的抗-A和抗-B抗体含量与根据WO 02/092632所述方法制备的IgG浓缩物(B2)相比低大约4倍。此外，随后通过特异性免疫亲和性柱对这些IgG浓缩物的处理使抗-A抗体效价降低大约5倍，使抗-B抗体效价降低大约7倍(b3)。

确定可有利使用的抗-A和抗-B抗体含量的另一方法包括通过体外补体裂解，这种方法为本领域技术人员已知，但已经为了本发明的需求而进行特别开发。这种分析方法包括如下步骤：

a)通过合适的放射性标记对选自血型A、B、AB和O的预先计数的木瓜蛋白酶解的红细胞悬浮液继续进行放射标记，

b)使放射标记的红细胞与预定体积的IgG浓缩物接触，

c)加入与步骤b)中血型AB相等体积的正常血清，

d)将在步骤c)获得的混合物温育预定的时间，

e)测量因此获得的温育的溶液的放射性。

制备血型A、B、AB或者O的木瓜蛋白酶解的红细胞的1％(v/v)悬浮液，然后在Malassez中计数，以获得106红细胞。加入100μCi的⁵¹Cr(对于1体积红细胞加入1体积)。将全体温育1-2小时，然后将放射标记的红细胞洗涤4-6次。

然后将放射标记的红细胞与IgG浓缩物样品接触，对于4-6.106放射标记的红细胞，浓度优选在1至3mg/ml之间，特别是1.2mg/ml，体积例如是100μl。

然后在先前的混合物中加入等体积如100μl的AB血型的正常血清，以加入互补方法的不同因子。

然后将因此获得的反应混合物温育，优选温育3-5小时，特别是温育4小时，温度通常在30℃至40℃之间，优选37℃。

然后优选将上述反应混合物离心，使用合适的商购仪器测量温育的溶液的放射性。测量的溶液的放射性与处理的红细胞溶血程度成正比，并因此与抗-A和抗-B抗体含量成正比。

例如，血型A、B和AB关于本发明的IgG浓缩物(B3)和现有技术中在可商购浓缩物中具有最低溶血水平的IgG浓缩物(C1)的红细胞溶血程度在下表2中示出。

表2

本发明的另一主题是上述组合物在制备用于治疗由母体-胎儿关于ABO系统不相容性所引起的新生儿黄疸的药物中的用途。

上述本发明所有方面均适于此种用途并构成本发明这个其它主题的一部分。

本发明的另一主题是治疗由母体-胎儿关于ABO系统不相容性所引起的新生儿黄疸或者新生儿ABO溶血性疾病的方法，包括施用前文所定义的IgG组合物。

在这个实施方案中，本发明的组合物可以是用于注射的溶液，例如用于静脉内使用的剂量为5g/100ml(5％)的正常人免疫球蛋白注射液。

有利地，所述注射溶液的剂量可以是1g/100ml(1％)，或者2g/100ml(2％)，或者3g/100ml(3％)，或者4g/100ml(4％)，有利地直至5g/100ml(5％)。

有利地，所述注射溶液中IgG剂量可以在1g/100ml至5g/100ml之间，或者在2g/100ml至5g/100ml之间，或者在3g/100ml至5g/100ml之间。

用于实现本发明的组合物可以与光疗法伴随或者相继施用，例如施用量为500mg/kg-2000mg/kg。可以重复这种施用。

上述本发明的所有方面均适于这种治疗方法并构成本发明这个其它主题的一部分。

本领域技术人员通过阅读如下实施例也可以更加明了本发明的其他优势。

实施例

实施例1：抗-A和抗-B抗体耗竭的IgG组合物的制备

通过WO 02/092632所述方法获得40g/l IgG浓缩物(B2)样品。

将长度为50cm及直径为44mm的层析柱充填50/50(v/v)的与相应于血型A和血型B的表位的三糖接枝的Glycosorb ABO载体的混合物，然后用1200ml水进行先前洗涤步骤。

通过泵以0.2l/ml载体的速度注射IgG浓缩物B2。一旦这个体积已经通过柱渗滤，则将柱用最小体积的用于注射制备物(IPP)的水洗涤以回收柱的死体积中存在的IgG。

大约40g/l的耗竭AcaA、AcaB和多反应性IgG的IgG浓缩物B3被回收，并进行超滤以便浓度为60g/l，并且在系列排列的具有分别为100、50和20nm的降低的保留阈值的3个过滤器上进行消除病毒的纳滤。

将由7g/l甘氨酸、30g/l甘露糖醇和20ppm Tween 80的混合物组成的稳定化赋形剂溶解在60g/l的IgG浓缩物中，随后通过水IPP将IgG浓度调整为50g/l，然后无菌过滤所述浓缩物并分配到烧瓶中。

实施例2：IVIG中抗A/B的定量

1)测量原理

1.1)制备人红细胞

将A型rh+、B型rh+或O型rh+的人红细胞标准化至浓度为40x 10⁶红细胞/ml于PBS缓冲液+1％BSA，pH＝7.4中。

1.2)单克隆抗D范围的制备

针对其PBS缓冲液pH7.4测量单克隆抗D制备物(称为R297)在280nm的光密度。蛋白质的摩尔消光系数()根据其氨基酸组成计算，单克隆抗D的浓度(C)通过适用公式C＝OD/而获得，其中1＝测量OD的容器宽度。

在12个点产生范围为0-200ng/ml的抗D单克隆抗体(200；150；100；75；50；25；12.5；6.25；3.13；1.56；0.78和0ng/ml)。

1.3)免疫球蛋白溶液的制备

研究了可商购的不同静脉内免疫球蛋白。这些免疫球蛋白的主要特征详见下表：

^*通过实施WO 02/092632中所述的方法随后进行实施例1中所述的免疫亲和步骤而产生。

^**通过实施WO 02/092632中所述的方法而不进行实施例1中所述的免疫亲和步骤而产生。

通过PBS缓冲液+1％BSApH＝7.4将不同的免疫球蛋白制备物调节至浓度为1mg/ml。

1.4)红细胞的敏化

将下述物质沉积在圆底微滴定板的孔中：

-50μl浓度为40x 10⁶红细胞/ml的红细胞A rh+、B rh+或O rh+的悬浮液，，

-50μl抗D范围或者50μl待分析的样品(IgIV)。待分析的样品一式三份沉积。

然后将平板在37℃振荡下温育2小时。

1.5)洗涤

将平板在770g离心1分钟。翻转分离上清，然后向每孔中加入200μlPBS+1％BSA。该操作重复3次。

1.6)加入缀合物及洗涤

用藻红蛋白(PE)标记的人抗IgG山羊(Fc特异性的)的F(ab’)2(Beckman Coulter ref：PN IM0550)在PBS缓冲液+1％BSA pH＝7.4中1/20稀释，然后将50μl所述溶液沉积在每孔中。平板在环境温度下避光温育20-30分钟。如段落1-5)所述进行3次连续洗涤。

1.7)用流式细胞术读数

红细胞悬液通过流式细胞术(Beckman Coulter FC500)根据合适程序读数。

读数进行50000次(événement)以上，装置自动计算每个范围点或样品的平均荧光强度(MFI)。

1.8)结果的解释

根据抗D单克隆抗体浓度报道MFI，并且用Excel软件获得直线回归方程。然后，对于每个样品，用线性直线回归方程获得抗D抗体当量浓度。样品已被一式三份分析，浓度的平均值被确立，变异系数用Excel软件计算。

2)结果：

2.1)抗A抗体浓度

ns＝不显著

2.2)抗B抗体的浓度

ns＝不显著

3)结论：

亲和性步骤实质上有助于消除抗A和抗B抗体。在所研究的市场上存在的不同免疫球蛋白中，IgNG产品是含有最少抗A抗体和抗B抗体的产品。

实施例3：实施例1获得的IgG B浓缩物的抗A和抗B的定量

在含有1％(重量)牛血清白蛋白BSA的PBS缓冲液pH7.4中制备血型A的红细胞的1％(v/v)悬液。取50μl所述红细胞悬液并与50μl测量流动的内部标记溶液一起导入Beckmann Coulter Epics XL流式细胞仪的试管中。悬液校准为40.10⁶红细胞/ml。

通过将实施例1获得的IgG浓缩物(v/v)(B3)以2倍连续稀释制备8个批次的IgG溶液，最浓批次为30g/l，最稀释批次为0.234g/l。接下来将50μl的悬液至于96孔微滴定板的每个孔中，然后加入50μl稀释的不同的IgG溶液。将全体在37℃振荡温育2小时。

然后每个孔用200μl含有一些先前的BSA的PBS缓冲液洗涤，以2000转/分钟离心微滴定板1分钟。在消除上清后，向每孔加入50μl稀释至1/20PBS-BSA的用藻红蛋白荧光染料标记的人抗IgG山羊F(ab’)2抗体(Beckman-Coulter)的溶液。

整体避光温育30分钟。

将如此获得的悬液然后如前所述洗涤。

每孔的剩余物用100μl PBS-BSA获取。将微滴定板每孔所含体积转移到试管中，向该试管中加入500μl来自isoflow导管(Coulter)的液体，用Beckman Coulter Epics XL装置进行流式细胞术，所述装置包括数据采集软件及探索结果的软件。对每个样品进行流式细胞术测量。

用来自血型B的红细胞进行相同程序。

这个操作模式使用三个不同批次的IgG(B3)，并且也拥有根据Cohn方法(上述)经乙醇分级分离制备的3个不同批次的IgG(B1)。

获得的结果见下表3。

表3

样品	抗A抗体含量	抗B抗体含量
			B1	1	1
B2(3批次)	3.80；3.55；3.59	3.80；4.45；3.31；
			B3(3批次)	0.66；0.68；0.69	0.33；0.73；0.50

实施例4：测量红细胞的溶血

制备血型A、B、AB或O的木瓜蛋白酶化的红细胞的1％(v/v)悬液，然后在Malassez cell中计数以获得10个红细胞。加入100μCi ⁵¹Cr(1体积/1体积红细胞)。温育1小时，然后将放射性标记的红细胞洗涤5次。

然后在100μl体积中以针对5.106放射性标记的红细胞1.2mg/ml的浓度将放射性标记的红细胞与实施例1所获得的IgG浓缩物(B2)样品接触。

然后将先前于相同体积的100μl血型AB的正常血清加入到先前混合物中以加入剩余物的不同因子。

然后将获得的反应混合物在37℃温育4小时。

然后将反应混合物以2000转/分钟离心1分钟，使用合适的市售装置测量经温育的上清溶液的放射性。测得的溶液的放射性与经处理的红细胞的溶血程度成比例，因此与抗A和抗B抗体含量成比例。用血型B、AB和O的均为rh+的红细胞以及用血型O+的血清样品进行相同程序。这个操作模式用3个不同批次的IgG(B2)。另外，该方法用于3个批次的IgG浓缩物商业样品，分别为C2至C4，血型O+的血清的样品C5作为阴性对照包括进来。

测得的所述溶液的放射性与经处理的红细胞的溶血程度成比例，因此与固定于红细胞的抗A和抗B抗体数量成比例。

获得的溶血结果见下表4。

表4

获得的结果显示根据本发明进行亲和性层析的IgG浓缩物B3含有最少数量的AcaA和AcaB，因为来自不同血型的红细胞的溶血程度最低。用作阴性对照的表型O+的红细胞未观测到溶血。

实施例5：IgG浓缩物B2(免疫亲和性层析之前)及实施例1所述的这个层析之后(IgG浓缩物B3)的多反应性的测量

这些IgG浓缩物的多反应性根据专利EP 1 059 088使用与所述多反应性IgG反应的两种抗原测量。这些抗原是肌球蛋白和用二硝基苯基基团修饰的白蛋白(DNP白蛋白)。

表5示出实施例3的样品B2、B3和C4的多反应性IgG富集倍数，其IgG含量任意固定为1，作为参照。

这些测量在所研究的三个不同批次的IgG浓缩物上进行。

表5

样品	肌球蛋白	DNP白蛋白
			B1	1	1
B2(3个批次)	1.2；0.8；1.2	3.2；1.0；2.0
			B3(3个批次)	0.4；0.4；0.4	1.0；1.0；1.0
C4(3个批次)	2.0；2.0；2.0	8.0；6.0；7.0

结果表明本发明的IgG浓缩物B3含有比现有技术C4浓缩物低5-8倍的多反应性IgG。

实施例6：耗竭AcaA、AcaB和多反应性IgG的IgG浓缩物(B3)与IgG浓缩物(B1)功效的比较实施例

本研究涉及Fc RI和Fc RIII受体缺陷的小鼠，它们被处理以评价本发明的IgG浓缩物的免疫调节活性。这些动物作为血小板减少性紫癜的模型。根据Cohn方法经乙醇分级分离获得的IgG浓缩物(B1)用作参照。

采用Teeling J.L.et al(Blood，15/08/2001，vol.98，number 4，pp.1095-1099[10])所述的实验方案。通过注射9.108/ml至2.108/ml水平的抗血小板单克隆IgG被破坏的血小板在用1g/kg治疗剂量的IgG B1和B3浓缩物治疗的动物中重新升至7.108/ml。

本发明的IgG浓缩物B3的免疫调节活性通过使用免疫亲和性层析而未发生改变。

实施例7：实施的实例

施用剂量及治疗耐受性评估。

将本发明的IgG组合物如B3组合物或者在市场上购买的另一IgG组合物施用给这样的新生儿，其是男孩或者女孩，年龄小于28天，患有ABO溶血性疾病，其症状是高胆红素血症，直接新生儿抗球蛋白测试(直接Coombs测试)阳性以及高网织红细胞计数(高于或者等于10％)。

患者的排除标准是IgA缺陷，存在抗-IgE/IgG抗体，具有脐带中胆红素水平高于或者等于4mg的出生交换输血指征、胎儿胎盘全身性水肿(胎儿水肿)、心功能不全，以及出生前治疗(母体IVIG和/或子宫内输血)。

治疗方案是施用500mg/kg和2000mg/kg的IgG(n＝大约10次)，单独施用或者组合光疗法，可反复应用。

主要的评估标准是交换输血的需求，以及在第一次施用所述组合物后3天测量血清中总胆红素水平。

主要的二级评估标准是光疗法的总持续时间，总住院治疗时间，在分娩后第27天晚期贫血的发生，以及在第一次施用所述免疫球蛋白组合物后24小时血清总胆红素水平。

通过Kaplan Meier方法进行结果对比分析。

停止评估的原则是根据美国儿科医学委员会对于高胆红素血症的临床治疗的指导(Paediatrics.2004 July；114(1)：297-316)的交换输血的起始。

通过一种已知测试方法测量胆红素水平，以监测患者症状缓解中的变化。

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Claims

1.用于治疗用途的免疫球蛋白G(IgG)组合物，包含根据间接Coombs测试(欧洲药典的方法2.6.20)为阴性结果的相应抗-A和抗-B抗体效价，其作为药物用以治疗由母体-胎儿关于ABO系统不相容性所引起的新生儿黄疸或者由ABO不相容性所引起的新生儿溶血疾病。

2.权利要求1的组合物，所述根据间接Coombs测试阴性结果的相应抗-A和抗-B抗体效价以稀释度的倒数为64。

3.权利要求1的组合物，所述根据间接Coombs测试阴性结果的相应抗-A和抗-B抗体效价以稀释度的倒数在0-8之间。

4.前述任一项权利要求的组合物，所述间接Coombs测试用初始浓度调节为30g/L的IgG溶液进行。

5.前述任一项权利要求的组合物，具有相对于总IgG含量在0.01％至0.1％之间的残余多反应性IgG含量。

6.前述权利要求之一的组合物，其进一步包含稳定剂。

7.前述权利要求之一的组合物，其中所述稳定剂是指醇糖，优选甘露糖醇或者山梨糖醇，甘氨酸和非离子去污剂的混合物。

8.前述权利要求之一的组合物，可经静脉内注射。

9.前述任一项权利要求的组合物，可通过包括如下步骤的方法获得：

a)通过乙醇分级分离和/或通过层析分离制备IgG浓缩物，包括病毒失活步骤，

b)通过将所述IgG浓缩物在载体混合物上渗滤进行免疫亲和性层析，所述载体混合物的基质用与血型A和B抗原性相似的寡糖基团接枝，以及

c)大小大于20nm的病毒和/或病毒颗粒的消除过滤。

10.权利要求9的组合物，所述方法的步骤a)包括通过用富集IgG的血浆或者血浆级分来沉淀脂质污染物的预纯化，在阴离子交换树脂载体上于碱性pH进行的单次层析，以及使用pH在4-7之间的合适缓冲液在一个步骤中选择性洗脱IgG。

11.权利要求9或10的组合物，所述方法的寡糖基团是指相应于血型A和B表位的三糖。

12.权利要求8-11之一的组合物，所述方法的病毒失活步骤通过溶剂/去污剂进行。

13.权利要求8-12之一的组合物，每个所述载体中与血型A及与血型B抗原性相似的基团的接枝载体的混合物的各自比例在25/75至75/25(v/v)之间，优选50/50(v/v)。

14.权利要求8-13之一的组合物，所述方法包括通过超滤和灭菌过滤的浓缩步骤。

15.权利要求14的组合物，所述灭菌过滤步骤通过纳米过滤来进行。

16.权利要求9-15之一的组合物，所述方法包括，在步骤c)之后，向所述IgG浓缩物中加入保存性稳定剂的步骤。

17.前述任一项权利要求的组合物在制备要用于治疗由母体-胎儿关于ABO系统不相容性所引起的新生儿黄疸的药物中的用途。

18.治疗由母体-胎儿关于ABO系统不相容性所引起的新生儿黄疸或者ABO新生儿溶血性疾病的方法，包括将权利要求1-17任一项的IgG组合物施用于有需要的人。