CN102308800A - 一种可德兰寡糖的应用 - Google Patents

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傅赟彬
刘启顺
赵小明
白雪芳
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Abstract

本发明公开了一种可德兰寡糖的应用，其结构为葡萄糖分子通过β-(1→3)糖苷键连接而成的寡糖，聚合度(Degree of Polymerization，DP)为2-24，分子式是(C6H12O6)n，n＝2-24，所述的可德兰寡糖的平均分子量在340-4000Da。本发明制备的可德兰寡糖可作为调节植物生长、诱导植物抗性的绿色生物农用剂。

Description

一种可德兰寡糖的应用
技术领域
本发明涉及可德兰寡糖，具体地说是一种可德兰寡糖的应用，其可诱导植物抗性、促进植物生长发育。
背景技术
可德兰多糖由Alcaligenes faecalis var myxogenes 10c3发酵产生的胞外多糖，是基本结构为葡萄糖通过β-(1→3)糖苷键连接而成，是β-1，3-葡聚糖家族的一名成员。迄今为止，该多糖是自然界中唯一一种不含分支的β-1，3-葡聚糖。然而，由于可德兰多糖不溶于水，严重阻碍了其在食品、医药、饲料添加剂和材料领域的应用。
可德兰寡糖也被称为β-1，3-葡寡糖，是多糖的降解产物，水溶性大大增强。随着寡糖研究日益受到人们的关注，可德兰寡糖及其衍生物的生物学功能和生理活性逐渐被揭示。Shimizu(2001)通过比较果寡糖和木聚寡糖的结构和功能后，认为可德兰寡糖可能也具有调节肠道菌群，作为益生源的功能。同时，还具有开发为医药研究过程中间体的潜在市场价值。
尽管可德兰寡糖具有重要的生理学功能，然而由于可德兰寡糖具有特殊的三级结构以及形成凝胶不溶于水等特性，目前尚未有报道使用可德兰寡糖应用于植物生物诱抗剂以及促生长活性研究，主要的瓶颈问题就是可德兰寡糖降解难度大，制备过程繁琐，效率较低。Grandpierre(2008)等报导使用硫酸或者三氟乙酸水解90h，降解产率只有25％。而化学合成可德兰寡糖技术难度大，特别是DP＞7以上的寡糖单体的合成，因涉及到糖单元的连接方式和立体构型，活性基团的保护等一系列问题，难度和成本都令人望而却步。
如果没有有效的制备可德兰寡糖的方法，将不利于研究寡糖结构与生物活性功能，阻碍从机理方面深层次地探讨可德兰寡糖及其衍生物与疾病发生之间的关系。因此，从药物的研发角度来说，制备可德兰寡糖是继续深入研究的基础和前提。
发明内容
本发明确定了可德兰寡糖在促进植物生长，形态建成，诱导植物抗病性，方面的应用。它是一种植物营养剂兼具促进生长剂、诱抗剂(生物农药)的新型生物农用剂，无毒无副作用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种可德兰寡糖的应用，其可作为激发子诱导植物抗性，或可作为生长促进剂促进植物生长发育。
所述的可德兰寡糖对于植物生长发育、形态建成等有着重大影响，可作为植物生长促进剂和营养调节剂。使用时，将质量浓度0.01-10％可德兰寡糖溶液喷洒于植物叶片或根部灌施或处理植物幼苗或种子，可以促进植物生长，提高产量。
所述的可德兰寡糖具有诱导植物抗病性活性，可作为活性成份用于制备植物诱导抗病性的激发子类型的绿色生物农药；使用时，将质量浓度1-50μg/mL的混合物溶液喷洒于植物叶片上，可以诱导植物产生抗病毒、抗真菌的活性，环境友好，易于降解，且本身无毒无害。
所述可德兰寡糖是由葡萄糖分子通过β-(1→3)糖苷键连接而成，不含有侧链分支，聚合度(Degree of Polymerization，DP)为2-24，分子式是(C6H12O6)n，n＝2-24，其结构式如下图所示：
Figure BSA00000162199600021
所述植物包括大豆、葡萄、烟草、水稻、黄瓜、玉米等，但不限于此。
用于农业生产，可提高作物的产量，诱导植物抗病性，增强植株的天然免疫力，是环境友好的绿色生物农药。
本发明与专利CN02110921.4合成的单一聚合度为5的β-1，3-葡寡糖相比，可德兰多糖的降解过程不会造成基本结构的破坏，避免了繁琐的有机合成路线以及可能存在的副反应。此外，通过葡萄细胞抗病性实验结果也证明了聚合度范围较广的可德兰寡糖更易被植物受体识别，诱导植物抗性的效果要好于单一聚合度的葡寡糖。
本发明具有如下优点：
本发明所述的可德兰寡糖的制备方法以及制备的产品与相关的专利和发表文章具有很大优点，主要表现如下：
1.目前尚未有报道使用可德兰寡糖应用于植物生物诱抗剂以及促生长活性研究，可德兰寡糖作为糖分子，完全能在自然界中降解，不污染环境。同时，可作为调节植物生长、诱导植物抗性的绿色生物农用剂。
2.本发明制备的可德兰寡糖无毒副作用、无有害物残留、无抗药性。
3.本发明制备的可德兰寡糖不含有侧链分支，以及其他基团的化学修饰，结构清晰更易被植物细胞膜表面受体识别，生物活性更高。
4.专利CN02110921.4化学合成造价昂贵，不利于大规模制备和农业上的广泛使用。
附图说明
图1为本发明使用高效液相检测酸法制备的可德兰寡糖的组分含量图；
图2为本发明使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)检测可德兰寡糖的图谱。
具体实施方式
下面结合实施实例对本发明作进一步说明：
一种酸法降解制备得到可德兰寡糖的方法。将可德兰多糖在溶剂中充分溶解制成均相溶液，在80-140℃条件下，添加浓度为0.1M-5M的酸溶液反应30-500min，0.1M-5M的碱调pH至6-8，浓缩至原反应体积的1/5-5/5，加入有机溶剂沉淀，同时搅拌，过滤，得到乳白色固体，固体用有机溶剂洗涤1-4次，干燥后得到平均分子量在340-4000Da的可德兰寡糖。
所述的溶剂通常为溶剂为碱液、二甲基亚砜、甲酸、镉乙二酸、碘化钾溶液的一种或者多种混合溶液，其与多糖的比例为5∶1-30∶1。所述的酸溶液为盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、甲酸、三氟乙酸和草酸的一种或者多种混合酸。所述的碱溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾的一种或者多种混合碱。所述的有机溶剂为乙醚、丙酮、甲醇、乙醇、石油醚、正己烷中的一种或多种混合物。
可德兰寡糖的制备方法(A)
称取5g可德兰多糖于50ml碘化钾、镉乙二胺溶液(比例为1∶1)中充分搅拌至完全溶解，在90℃(可在80-140℃条件下进行操作)下缓慢滴加入0.5M的草酸混合溶液3ml，反应60min后，用50mL乙醇和丙酮的混合溶液(V/V＝1)沉淀，同时搅拌，得到乳白色粉末，抽滤，于50℃下真空干燥得到4.25g，产率达85.12％。
经检测高效阴离子交换色谱脉冲安培检测法和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱证明所得物质为可德兰寡糖。
可德兰寡糖的制备方法(B)
称取5g可德兰多糖于50ml二甲基亚砜，碘化钾溶液(比例为1∶1)中充分搅拌至完全溶解，在90℃(可在80-140℃条件下进行操作)下缓慢滴加入0.5M的三氟乙酸混合溶液3ml，反应60min后，用混合碱溶液中和，用混合碱溶液中和，在45℃(可在30-150℃下进行操作)旋转蒸发浓缩至10ml，呈淡黄色透明液体，用50mL乙醇和丙酮的混合溶液(V/V＝1)沉淀，同时搅拌，得到乳白色粉末，抽滤，于50℃下真空干燥得可德兰寡糖4.51g，产率达90.2％。
实施例1：诱导植物抗病实验
材料和方法：可德兰寡糖、壳寡糖；供试植物为枯斑三生烟(Nicotianatobacum L.SamSun NN)；供试毒源为烟草花叶病毒(TMV)
温室试验：对照药剂壳寡糖50μg/ml，喷雾。供试药剂可德兰多糖混合物浓度分别为1μg/mL，10μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，500μg/mL喷雾。选取大小一致6～8叶期的烟草植株，叶面喷雾施药，每株10mL。24小时后汁液摩擦接种TMV病毒。在病毒汁液中加入少量石英砂，用毛笔蘸取汁液摩檫接种。枯斑三生烟苗采用半叶法接种，每株接四片叶。接种后每天观察发病情况。待全面发病后，调查病斑数。重复三次。计算抑制率。试验结果表明：可德兰寡糖对抑制烟草花叶病毒引起的枯斑有抑制作用。浓度为100μg/mL的可德兰寡糖抑制病毒产生枯斑的抑制率为57％，比50μg/mL具有更好的诱抗活性(55.0％)，但是与50μg/mL没有显著性差异。因此，50μg/mL-100μg/mL的可德兰寡糖具有良好的诱抗活性，而阳性对照壳寡糖50μg/mL，抑制率为63.9％，说明可德兰寡糖相对于已经广泛使用的生物农药壳寡糖而言，具有开发成为新一代绿色生物农药的光明前景。
实施例2：促进植物生长实验
经过15％H2O2(wt/wt)溶液浸泡除菌后的玉米种子，于0.2M CaCl2中浸泡30min以提高种子的发芽率，在黑暗环境中铺于湿润滤纸的培养皿上进行发芽。两天后，种子发芽出现子叶，将其转移到水培营养液的器皿中，每天更换新鲜的培养液。待玉米长成幼苗后，将供试药剂可德兰寡糖配成浓度为0.01-10％的水溶液，调节pH6至7，每天更换含寡糖样品的新鲜水培营养液，未加寡糖样品的水培营养液作为空白对照。实验结果表明，可德兰寡糖使得玉米生物量提高了15％，叶绿素含量增加了18.4％。
比较例：可德兰寡糖与其他葡聚糖的生物活性比较试验
将本发明制备的可德兰寡糖与专利CN02110921.4合成的聚合度为5的β-1，3-葡寡糖以及含有β-1，6-侧链分支的高分子量为(2×105-2×106)酵母来源的葡聚糖均配制成母液，分别加入处于对数生长期的葡萄悬浮细胞(葡萄细胞/)培养体系中使其终浓度达到500μg/mL。100rpm，25℃，光暗比16h∶8h条件下培养24h，检测抵抗病虫害性相关的苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性，发现可德兰寡糖诱导的PAL酶活比合成寡糖处理组提高了27％，比酵母葡聚糖提高了15.7％。同时可德兰寡糖诱导的次生代谢产物白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量较合成寡糖组提高了45％，比酵母葡聚糖组提高了18％。这说明直链不含分支结构且聚合度为2-10的低分子量的β-1，3-葡寡糖诱导植物产生抗病性的效果更好。
本发明确定了可德兰寡糖在促进植物生长，形态建成，诱导植物抗病性方面的应用。其作为糖分子，完全能在自然界中降解，不污染环境，对促进环境友好与绿色农业具有明显效果。它是一种植物营养剂兼具促进生长剂(提高农作物的质量和产量15％)、诱导植物天然免疫抵御病害的新型生物农用剂。

Claims (6)

1.一种可德兰寡糖的应用，其特征在于：其可作为激发子诱导植物抗性，或作为生长促进剂促进植物生长发育；
所述可德兰寡糖是由葡萄糖分子通过β-(1→3)糖苷键连接而成的线性分子，不含有侧链结构，有别于其他含有侧链分支及带有化学基团修饰的葡聚糖；本发明所述的可德兰寡糖其聚合度(Degree of Polymerization，DP)为2-24，分子式是(C6H12O6)n，n＝2-24，其结构式如下图所示：
Figure FSA00000162199500011
2.按照权利要求1所述可德兰寡糖的应用，其特征在于：所述的可德兰寡糖能促进植物生长、提高产量，可作为植物生长促进剂。
3.按照权利要求2所述可德兰寡糖的应用，其特征在于：使用时，将质量浓度0.01-10％可德兰寡糖溶液喷洒于植物叶片或根部灌施或处理植物幼苗或种子，可以促进植物生长，提高产量。
4.按照权利要求1所述可德兰寡糖的应用，其特征在于：所述的可德兰寡糖具有诱导植物抗病性活性，可作为活性成份用于制备植物诱导抗病性的激发子类型的绿色生物农药。
5.按照权利要求4所述可德兰寡糖的应用，其特征在于：使用时，将质量浓度1-50μg/mL的混合物溶液喷洒于植物叶片上，可以诱导植物产生抗病毒、抗真菌的活性。
6.按照权利要求2、3、4或5所述可德兰寡糖的应用，其特征在于：所述植物为大豆、葡萄、水稻、烟草、黄瓜、玉米、草莓或苹果。
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