CN102300867A

CN102300867A - 新的发荧光的硼取代二吡咯甲烯及其用于诊断的用途

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Publication number: CN102300867A
Application number: CN2009801558239A
Authority: CN
Inventors: 让·德巴里; 科里纳·利埃茹瓦; 亚历山大·阿埃费莱; 托马斯·布拉; 吉勒斯·乌尔里希; 雷蒙德·齐塞尔
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Strasbourg
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Strasbourg
Priority date: 2008-12-29
Filing date: 2009-12-28
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2029-12-28
Also published as: EP2384329A1; WO2010076433A1; AU2009334648A1; CA2748313A1; IL213832A0; BRPI0923871B8; FR2940653B1; JP5924939B2; AU2009334648B2; EP2384329B1; US20110287473A1; IL213832A; FR2940653A1; US8993781B2; JP2012513973A; CN102300867B; CA2748313C; BRPI0923871B1; BRPI0923871A2

Abstract

本发明涉及新的荧光化合物即非氟化的二吡咯甲烯-硼衍生物、其制备方法及其用于生物分子荧光标记的用途。本发明还涉及用所述荧光化合物标记的生物分子，及其在检测方法(如医学诊断方法)中的用途。更特别地，本发明的检测方法特别可用于诊断神经退行性疾病如阿尔茨海默病。

Description

新的发荧光的硼取代二吡咯甲烯及其用于诊断的用途

本发明涉及新的荧光化合物即非氟化的二吡咯甲烯-硼衍生物、其制备方法及其用于生物分子荧光标记的用途。本发明还涉及用所述荧光化合物标记的生物分子，及其在检测方法如医学诊断方法中的用途；特别地，发现本发明的检测方法特别可用于诊断神经退行性疾病如阿尔茨海默病。

荧光标记物在免疫学、分子生物学、医学诊断或DNA芯片领域中常用于检测和/或评价生物分子。

在现有技术中可用作荧光标记物的多种化合物中，可特别提及的是二吡咯甲烯-硼(dipyrrométhènes-bore)的二氟化物(在下文中称为DFMB)。专利US 4,774,339、US 5,187,288和US 5,451,663描述了衍生自DFMB的含荧光官能团的化合物，其可用于标记生物分子或聚合物。

然而，所述DFMB衍生物在化学上不稳定；因此，在碱性介质中或在亲核试剂(如胺或醇)存在下，这些化合物的氟原子容易被替代。

国际专利申请WO 2006/087459和WO 2006/087458描述了衍生自非氟化的二吡咯甲烯-硼的化合物。这些化合物显示出比DFMB衍生物更好的化学稳定性；特别地，在自动肽合成期间，其耐受特别地用于氨基甲酸酯类型的基团(例如Fmoc)脱保护的碱性条件。

然而，仍然需要具有表现出如下特征的荧光化合物：

-进一步提高的化学稳定性；

-高的荧光量子产率和高的摩尔消光系数；

-可以控制的激发波长和发射波长；以及

-能够容易接枝到生物分子上的官能团。

本申请人通过开发新的通式(I)的荧光化合物实现了这一目的，所述通式(I)的荧光化合物是非氟化的二吡咯甲烯-硼衍生物，其具有使其可接枝到生物分子上的羰基官能团。通式(I)的化合物比标准荧光团如荧光素、罗丹明和二氟硼二氮杂引达省(difluoroboradiazaindacène)化学上更稳定；另外，这些化合物耐受在肽或寡核苷酸的固相载体合成中使用的各种试剂，因此，其特别适于标记氨基酸或核苷酸。

在本发明的上下文中，生物分子应理解为指氨基酸、多肽、蛋白质、生物素或者其衍生物或结构类似物、核苷酸或核酸(RNA、DNA)。

荧光团(也称为荧光化合物或标记物)是一种包含能够吸收一种波长(称为激发波长或吸收波长)的光能并通过在大于或等于该吸收波长的波长(称为发射波长)下的光辐射而释放所吸收的全部或部分能量的官能团的化合物；荧光团可以与分子(如生物分子)共价键合。

通常，当分子包含至少一个可检测的原子或原子团(如放射性原子或基团、生色团或荧光团)时，其被称为是标记的。

在本发明的上下文中，除非另有说明，当分子与荧光团共价键合时，其被称为是标记的。

标记应理解为指荧光团共价连接至生物分子的过程；所述生物分子优选地为氨基酸或核苷酸，然后，所述荧光团连接至所述氨基酸或核苷酸的侧链。

羰基官能团是下述结构的官能团：

存在于例如羧酸、酯、酰胺或硫代酯中。在本发明的上下文中，通式(I)化合物的羰基官能团定义为基团-(Ar)_m-CO-Z，其中Ar、m和Z定义如下。

因此，本发明更特别地涉及通式(I)的化合物：

其中：

-R¹选自-Ar-CO-Z、氢原子(-H)、-L-H、-G和-L-G，

其中Ar、Z、L和G定义如下；

-R³、R⁴、R⁶和R⁷彼此独立地选自：-(Ar)_m-CO-Z、氢原子(-H)、-L-H、-G和-L-G，

其中m为0或1，应当理解，取代基R¹、R³、R⁴、R⁶和R⁷中仅一个是-Ar-CO-Z或-(Ar)_m-CO-Z；优选地，R¹为-Ar-CO-Z；

-R²与R⁵相同或不同，彼此独立地选自：氢原子(-H)、-L-H、-G和-L-G，

其中L和G定义如下；

-S¹与S²相同或不同，为式-C≡C-L’-A的亲水基团，

其中L’和A定义如下；

-Ar选自C₅-C₁₄亚芳基或杂亚芳基，其上基团-CO-Z在邻位、间位或对位，优选地在对位；Ar优选地为苯、萘、蒽、芘、吡啶、嘧啶、噻吩或吡咯基；

-Z为能够将通式(I)化合物接枝到生物分子上的基团；特别地，Z选自-OH、-O-琥珀酰亚胺、-O-马来酰亚胺、-N-甘氨酸、-N-赖氨酸、Y-L″-NH₂、-Y-L″-COOH或-Y-L″-SH基团，其中Y选自N和O原子，并且L”定义如下；

-L和L”彼此独立地选自单键；任选地支链的C₁-C₁₀、优选C₁-C₆的碳链；C₆-C₁₆亚芳基，其上基团-H或-G相对于L、并且-NH₂、-COOH或-SH相对于L″而言处于邻位、间位或对位，优选对位；C₂-C₄亚烯基；C₂-C₄亚炔基；被1至10个氧原子间隔开的直链或支链的C₁-C₂₀碳链；被一至四个酰胺官能团-CO-NH-间隔开的直链或支链的饱和C₁-C₂₀碳链；核苷酸片段和/或糖片段；

-G选自琥珀酰亚胺基酯、硫代琥珀酰亚胺基酯、异硫氰酸酯、异氰酸酯、碘乙酰胺、马来酰亚胺、磺酰卤、氨基磷酸酯(phosphoramidite)、C₂-C₅烷基亚胺醚(alkylimidate)、C₆-C₁₀芳基亚胺醚(arylimidate)、酰基卤优选酰基氯和酰基溴、被C₁-C₄烷基取代的肼、被C₁-C₄烷基取代的羟胺、碳二亚胺和全氟苯酚；

-L’选自单键、C₁-C₁₀亚烯基或者被1至10个氧原子间隔开的直链或支链的饱和C₁-C₂₀碳链；

-A代表选自下述的基团：C₁-C₄烷基，优选甲基；磷酸酯基或磺酸酯基。

优选地，A为甲基、丙基磺酸酯(propyl sulfonate)、乙基磺酸酯(éthylsulfonate)或甲基磷酸酯(méthylphosphate)。

优选的C₆-C₁₆亚芳基选自苯、萘和蒽。

在本发明中，术语“C₁-C₄烷基”用于指包含1至4个碳原子的直链或支链烃基或环烷基；可以提及例如甲基、丙基、正丁基、异丙基等。

在本发明中，“C₂-C₄亚烯基”应理解为指2至4个碳原子的直链碳链，其在两个碳原子之间包含双键。

在本发明中，“C₂-C₄亚炔基”应理解为指2至4个碳原子的直链碳链，其在两个碳原子之间包含叁键。

在本发明中，“C₂-C₁₀亚烯基”应理解为指2至10个碳原子的直链碳链，其在两个碳原子之间包含至少一个双键。

优选地，在本发明的上下文中，被1至10个氧原子间隔开的直链或支链的饱和C₁-C₂₀碳链是聚(环氧乙烷)或聚(环氧丙烷)，其单元重复一至六次。

核苷酸片段应理解为指包含一个或多个核苷酸的直链。

糖片段应理解为指包含一个或多个糖单元的直链。

选择基团R¹至R⁷使得可改善所述化合物的性质，例如其荧光发射波长、其荧光量子产率、其溶解度及其偶极矩。

根据本发明的一个具体类型的化合物包括通式(I)的对称化合物，即其中R²与R⁵相同，R³与R⁶相同、R⁴与R⁷相同、S¹与S²相同，在此情况下，R¹是羰基官能团-Ar-CO-Z。

在下文中，通式(I)的化合物也由式P-(Ar)_m-CO-Z表示，其中P代表除了取代基R¹或R³或R⁴或R⁶或R⁷为基团-Ar-CO-Z或-(Ar)_m-CO-Z之外的整个通式(I)化合物，其中Ar、m和Z具有与如上相同的定义。

通式(I)的化合物除了能够易于接枝到生物分子上之外，还显示出多种优点：

-它们发射强的荧光强度，当将其连接到生物分子如蛋白质时，它们不会丧失该强度；

-其在化学上耐受在多肽或多核苷酸的制备期间固相载体合成的步骤；

-它们不会破坏其所连接的生物分子的性质。

根据本发明的化合物P-(Ar)_m-CO-Z的合成是由合成中间体二吡咯甲烯-硼衍生物进行的。该合成中间体是在PCT国际专利申请WO 2006/087459中描述的条件下，通过使二氟化合物DFMB与下式的格氏有机金属试剂(有机镁或有机锂)反应而获得的：S¹-MgX、S¹-LiX、S²-MgX或S²LiX，其中X为卤素原子；该反应使得可将基团S¹和S²引入到二氟化合物DFMB中。

该合成中间体具有式P-(Ar)_m-Q，其中P、m和Ar为如对于式(I)定义的，Q选自卤素原子，特别是I、Br或Cl；-O-三氟甲磺酸酯基团((三氟甲磺酸酯具有式-O-SO₂-CF₃，也称为Tf)、-O-甲苯磺酸酯基团(甲苯磺酸酯具有式-O-SO₂-C₆H₆-CH₃，也称为Ts)或-O-甲磺酸酯基团(甲磺酸酯具有式-O-SO₂-CH₃，也称为Ms)。

在下述物质的存在下，从该合成中间体P-(Ar)_m-Q开始，通过与一氧化碳源或一氧化碳反应将基团-Q转化成羰基官能团：

-亲核试剂，根据期望的羰基官能团的性质选择：选择水以获得羧酸，选择醇以获得酯，选择胺以获得酰胺以及选择硫醇以获得硫代酯，和

-基于钯的催化剂，例如Pd(PPh₃)₂Cl₂。

该合成的方案显示在图1中。

在该反应中使用的一氧化碳可以是未标记的、用¹³C原子标记的(具有可控制的从1至99％的标记率用于NMR监测)、或用¹⁴C原子标记用于放射性监测；这样的标记使得能够对用本发明荧光化合物(I)标记的生物分子进行附加监测。

有必要将羰基官能团-CO-Z引入到已经在硼上包含基团S¹和S²的合成中间体P-(Ar)_m-Q中；实际上，羰基官能团的存在与使用加成S¹和S²所必需的有机金属化合物是不相容的。

在实施例1中举例说明了制备通式(I)化合物的一个具体实例，其中所述羰基官能团是R¹。

类似地，如果位置R³或R⁴或R⁷或R⁶具有如上定义的基团-Q，则在一氧化碳或任何其它一氧化碳源的存在下，利用钯催化的偶联，可将羰基官能团直接引入这些位置。

因此，本发明的一个主题涉及一种制备通式(I)化合物的方法，其特征在于其包括在选自水、醇、胺或硫醇的亲核试剂和含钯催化剂的存在下，通过与一氧化碳反应而将合成中间体P-(Ar)_m-Q转化成通式(I)化合物；所述合成中间体是使得P为结构与待制备的通式(I)化合物相同的基团，但是基团R¹或R³或R⁴或R⁶或R⁷除外；其中R¹是基团-Ar-CO-Z，或者R³或R⁴或R⁶或R⁷是-(Ar)_m-CO-Z，Ar为针对式(I)所定义的，m为0或1，应当理解，如果R¹为羰基官能团-Ar-CO-Z，则m为1，Q选自卤素原子、-O-三氟甲磺酸酯、-O-甲苯磺酸酯或-O-甲磺酸酯。在一个有利的实施方案中，R¹为-Ar-CO-Z。

此外，本发明的一个主题是通式(I)化合物作为荧光标记物的用途。

由于其羰基官能团，式(I)化合物可以容易地接枝到生物分子如氨基酸、蛋白质、生物素或者其衍生物或结构类似物之一或者核苷酸上。

此外，根据其另一个主题，本发明涉及通式(II)的标记的生物分子(以下称为“标记生物分子”)：

P-(Ar)_m-CO-(X)_n-T (II)

其中：

-P、Ar和m如上所定义，m为0或1，应当理解，如果在R¹上取代有基团(Ar)_m-CO-(X)_n-T，则m为1；

-X为带有羧基、胺或硫醇官能团的间隔基；其为例如包含一至三个氨基酸的链，或者为可被2或3个氧原子间隔开且利用酰胺、醚、酯或硫代酯官能团或二硫桥共价结合至荧光团和生物分子的C₁-C₆亚烷基；

-n为等于0或1的整数，以及

-T为生物分子。

在本发明的上下文中，间隔基起到间隔开生物分子T与荧光团P的作用。优选地，间隔基是化学上惰性的，换言之，其不与其所间隔开的任何基团反应；特别地，其不影响荧光团的荧光，也不影响生物分子的生物活性。

作为生物分子，T选自天然或合成的氨基酸、多肽、蛋白质、生物素或者其衍生物或结构类似物、核苷酸或核酸(RNA、DNA)。

当T为氨基酸时，其选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸盐/酯或天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸盐/酯或谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。优选地，T为赖氨酸或甘氨酸。

当T为核苷酸时，其选自核糖核苷酸，例如腺苷、尿苷、鸟苷、胞苷或核糖胸腺嘧啶核苷，或者脱氧核糖核苷，例如脱氧腺苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷或脱氧核糖胸苷。

根据下述方法制备标记的生物分子。

当T为氨基酸或蛋白质时，通式(II)的标记生物分子的制备是由用带有羧酸的基团Z官能化的通式(I)化合物进行的；将所述化合物(I)先(i)转化成羟基琥珀酰亚胺或四氟苯酯，然后(ii)与氨基酸或蛋白质反应(用荧光染料标记蛋白质的指南-注释7.1http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-Th e-Handbook/)。

肽偶联还可以用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI，参见实施例1)进行。

在步骤(ii)中，可以有利地使用已经与保护基相连的氨基酸，所述保护基例如BOC(叔丁氧基羰基)、Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)、Bpoc(2-(4-联苯基)丙基(2)氧基羰基)、Nps(2-硝基苯基亚磺酰基)或Dts(二硫代琥珀酰基)，所述保护基被引入到参与多肽形成的氨基酸的胺官能团上；事实上，然后可将如此保护的标记氨基酸用于固相肽合成的标准技术中(Merrifield，R.B.J.Am.Chem.Soc.1963，85，2149-2154)。根据该合成，由于在其至少一个氨基酸上存在荧光团而获得荧光多肽。

根据本发明的一个变化方案，T为生物素或者其衍生物或结构类似物之一。在此情况下，通式(II)的标记生物分子的制备是由用带有羧酸的基团Z官能化的通式(I)化合物进行的；所述化合物(I)先(i)通过与脂肪族二胺(所述脂肪族二胺可以为1，6-二氨基己烷、1，3-二氨基丙烷或1，2-二氨基乙烷)的水解反应而转化成酰胺，然后(ii)通过本领域技术人员已知的任何标准方法与生物素或者具有游离羧酸官能团的其衍生物或结构类似物之一反应。

根据本发明的另一个变化方案，T为核苷酸。通式(II)的标记生物分子的制备则是由用带有羧酸的基团Z官能化的通式(I)化合物进行的；通过本领域技术人员已知的任何标准方法，使所述化合物(I)与具有游离胺官能团的修饰核苷酸反应。

然后，有利地使用该标记核苷酸进行标记寡核苷酸的合成。

存在多种用于合成寡核苷酸的技术；可特别提及的是受到Merrifield提议用于肽合成而启发的固相载体寡核苷酸合成，或者通过氨基磷酸酯方法合成寡核苷酸(Matteucci，M.D.；Caruthers，M.H.Tetrahedron Lett.1980，21，719-722；Matteucci，M.D.；Caruthers，M.H.J.Am.Chem.Soc.1981，103，3185-3191)。

标记的生物分子与配体的相互作用导致所述分子的荧光发射光谱改变；检测方法的开发来源于该性质。

来源于该性质的另一个优点是检测方法的实施可以用本发明的荧光团单独进行，并且不需要几个荧光团或荧光团-荧光抑制剂配对的组合，例如在如下情形下：如用于测量蛋白质间相互作用的FRET技术(荧光共振能量转移，参见Lopper等，Protein-protein interactions：identification，2007，Encyclopedia of Life Science)或实时PCR(Poitras等，La PCR en temps réel：principes et applications，2002，Reviews in Biology and Biotechnology，第2卷，N^o2，第2-11页)；然而，其没有阻止在这些技术中使用根据本发明的荧光团。

在本发明的上下文中，配体是在待检测样品中存在或不存在的分子；根据其与配体相互作用的性质选择生物分子。

荧光团的发射光谱可以通过本领域技术人员已知的任何标准方法来测量。优选地，所述荧光发射光谱应利用装有光谱检测器的荧光分光光度计或显微镜装置来测定；所述光谱以X轴为波长和Y轴为光强度的图表示。

因此，可测量标记生物分子在不同条件下(存在或不存在试验样品)荧光光谱的各向异性指数(l’indice d’anisotropie)。

光谱的各向异性指数(也称为光谱指数或变形指数)应理解为指代表相对于主荧光发射峰位置而言光谱不对称性的指数。

为测定所测量光谱的各向异性指数，对光谱进行分析，其包括通过使用非线性回归方法的解卷积(déconvolution)将其分解为作为组成部分的高斯曲线。计算这些高斯曲线的特征(峰位置、波幅、面积和分布)：

-峰位置对应于可观察到的最大光强度的波长；

-波幅是峰的光强度；

-面积是曲线下光强度的积分；

-分布是以波长表示的曲线的半高宽度。

在相同的光谱内，两个主要高斯曲线的波幅比或面积比使得可将荧光光谱的变形指数定义为在所记录光谱条件下的函数。在存在或不存在样品下，所测量的光谱变形指数值的变化使得可检测配体的存在和评价其比例。

在一个变化方案中，所述光谱的各向异性还可利用带通滤光器来测量。然后，使用利用不同的带通滤光器测量的荧光强度的比例来评价光谱的变形指数。

因此，根据其另一个主题，本发明涉及一种检测样品中通式(II)标记生物分子之配体的方法，包括下述步骤：

a)测量单独的测试样品的荧光发射光谱；所得光谱指定为“基线”；

b)测量标记生物分子在溶液中的荧光发射光谱；从所得光谱中减去基线，并计算变形指数；

c)将所述标记生物分子的溶液与所述测试样品一起孵育，获得混合物；

d)测量在步骤c)中得到的混合物的荧光发射光谱；从所得光谱中减去基线，并计算变形指数；

e)比较在步骤b)和d)中计算的变形指数，当所述指数不同时，检测配体与标记生物分子之间的相互作用。

优选地，在步骤b)中，所述生物分子是在溶液中，其中含有与在生物样品存在下测量标记分子之荧光光谱的溶液相同的组成。

根据本发明的一个变化方案，所述检测方法还可定量样品中的配体。为了实现这一点，预先建立所述光谱的变形指数值(作为配体量的函数)的校正曲线。

另外，如果所述配体可以表现出不同的构象(其可以是肽的情况，其三维构象可以根据其环境而变化)，与配体络合的标记生物分子的荧光光谱将根据配体构象而不同；该性质使得可实施定性检测配体的方法。

样品可以是生物来源的，即其代表器官、组织、细胞、微生物等的全部或部分。

所述样品也可以具有任何其它性质，其可以是例如(但不限于)食品，其中期望检测污染物(如不期望的或甚至致病的微生物、毒素或污染物如杀虫剂等)的不存在。

实施本发明的检测方法还可以用来诊断疾病。

因此，开发了用于诊断神经退行性疾病(如阿尔茨海默病)的方法。

寿命的普遍延长促进了神经退行性疾病特别是阿尔茨海默病的发病。这些病症构成了现代社会的重大社会问题和经济问题。临床检查联合医学成像和神经心理学试验仅仅能够在疾病的末期进行晚期诊断，而明确性诊断则只能通过死后检查脑组织获得，这并不令人满意。因此，已经研究了鉴定外周生物标志物的各种方式，所述外周生物标志物使得能够对疾病进行非侵入性诊断。

已经证实了在阿尔茨海默病中红细胞发生改变；这一改变是作为蛋白激酶C的构象异常而观察到的，其可由细胞内钙浓度的下调引起(Janoshazi等，Neurobiol.Aging 2006，27：245-251)。

另外，已经表明在阿尔茨海默病的病程中，在神经组织和血液中产生的人β-淀粉样肽可与红细胞表面相互作用(Mattson MP等，Brain Res 1997，771：147-153)，改变其钙内稳态。

在本发明的上下文中进行的试验表明，之前在低浓度未标记β-淀粉样肽1-42的存在下放入的活细胞(如红细胞)能够随后结合带有本发明中所述荧光团的β-淀粉样肽；该结合伴有荧光团的荧光光谱的特异性变形，使得可评价所述细胞之前暴露的未标记β-淀粉样肽1-42的浓度。因此，可定量在个体中循环的人β-淀粉样肽1-42。

更特别地，诊断阿尔茨海默病的方法实施了根据本发明的检测方法；其使得可评价样品中β-淀粉样肽1-42的量，其中：

-生物样品包含红细胞，例如血液；和

-标记的生物分子使得T为来源于β-淀粉样肽1-42的肽。

β-淀粉样肽1-42是序列SEQ ID No.：1的肽。

β-淀粉样肽1-42的衍生物应理解为指肽，其一个或多个氨基酸已经被用本发明通式(I)的荧光化合物标记的相同氨基酸替代；该衍生物还可以在其链的任何部分中包含标记氨基酸的一个或多个插入。

例如，β-淀粉样肽1-42的衍生物的制备描述在实施例1中，产生下述肽：

H-Asp-Ala-glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys^*-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH(SEQ ID NO：1)，

其中荧光团由16位赖氨酸携带。

可以标记不同于赖氨酸的氨基酸并用来制备β-淀粉样肽1-42的衍生物；这些氨基酸优选地为在其侧链具有胺或羧酸官能团的氨基酸。

在样品中测量荧光光谱的变形指数值，然后与校正曲线比较，使得可评价测试样品中存在的β-淀粉样肽1-42的比例。

为了实施该诊断方法，使用来源于健康对象的人红细胞并在递增浓度的β-淀粉样肽1-42的存在下预孵育18小时产生校正曲线。然后，根据本发明方法的步骤e)包括将步骤d)中获得光谱的变形指数与校正曲线进行比较。

因此，该方法使得可评价循环中β-淀粉样肽1-42的量，同时克服了由该肽与其它可溶性蛋白质(如血清白蛋白)相互作用而导致的测定困难。其构成了一种简单、快速和便宜的诊断阿尔茨海默病的原创方法。其也是一种预后方法，用于监测对该疾病的治疗功效的方法和利用疾病的细胞系或动物模型开发治疗剂的方法。

本发明方法的另一个方案使得可以鉴定能与标记生物分子的配体相互作用的化合物；这样的实施方案包括下述步骤：

a)测量标记生物分子在溶液中的荧光发射光谱，并计算其变形指数；

b)将所述标记生物分子的溶液与配体一起孵育，获得混合物1；

c)测量该混合物1的荧光发射光谱，并计算其变形指数；

d)将所述配体与所述测试化合物一起孵育，然后加入所述标记生物分子的溶液，获得混合物2；

e)测量该混合物2的荧光发射光谱，并计算其变形指数；

f)通过比较在步骤a)、c)和e)中计算的变形指数，检测配体与测试化合物之间的相互作用。

如此实施的方法使得可鉴定潜在的治疗剂，或者测量这种治疗试剂在体外和离体的功效。

本发明还涉及用于实施本发明检测方法的诊断试剂盒或试剂套装。这些试剂盒的特征在于它们包含至少一种适量的本发明通式(II)的标记生物分子，以及试剂和使用说明。

现在参照随后的附图和实施例对本发明进行更详细地描述。然而，必须清楚地理解，这些实施例仅仅作为本发明主题的示例给出，其决不构成对本发明的限制。

-图1显示合成本发明通式(I)化合物的方案。

-图2显示得到如实施例1中所述化合物1a-d至6a的合成方案(TEA＝三乙胺)

-图3显示得到如实施例1中所述化合物6a¹³-b和7a，7a¹³和b的合成方案(EDCI＝N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺，NHS＝N-羟基琥珀酰亚胺)。

-图4图示了在实施例3条件下荧光发射光谱的测量。图A显示在与未标记β-淀粉样肽1-42预孵育之前(实线)和预孵育之后(虚线)在PC12细胞的存在下，所记录的与化合物7a相连的β-淀粉样肽的荧光光谱，图B显示在上述条件下与化合物7a相连的β-淀粉样肽的荧光光谱的反卷积。

-图5是显示在不同浓度的如实施例4中所述未标记β-淀粉样肽(Ab)预孵育之后，与β-淀粉样肽1-42相连的化合物7a的光谱指数值的图。

-图6为显示在如实施例5中所述与未标记β-淀粉样肽1-42一起预孵育的大鼠红细胞存在下与化合物7a相连的β-淀粉样肽1-42的光谱指数值的变化的柱状图。

实施例1-根据本发明的其中R ¹ 为-Ar-CO-Z的通式(I)化合物的制备

选择本实施例的化合物1a-d至7a-b，使其光谱与目前最常用的荧光团一致，其中符号a：荧光素，符号b：罗丹明6G；符号c：TMR(四甲基罗丹明)和符号d：TOTO-3。

化合物1a-d至6a的合成方案显示在图2中。

按照如国际专利申请WO2006/087459中所描述的操作步骤，通过在60℃下使甲氧基乙氧基乙炔基有机金属(格氏试剂)对相应二氟产物(其可以如US专利4,744,339中所述进行制备)的作用得到化合物1a-d。

然后，在70℃下，在三乙胺和苯的混合物中在Pd(PPh₃)₂Cl₂催化剂存在下在一氧化碳气氛下将化合物1a-d带有的碘转化成羰基。

选择所用的亲核试剂，使得可直接获得多种官能团，然后，其可用于通过以下方式偶联到生物分子上：

-采用乙醇，以非常好的产率获得乙酯2a-d；

-利用过量的脂肪族二胺，可以获得4型化合物；

-当直接使用具有游离胺和经保护羧酸官能团(例如甘氨酸乙酯)的氨基酸时，可以直接引入氨基酸，得到5型化合物。

从化合物3a-d开始，根据图3中所示的合成方案，得到化合物7a、a¹³、b。带有上标“13”的化合物是用¹³C标记的。

可以在乙醇中的苛性钠的存在下，将化合物2a-d的酯官能团皂化，得到相应的羧酸3a-d(参见图2)。这些羧酸可以直接用于标记生物分子，或者与氨基酸类型的间隔基相连(使用如下在图3的合成方案中所示的针对化合物6a-b使用的肽偶联技术进行接枝)。

为了使其能够用于肽合成仪中，将化合物3a-b通过标准肽合成与甘氨酸酯偶联(EDC，DMAP)。如有必要，该步骤使得可引入例如用¹³C原子标记的片段(化合物5a¹³)以赋予可通过NMR追踪的能力。

然后将得到的化合物5a-b皂化成羧酸6a-b。

将酸6a-b转化成羟基琥珀酰亚胺酯，其直接与赖氨酸-Fmoc反应。

可以直接使用化合物7a-b，以将标记的氨基酸Lys引入到肽合成仪中。

化合物2a的制备

根据下述反应方案制备化合物2a：

向化合物1a(235mg，0.37mmol)在15mL苯中的溶液中加入1mL乙醇(17.2mmol)、44mg双三苯基膦二氯化钯(0.07mmol)和5mL三乙胺。在70℃下，通过“鼓入”一氧化碳搅拌该溶液1小时。将反应混合物用二氯甲烷萃取，并用水(3×20mL)洗涤。将有机相用亲水性棉花干燥，并蒸发。通过硅胶柱色谱(CH₂Cl₂/MeOH 99∶1或AcOEt/石油醚40∶60)纯化残余物，得到橙色粉末形式的化合物2a(210mg，97％)。

化合物2a的表征

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝1.33(s，6H)，1.42(t，3H，³J＝7.0Hz)，2.71(s，6H)，3.35(s，6H)，3.53(m，4H)，3.64(m，4H)，4.19(s，4H)，4.40(q，2H，³J＝7.0Hz)，6.00(s，2H)，7.78(AB对称，4H，J_AB＝8.5Hz，ν₀δ＝300.4Hz)；

¹³C{¹H}NMR(CDCl₃，100MHz，)：δ＝14.4，14.8，16.1，59.0，59.7，61.4，68.4，68.6，71.8，90.9，121.8，128.6，129.1，130.3，131.0，140.3，140.3，140.9，155.6，166.1；

¹¹B NMR(CDCl₃，128.4MHz)：δ＝-10.2(s)；

UV-可见(CH₂Cl₂)λnm(ε，M^-1 cm^-1)＝500(90000)，366(4900)，308(7700)；

FAB⁺m/z：585.2([M+H]⁺，100)；

元素分析-针对C₃₄H₄₁BN₂O₆的计算值：C，69.86；H，7.07；N，4.79。实测值：C，69.77；H，7.04；N，4.59。

化合物2b的制备

根据下述反应方案制备化合物2b：

向化合物1b(980mg，1.41mmol)在50mL苯中的溶液中加入3mL乙醇(17.2mmol)、240mg双三苯基膦二氯化钯(0.07mmol)和15mL三乙胺。在70℃下，通过“鼓入”一氧化碳搅拌该溶液一夜。将该反应混合物用二氯甲烷萃取，并用水(3×20mL)洗涤。将有机相用亲水性棉花干燥，并蒸发。通过硅胶柱色谱(AcOEt/石油醚20∶80；40∶60)纯化残余物，得到橙色粉末形式的化合物2b(895mg，定量)。

化合物2b的表征

¹H NMR(CDCl₃300MHz)：0.97(t，6H，³J＝7.40Hz)，1.23(s，6H)，1.43(t，3H，³J＝7.10Hz)，2.31(q，4H，³J＝7.40Hz)2.69(s，6H)，3.35(s，6H)，3.53(m，4H)，3.65(m，4H)，4.19(s，4H)，4.43(q，2H，³J＝7.10Hz)，7.78(AB对称，4H，J_AB＝8.19Hz，ν₀δ＝223.07Hz)；

¹³C NMR(CDCl₃，300MHz，)：δ＝12.03，14.07，14.41，14.76，17.40，29.78，59.02，59.79，61.37，68.57，71.85，90.67，128.60，128.95，130.19，130.81，133.11，136.02，138.77，141.27，154.05，166.28.

¹¹B NMR(CDCl₃，128.4MHz)：δ＝-10.2(s)；

UV-可见(CH₂Cl₂)λnm(ε，M^-1cm^-1)＝522(80000)，488(20000)，381(6400)，277(6400)。

化合物2c的制备

根据下述反应方案制备化合物2c：

向化合物1c(100mg，0.095mmol)在25mL苯中的溶液中加入1mL乙醇，24mg双三苯基膦二氯化钯和5ml三乙胺。在70℃下，通过“鼓入”一氧化碳搅拌该溶液一夜。将该反应混合物用二氯甲烷萃取，并用水(3×10mL)洗涤。将有机相用亲水性棉花干燥，并蒸发。通过硅胶柱色谱(AcOEt/石油醚80∶20；100％)纯化残余物，得到蓝色粉末形式的化合物2c(88mg，92％)。

化合物2c的表征

¹H NMR(CDCl₃ 200MHz)：1.40(s，6H)，1.44(t，3H，³J＝10.5Hz)3.15(m，4H)，3.19(s，6H)，3.41(s，6H)，3.50(m，4H)，3.59(m，4H)，3.74(m，4H)，3.88(m，4H)，4.15(s，4H)，4.18(m，4H)，4.41(q，2H，³J＝10.5Hz)，6.62(s，2H)，7.27(AB对称，8H，J_AB＝8.73Hz，ν₀δ＝120.73Hz)，7.60(AB对称，4H，J_AB＝16.26Hz，ν₀δ＝192.63Hz)7.83(AB对称，4H，J_AB＝8.34Hz，ν₀δ＝141.89Hz).

UV-可见(CH₂Cl₂)λnm(ε，M^-1 cm^-1)＝647(121 000)，373(72 800)。

化合物2d的制备

根据下述反应方案制备化合物2d：

向化合物1d(100mg，0.118mmol)在25mL苯中的溶液中加入2mL乙醇、24mg双三苯基膦二氯化钯(0.07mmol)和5mL三乙胺。在70℃下，通过“鼓入”一氧化碳搅拌该溶液一夜。将该反应混合物用二氯甲烷萃取，并用水(3×10mL)洗涤。将有机相用亲水性棉花干燥，并蒸发。通过硅胶柱色谱(AcOEt/石油醚 20∶80；40∶60)纯化残余物，得到蓝紫色粉末形式的化合物2d(82mg，88％)。

化合物2d的表征

¹H NMR(CDCl₃300MHz)：1.35(s，3H)，1.38(s，3H)，1.43(t，3H，³J＝7.15Hz)2.74(s，3H)，3.25(s，6H)，3.31(m，4H)，3.39(s，3H)，3.54(m，6H)，3.72(m，2H)，3.87(m，2H)，4.18(m，4H)，4.43(q，2H，³J＝7Hz)，6.02(s，1H)，6.59(s，1H)，7.22(AB对称，4H，J_AB＝8.67Hz，ν₀δ＝180.18Hz)；7.58(AB对称，2H，J_AB＝16.29Hz，ν₀δ＝297.72Hz)，7.85(AB对称，4H，J_AB＝7.99Hz，ν₀δ＝226.28Hz)。

化合物3a的制备

根据下述反应方案制备化合物3a：

向化合物2a(210mg，0.36mmol)在20mL乙醇中的溶液中加入215mg苛性钠(5.39mmol)。将溶液在环境温度下搅拌3小时。加入30-40mL乙酸乙酯。用水(3×20mL)萃取有机相。合并水相，并用1M HCl溶液酸化至pH1-2。

用二氯甲烷萃取水相。将有机相用亲水性棉花干燥，然后蒸干，得到橙色粉末形式的化合物3a(190mg，95％)。

化合物3a的表征

UV-可见(CH₂Cl₂)λnm(ε，M^-1cm^-1)＝501(72800)，366(4000)，307(6400)；

UV-可见(PBS缓冲液)λnm(ε，M^-1 cm^-1)＝494(71500)，364(3900)，307(4900)。

化合物3b的制备

根据下述反应方案制备化合物3b：

向化合物2b(840mg，1.31mmol)在50mL乙醇中的溶液中加入2.10g苛性钠(0.525mol)。将溶液在环境温度下搅拌1小时。加入30-40mL乙酸乙酯。用水(3×20mL)萃取有机相。合并水相，并用1M HCl溶液酸化至pH1-2。用二氯甲烷萃取水相。将有机相用亲水性棉花干燥，然后蒸干，得到橙色粉末形式的化合物3b(778mg，97％)。

UV-可见(PBS缓冲液)λnm(ε，M^-1 cm^-1)＝517(65 000)，378(3600)，320(5000)；

化合物3c的制备

根据下述反应方案制备化合物3c：

向化合物2c(80mg，0.080mmol)在20mL乙醇中的溶液中加入130mg苛性钠(3.22mmol)。将溶液在环境温度下搅拌1小时。加入10-20mL乙酸乙酯。用水(3×10mL)萃取有机相。合并水相，并用1M HCl溶液酸化至pH1-2。用二氯甲烷萃取水相。将有机相用亲水性棉花干燥，然后蒸干，得到蓝色粉末形式的化合物3c(70mg，90％)。

化合物3c的表征

¹H NMR(CDCl₃300MHz)：1.41(s，6H)，3.15(m，4H)，3.20(s，6H)，3.41(s，6H)，3.52(m，4H)，3.60(m，4H)，3.74(m，4H)，3.90(m，4H)，4.17(s，4H)，4.22(m，4H)，6.63(s，2H)，7.28(AB对称，8H，J_AB＝8.6Hz，ν₀δ＝120.59Hz)，7.61(AB对称，4H，J_AB＝16.12Hz，ν₀δ＝191.44Hz)7.88(AB对称，4H，J_AB＝8.19Hz，ν₀δ＝144.73Hz).

UV-可见(CH₂Cl₂)λnm(ε，M^-1 cm^-1)＝647(118000)，373(67800).

化合物3d的制备

根据下述反应方案制备化合物3d：

向化合物2d(80mg，0.10mmol)在20mL乙醇中的溶液中加入162mg苛性钠(4.05mmol)。将溶液在环境温度下搅拌1小时。加入10-20mL乙酸乙酯。用水(3×10mL)萃取有机相。合并水相，并用1M HCl溶液酸化至pH1-2。用二氯甲烷萃取水相。将有机相用亲水性棉花干燥，然后蒸干，得到橙色粉末形式的化合物3d(70mg，90％)。

化合物3d的表征

¹H NMR(CDCl₃300MHz)：1.36(s，3H)，1.39(s，3H)，2.74(s，3H)，3.26(s，6H)，3.32(m，4H)，3.40(s，3H)，3.56(m，6H)，3.73(m，2H)，3.88(m，2H)，4.18(m，6H)，6.03(s，1H)，6.59(s，1H)，7.22(AB对称，4H，J_AB＝8.67Hz，ν₀δ＝180.18Hz)；7.58(AB对称，2H，J_AB＝16.29Hz，ν₀δ＝297.72Hz)，7.85(AB对称，4H，J_AB＝7.99Hz，ν₀δ＝226.28Hz).

¹³C NMR(CDCl₃，300MHz，)：δ＝14.86，15.08，16.37，29.79，58.91，59.18，59.58，67.63，68.41，69.79，70.88，71.69，72.05，91.43，128.76，129.06，129.69，130.15，130.44，130.86，134.10，138.65，140.39，140.59，141.25，152.61，155.54，159.61，170.40.

UV-可见(PBS缓冲液)λnm(ε，M^-1 cm^-1)＝564(70000)，338(25000).

化合物4a的制备

根据下述反应方案制备化合物4a：

向化合物1a(200mg，0.31mmol)在15mL苯中的溶液中加入1mL乙二胺(15mmol)、66mg双三苯基膦二氯化钯(0.09mmol)和1mL三乙胺。在70℃下，通过“鼓入”一氧化碳搅拌该溶液一夜。将反应混合物用二氯甲烷萃取，并用水(3×20mL)洗涤。将有机相用亲水性棉花干燥，并蒸发。通过硅胶柱色谱(梯度为从CH₂Cl₂ 100％至CH₂Cl₂ 75∶25)纯化残余物，得到橙色粉末形式的化合物4a(160mg，80％)。

化合物4a的表征

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：δ＝1.34(s，6H)，2.72(s，6H)，3.01(t，2H，³J＝5.7Hz)，3.36(s，6H)，3.55(m，6H)，3.64(m，4H)，4.20(s，4H)，6.01(s，2H)，6.98(t，1H，³J＝5.5Hz)，7.69(AB对称，4H，J_AB＝8.3Hz，ν₀δ＝162.7Hz)；

¹³C{¹H}NMR(CDCl₃，75.4MHz，)：δ＝15.0，16.2，41.3，42.2，59.1，59.8，68.7，71.9，90.6，121.9，127.9，128.8，129.4，134.9，139.1，140.4，141.0，155.7，167.0；

¹¹B NMR(CDCl₃，128.4MHz)：δ＝-10.3(s)；

UV-可见(CH₂Cl₂)λnm(ε，M^-1 cm^-1)＝500(64 500)，371(5600)

FAB⁺m/z：599.2([M+H]⁺，100)；

元素分析-针对C₃₄H₄₃BN₄O₅的计算值：C，68.23；H，7.24；N，9.36。实测值：C，67.84；H，7.07；N，9.22。

化合物5a的制备

根据下述反应方案制备化合物5a：

向化合物1a(100mg，0.16mmol)在6mL无水甲苯中的溶液中加入80mg甘氨酸乙酯(0.47mmol)、22mg双三苯基膦二氯化钯(0.03mmol)和2mL三乙胺。在80℃下，通过“鼓入”一氧化碳搅拌该溶液6小时。将反应混合物通过硅藻土过滤，并部分蒸发。将残余物用二氯甲烷萃取，并用水(2×20mL)洗涤。将有机相用亲水性棉花干燥，并蒸发。通过硅胶柱色谱(AcOEt/石油醚50∶50)纯化残余物，得到橙色粉末形式的化合物5a(43mg，43％)。

化合物5a的表征

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：δ＝1.33(t，3H，³J＝7.2Hz)，1.34(s，6H)，2.72(s，6H)，3.36(s，6H)，3.55(m，4H)，3.66(m，4H)，4.20(s，4H)，4.27(d，2H，³J＝4.5Hz)，4.29(q，2H，³J＝7.1Hz)，6.01(s，2H)，6.77(t，1H，³J＝4.9Hz)，7.69(AB对称，4H，J_AB＝8.3Hz，ν₀δ＝156.4Hz)；

¹³C{¹H}NMR(CDCl₃，75.4MHz，)：δ＝14.3，14.9，16.2，42.1，59.1，59.8，61.9，68.7，71.9，91.0，121.9，127.9，129.0，129.3，134.2，139.5，140.2，141.0，155.8，166.7，170.2；

¹¹B NMR(CDCl₃，128.4MHz)：δ＝-10.3(s)；

UV-可见(CH₂Cl₂)λnm(ε，M^-1 cm^-1)＝501(84200)，366(4200)，309(6500).

化合物6a的制备

根据下述反应方案制备化合物6a：

向化合物5a(40mg，0.06mmol)在乙醇(10mL)中的溶液中加入苛性钠(60mg，1.2mmol)的水溶液。在环境温度下搅拌该溶液2小时。加入10-20mL乙酸乙酯。用水(2×20mL)萃取有机相。合并水相，并用1M HCl溶液酸化至pH 1-2。用二氯甲烷萃取产物。有机相经Na₂SO₄干燥，然后蒸干，得到橙色粉末形式的化合物6a(35mg，90％)。

化合物6a的表征

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ＝1.32(s，6H)，2.72(s，6H)，3.36(s，6H)，3.55(m，4H)，3.66(m，4H)，4.19(s，4H)，4.27(d，2H，³J＝3.4Hz)，4.87(b，1H)，6.01(s，2H)，7.04(t，1H，³J＝3.8Hz)，7.69(AB对称，4H，J_AB＝6.0Hz，ν₀δ＝160.2Hz)；

¹³C{¹H}NMR(CDCl₃，100MHz，)：δ＝14.9，16.2，42.0，59.0，59.7，68.6，71.8，90.9，121.9，128.0，129.0，129.3，133.8，139.6，140.2，140.9，155.8，167.3，172.3；

¹¹B NMR(CDCl₃，128.4MHz)：δ＝-10.2(s)；

UV-可见(CH₂Cl₂)λnm(ε，M^-1cm^-1)＝501(65 000)，366(3800)，309(5900)；

UV-可见(PBS缓冲液)λnm(ε，M^-1 cm^-1)＝496(59 600)，367(4100)，308(6100)。

化合物7a的制备

根据下述反应方案制备化合物7a：

在0℃下，向化合物6a(25mg，0.04mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(7mg，0.06mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液中加入12mg N-二甲基-3-氨基丙基-碳二亚胺(0.06mmol)。搅拌反应介质过夜，同时进行水浴以恢复至环境温度。将溶液在二氯甲烷中稀释，先用1M盐酸溶液(2×20mL)、用5％NaHCO₃溶液洗涤，然后用饱和NaCl溶液洗涤。有机相经Na₂SO₄干燥，然后在减压下蒸干。将残余物溶于乙腈(5mL)中。向该溶液中加入Fmoc-Lys-OH(16mg，0.04mmol)和K₂CO₃(11mg，0.08mmol)在乙腈/水混合物(5mL/1mL)中的溶液。在环境温度下搅拌该溶液1小时，然后将其用乙酸乙酯萃取。将有机相用水(2×20mL)洗涤，经MgSO₄干燥并蒸发。通过在洗脱的硅胶柱(梯度为从AcOEt 100％至AcOEt/EtOH 90∶10)上的色谱纯化残余物。合并水相，用1M盐酸溶液酸化至pH 1，并用二氯甲烷萃取。将得到的有机相经MgSO₄干燥，并蒸发。合并不同的级分，得到橙色粉末形式的化合物7a(25mg，64％)。

化合物7a的表征

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：δ＝1.27(s，6H)，1.35-1.82(m，6H)，2.67(s，6H)，3.21-3.31(m，8H)，3.49(m，4H)，3.61(m，4H)，3.99-4.36(m，10H)，5.95(s，2H)，7.22-7.39(m，6H)，7.54-7.58(m，2H)，7.70(d，2H，³J＝7.5Hz)，7.93(d，2H，³J＝7.7Hz)；

¹³C{¹H}NMR(CDCl₃，75.4MHz，)：δ＝14.7，16.0，23.4，28.6，31.5，31.9，39.1，43.3，53.6，58.9，59.6，67.0，68.5，71.7，90.7，118.8，120.0，121.8，123.3，125.1，127.1，127.8，128.0，129.2，129.8，133.9，139.4，140.2，140.9，141.3，143.8，143.9，155.6，156.4，167.5，169.2；

ESl m/z：986.4([M+Na]⁺，100).

化合物5a ¹³ 的制备

根据下述反应方案制备化合物5a¹³：

在0℃下，向化合物3a(570mg，1.025mmol)的二氯甲烷(30mL)溶液中加入294mg N-二甲基-3-氨基丙基碳二亚胺(1.537mmol)和187mg二甲基氨基吡啶(1.537mmol)。在环境温度下搅拌反应介质1小时。然后，向该溶液中加入142mg碳13标记的甘氨酸酯(1.127mmol)。在环境温度下搅拌反应介质1小时。将溶液在二氯甲烷中稀释，用水(2×20mL)、5％NaHCO₃溶液洗涤，然后用饱和NaCl溶液洗涤。有机相经Na₂SO₄干燥，然后在减压下蒸干。残余物通过在硅胶柱色谱纯化，用乙酸乙酯/石油醚梯度20/80、30/70、40/60洗脱，得到橙色粉末形式的化合物5a¹³(527mg，82％)。

化合物5a ¹³ 的表征

¹H NMR(CDCl₃300MHz)：1.32(s，6H)，2.71(s，6H)，3.34(s，6H)，3.52(m，4H)，3.64(m，4H)，4.02(d，1H，¹J＝141.3Hz，³J＝4.4Hz)，4.18(s，4H)，4.50(d，1H，¹J＝141.3Hz，³J＝4.4Hz)，6.00(s，2H)，6.85(s，1H)，7.68(AB对称，4H，J_AB＝8Hz，ν₀δ＝159.56Hz).

¹³C NMR(CDCl₃，300MHz，)：δ＝14.72，16，41.72，52.48，58.86，59.54，68.44，71.66，76.57，77，77.42，121.66，127.78，128.71，129.06，133.88，139.24，140，140.72，155.51，166.58，169.976，170.79.

化合物6a ¹³ 的制备

根据下述反应方案制备化合物6a¹³：

向化合物5a¹³(500mg，0.795mmol)的乙醇(30mL)溶液中加入苛性钠(1.27g，32mmol)的水溶液。在环境温度下搅拌溶液2小时。加入20-30mL乙酸乙酯。用水(3×20mL)萃取有机相。合并水相，并用1M HCl溶液酸化至pH1-2。用二氯甲烷萃取水相。将有机相用亲水性棉花干燥，然后蒸干，得到橙色粉末形式的化合物6a¹³(464mg，95％)。

化合物6a ¹³ 的表征

¹H NMR(CDCl₃300MHz)：δ＝1.29(s，6H)，2.70(s，6H)，3.34(s，6H)，3.52(m，4H)，3.65(m，4H)，3.93(s，1H，¹J＝140.6Hz)，4.17(s，4H)，4.39(s，1H，¹J＝140.6Hz)，7.67(AB对称，H，J_AB＝7.72Hz，ν₀δ＝177.95Hz).

¹³C NMR(CDCl₃，300MHz，)：δ＝14.72，15.43，16.03，42.20，43.02，54.94，58.36，58.85，59.55，68.46，71.63，76.57，90.76，121.74，127.94，128.74，129.05，133.70，139.35，139.94，140.68，140.78，155.26，155.48，155.57，167.35。

化合物7a ¹³ 的制备

根据下述反应方案制备化合物7a¹³：

在0℃下，向化合物6a¹³(430mg，0.7mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(120mg，1.05mmol)在二氯甲烷(50mL)中的溶液中加入207mg N-二甲基-3-氨基丙基碳二亚胺(1.05mmol)。搅拌反应介质一夜，同时进行水浴恢复到环境温度。将溶液在二氯甲烷中稀释，用1M盐酸溶液(3×20mL)、5％NaHCO₃溶液洗涤，然后用饱和NaCl溶液洗涤。有机相经Na₂SO₄干燥，然后在减压下蒸干。将残余物溶于乙腈(50mL)中。向该溶液中加入Fmoc-Lys-OH(566mg，1.40mmol)和K₂CO₃(193mg，1.40mmol)在乙腈/水混合物(15mL/5mL)中的溶液。在环境温度下搅拌该溶液2小时，然后将其用乙酸乙酯萃取。将有机相用水(3×20mL)洗涤，经MgSO₄干燥并蒸发。通过硅胶柱色谱纯化残余物，用AcOEt 100％至AcOEt/EtOH 90∶10的梯度洗脱。合并不同的级分，得到橙色粉末形式的化合物7a¹³(539mg，80％)。

化合物7a ¹³ 的表征

¹H NMR(MeOD 400MHz 60℃)：δ＝1.18(m，1H)，1.22(s，6H)，1.40(m，2H)，1.53(m，2H)，2.71(s，6H)，3.23(t，2H，³J＝6.72Hz)3.34(s，6H)，3.51(m，4H)，3.63(m，4H)，4.14(s，4H)，4.18(t，1H，³J＝5.10Hz)，4.21(d，2H，¹JHC¹³＝140Hz)，6.04(s，2H)，7.25(m，2H)，7.33(m，4H)，7.61(m，2H)，7.71(d，2H)，8.01(d，2H).

化合物5b的制备

根据下述反应方案制备化合物5b：

在0℃下，向化合物3b(600mg，0.979mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液中加入280mg N-二甲基-3-氨基丙基碳二亚胺(1.47mmol)和180mg二甲基氨基吡啶(1.47mmol)。在环境温度下搅拌该反应介质1小时。然后向该溶液中加入205mg甘氨酸酯(1.47mmol)。在环境温度下搅拌反应介质1小时。将溶液在二氯甲烷中稀释，用水(2×20mL)、5％NaHCO₃溶液洗涤，然后用饱和NaCl溶液洗涤。有机相经Na₂SO₄干燥，然后在减压下蒸干。通过硅胶柱色谱纯化残余物，用乙酸乙酯/石油醚20/80、30/70、40/60梯度洗脱，得到橙色粉末形式的化合物5b(560mg，82％)。

化合物5b的表征

¹H NMR(CDCl₃300MHz)：0.97(t，6H，³J＝7.35Hz)，1.22(s，6H)1.31(t，2H，³J＝7.10Hz)，2.28(q，4H，³J＝7.5Hz)2.68(s，6H)，3.34(s，6H)，3.53(m，4H)，3.64(m，4H)，4.18(s，4H)，4.25(m，4H)，6.84(t，1H，³J＝4.7Hz)，7.78(AB对称，4H，J_AB＝8.5Hz，ν₀δ＝300.4Hz)；

¹³C NMR(CDCl₃，300MHz，)：δ＝12.08，14.05，14.25，14.75，15.34，17.38，29.72，42.05，59，59.76，61.85，68.55，71.83，90.62，127.81，128.66，129.16，133.11，133.91，136.02，138.60，140.27，154.04，166.80，170.14。

化合物6b的制备

根据下述反应方案制备化合物6b：

向化合物5b(510mg，0.732mmol)的乙醇(50mL)溶液中加入苛性钠(1.20g，30mmol)的水溶液。在环境温度下搅拌该溶液2小时。加入20-30mL乙酸乙酯。用水(3×20mL)萃取有机相。合并水相，并用1M HCl溶液酸化至pH 1-2。用二氯甲烷萃取水相。将有机相用亲水性棉花干燥，然后蒸干，得到橙色粉末形式的化合物6b(490mg，定量)。

化合物6b的表征

¹H NMR(CDCl₃ 300MHz)：δ＝0.96(t，6H，³J＝7.3Hz)，1.22(s，6H)，2.30(q，4H，³J＝7.3Hz)，2.68(s，6H)，3.34(s，6H)，4.19(s，4H)，3.54(m，4H)，3.66(m，4H)，4.18(s，4H)，4.26(d，2H，³J＝4.8Hz)，7.13(t，1H，³J＝4.8Hz)，7.40(AB对称，H，J_AB＝6.0Hz，ν₀δ＝160.2Hz)；

¹³C NMR(CDCl₃，300MHz，)：δ＝12.08，14.03，14.73，17.35，41.93，58.91，59.71，68.48，71.74，90.51，127.90，128.60，129.18，133.14，133.57，136.01，138.54，140.39，154.04，167.35，172.29.

化合物7b的制备

根据下述反应方案制备化合物7b：

在0℃下，向化合物6b(430mg，0.643mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(112mg，0.968mmol)在二氯甲烷(50mL)中的溶液中加入190mg N-二甲基-3-氨基丙基碳二亚胺(0.968mmol)。搅拌该反应介质一夜，同时进行水浴恢复至环境温度。将溶液在二氯甲烷中稀释，用1M盐酸(3×20mL)、5％NaHCO₃溶液洗涤，然后用饱和NaCl溶液洗涤。有机相经Na₂SO₄干燥，然后在减压下蒸干。将残余物溶于乙腈(50mL)中。向该溶液中加入Fmoc-Lys-OH(522mg，1.29mmol)和K₂CO₃(180mg，1.29mmol)在乙腈/水混合物(15mL/5mL)中的溶液。在环境温度下搅拌该溶液2小时，然后将其用乙酸乙酯萃取。有机相用水(3×20mL)洗涤，经MgSO₄干燥并蒸发。通过硅胶柱色谱纯化残余物，用AcOEt 100％至AcOEt/EtOH 90∶10的梯度洗脱。合并不同的级分，得到橙色粉末形式的化合物7b(491mg，75％)。

化合物7b的表征

¹H NMR(MeOD 400MHz 60℃)：δ＝0.98(t，6H，³J＝7.50Hz)，1.26(s，6H)，1.41(m，2H)，1.55(m，2H)，2.33(q，4H，³J＝7.50Hz)，2.71(s，6H)，3.24(t，2H，³J＝5.10Hz)3.34(s，6H)，3.51(m，4H)，3.63(m，4H)，4.06(s，3H)，4.14(s，4H)，4.19(t，1H，³J＝5.10Hz)，4.37(m，2H)，7.30(m，6H)，7.62(m，2H)，7.87(AB对称，H，J_AB＝7.66Hz，ν₀δ＝112.84Hz)。

实施例2-包含用本发明通式(I)化合物标记的赖氨酸的肽的合成

在肽自动合成仪中使用根据实施例1制备的化合物7a(标记赖氨酸)替代在下述对应于人β-淀粉样肽1-42的氨基酸序列16位的赖氨酸：

H-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys^*-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH(SEQ ID NO：1).

在实施例3、4和5中使用该肽，在下文中称为标记淀粉样肽。

实施例3和4通用的方案

在用胶原和多聚鸟氨酸处理之前，将PC12细胞(来源于雄性大鼠肾上腺髓质肿瘤)接种于玻璃底培养皿中。在37℃下，在含有谷氨酰胺并补充有10％马血清、5％胎牛血清、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，在包含5％CO₂的气氛下将其培养7天。为了诱导细胞分化，在接种24小时之后，将50ng/mL的小鼠神经营养生长因子(NGF)2.5S加入到该培养基中。

在测量前一天，加入浓度为10至1000nmol.L^-1之间的不同浓度的未标记的SEQ.ID.No.：1的β-淀粉样肽1-42或相应未标记的SEQ ID No.：2的反肽(peptide inverse)(42-1)。

第二天，在环境温度下用Krebs培养基洗涤该制品3次，并置于与荧光分光光度计相连的倒置显微镜上。在加入标记淀粉样肽(250nmol.L^-1)之前，记录基线的荧光光谱(激发波长480nm；发射波长495-600nm)。在孵育10分钟之后记录第二次荧光光谱。

实施例3-在与来标记的β-淀粉样肽一起预孵育之后，测量与β-淀粉样肽 1-42偶联的化合物7a的光谱指数值

从标记淀粉样肽的荧光光谱中减去基线光谱。通过如图4所示的解卷积和非线性回归，将所得光谱分解为4种作为组成部分的高斯曲线，利用光谱解卷积软件(Peakfit，Seasolve Software Inc.，www.seasolve.com)(图A)，可将该荧光光谱(黑线)分解为作为组成部分的高斯曲线(不同灰度的线)。中心分别位于525nm和540nm的高斯曲线的幅度比(由图测或用解卷积软件测量)定义了描述光谱分布的光谱指数。

图B显示在未标记β-淀粉样肽1-42存在下，在PC12细胞存在下，在预孵育PC12细胞之前(实线)和之后(虚线)所记录的标记淀粉样肽的荧光光谱的解卷积。当在未标记β-淀粉样肽1-42存在下预先放置所述细胞时，观察到中心为525nm的所述高斯曲线的幅度的相当大增加，其引起光谱指数增加。

因此，观察到将细胞与未标记的β-淀粉样肽1-42一起预孵育导致光谱的变化，并且可以在样品中检测出β-淀粉样肽1-42的存在。

实施例4-在与不同浓度来标记β-淀粉样肽一起预孵育之后，测量与β-淀粉样肽1-42偶联的化合物7a的光谱指数值

根据相同的实验原理，在不同浓度的SEQ ID No.：1的未标记β-淀粉样肽预孵育之后，测量与β-淀粉样肽1-42偶联的化合物7a的光谱指数值。

在未标记的β-淀粉样肽1-42或42-1的存在下，将PC12细胞预孵育12小时，然后洗涤，之后置于与荧光分光计相连的显微镜下。记录第一光谱(基线)。

接着，加入标记β-淀粉样肽。在加入荧光化合物之后，记录光谱10分钟。

光谱指数为通过解卷积计算的第一和第二高斯曲线的幅度之比(参见图4)。

结果显示在图5中：

-在不存在未标记β-淀粉样肽1-42下(第一个直方图)，

-在100nM未标记β-淀粉样肽1-42的存在下(第二个直方图)，

-在250nM未标记β-淀粉样肽1-42的存在下(第三个直方图)，

-在250nM未标记β-淀粉样肽42-1的存在下(第四个直方图)。

探针的荧光光谱指数的值作为在细胞预孵育期间存在的未标记β-淀粉样肽1-42的浓度的函数而变化。当在无活性的β-淀粉样肽42-1的存在下孵育所述细胞时，也观察到光谱指数值没有变化。(Student’s t检验：对于Ab0nM，^***p＜0.5％；对于Ab 1-42 250nM，^○○p＜1％)。该图代表了一式三份测量的4个独立实验。

图5表明所述比值的变化特异性地受到β-淀粉样肽1-42的诱导，并且该值随预孵育肽的浓度增加而增加；另外，可见β-淀粉样肽42-1对于所述比值没有显著影响。

因此，对所述探针的荧光光谱进行分析使得可评价预孵育细胞所用的β-淀粉样肽的浓度。

实施例5-在与来标记的β-淀粉样肽1-42一起预孵育的大鼠红细胞的存在下，偶联化合物7a的β-淀粉样肽1-42的光谱指数值的变化。

将大鼠血液样品(1至3ml)收集在肝素化管中。将样品用Krebs培养基稀释，然后离心三次，弃去缓冲液层(“血沉棕黄层”)。接着在不同浓度(10-1000nmol.L^-1)的未标记β-淀粉样肽1-42或相应的未标记反肽(42-1)的存在下，将所得红细胞在37℃下孵育2小时。在再次洗涤之后，将细胞置于荧光分光光度计中，记录基线的荧光光谱(激发波长：480nm；发射波长：495-600nm)，之后加入标记淀粉样肽(250nmol.L^-1)。在标记淀粉样肽存在下孵育10分钟之后，记录第二荧光光谱。

从标记β-淀粉样肽的荧光光谱中减去基线光谱。通过解卷积和非线性回归，将所得光谱分解成4种作为组成部分的高斯曲线。计算中心以约510nm为中心的高斯曲线的幅度与以约530nm为中心的高斯曲线的幅度的比值。其值作为未标记β-淀粉样肽1-42浓度的函数而变化，在所述未标记β-淀粉样肽1-42的存在下孵育细胞，如图6所示。

图6的直方图显示光谱指数值作为在预孵育所述细胞期间使用的未标记β-淀粉样肽之浓度的函数而增加。

Claims

1.通式(I)的化合物：

其中：

-R¹选自-Ar-CO-Z、氢原子(-H)、-L-H、-G和-L-G，

其中Ar、Z、L和G定义如下；

其中m为0或1；

应当理解取代基R¹、R³、R⁴、R⁶和R⁷中仅一个是-Ar-CO-Z或-(Ar)_m-CO-Z；

-R²和R⁵相同或不同，彼此独立地选自：氢原子(-H)、-L-H、-G和-L-G，

其中L和G定义如下；

-S¹和S²相同或不同，为式-C≡C-L’-A的亲水基团，

其中L’和A定义如下；

-Ar选自C₅-C₁₄亚芳基或杂亚芳基，其上基团-CO-Z在邻位、间位或对位，优选地在对位；

-Z选自-OH、-O-琥珀酰亚胺、-O-马来酰亚胺、-N-甘氨酸、-N-赖氨酸、Y-L″-NH₂、-Y-L″-COOH或-Y-L″-SH基团，其中Y选自N和O原子，并且L”定义如下；

-L和L”彼此独立地选自单键；任选地支链的C₁-C₁₀、优选C₁-C₆的饱和碳链；C₆-C₁₆亚芳基，其上基团-H或-G相对于L、并且-NH₂、-COOH或-SH相对于L″而言处于邻位、间位或对位，优选对位；C₂-C₄亚烯基；C₂-C₄亚炔基；被1至10个氧原子间隔开的直链或支链C₁-C₂₀碳链；被一至四个酰胺官能团-CO-NH-间隔开的直链或支链的饱和C₁-C₂₀碳链；核苷酸片段和/或糖片段；

-G选自琥珀酰亚胺基酯，硫代琥珀酰亚胺基酯，异硫氰酸酯，异氰酸酯，碘乙酰胺，马来酰亚胺，磺酰卤，氨基磷酸酯，C₂-C₅烷基亚胺醚，C₆-C₁₀芳基亚胺醚，酰基卤优选酰基氯和酰基溴，被C₁-C₄烷基取代的肼，被C₁-C₄烷基取代的羟胺，碳二亚胺和全氟苯酚；

-L’选自单键、C₁-C₁₀亚烯基或者被1至10个氧原子间隔开的直链或支链的饱和C₁-C₂₀碳链；以及

-A代表选自以下的基团：C₁-C₄烷基、优选甲基，磷酸酯基或磺酸酯基。

2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于R¹为-Ar-CO-Z。

3.如权利要求1或2所述的化合物，其特征在于其是对称的，R²与R⁵相同，R³与R⁶相同，R⁴与R⁷相同，S¹与S²相同，并且R¹是所述羰基官能团-Ar-CO-Z。

4.如前述权利要求中任一项的化合物，其特征在于Ar选自苯、萘、蒽、芘、吡啶、嘧啶、噻吩或吡咯。

5.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于A选自甲基、丙基磺酸酯、乙基磺酸酯或甲基磷酸酯。

6.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于所述被1至10个氧原子间隔开的直链或支链的饱和C₁-C₂₀碳链为聚(环氧乙烷)或聚(环氧丙烷)，其单元重复一至六次。

7.一种制备如权利要求1至6中任一项所述的通式(I)化合物的方法，其特征在于，其包括在选自水、醇、胺或硫醇的亲核试剂和含钯催化剂的存在下，通过与碳源反应将合成中间体P-(Ar)_m-Q转化成通式(I)化合物；

所述中间体是使得P为结构与待制备的通式(I)化合物相同的基团，但是基团R¹或R³或R⁴或R⁶或R⁷除外，其中R¹是-Ar-CO-Z，或者R³或R⁴或R⁶或R⁷是-(Ar)_m-CO-Z，Ar如式(I)所定义，m为0或1，应当理解，如果R¹为羰基官能团-Ar-CO-Z，则m为1，Q选自卤素原子、-O-三氟甲磺酸酯/盐、-O-甲苯磺酸酯/盐或-O-甲磺酸酯/盐。

8.如权利要求1至6中任一项所述的通式(I)化合物作为荧光标记物的用途。

9.通式(II)的标记的生物分子：

P-(Ar)_m-CO-(X)_n-T (II)

其中：

-P为如权利要求1至6中任一项所述的通式(I)的化合物，不同之处在于基团R¹或R³或R⁴或R⁶或R⁷为基团-(Ar)_m-CO-Z，

-Ar选自C₅-C₁₀亚芳基或杂亚芳基，其上的-CO-Z基团在邻位、间位或对位，优选对位，

-m为0或1，应当理解，如果-(Ar)_m-CO-(X)_n-T基团在R¹有取代，则m为1，

-X为带有羧基、胺或硫醇官能团的间隔基，

-n为等于0或1的整数，以及

-T为生物分子。

10.如权利要求9所述的标记的生物分子，其特征在于T选自天然或合成的氨基酸，多肽，生物素或者其衍生物或结构类似物之一，核苷酸或核酸。

11.如权利要求9或10所述的标记的生物分子，其特征在于T为来源于SEQ ID No.：1的β-淀粉样肽1-42的肽。

12.如权利要求9至11中任一项所述的标记的生物分子，其特征在于X选自包含至少一种氨基酸的链或可以被2至3个氧原子间隔的C₁-C₆亚烷基。

13.制备权利要求9至12中任一项所述生物分子的方法，其中T为氨基酸，所述方法的特征在于包括将其中Z包含末端羧酸的如权利要求1至6中任一项所述的通式(I)化合物转化成羟基琥珀酰亚胺酯的步骤和与T反应的步骤。

14.如权利要求9或权利要求10中所述生物分子的制备方法，其中T为生物素或者其衍生物或结构类似物之一，所述方法的特征在于其是由用带有羧酸的基团Z官能化的如权利要求1至6中任一项所述的通式(I)化合物实施的；所述化合物(I)：(i)通过与脂肪族二胺的水解反应转化成酰胺，然后(ii)与生物素或其具有游离羧酸官能团的衍生物或结构类似物之一反应。

15.如权利要求9或权利要求10所述生物分子的制备方法，其中T为核苷酸，所述方法的特征在于其是由用带有羧酸的基团Z官能化的如权利要求1至6中任一项所述的通式(I)化合物实施的，所述化合物(I)与具有游离胺官能团的经修饰核苷酸反应。

16.一种检测样品中如权利要求9至12中任一项所述标记生物分子之配体的方法，其特征在于其包括下述步骤：

a)测量单独的待测试样品的荧光发射光谱，所得光谱指定为“基线”；

b)测量标记生物分子在溶液中的荧光发射光谱；从所得光谱中减去基线，并计算变形指数，

c)将所述标记生物分子的溶液与所述待测试样品一起孵育，获得混合物；

d)测量在步骤c)中得到的所述混合物的荧光发射光谱；从所得光谱中减去所述基线，并计算变形指数，以及

e)比较在步骤b)和d)中计算的变形指数，并且当所述指数不同时，检测所述配体与所述标记生物分子之间的相互作用。

17.一种诊断阿尔茨海默病的方法，其特征在于其实施如权利要求16所述的方法，其中所述配体为β-淀粉样肽1-42，所述样品包含红细胞，并且所述标记生物分子为如权利要求11所述的标记生物分子。

18.一种鉴定能够与如权利要求9至12中任一项所述标记生物分子之配体相互作用的化合物的方法，包括下述步骤：

a)测量所述标记生物分子在溶液中的荧光发射光谱，并计算其变形指数，

b)将所述标记生物分子的溶液与配体一起孵育，获得混合物1，

c)测量该混合物1的荧光发射光谱，并计算其变形指数，

d)将所述配体与所述待测试化合物一起孵育，然后加入在所述标记生物分子的溶液，获得混合物2，

e)测量该混合物2的荧光发射光谱，并计算其变形指数，

f)通过比较在步骤a)、c)和e)中计算的变形指数来检测所述配体与所述待测试化合物之间的相互作用。

19.一种用于实施如权利要求16或17中所述方法的诊断试剂盒，其特征在于，其包含至少一种如权利要求9至12中任一项所述的标记生物分子。