CN102288597A - 一种快速简便的多肽残留检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速简便的多肽残留比色检测方法，将双缩脲比色反应用于多肽的残留检测，与阳性对照液进行对比，可对合成多肽生产过程中所使用的仪器及容器清洗后多肽的残留量进行限度检测，用于多肽物质日常生产中仪器及容器的清洗效果监控及清洗验证的检测。双缩脲试剂由试剂A和试剂B组成，试剂A为0.1g/ml的氢氧化钠溶液，试剂B为0.01g/ml的硫酸铜溶液，使用时先加入2ml试剂A，振荡摇匀，造成碱性的反应环境，然后再加入4滴试剂B。双缩脲试剂一般用于蛋白质的含量测定，本发明利用了其专属低的特点，将其用于所有多肽的残留检测，同时解决了其灵敏度差的弊端，使其能够适用于10ppm的多肽残留的检测。

Description

一种快速简便的多肽残留检测方法
技术领域
本发明涉及一种快速简便的多肽残留比色检测方法，可对多肽合成生产过程中所使用的容器清洗后的多肽残留量进行检测，属化学分析领域。
背景技术
多肽是由氨基酸缩合而成的合化物，不同多肽由不同数量的氨基酸组成，结构中含有不同数量的肽键，肽键(-CO-NH-)的结构与双缩脲相似，也会发生双缩脲反应。因此双缩脲试剂可用做蛋白质或多肽的检测，其颜色深浅与蛋白质或多肽的浓度成正比，可以用比色法进行测定。
多肽生产过程中有合成、纯化、冻干等工序，使用的容器有合成罐、周转瓶、冻干盘等，由于不同品种多肽的合成生产工艺类似，使用的容器一致，故合成罐、周转瓶、冻干盘等容器可多个品种共用。为防止交叉污染，如何判断容器是否清洗干净非常重要。
目前，判断容器是否清洗干净的方法为制定一种清洗程序，然后验证该方法的清洗效果，不同品种需使用不同的试验条件检测容器淋洗水中各多肽的残留量。这种方法有两个弊端：一是试验过程繁琐，一般采用高效液相法，虽然方法灵敏度高，但运行费用也高，不同的多肽使用的试验条件不同，每个品种的检测方法都需要进行方法学验证；二是由于检测所用时间长，不能用于即时监控检测。
为此，人们不断地对多肽物质残留检测方法进行改进，以期获得试验过程更简单、更可靠的，而且可用于所有多肽物质残留检测的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单、快捷可靠、可用于所有多肽物质的残留检测方法，以克服以往这类检测操作烦琐、运行费用高、不能即时监控的缺点，可检测10ppm的多肽残留。
本方法的检测原理如下：
双缩脲(H2NOC-NH-CONH2)是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与Cu2+反应生成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。肽键(-CO-NH-)的结构与双缩脲相似，也会发生双缩脲反应。因此双缩脲试剂可用做蛋白质或多肽的检测，其颜色深浅与蛋白质或多肽的浓度成正比，可以用比色法进行测定。
由于该方法是对肽键的检测，故专属性低，适用于所有蛋白及多肽的检测，但该方法灵敏度差、所需样品量大，不能直接用于蛋白及多肽的残留检测。
本发明利用双缩脲试剂的变色反应专属性低的特点，将其用于所有多肽的残留检测，解决了方法灵敏度差的问题，并进行了方法学研究，确定了比色用对照品的配制方法。
本发明的技术说明如下：
1.试剂配制及使用方法
双缩脲试剂由试剂A和试剂B组成，试剂A为0.1g/ml的氢氧化钠溶液，试剂B为0.01g/ml的硫酸铜溶液，使用时先加入2ml试剂A，振荡摇匀，造成碱性的反应环境，然后再加入4滴试剂B。
试剂配制及使用时应注意：
⑴    硫酸铜可用含结晶水的固体试剂直接配制，不需折算；
⑵    使用时最好将试剂A和试剂B按顺序加入，如将两者现混现用，最终也能得到兰紫色的络合反应结果，但两者混合后产生难溶性的Cu(OH)2，影响Cu2+与肽键的络合反应速度，而且Cu(OH)2的兰色会影响结果判定；
⑶ 使用时试剂A与试剂B的用量为2ml:4滴，试剂A用量偏少时碱性不足，不能发生络合反应，放置一定时间后会出现棕色沉淀，Cu2+被还原成Cu2O沉淀析出，影响结果判定。
2.检测反应的颜色变化
⑴试剂A为无色，试剂B为淡兰色；
⑵阴性对照液(纯化水)为无色，加试剂A振摇后，仍为无色，滴加试剂B振摇后呈淡兰色，与试剂B的颜色相近；
⑶阳性对照液(0.5mg/ml的比伐卢定水溶液)为无色，加试剂A振摇后，仍为无色，滴加试剂B振摇后呈兰紫色，与阴性对照液有明显区别；
⑷供试溶液为无色，加试剂A振摇后，仍为无色，滴加试剂B振摇后所呈现的颜色，依多肽的种类不同而不同，分别呈“兰紫→紫→紫红”等几种颜色，多肽的浓度越高，紫色越明显。8种多肽物质的变色情况如下：
比伐卢定                   兰紫
醋酸奥曲肽               紫
鲑降钙素                   紫
生长抑素                   紫
胸腺法新                   紫
胸腺五肽                   紫红
缩宫素                       紫红
依替巴肽                   淡绿→兰紫
其中依替巴肽的颜色变化比较特殊，滴加试剂B摇匀后，溶液即显淡绿色，放置10分钟后慢慢变成兰紫色，故如进行依替巴肽的残留检测，滴加试剂B摇匀后放置10分钟以后再观察颜色变化。
目前我们已试验了8种多肽物质的双缩脲试验的颜色变化，在用该方法进行其他多肽物质的残留检测前应首先验证其颜色变化是否在“兰紫→紫→紫红”范围内。
3.检测限
用以上8种多肽物质进行的试验中，配制样品浓度在50ppm时，加双缩脲试剂后都可观察到明显的颜色变化，浓度为30ppm时，也可观察到颜色的变化，但不甚明显，药液浓度为10ppm时，基本观察不到颜色的变化。
4.阳性对照溶液的选择及淋洗液浓缩倍数的确定
双缩脲试剂与多肽络合后呈现紫色，但各多肽品种的颜色变化有差异，在兰紫→紫→紫红范围内所显示的紫色深浅不一，浓度相同时比伐卢定所呈紫色最浅，在50ppm、100ppm时都呈兰紫色，而100ppm时紫色更深，与阴性对照液相比差别更明显，故选择比伐卢定100ppm的溶液作为阳性对照溶液。
容器及设备清洗后的淋洗液中多肽残留应低于10ppm，如阳性对照溶液的浓度为100ppm，则淋洗液浓缩10倍后检测，其呈现的紫色若不比阳性对照溶液更深，就表明原淋洗液中的多肽残留浓度小于10ppm。以此类推，淋洗液浓缩50倍后检测，则阳性对照溶液的浓度应为500ppm，若供试液呈现的紫色不比阳性对照溶液更深，即表明原淋洗液中的多肽残留浓度小于10ppm。
浓缩过程对检测反应的影响我们也进行了验证，将多肽配制成10ppm的水溶液，分别取500ml及100ml，封闭电炉上直接加热浓缩至小于10ml，再补水至10ml，两份样品的浓缩倍数分别为50倍和10倍，加双缩脲试剂后，其颜色变化与未经浓缩的500ppm及100ppm的多肽水溶液一致。另外，将10ppm溶液的溶剂换成40%的乙腈水溶液，同法浓缩后检测，其颜色变化也与未经浓缩的500ppm及100ppm的多肽水溶液一致。试验结果表明，浓缩过程对检测反应的颜色变化没有影响。
具体实施方式
实施例1
本发明检测多肽物质残留量的方法如下：
双缩脲试剂的配制：称取氢氧化钠适量，加纯化水溶解并稀释至浓度为0.1g/ml的溶液，作为试剂A；称取硫酸铜(CuSO4·5H2O) 适量，加纯化水溶解并稀释至浓度为0.01g/ml的溶液，作为试剂B。
测定法：取容器及设备清洗的淋洗水100ml~500ml，置烧杯中加热浓缩，浓缩至体积小于10ml，残液转移至10ml容量瓶中，并用纯化水荡洗烧杯，荡洗液也移至容量瓶中，再补水至10ml，作为供试溶液；取比伐卢定适量，加纯化水溶解并稀释至浓度为0.1~0.5mg/ml的溶液，作为阳性对照溶液；另取纯化水作为阴性对照溶液。
取供试溶液、阳性及阴性对照溶液各5ml，分别置比色管中，加试剂A 2ml，摇匀，再滴加试剂B 4滴，振摇，供试溶液的颜色与阴性对照溶液相比如有变化，所呈现的紫色应不比阳性对照溶液更深。
用该方法检测多肽生产线净化室中的纯化周转塑料桶、冻干盘、及合成反应罐等容器清洗后的淋洗液，结果表明所有淋洗液中的多肽含量都远远低于10ppm，说明对周转塑料桶、冻干盘、合成反应罐的清洗操作程序适当，清洗效果良好。

Claims (7)

1.一种快速简便的多肽残留比色检测方法，将双缩脲比色反应用于多肽的残留检测，与阳性对照液进行对比，可对合成多肽生产过程中所使用的仪器及容器清洗后多肽的残留量进行限度检测，用于多肽物质日常生产中仪器及容器的清洗效果监控及清洗验证的检测。
2.根据权利要求1所述的双缩脲比色反应，其特征在于，双缩脲试剂由试剂A和试剂B组成，试剂A为0.1g/ml的氢氧化钠溶液，试剂B为0.01g/ml的硫酸铜溶液，使用时先加入2ml试剂A，振荡摇匀，造成碱性的反应环境，然后再加入4滴试剂B。
3.根照权利要求1所述的阳性对照液，其特征在于，所述的阳性对照液为0.1~0.5mg/ml的比伐卢定水溶液。
4.权利要求1中仪器及容器清洗液浓缩10~50倍后作为供试品溶液进行检测。
5.根据权利要求2所述的试剂A与试剂B，其特征在于，所述的试剂A与试剂B按顺序加入供试品溶液中，使用比例为试剂A : 试剂B = 2ml : 4滴。
6.根照权利要求1~5任一项所述的多肽残留比色检测方法，包括以下步骤：
（1）双缩脲试剂的配制：称取氢氧化钠适量，加纯化水溶解并稀释至浓度为0.1g/ml的溶液，作为试剂A；称取硫酸铜(CuSO4·5H2O) 适量，加纯化水溶解并稀释至浓度为0.01g/ml的溶液，作为试剂B；
（2）测定法：取容器及设备清洗的淋洗水100ml~500ml，置烧杯中加热浓缩，浓缩至体积小于10ml，残液转移至10ml容量瓶中，并用纯化水荡洗烧杯，荡洗液也移至容量瓶中，再补水至10ml，作为供试溶液；取比伐卢定适量，加纯化水溶解并稀释至浓度为0.1~0.5mg/ml的溶液，作为阳性对照溶液；另取纯化水作为阴性对照溶液；
（3）取供试溶液、阳性及阴性对照溶液各5ml，分别置比色管中，加试剂A 2ml，摇匀，再滴加试剂B 4滴，振摇，观察供试溶液与阴性对照溶液的颜色变化。
7.根照权利要求1所述的多肽残留比色检测方法，此方法操作简单、快捷可靠、可用于所有多肽物质的残留检测，而且灵敏度高，能够适用于10 ppm的多肽残留的检测。
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