CN102281907B - 生物复合材料及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

总体上，本发明涉及生物聚合体和生物复合材料及结构，以及制造和使用它们的方法。在一些实施方案中，本发明涉及基于定向胶原蛋白的生物复合材料和结构，以及制造方法。

Description

生物复合材料及其制造方法
发明领域
总体上，本发明涉及生物聚合体和生物复合材料及结构，以及制造和使用它们的方法。在一些实施方案中，本发明涉及基于定向胶原蛋白的生物复合材料和结构，以及制造方法。
发明背景
胶原蛋白凝胶、绷带、海绵和纤维已用作干细胞的载体。胶原蛋白是存在于许多组织中的中性蛋白。它向组织提供拉伸强度并提供细胞结合、迁移和增殖的附着点。然而，胶原蛋白凝胶和粉状胶原蛋白缺乏拉伸强度并且在压力下往往分散在组织中，因此不太适合将细胞保持在确定部位的任务。
胶原蛋白能够以纯形式从多种组织中分离成能够重新形成纤维的可溶蛋白。一般来说，纤维缺乏它们在不同组织中显示的上层结构。这已限制在许多医学应用中成功使用胶原蛋白。
心脏、横纹肌、皮肤、骨骼和软骨、脊髓等的组织损伤通常发展并引起正常周围组织的分解，增加了受损伤的区域并严重损害组织功能。当前观念建议多种因子或细胞可通过直接注射被引入受损伤的区域中，并阻止进一步损伤甚至修补受损伤的区域。实际上，临床前试验和临床试验已显示，当将间充质干细胞注入组织损伤位点时，心脏功能改善。然而，这类研究还显示，大量的注射细胞从组织漏出并且剩余的细胞大部分迅速死亡。因此，对允许各种类型细胞递送到受损组织的特定位点并保持其存活和扩增的装置存在需求。然而，不同组织的物理特性差别明显(比较心肌与横纹肌、与皮肤或脊髓)。因此，递送媒介物应具有足够强度使其被放置在特定的组织，而没有因不良匹配的物理因素而引起组织功能改变。这需要如下材料：所述材料的物理特性适合于它们将要在其中使用的组织。同样，细胞需要支持其存活、迁移和特定修复因子的产生的因子和表面。简言之，受损组织的治疗应该通过新颖装置改善，所述装置将干细胞和其他细胞递送并保持在特定位点以使其存活并产生维持处于危险的组织的因子。
腱和韧带的损伤是影响成年人口的最常见的健康问题之一。估计在2000年美国进行了175,000例前交叉韧带(ACL)重建，花费超过20亿美元。单在美国每年有50,000个需要手术修复肩袖的患者和500万网球肘新病例。此外，11％的定期运动者患阿基里斯腱炎(Achilles tendinopathy)。在2000年，肩痛治疗花费美国政府高达70亿美元，并且腱和韧带损伤的总花费估计每年在300亿美元；参见Chen，J.，Xu J.，Wang A.，Zheng M.，2009.Scaffolds for tendon and ligament repair：review of the efficacy ofcommercial products(用于腱和韧带修复的支架：商业产品的功效综述).Expert Rev.Med.Devices.6.1：61-73。
目前修复手和脚的腱和韧带的方法只取得有限的成功。在一些情况下，在瘢痕组织构建的同时，关节被固定4周。这种具有不良机械特性的瘢痕组织必须承担原来的腱/韧带的功能，但具有高失败率。在其他情况下使用锚定于骨的非吸收缝线。这些缝线缺乏适当的弹性并常常引起免疫应答。在其他情况下，修复是不可能的并且可用的替代程序具有各种局限性。
目前临床和研究实践利用动物和人的移植物作为日常临床实践中的主要材料来修复腱和韧带的缺陷。生物学代用品包括自体移植物、同种异体移植物和异种移植物。
髌腱和腘绳肌腱的自体移植物被认为是组织修复的“黄金标准”并且通常是优选的以避免排斥反应。然而，这些自体移植物有许多缺点。例如，自体移植物需要对患者进行额外的手术，手术可能引起供体部位发病、恢复时间增加和/或在收获部位的可能疼痛加上收获部位感染、神经损伤和髌骨骨折。使用腘绳肌腱重建ACL的另一个缺点是缺乏有效的腱-骨愈合，由于腱-骨界面的不稳定性而影响患者恢复。
同种异体移植物是从尸体的腱、真皮和其他组织获得。异种移植物是从动物腱、小肠黏膜下层、真皮和皮肤、以及心包膜收集。同种异体移植物和异种移植物主要由具有与人腱相似的机械特性的I型胶原蛋白组成。然而，同种异体和异种移植物能够潜在地传递疾病或感染，并且可引起宿主不利的免疫应答。
合成的移植物显示出优异的短期效果，但长期临床结果不良，有40％到78％失败率的断裂、新组织应力遮蔽、疲劳、蠕变和磨损产物，它们能够最终导致关节炎和滑膜炎。
目前的细胞接种技术包括：a)递送细胞-凝胶复合材料到支架区域中，以及b)递送细胞悬液到处于静态或动态的支架中。然而，这些技术有一些缺点，诸如细胞连接到致密纤维基质或支架的效率低以及凝胶系统的机械强度差。这些缺点使得在致密组织移植物上接种大量细胞很困难。因此，目前技术的局限性阻止使用干细胞来改善用于组织修复的大组织移植物的效能。为了解决这些局限性，发展部分厚度切口和超声破碎以使接种的细胞在植入之前浸润培养中的腱。没有切口或超声破碎，接种到腱表面上的非固有细胞难以渗入腱。然而，有切口和超声破碎，移植物的机械强度被减小，这限制了临床应用的潜力。
几个研究组已着手将体外组织工程新韧带用于腱和韧带的替代，如在Hairfield-Stein M.等人2007.Development of Self-Assembled，Tissue-Engineered Ligament from Bone Marrow Stromal Cells(自装配的来自骨髓间质细胞的组织工程韧带的开发).Tissue Engineering.13.4：703-710中所述。在这一方向上第一次有前景的结果之一已被Goldstein JD等人在Goldstein，JD，等人1989.Development of a Reconstituted Collagen TendonProsthesis(重建的胶原蛋白腱假体的开发).The Journal of Bone and JoinsSurgery.71.A.8：1183-1191；以及Dunn等人在Dunn，MG.等人1992.Anterior cruciate ligament reconstruction using a composite collagenousprosthesis.A biomechanical & histological rabbit study(使用复合材料胶原蛋白假体的前交叉韧带重建：兔中的生物力学和组织学研究).Am J SportsMed.20.507-515中公开。构建的胶原蛋白纤维支架在有或没有胶原蛋白凝胶的情况下被束以不同的构型以使其保持在一起。Dunn等人和其他研究组使用有或没有接种的细胞的胶原蛋白支架。这种方法的主要问题是：a)支架胶原蛋白的降解速率比新合成胶原蛋白的速率高，促使新韧带不能支撑体内负荷；以及b)产生成本太高，而再现性低。
为了降低降解速率，几个研究组使用丝和其他合成材料。这解决了酶降解问题但产生了其他问题，包括免疫反应、纤维化和磨损产物。清除细胞外基质支架的试图导致了称作“功能组织工程”或“自发的3维组织形成”的新方法，如Calve，S.，Dennis RG，Kosnik PE，Baar K，Grosh K，ArrudaEM.2004.Engineering of functional tendon(功能腱的工程化).TissueEngineering.10，755-761中所述的。这种方法并没有在很大程度上依赖限制新形成的组织的生理学特性或机械特性的现有的人造支架或生物学支架的材料特性。反之，利用介质像胶原蛋白凝胶、纤维蛋白凝胶、基质胶或合成凝胶来协调新形成的组织的构造。Chen等人在Chen X，Zou XH，YinGL，Ouyang HW.2009.Tendon tissue engineering with mesenchymal stemcells and biografts：an option for large tendon defects？(使用间充质干细胞和生物移植物的腱组织工程：对较大的腱缺陷的选择？)Frontiers in Bioscience.S1.23-32中。然而，以上强调的问题(a)和(b)在功能组织工程的情况下仍是有效的。
已作出一些努力来赋予重建的胶原蛋白结构某种程度的定向各向异性。已在研究实验室演示了通过机械负载，微流通道、流和磁场引起的对齐，电化学处理、间隙流、高磁场、定向电纺丝、Langmuir-Blodgett沉积和挤压方法使分子和原纤维对齐。由这些方法中的每一种所产生的胶原蛋白基质已成功引起不同细胞的对齐。然而，它们没有模拟天然细胞外基质(ECM)并且缺乏必要的天然空间复杂性，例如，受控的原纤维直径、对齐的原纤维、卷曲、周期性和角分布。二级结构的缺乏导致合成支架的强度差并且影响细胞的存活和行为。Builles等人(2007)证明了细胞环境对新合成的ECM的重要性。一些已获得更好的原纤维大小的控制并证明组织样图样的构造。然而，对于它们产生的构建体的大小和所需的漫长过程存在问题。纳米结构和微结构及其取向对腱和韧带特别重要，因为这些组织需要强度、弹性以及引导细胞附着和迁移以发生修复。例如，致力于人组织的细胞-细胞外构造的最近的综述没有讨论原纤维取向或ECM对齐，但它声称“支架构造在组织工程中的重要性正日益被认识，这导致支架设计的倾向改变，从各向同性支架到不均匀的且各向异性的“仿生”支架，目标是模拟细胞的组织(诸如对齐或簇集)和/或考虑组织的ECM。”参见30.Singh M.，Tech B，Berkland C，和Detamore MS.2008.Strategies andApplications for Incorporating Physical and Chemical Signal Gradients inTissue Engineering(用于在组织工程中加入物理和化学信号梯度的策略和应用).Tissue Engineering.B部分.14.4：341-366。
最近，将胶原蛋白以有序阵列沉积在玻璃基底或塑料基底上以制造具有皮肤样、腱样、对齐编织的和其他原纤维结构的薄膜的方法描述在美国专利申请公开第2009/0069893号和美国专利申请系列第11/951,324号中，其整个公开内容通过引用并入本文。重要的是，这些对齐和有序的胶原蛋白沉积物指导应用于它们之上的细胞的取向。具体而言，细胞在膜上附着并对齐，并沿着对齐的轴迁移。这些膜可以用增强细胞存活、迁移和增殖的因子诸如生长因子处理。其他生物聚合体可以被并且已经被设计成递送细胞到组织，但是许多缺乏生物相容性，不消失或被加入到组织中，或具有与组织非常不同的物理特性并改变其功能。
尽管为发展模拟腱、皮肤和其他基于胶原蛋白的原纤维组织的生物材料付出了大量努力，但迄今为止还没有用于生产这些材料的工业制造方法。因此，迫切需要进一步的重大发展。
发明概述
总体上，本发明涉及生物复合材料及结构，以及制造和使用它们的方法。在一些实施方案中，本发明涉及基于定向胶原蛋白的生物复合材料和结构，以及制造方法。在一些实施方案中，提供了形成基于胶原蛋白的膜的方法，在所述膜中胶原蛋白以多种形式排列(对齐的、扭折的、编织的或以上的组合)。可以通过依次施加水溶剂和在溶剂空气界面的力将基于胶原蛋白的膜转换成或形成个体假纤维。在一些实施方案中，这些假纤维能够交联以增强其强度并用多种因子或材料诸如肝素处理以增强其储存生长因子的能力和/或增强其水合作用和其他性质。
一方面，本发明的实施方案提供了生产定向原纤维生物聚合体材料的方法，所述方法包括以下步骤：制备期望相的原纤维生物聚合体溶液或凝胶；使该原纤维生物聚合体溶液或凝胶以大致层流的状态或方式流动；并且将该原纤维生物聚合体溶液或凝胶从液体转化为固相以形成定向原纤维生物聚合体材料。在一些实施方案中，原纤维生物聚合体溶液或凝胶的期望相是液晶相。在一些实施方案中，原纤维生物聚合体溶液或凝胶显示范围在0.001M到0.5M的离子强度以及范围在2到9的pH。在其他实施方案中，离子强度在0.1M到0.3M的范围，并且pH在2到5的范围。在一些实施方案中，将原纤维生物聚合体溶液或凝胶转化为固相的步骤包括干燥该溶液或凝胶。干燥可以通过多种方法实现，诸如例如通过控制环境条件诸如但不限于湿度、温度和静电条件来促进蒸发。
在一些实施方案中，原纤维生物聚合体溶液或凝胶流经并沉积于官能化基底上。该基底可以用任何数目的期望化合物进行官能化，诸如促进粘附、分离、影响原纤维组织等的化合物。
一个具体的优点是，根据本发明的实施方案的生物聚合体可以被进一步加工形成生物复合材料和结构。在一个实施方案中，提供了具有一种或多种带状形式的定向原纤维材料。在一些实施方案中，提供了具有层形式的定向原纤维生物聚合体材料，所述层具有与层表面平行的任何方向的平均原纤维取向。在其他实施方案中，层具有在垂直于层表面的方向的平均原纤维取向。在一些实施方案中，提供了具有管形式的原纤维生物聚合体材料，其中所述管具有平行于管轴或者与其有一定角度的平均原纤维取向。定向的原纤维生物聚合体材料可具有单卷曲图样。可选地，定向的原纤维生物聚合体材料可具有双卷曲图样，在卷曲构造之间有任意角。在一些实施方案中，定向的原纤维生物聚合体材料显示由左手螺旋原纤维和右手螺旋原纤维所形成的卷曲图样。在其他实施方案中，定向原纤维生物聚合体材料具有大致平行线以大致相等交错角的人字纹形式的卷曲图样。
另一方面，本发明的实施方案提供了形成一种或多种原纤维生物聚合体材料诸如假纤维的方法，所述方法包括如下步骤：将生物聚合体材料浸入具有大致上中性pH的溶液中；并且将该生物聚合体材料从该溶液中拉出以使得该材料在空气-液体界面塌缩成假纤维。根据期望的应用，可以将形成的原纤维生物聚合体假纤维干燥、交联和/或灭菌。
另一个优点是，可以将本发明的原纤维生物聚合体假纤维形成生物复合材料和或结构。在一些实施方案中，提供了包含至少一种定向原纤维生物聚合体材料和生物可降解的生物相容性基质的生物复合结构。在其他实施方案中，提供了包含由生物可降解的生物相容性基质粘合的具有任意取向的多种定向原纤维生物聚合体材料的生物复合结构。生物相容基质可由任何适宜材料组成，诸如有限实例：糖胺聚糖、蛋白聚糖、钒酸盐、磷酸钙、活细胞、生长因子以及它们的组合。
在一些实施方案中，定向原纤维生物聚合体材料在细胞和组织培养应用中找到用作基质和基底的用途。在其他实施方案中，定向原纤维生物聚合体材料用作体内细胞引导支架。又在另一个实施方案中，定向原纤维生物聚合体材料包含被设置成向期望位点或靶标递送组分的递送媒介物。在一个实例中，该材料递送富含血小板的血浆的组分。在另一个实施方案中，该材料被设置成递送活细胞，以用于组织修复和再生。在另一个实施方案中，该材料被设置成递送肽、药物、生长因子和小分子。
在一些实施方案中，通过液膜施用器制造生物聚合体材料，所述生物聚合体材料包括(i)具有平行楔状梁的形式的至少两个纵向侧部构件，其基础与基底在同一平面内；(ii)在所述侧部构件之间具有桥形式的交叉构件，其中所述交叉构件具有至少一个平坦面并且以至少一个点与每个所述梁接触；以及(iii)确保桥在任何预设位置严格固定在所述梁上的钳系统，其中所述桥能够沿着两个所述梁移动以使得所述桥的平坦面与基底平面形成0-10弧分内的某一恒定二面角，并且在所述平坦面与所述基底平面之间的间隙具有5到50微米的宽度。
在一些实施方案中，通过如下步骤制造生物聚合体材料：输送胶原蛋白溶液到第一平板和第二平板，其中所述第二平板保持大致上与所述第一平板平行，空隙宽度为5到50微米，并且其中胶原蛋白溶液在所述第一平板与所述第二平板之间被捕获；并且移动与所述第一平板平行的所述第二平板以在所述胶原蛋白溶液上产生适宜剪切力来使胶原蛋白溶液以大致层流的状态或方式流动，其中所述第一平板在所述移动步骤过程中保持静止，并且其中移动第二板的方向是涂覆方向。在一些实施方案中，涂覆方向与所述单轴取向平行。在一些实施方案中，所述胶原蛋白溶液的浓度为大约20mg/ml至100mg/ml。在一些实施方案中，所述胶原蛋白溶液的浓度为至少25mg/ml。在一些实施方案中，胶原蛋白溶液呈现向列液晶态。在一些实施方案中，通过浓缩的液体胶原蛋白溶液的剪切来制造胶原蛋白层。
在一些实施方案中，生物聚合体溶液包括浓缩的液体胶原蛋白溶液，所述浓缩的液体胶原蛋白溶液具有但不限于胶原蛋白类型I、II、III、VI和XI中的至少一种(包括生物改性或化学改性的胶原蛋白以及类似胶原蛋白)，并且所述浓缩的液体胶原蛋白溶液任选地具有一种或多种添加剂，诸如例如但不限于，能够促进所述胶原蛋白的定向或粘附的添加剂。在一些实施方案中，添加剂为ATP。
附图简述
本发明的前述目的和其他目的在考虑与附图结合的以下详细描述时将是明显的，在附图中同样的参考字符通篇是指同样的部件。
图1是描绘腱的层级结构的示意图；
图2A-2C分别示出显示在取自猪二尖瓣的腱索中的卷曲胶原蛋白纤维的螺旋性质的SEM照片，以及由Freed和Doering在其数学模型中使用的螺旋状弹簧的简图，和螺旋胶原蛋白纤维的应力拉伸曲线；
图3A-3F是显示根据本发明的实施方案形成的多种胶原蛋白膜或材料的原子力显微镜(AFM)照片；
图4A-4B分别是大鼠尾腱的SEM图像和新颖的牛胶原蛋白1基质的AFM图像；
图5A-5C是显示根据本发明的实施方案形成的多种胶原蛋白膜或材料的AFM照片；
图6A-6B分别是猪心脏二尖瓣的SEM图像和根据本发明的腱样生物聚合体基质的AFM图像；
图7A-7B是分别显示根据本发明的实施方案的单个胶原蛋白假纤维和胶原蛋白线的照片；
图8A-8C展示了显示右手和左手取向或卷曲的双超螺旋结构；
图9描绘了可用于执行本发明的方法的系统的一个实施方案的示意图；
图10是根据本发明的一些实施方案的具有对齐编织的取向的螺旋非嵌套生物聚合体材料的AFM图像；
图11是根据本发明的一些实施方案的双卷曲生物聚合体材料的AFM图像；
图12A-12C是分别描绘在形成根据本发明的实施方案的生物复合结构的定向胶原蛋白层上的人成纤维细胞、MSC和肌细胞的照片；
图13展示了可用于执行本发明的方法来形成根据本发明的实施方案的假纤维的系统的一个实施方案的示意图；并且
图14示出根据本发明的实施方案在定向胶原蛋白假纤维上接种并于五天后从该假纤维上增殖和迁移的细胞。
发明详述
应理解上述一般描述和以下详细描述仅是示例性和解释性的，并且不是对本文所述的组合物、膜和方法的限制。在本申请中，除非另作特别说明，单数的使用包括复数。同样，除非另作说明，“或”的使用表示“和/或”。类似地，“包含”、“包含有”、“包含了”、“包括”、“包括有”和“包括了”不旨在是限制的。术语“层”或“膜”或“薄膜”或“基质”在整篇描述中可互换使用。
总体上，本发明涉及生物复合材料和结构，以及制造和使用它们的方法。在一些实施方案中，本发明涉及基于定向胶原蛋白的生物复合材料和结构以及制造方法。在一些实施方案中，提供了形成基于胶原蛋白的膜的方法，其中胶原蛋白以各种形式(对齐的、扭折的、编织的或以上的组合)排列。基于胶原蛋白的膜可以通过顺序应用含水溶剂和在溶剂空气界面的力被转化或形成个体假纤维。在一些实施方案中，这些假纤维可以交联以增强其强度并用多种因子或材料诸如肝素处理以增强其储存生长因子的能力和/或增强其水合作用和其他性质。
本文使用了以下非限制性定义。“原纤维生物聚合体”是指不同类型的胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、血纤蛋白、丝、其他多肽和它们的组合。
“定向原纤维生物聚合体材料”是指具有重复图样的材料。具体来说，它可以是结晶原纤维生物聚合体或半结晶原纤维生物聚合体。在一些实施方案中，如果生物聚合体表面具有重复图样，它被称为“定向的”。具体来说，表面图样可以通过17个平面结晶群之一来确定。取向可以通过光偏振、偏光显微术、激光衍射、x光衍射、原子探针显微术、电子显微镜中的任何一个来评估。
取决于浓度、温度、pH、离子强度和添加剂，“原纤维生物聚合体溶液和凝胶”具有不同的相。在一些实施方案中，这些相是具有长程取向次序(例如，各向同性、胆甾、层列、向列、六方)的液晶相。当在偏光显微镜下观察时，不同的液晶相显示具有不同的纹理。不同的相可以通过光衍射和散射、通过穆勒矩阵偏振、通过密度变化以及通过差示量热术来识别。胶原蛋白、层粘连蛋白、DNA、许多多肽以及其他原纤维生物聚合体是溶致液晶材料的好例子。少量的无机添加剂(例如原钒酸盐)可改变相变。胶原蛋白相形成的综合信息呈现在Mosser G，Anglo A，Helary C，Bouligand Y，Giraud-Guille MM.2006；Dense tissue-like collagen matricesformed in cell-free conditions(在无细胞条件下形成的致密组织样胶原蛋白基质)；Matrix Biology.25：3-13中；通过引用将其整体并入本文。
稳定(层)流条件施加至特定液相导致图样形成。换言之，在一些实施方案中，生物聚合体溶液或凝胶以分层方式或以分层状态流动。这些流条件的例子包括但不限于：库爱特流、泰勒-库爱特流、平面泊萧流(Poiseuille flow)和轴对称泊萧流。
环境条件(湿度、温度、UV、X射线、电子束、电场、磁场)或原纤维生物聚合体的关键参数像pH和离子强度的改变可能导致自组装过程并促使定向材料从液/凝胶相转变为固相。在一个示例性实施方案中，从液/凝胶相到固相的转变是通过干燥过程完成的。在固相中得到的生物聚合体的图样取决于在液相中的图样和自组装过程。在一个实施方案中，胶原蛋白溶液的快速干燥过程导致具有小直径的螺旋状原纤维(透明材料)的形成，而缓慢干燥过程导致具有大直径的螺旋状原纤维(模糊材料)的形成。在薄胶原蛋白层(例如几微米厚度)的情况下，得到的取向基本上取决于基底的化学和物理特性。在一些实施方案中，基底的官能化可用于控制取向。
当促使定向胶原蛋白的独立带沿该带的长轴纵向卷起并通过静电力被稳定地就地保持时产生“假纤维”。
“线”是通过将多个假纤维、通常三个或更多个假纤维编织在一起而产生。
“生物可降解基质”在本文是指能够自然分解并被生理环境重吸收的材料。此处的生物可降解基质是用于将生物聚合体粘合在一起的生物相容材料。
简要地评述在文献中讨论的韧带和腱的结构是有用的。尽管胶原蛋白在分子水平上的特征已被广泛地研究并得到很好的理解，但对腱和韧带水平上的特征和结构的理解还不太清楚。
本发明的一些实施方案描述了具有在哺乳动物身体中发现的腱和韧带的相同结构的制造的支架产物。该方法用分子级胶原蛋白，通常为I型，开始，并使用专利方法将其重组成支架。该方法在不存在细胞材料或其他生物材料的情况下创建支架。因为不存在这些额外的组分，所以该方法容许获得得到的支架的更清晰的图片及其基本几何结构。这样做时，该方法给出了对这些哺乳动物身体部件如何组织以及它们如何创建的理解，这些至今没有在文献中报道。
在描述韧带和腱的结构时，存在每个层次上特性不同的组织层级结构。取决于如何定义每个层次，研究者确定六个、七个或八个层次。以下表1显示通常用于描述八个层次的命名法(参考：Cowin & Doty，2007的“Tissue Mechanics(组织力学)”)。
 第1层   多肽
 第2层   原胶原蛋白
 第3层   微原纤维
 第4层   亚原纤维
 第5层   原纤维
 第6层   纤维
 第7层   纤维束
 第8层   腱和韧带
表1
其中的六个层次，即第2、3、4、5、7和8层显示在图1中。提供以下解释来帮助理解本发明的教导内容。在第1层次，组成胶原蛋白分子的每种多肽α链由大约1000个氨基酸残基构成。每个链以大约1.2nm直径的左手螺旋缠绕。
在第2层次，原胶原蛋白或“胶原蛋白分子”约300nm长并且直径为1.5nm。它由三个多肽α链组成。这三个左手螺旋扭在一起成为右手线圈，产生三重螺旋。这种三重螺旋是“超螺旋”，因为它是包含三个左手螺旋的右手螺旋。
在第3层次，微原纤维由胶原蛋白分子的五条链形成。每条链由胶原蛋白分子之间具有离散间隙的端对端连接的胶原蛋白分子组成。这些链通过静电力缠绕在一起成左手超螺旋以形成3.5nm到4nm直径的微原纤维。
在第4层次，亚原纤维具有10-20nm的直径并且由微原纤维簇组成。
在第5层次，通过将亚原纤维缠绕在一起制成具有大约1090nm螺距和30-500nm直径的右手超级-超级-超螺旋来形成原纤维。微原纤维的胶原蛋白分子末端之间的间隙对齐形成特征性67nm“D-带”周期性。
在第6层次，纤维具有1-20um的直径并由原纤维簇组成。
在第7层次，纤维束(fascicle)由被组装成以卷曲图样组织的结构的纤维组成，所述卷曲图样被描述为起伏的波纹、波形或Z字型。卷曲的功能是为经受拉力的组织诸如韧带、腱、心包等提供所需弹性。这些卷曲在主要经受压迫力的骨胶原蛋白中不存在。细胞的向内生长在纤维束水平上发生。
在第8层次，韧带和腱由纤维束捆组成。在纤维束之间不存在侧向偶合，所以它们能够自由滑过彼此，产生平稳运行的机械组件。
对腱和韧带的机械行为存在许多研究，诸如由A.D.Freed和T.C.Doering在Freed AD and Doehring TC.2005；Elastic Model for CrimpedCollagen Fibril(卷曲胶原蛋白原纤维的弹性模型).J.Biomech.Eng.127.587-593中的研究。他们观察到，从承载负荷的观点看，被动软组织是主要由浸入蛋白聚糖凝胶中的两种弹性物质胶原蛋白和弹性蛋白组成的多组分材料。他们观察到纤维束由原纤维捆组成，但没有讨论“纤维”的中间体形式。他们提出卷曲的形成受限于原纤维的细长比，每当纤维组织没有外部负荷时，原纤维在弹性蛋白基质的内部恢复力之下弯曲。这种褶皱的结构称为卷曲。本发明描述了产生卷曲的不同机制。这是由于不同于现存胶原蛋白的弯曲现象的胶原蛋白再生方法的结果。
作为简化假设，他们提出形成卷曲的原纤维被认为是机械线圈弹簧。这种假设与观察到的卷曲胶原蛋白组织的非线性应力/应变行为很好地匹配，其中弹簧在图2C中所示的应力/应变曲线的低应力(脚趾区)处显示线性行为直到线圈变得伸展。在那点线圈开始变得越来越僵硬，促使曲线的斜率连续增加(脚跟区)。在线圈完全伸展后，行为再次变为线性，但斜率更陡(线性区)。这一曲线因其形状而被称为“J”曲线。他们提出的数学模型与实验数据很好地匹配。
图2A是显示在取自猪二尖瓣的腱索中的卷曲胶原蛋白纤维的螺旋性质的SEM照片。图2B是由Freed和Doering在其数学模型中使用的螺旋弹簧的简图。它示出沿螺旋的中心线起作用的中心力如何被转移至螺旋的其他区域。注意图2A的SEM照片示出左手螺旋，而图2B的简图示出右手螺旋。该论文既没有任何地方指出所述图之间的区别，也没有讨论旋向性概念，这说明了在现有技术中缺乏理解和教导。
尽管在该文献中多次提到腱和韧带卷曲的螺旋性质，但无法找到对旋向性的讨论。Freed和Doering是旋向性观念被忽略的具体例子。
在本发明的一些实施方案中描述了由纯化的单体胶原蛋白溶液制成的生物等价的重建腱样基质的产生。这些新颖基质包括诸如但不限于以下任何一种或多种的优点：a)生物相容性，b)高机械强度和在原纤维取向上的“J”弹性特征，c)在大面积(2″×10″)无缺陷，d)仿生(即，接近天然韧带结构-在纳米级到宏观尺度上)，以及e)依据交联的水平为生物可降解的。图3A到3F展示了根据本发明的实施方案的胶原蛋白膜或胶原蛋白薄膜的一些例子。图4A和4B分别展示了大鼠尾腱与根据本发明的实施方案形成的胶原蛋白基质之间的比较。这些基质的复杂卷曲和对齐编织(aligned-braided structure)结构可以加入具有期望的空间梯度的生长因子以加强生物功能。成纤维细胞、成肌细胞、神经元和间充质干细胞在这些基质上显示出优异的增殖、迁移和对齐。这些腱样基质可以被形成纤维结构或多层复合材料支架。可用患者干细胞和源于患者血小板的因子重新住入这些支架以大大减少愈合时间并改善支架效能。本发明实施方案使在体外生产天然组织支架成为可能。
在本发明的一方面，提供了生产生物聚合体材料、层和/或结构的方法。在一些实施方案中，在基底上的多结构域半结晶原纤维生物聚合体层从主要为单体的溶液中形成，包括以下步骤：在基底与至少一个固体装置之间产生剪切流，诱导溶液中的长程的分子和原纤维取向，控制溶液的起始pH和温度，控制在剪切流中时溶液的pH和温度，并且在控制的pH、温度和/或蒸发速率下干燥溶液。
可以形成具有期望取向的生物聚合体层。具体取向可通过根据生物聚合体的组织的某些参数和定义来表征，如以下详细讨论的。
在一些实施方案中，取向的范围也受控制。取向的范围是结晶学术语，定义为在相同角度取向的局部结构域之间的最大距离。在这种情况下，该范围可以是小至皮肤样取向的10nm到大至腱样取向的0.5米。
本发明的方法的实施方案具有诸如以下的益处，在剪切负荷下具有低pH的液晶溶液的长程分子取向和在可变pH下干燥过程中的自组装。具体来说，在一些实施方案中，可将干燥过程保持在调至7.4±0.2的中性pH。发明人已发现除了施加剪切流之外，在干燥过程中控制溶液的pH、温度和/或蒸发速率也有助于胶原蛋白的自组装过程。
可使用不同类型的原纤维生物聚合体：原纤维胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、丝等等。
这种方法使得具有短程和长程取向的均一和多结构域半结晶层的产生成为可能。这些差别被概括在表2中并示于图5A到5C中。
  生物聚合体的组织   取向范围   结构
  腱样   长   均一
  编织的皮肤样   短   多结构域
  对齐编织的   长   均一
表2
通过上述方法制备胶原蛋白层的一个例子显示在图6B中。每个原纤维在垂直取向上延伸并且具有带特征周期的波形。相邻原纤维的周期性近似相等。原纤维嵌套在一起产生由相邻原纤维的集拢所形成的“卷曲”图样。卷曲图样位于水平取向。
图6A是猪心脏二尖瓣的腱结构的SEM照片，显示了在所有腱中看到的特征性卷曲图样。在框内的区域具有与图6B中所示的形成材料相同的尺寸。可以看到图6B中的人造基质的卷曲图样与图6A中的实际腱的卷曲图样相似。
上述卷曲图样的形态通过嵌套胶原蛋白的螺旋原纤维而形成。螺旋结构由嵌套在一起形成双超螺旋结构的右手和左手螺旋组成，参考图8A到8C所示。如这些图中所示，“较暗”色调的原纤维是右手的，“较浅”色调的原纤维是左手的。
注意卷曲实际上是群集的嵌套螺旋峰。暗螺旋的峰形成右手卷曲。浅螺旋的峰形成左手卷曲。
这些嵌套螺旋起螺旋弹簧阵列的作用。该阵列由近似相等数目的右手和左手弹簧组成的事实并不影响该阵列的弹簧常数。然而，当该阵列在弯曲而非伸展时，右手弹簧和左手弹簧趋于彼此平衡。该阵列的一边拉伸，而另一边压缩。右手弹簧和左手弹簧互锁并趋于彼此平衡，产生自然稳定性。
图8A-8C示出几个角度的单个双超螺旋。
取决于具体的生物聚合体的组织，“取向”的定义将具有以下表3所示的不同含义。
  生物聚合体的组织   组分   定义
  腱样   原纤维   螺旋的轴
  腱样   “卷曲”   连接嵌套的螺旋原纤维的峰的线
  对齐编织的   原纤维   螺旋的轴
  编织的皮肤样   原纤维   局部向量
表3：取向的定义
在图10中示出的腱样构造和对齐编织构造之间的关键差异是螺旋的堆积密度。在腱样构造中，螺旋是密集堆积的，而在对齐编织构造中，螺旋是松散堆积的。图11是根据本发明的一些实施方案的双卷曲生物聚合体材料的AFM图像。
基于这种对卷曲结构的更为完整的理解，韧带层级结构可以按以下表4中所示来修改。
  描述   螺旋结构   结构组分
  1   多肽   左手   1条α链
  2   原胶原蛋白   右手   3条多肽
  3   微原纤维   左手   5条原胶原蛋白
  4   亚原纤维
  5   原纤维   右手，左手   亚原纤维簇
  6   n/a(纤维)   n/a   n/a
  7   纤维束   右手+左手   嵌套原纤维的匹配对
  8   腱和韧带
表4
我们已发现这些膜具有定向的原纤维结构并且具有某种各向异性的机械强度，并且可以在处理、改性、中和和或交联以及类似操作之前或之后从基底中移出。
这种改性的一个例子包括离子交换反应。例如，它是通过将胶原蛋白膜浸入原钒酸盐或焦磷酸盐溶液中的处理。另一个例子是将胶原蛋白浸入肝素溶液中。这些改性改变了膜的特性，诸如其被水合的能力、其结合蛋白的能力或其增强对其施加的细胞的行为的能力。这些胶原蛋白基质控制细胞行为的能力的一些例子示于图12A-12C中。一般说来，对齐的纤维促使细胞沿纤维的轴对齐。就神经来说，当细胞本身不显示升高的对齐时，它们产生的神经突过程被高度延伸并与纤维对齐。这种基质结构控制细胞行为的现象扩展到各种干细胞。
在一些方面，提供了用于从纯化的单体胶原蛋白溶液中生产腱样胶原蛋白基质的方法。这种方法的实施方案适合于溶致液晶材料等。根据一些实施方案，处于液晶态的分子胶原蛋白溶液可以通过精密涂布器头(precision applicator head)而被沉积在具有光学精密度的玻璃和塑料上，如在美国专利公布第2008/0115724号中(并且具体如图1所示)所示并较完备描述的，该文献的整个公开内容通过引用并入本文。在示例性实施方案中，将玻璃基底固定在台(stage)上，该玻璃基底通过在静止的涂布器头下的线性传动器运输。该头是可调的，以产生不同涂覆厚度的生物聚合体基质。在一个实例中，干净的玻璃基底和范围在10mm/sec到1000mm/sec的涂覆速率用于产生期望的卷曲结构。在最初的实验中，使用几种商业来源中的任何一种的纯化胶原蛋白I溶液。得到的基质可以从玻璃中分层并且具有图3A到3F中所示的多种原位结构。可以制出由横向上的两种胶原蛋白基质和将其粘合在一起的薄肝素层构成的三层结构。可根据WollensakG.，Wilsch M.，Spoerl E.，Seiler T.2004.Collagen fiber diameter in the rabbitcornea after collagen crosslinking by riboflavin/UVA(通过核黄素/UVA交联胶原蛋白后在兔角膜中的胶原蛋白纤维直径).Cornea.23.5：503-507中描述的程序，可通过暴露于核黄素中将这种样品进一步交联。使用两种类型聚合物也就是葡聚糖和激活的聚乙二醇用于交联。薄腱样胶原蛋白基质可以被自发转化为以下更详细描述的假纤维。腱样胶原蛋白假纤维(直径125μm)的初步机械评估显示至少60克的强度。这种构建体甚至在没有交联时在两个取向上都具有相当大的强度。
参考图9，示出了系统100的另一个实施方案。在这个实施方案中，系统100可包括由硬材料诸如不锈钢等制成的棱柱102。棱柱102被精确地安放在平滑基底104(诸如玻璃)的上方以形成间隙112。在一些实施方案中，棱柱102的组件包括在一些实施方案中通常具有圆柱形状的入口轮廓108、与入口轮廓平稳交叠的打磨得高度平整的平坦表面106以及在间隙112的出口形成过渡的锐利边缘110。在此没有讨论将棱柱安放在基底上方形成精确间隙的方法。在一些实施方案中，狭长的胶原蛋白溶液液体被沉积在基底上形成坑114。在某些实施方案中，液体可具有足够高的粘度来形成独立坑。在一些实施方案中，棱柱被保持固定并且基底从左向右移动，将液体拖入入口轮廓区，促使液体填满间隙直至到达出口。间隙可在5-50微米范围并且涂覆速率可在10到100mm/sec范围。处于狭窄间隙时，液体经受使其变得定向的足够持续时间的高剪切力。出口的锐利边缘用来使自然发生的新月面的大小最小化，如果新月面太大将引起完成的膜上不可接受的条纹。在替代的实施方案中，棱镜可以相对于基底移动。
在一些实施方案中，使用液膜涂布器形成本发明的生物复合材料，所述生物复合材料包括：i)具有平行楔状梁的形式的至少两个纵向侧部构件，其基础与基底在同一平面内；(ii)在所述侧部构件之间具有桥形式的交叉构件，其中所述交叉构件具有至少一个平坦面并且以至少一个点与每个所述梁接触；以及(iii)确保桥在任何预设位置严格固定在所述梁上的钳系统，其中所述桥能够沿着两个所述梁移动以使得所述桥的平坦面与基底平面形成0-10弧分内的某一恒定二面角，并且在所述平坦面与所述基底平面之间的间隙具有0到50微米的宽度。
根据本发明的方法还教导了其他制备方法。例如，提供了管状实施方案，其中剪切区具有圆柱几何形状。圆柱几何形状可通过任何数目的手段形成，并且在一个实施方案中，圆柱几何形状由空心圆柱组成，在所述空心圆柱中安放了实心圆柱心轴。剪切间隙由空心圆柱内径与实心心轴外径之间的直径差形成。生物聚合体材料在高压力之下通过间隙被挤出，并且在这样做时产生了形成定向支架结构的流，诸如库爱特流、泰勒-库爱特流、平面泊萧流和轴对称泊萧流。间隙的精细控制可通过将空心圆柱和实心心轴均制造成略微锥角来实现。相对于空心圆柱轴向放置心轴将使间隙具有精细调整。在以上描述中，将形成原纤维的平均取向平行于心轴和圆柱组件的中心轴的管。通过在胶原蛋白管被挤出时赋予中心轴的一个组件相对于另一个组件的差异转向速度，原纤维的平均取向将遵循沿管的螺旋途径并产生相对于中心轴的角度。
可将如上述产生的离散或连续的生物聚合体膜转化为定向生物聚合体(胶原蛋白)假纤维。这是本发明的主题之一并且可通过诸如图13所示的系统形成。薄胶原蛋白膜(例如，2-6um厚和1″宽)可如图13所示地被完全或部分浸入适合溶液中(例如，PBS溶液)。如图7A所示，膜在从溶剂移出时在空气溶液界面塌缩成假纤维。假纤维可以在有或没有机械处理和热处理的情况下被干燥。可编织若干假纤维产生直径和强度不同的线。这些线和假纤维的例子示于图7B中。本发明的实施方案容许通过在塑料或玻璃上产生沉积物来控制最终假纤维的弹性度，所示沉积物具有不同的胶原蛋白原纤维排列。例如，在替代条件下沉积的胶原蛋白可以在假纤维和最终的线中产生扭折或折叠，由此产生具有J型机械拉伸的线。甚至可以通过以编织结构沉积胶原蛋白来产生更大的弹性，在所述编织结构中，几捆对齐的纤维支持远远更大的弹性。
一个具体的优点是，根据本发明产生的膜、纤维和假纤维可用于支持细胞的附着、迁移和增殖。一般来说，可通过将假纤维放在培养基中的细胞悬液内来将细胞应用至假纤维。可选地，包含感兴趣的细胞的培养基可被应用至干燥的悬挂假纤维并使之沿假纤维长度流下。培养基中的细胞结合胶原蛋白假纤维，特别是在存在血清的情况下。可重复该过程以提高结合细胞的数目。使用定向胶原蛋白假纤维递送干细胞到组织中的一个实例示于图14中。
通常递送到特定组织的细胞将是干细胞、神经细胞、肌细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞或预期改善修复、再生或功能的细胞。如本领域医师和普通技术人员公知的，应用至组织可以作为贴片或通过使用导管或针将假纤维插入受损组织部分中。
诸如胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白或合成物的材料当沉积在玻璃或塑料上时可用作测试细胞反应的系统，所述测试是通过将细胞覆于其上然后观察细胞行为，诸如是否细胞存在附着、迁移、增殖等。此外，可将生长因子或生物材料诸如富含血小板的血浆加入多种基底中，所述富含血小板的血浆是刺激细胞行为的因子的丰富来源。可以使用的一个机制是吸附。另一种机制是加入静电结合的因子，诸如肝素或其他糖胺聚糖。因子还可以结合基底的某些区域并且具有对多种生长因子的亲和力。类似地，生物活性材料诸如钒酸盐、带负电的抗炎剂或包括乙二胺四乙酸或柠檬酸盐在内的抗蛋白酶剂与带正电的胶原蛋白基底紧密结合。改变细胞行为的能力和细胞降解材料的能力容易地在细胞培养物中测试。另外，这些改性的基底可用于在改性的基底上评定细胞行为的多种测定中，所述细胞包括神经细胞、干细胞和肿瘤细胞等。
另一个优点是，本发明的实施方案提供的方法使官能化和/或改变的生物复合结构的形成成为可能。在一些情况下，细胞培养物研究需要对基底很强的粘附。这可通过使用官能化表面来完成，所述官能化表面通过离子或通过共价键形成来结合沉积的生物聚合体。在期望移出沉积材料的其他情况下，可使用容许沉积物待释放用于进一步加工的多种沉积表面。
在一些实施方案中，取决于期望的应用，这些生物聚合体的功能特性可以被改变或改善。这些改变包括沉积的生物聚合体的交联和材料当沉积在基底上时或进一步操作后的灭菌、等等。
在一些实施方案中，如下制备胶原蛋白起始溶液。分子级液体胶原蛋白溶液从许多商业来源诸如BD获得，浓度通常在3mg/ml的范围内。胶原蛋白的哺乳动物来源可以是大鼠尾、牛、猪、人或其他哺乳动物。将溶液放在从Spectrum Labs获得的具有12,000到14,000道尔顿截留分子量范围的透析膜管内部。将管放在容器中并且用冷却至4℃的分子量20,000的聚乙二醇(PEG)将其完全覆盖。PEG分子量必须比透析管的截留分子量大。将容器及其内容物放在4℃环境中一段时间，该时间足以使PEG从胶原蛋白溶液中除去水分并增加其浓度。时间将因管中胶原蛋白的体积和外部PEG的饱和度而不同，并且可少至10分钟，多达3小时。然后将浓缩的胶原蛋白从管中移出并放入小管中，将该小管在4℃离心以除去任何滞留空气。
胶原蛋白溶液也可以由粉末形式的胶原蛋白制备。典型方法是向该粉末添加4℃的酸诸如HCl或乙酸，在4℃静置18小时并稀释至终浓度。
浓度的提高也可以通过如下方式实现：将胶原蛋白溶液放在底部固定有透析型膜的商业设计的小管中，并在4℃离心直至达到期望的浓度。这种小管的例子是由Sartorius Stedim制造的Vivaspin。10,000及以上的膜的各种截留分子量是可用的。胶原蛋白的典型终浓度范围可以在20mg/ml直至100mg/ml。优选浓度范围在40mg/ml到75mg/ml，并且可能因期望的原纤维取向和多个供应商的起始胶原蛋白材料的特定性质而不同。
限定溶致液晶相的一个重要参数是浓度。调整浓度的方法在以上描述。另两个重要的参数是离子强度和pH。液体胶原蛋白I和层粘连蛋白的pH使用范围是2到9。优选的pH范围是2到5。离子强度的使用范围是0.001M到0.5M。离子强度的优选范围是0.1M到0.3M。
相变的标准方法是可伴有气刀干燥、真空、高温条件和低温条件的蒸发方法。对于薄生物聚合体层而言，如果生物聚合体溶液已被UV敏感性添加剂例如像核黄素激活，UV处理可能是有效的。在这种UV处理中可能引发生物聚合体交联。
在许多纤维生物聚合体中的自组装过程极为依赖离子强度和可通过例如氨水蒸发调节的pH。在生物聚合体沉积在导电/金属基底的情况下，离子强度可以通过应用电场来调整。
几种聚合体材料例如像PET对胶原蛋白和层粘连蛋白的粘附力低，因此如果目的是从基底中移出定向生物聚合体的话，这种类型材料可用于表面官能化。标准胶粘带可用于这一程序。
氨基甲硅烷基化玻璃官能化引起沉积在玻璃表面上的定向胶原蛋白薄膜结构的实质改变。因此，它产生了图3B所示的垂直原纤维构造而不是图3D所示的在没有玻璃处理的情况下制造的皮肤样编织图样。
另外，某些生长因子诸如胰岛素、胰岛素样生长因子、VEGF、PDGF等结合细胞上的受体，所述受体通过细胞内的酪氨酸激酶受体结构域刺激细胞过程。通常激酶结构域将使受体上的酪氨酸残基磷酸化，使受体处于“活性”状态。通过某些细胞内磷酸酶酶法去除这些磷酸残基终止受体的“活性”状态及其对细胞行为的活性。原钒酸盐能够抑制这些磷酸酶并增强受体磷酸化作用和活性。
可以将因子诸如生长因子和原钒酸盐加入胶原蛋白结构中来增强稳定性并刺激细胞反应。在无关联配体的情况下加入胶原蛋白基质的实际结构中的原钒酸盐保证其滞留并通过充当连接相邻分子的离子桥而使基质溶解降到最低。在这种形式中，胶原蛋白/原钒酸盐复合物增强了细胞基质相互作用并提高了对内源酪氨酸激酶生长刺激物和外源添加的酪氨酸激酶生长刺激物的细胞反应，尤其是细胞存活、迁移、增殖和分化。存在原钒酸盐毒性的报道，然而它在不存在关联配体的情况下以与胶原蛋白分子牢固地离子缔合的方式加入限制了原钒酸盐的扩散，限制了其系统暴露并且限制了其对细胞进入和接触构建体的作用。
除了其他方面以外，我们已描述了将纯化的胶原蛋白从溶液制备成膜的方法，在所述膜中胶原蛋白以多种形式排列(对齐的、扭折的、编织的或以上的组合)。可以通过顺序应用水溶剂和在溶剂空气界面的力将这些材料转化或形成个体假纤维。可以交联这些假纤维以增强其强度并用多种因子诸如肝素和其他因子处理以增强其储存生长因子的能力并增强其水合作用。应用至需要处理的组织是通过本领域熟练医师公知的标准程序。
应理解本文所述的例子和实施方案仅是出于说明目的并且根据本文所述的例子和实施方案的各种变更或改变是对本领域技术人员暗示的，并且将被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。出于所有目的将本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文。
实施例
提供以下实施例仅是为了说明目的并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。
对成纤维细胞和间充质干细胞(小鼠脂肪来源和人骨髓来源)进行细胞培养研究。使用以下细胞生长培养基：对成纤维细胞使用具有10％FBS的低葡萄糖DMEM，对脂肪来源的干细胞使用具有10％FBS的高葡萄糖DMEM，对人间充质干细胞使用具有20％FBS的α-MEM(所有培养基补充1％青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺)。
实施例1：在玻璃芯片上具有腱样结构的定向胶原蛋白膜(基质)上的细胞接种。使用成纤维细胞和间充质干细胞(小鼠脂肪来源和人骨髓来源)。将细胞以4-6,000个细胞/cm2接种到放在6孔细胞培养板中的玻璃芯片上的胶原蛋白基底上，在没有FBS的生长培养基中并使其附着。然后将培养基更换成完全生长培养基(具有10％FBS)，在其中将细胞保持达一周。细胞根据基底图样在基底上对齐，见图2A。观察细胞直到它们形成单层片(达一周)。
实施例2：在胶原蛋白假纤维上的细胞接种。使用成纤维细胞。将细胞以高密度细胞悬液(106个细胞/ml)接种在定向胶原蛋白假纤维上：将3-cm假纤维放在具有1ml细胞悬液的15-ml Falcon管中并且在37℃下的CO2培养箱中在摇床上孵育30min。然后将接种细胞的假纤维放在6孔培养板的孔中，将假纤维末端用玻璃芯片固定。在接种后用光学显微镜证实细胞附着，并且用光学显微镜和荧光显微镜监测细胞从假纤维迁移，如图14所示。
实施例3：将胶原蛋白带浸入具有氯化钠缓冲液的原钒酸盐的酸性溶液中。由于离子交换反应的结果，原钒酸盐将交联胶原蛋白原纤维并形成保存结构特征的胶原蛋白-钒酸盐复合材料基质。在PBS(磷酸盐缓冲盐水)中的中和以及在DI水中的漂洗移除多余的原钒酸盐。
出于说明和描述的目的已呈现了对本发明的具体实施方案的以上描述。它们并非旨在为穷尽的或将本发明限制成公开的精确形式，并且显然根据以上教导内容许多变动和更改是可能的。实施方案的选择和描述是为了便于最好地解释本发明的原理及其实际应用，由此使本领域其他技术人员能够最好地利用本发明和各种实施方案，并根据适于所考虑的特定用途做出各种变动。本发明的范围意图由本发明所附的权利要求及其等同替代来限定。
本文所引用的所有专利、专利申请、出版物和参考文献通过引用明确地并入本文，其程度如同具体和单独地指出每篇单独的出版物或专利申请通过引用并入本文。

Claims (36)

1.一种由形成液晶溶液或凝胶的原纤维生物聚合体制造定向原纤维生物聚合体材料的方法，所述方法包括以下步骤：
制备期望的液晶相的原纤维生物聚合体溶液或凝胶；
使所述原纤维生物聚合体溶液或凝胶以大致上层流的状态或方式流动；并且
将所述原纤维生物聚合体溶液或凝胶从液体转化为固相以形成定向原纤维生物聚合体材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过调整以下一种或多种来制备所述原纤维生物聚合体溶液或凝胶：浓度、温度、pH、离子强度或添加剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述流动步骤导致具有长程取向次序的特定图样的形成。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述转化步骤还包括促进所述原纤维生物聚合体的自组装。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述转化步骤还包括在转化过程中改变环境条件。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述环境条件是以下的任何一种或多种：环境湿度、温度或静电条件。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述原纤维生物聚合体溶液或凝胶显示可通过外部蒸发调整的离子强度和pH。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述液晶相被沉积在官能化基底上。
9.根据权利要求8所述的方法，其中官能化被设置成促进对基底的低粘附。
10.根据权利要求8所述的方法，其中官能化被设置成促进对基底的高粘附。
11.根据权利要求8所述的方法，其中官能化被设置成影响所述固相中的最终取向。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述定向原纤维材料被进一步交联和灭菌。
13.根据权利要求1所述的方法，其中定向原纤维材料从具有低粘附力的基底中移出。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述定向原纤维材料具有带形式。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述液晶相是溶致液晶相。
16.一种生产原纤维生物聚合体假纤维的方法，所述方法包括如下步骤：
通过根据权利要求1的方法制备定向生物聚合体材料；
将定向生物聚合体材料浸入具有2到9的范围内的pH的溶液中；并且
将所述定向生物聚合体材料从所述溶液中拉出以使得所述材料在空气-液体界面塌缩成假纤维。
17.根据权利要求16所述的方法，所述方法还包括干燥所述原纤维生物聚合体假纤维。
18.根据权利要求16所述的方法，所述方法还包括交联所述原纤维生物聚合体假纤维。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述定向生物聚合体材料由一种或多种带构成。
20.一种根据权利要求1形成的定向原纤维生物聚合体材料，所述材料具有层形式，所述层具有与所述层的表面平行的任何方向的平均原纤维取向。
21.一种根据权利要求1形成的定向原纤维生物聚合体材料，所述材料具有层，所述层具有与所述层的表面垂直的方向的平均原纤维取向。
22.一种根据权利要求1形成的定向原纤维生物聚合体材料，所述材料具有管，所述管具有与所述管的轴成一定角度的平均原纤维取向。
23.一种根据权利要求1形成的定向原纤维生物聚合体材料，所述材料具有单卷曲图样。
24.一种根据权利要求1形成的定向原纤维生物聚合体材料，所述材料具有卷曲构造之间成任意角度的双卷曲图样。
25.一种根据权利要求1形成的定向原纤维生物聚合体材料，所述材料具有由左手螺旋原纤维和右手螺旋原纤维形成的卷曲图样。
26.一种根据权利要求1形成的定向原纤维生物聚合体材料，所述材料具有大致平行线以大致相等交错角的人字纹形式的卷曲图样。
27.用于形成生物复合结构的方法，所述方法包括：
通过根据权利要求1所述的方法来制备定向原纤维生物聚合体材料；和
形成生物复合结构，所述生物复合结构包括至少一种定向原纤维生物聚合体材料和生物可降解的生物相容性基质。
28.一种生物复合结构，包括：根据权利要求1的方法制造的多种定向原纤维生物聚合体材料以及将所述多种定向原纤维生物聚合体材料粘合在一起的生物可降解的生物相容性基质。
29.根据权利要求1所述的方法，其中形成定向原纤维生物聚合体材料，所述材料用作细胞培养和组织培养应用中的基质和基底。
30.根据权利要求1所述的方法，其中形成定向原纤维生物聚合体材料，所述材料用作体内细胞引导支架。
31.根据权利要求1所述的方法，其中形成定向原纤维生物聚合体材料，以递送富含血小板的血浆的组分。
32.根据权利要求1所述的方法，其中形成定向原纤维生物聚合体材料，以递送活细胞用于组织的修复和再生。
33.根据权利要求16形成的一种原纤维生物聚合体假纤维或多种假纤维，所述一种原纤维生物聚合体假纤维或多种假纤维被设置成递送活细胞和富含血小板的血浆的组分用于组织的修复和再生。
34.根据权利要求1所述的方法，其中形成定向原纤维生物聚合体材料，以递送肽、药物、生长因子和小分子。
35.根据权利要求27所述的方法，其中所述生物相容性基质由选自糖胺聚糖、蛋白聚糖、钒酸盐、磷酸钙、活细胞、和生长因子的一种或多种材料组成。
36.根据权利要求1所述的方法，其中，使原纤维胶原蛋白溶液或凝胶以大致上分层的状态流动并以期望的方式定向，并且随后将所述溶液或凝胶从液相转化为固相来形成基于定向胶原蛋白的材料。
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