CN102277409A - 一种基于多种微生物的急性毒性试验方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于多种微生物的急性毒性试验方法及其试剂盒。它以Comamonas test osterone HJK 1.4-9，Brevibacterium epidermidis HJK 2.11-1，Staphylococcus sciuri HJK8.2-17，Diaphorobacter nitroreducens HJK 2.2-7，Brevundimonas diminuta HJK 2.2-9，Pseudom onas Sp.HJK 1.6-3，Ochrobactrum anthropi HJK1.2-13，Citrobacter freundii HJK 2.3-11，Pantoea agglomerans HJK 2.3-6，Enterococcus casseliflavus HJK 2.3-10，Saccharomyces cere visiae HJK 5.1-5作为受试微生物，利用脱氢酶活性法检测待测样品对上述11种微生物细胞的脱氢酶活性变化来评价待测样品的毒性大小。以上述11种微生物作为检测待测样品的急性毒性的受试微生物时，其重复性较好，稳定性高，以其作为急性毒性试验获取均值MTC是可靠的。且一次试验可以提供11个急性毒性值，可避免单个物种试验的灵敏度单一性，在化学品毒性评价和环境样品毒性检测中具有较好的应用前景。
Description
技术领域：
本发明涉及一种急性毒性的评价方法及其试剂盒，具体涉及一种基于多种微生物的急性毒性试验方法及其试剂盒。
背景技术：
微生物试验相对于其他生物试验方法，在毒性检测中具有不可比拟的优势。微生物世代时间短，可以大大缩短试验时间；操作容量小而受试生物量大，能够反映整个群体的染毒效应，而非个别效应；微生物适应力强，能用于各种灵敏度要求不同的环境样品的测定；没有道德上的争议存在。目前用于水质检测的微生物检测法主要有以下几种：生物发光法、生长抑制法、呼吸计量法、酶活法及硝化速率法等等。
脱氢酶活性法是其中一种应用较多的生物试验。应用脱氢酶检测样品毒性是通过测定毒物对细菌体内的脱氢酶活性的影响来确定毒物毒性。实验中应用细菌活细胞作为酶源，在毒物作用下，微生物代谢作用的任何改变必将影响反应系统中脱氢酶活性。脱氢酶在各种生物的新陈代谢中都起着重要的作用。通过测定废水、污染水体或化学品对脱氢酶活性的影响，了解污染物的毒性和生态学效应。在生物新陈代谢过程中，脱氢酶起着传递体作用，即将有机质的氢脱下，使有机质氧化，并将氢转移给氧化型化合物。在无氧反应系统中，受毒物作用，脱氢酶活性降低，其程度与毒物毒性存在一定关系，所以可以用毒物对脱氢酶活性的影响确定毒物毒性的大小。测定脱氢酶活性要用到四氮唑盐——一种在脱氢酶作用下还原为不同颜色的物质，用得较多的有TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)、MTT(溴化噻唑蓝四氮唑)、INT(碘硝基氯化四氮唑蓝)以及新一代水溶性的XTT(3，3′-[1-(苯氨酰基)-3，4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠)、WST-1(2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-苯二磺酸)-2H-四唑单钠盐)等。结合现代物理学的光电检测技术和计算机数据处理技术，还可制成便携式野外水质毒性检测仪，从而实现对水质毒性野外现场快速的检测。
发明内容：
本发明的第一目的是提供一种基于多种微生物急性毒性试验方法，利用该方法对待测样品的急性毒性进行检测，具有稳定性好，可靠的优点。
本发明的基于多种微生物的急性毒性试验方法，其特征在于，包括以下步骤：
以Comamonas testosterone HJK 1.4-9，Brevibacterium epidermidis HJK 2.11-1，Staphylococcus sciuri HJK8.2-17，Diaphorobacter nitroreducens HJK 2.2-7，Brevundimonasdiminuta HJK 2.2-9，Pseudomonas Sp.HJK 1.6-3，Ochrobactrum anthropi HJK1.2-13，Citrobacterfreundii HJK 2.3-11，Pantoea agglomerans HJK 2.3-6，Enterococcus casseliflavus HJK 2.3-10，Saccharomyces cerevisiae HJK 5.1-5作为受试微生物，利用脱氢酶活性法检测待测样品对上述11种微生物细胞的脱氢酶活性变化来评价待测样品的毒性大小。
本发明还提供一种检测待测样品急性毒性的检测试剂盒，包括受试微生物、培养受试微生物的培养液、培养受试微生物的器皿和四氮唑盐，其特征在于，所述的受试微生物为Comamonas testosterone HJK 1.4-9，Brevibacterium epidermidis HJK 2.11-1，Staphylococcussciuri HJK8.2-17，Diaphorobacter nitroreducens HJK 2.2-7，Brevundimonas diminuta HJK 2.2-9，Pseudomonas Sp.HJK 1.6-3，Ochrobactrum anthropi HJK 1.2-13，Citrobacter freundii HJK 2.3-11，Pantoea agglomerans HJK 2.3-6，Enterococcus casseliflavus HJK 2.3-10和Saccharomycescerevisiae HJK 5.1-5。
所述的培养受试微生物的器皿优选为96孔板，96孔板能使11种微生物和空白对照在同一个板上面反应，显示，便于利用和观察。
所述的四氮唑盐优选为2，3，5-氯化三苯基四氮唑。
本发明的受试微生物：Comamonas testosterone HJK 1.4-9，Brevibacterium epidermidis HJK2.11-1，Staphylococcus sciuri HJK8.2-17，Diaphorobacter nitroreducens HJK 2.2-7，Brevundimonas diminuta HJK 2.2-9，Pseudomonas Sp.HJK 1.6-3，Ochrobactrum anthropiHJK 1.2-13，Citrobacter freundii HJK 2.3-11，Pantoea agglomerans HJK 2.3-6，Enterococcuscasseliflavus HJK 2.3-10和Saccharomyces cerevisiae HJK 5.1-5都可以从广东省微生物菌种保藏中心(广东省广州市越秀区先烈中路100号大院广东省微生物研究所)中购买到。
本发明选择上述11种微生物作为检测待测样品的急性毒性的受试微生物，根据微生物细胞脱氢酶在外界毒物作用下受阻，通过四氮唑盐检测微生物细胞的脱氢酶活性变化来评价样品的毒性大小，这是由于经本发明人实验发现，上述11种微生物作为检测待测样品的急性毒性的受试微生物时，其重复性较好，稳定性高，以其作为急性毒性试验获取均值MTC是可靠的。并且一次试验可以提供11个急性毒性值，可避免单个物种试验的灵敏度单一性，在化学品毒性评价和环境样品毒性检测中具有较好的应用前景。
附图说明：
图1是实施例1的TOXPlate的96孔板的使用示意图；
图2是11种微生物对测试化合物的均值MTC的变异系数CV值的散点分布图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
一、稳定性测试：
方法：
1)将Comamonas testosterone HJK 1.4-9(1#)，Brevibacterium epidermidis HJK 2.11-1(2#)，Staphylococcus sciuri HJK8.2-17(3#)，Diaphorobacter nitroreducens HJK 2.2-7(4#)，Brevundimonas diminuta HJK 2.2-9(5#)，Pseudomonas Sp.HJK 1.6-3(6#)，OchrobactrumanthropiHJK1.2-13(7#)，CitrobacterfreundiiHJK 2.3-11(8#)，PantoeaagglomeransHJK 2.3-6(9#)和Enterococcus casseliflavus HJK 2.3-10(10#)接种于LB液体培养基中，30℃，175r/min，培养18小时，然后再用LB液体培养基将菌液密度调至OD600＝1.0，再用2倍浓度的LB液体培养基+0.01％(w/v)TTC将其稀释100倍制成菌悬液；将Saccharomyces cerevisiae HJK 5.1-5(11#)接种于YPD液体培养基中，30℃，175r/min，培养18小时，用YPD液体培养基将菌液密度调至OD600＝1.0，再用2倍浓度的YPD液体培养基+0.01％(w/v)TTC将其成稀释100倍制成菌悬液。
2)将样品丝裂霉素、氟化钠、硫酸锂，苯酚，敌克松，氯化钾和丙烯酰胺配制成10mg/mL，再进行2倍梯度稀释，稀释液液待用(即用二次去离子水分别将样品稀释2、4、8、16、32、64倍)。
3)如图1所示，TOXPlate 96孔板，其横向12列，每一列作为一种受试微生物的反应孔，每一列的8个孔加入待测样品的2倍梯度浓度稀释液，即在第1列每孔加入菌株1#菌悬液50μl，第2列每孔加入菌株2#菌悬液50μl，如此类推，第11列每孔加入菌株11#菌悬液50μl。往第H行加入50μL未经稀释的待检测样品(原样)，由G往上至B依次是加入2、4、8、16、32、64倍梯度稀释液各50μl，第A行每孔加入50μl纯水作为阴性对照；合上盖子，30℃恒温培养18h，用酶标仪测定490nm吸光值。
4)a、分别计算单个菌MTC和均值MTC的变异系数CV(coefficient ofvariations)并绘成散点图；
b、画出剂量与MTC值的回归曲线，计算相关系数值
MTC值的计算方法如下：
其中Cmin——梯度浓度中最小浓度值；
D-稀释因子，对于2倍稀释法d即为2；
G-生长率，G＝1-I，I为抑制百分数
A为吸光度(absorption)，A0即阴性对照吸光度。
MTC和均值MTC的变异系数CV(coefficient of variations)的散点图如图1所示，CV小于0.2表示重复性较好，反之证明重复性差。从图1可以看出均值MTC的重复性较好，基本上远小于0.2且大部分低于0.1，虽然单个菌株表现出的稳定性略差，偶有超过0.2的现象，包括有CV＝0.5这种摆动幅度过大的情况。总体看来，作为急性毒性试验获取均值MTC是可靠的，稳定性好。
11株菌对不同种类化学物质的剂量-效应曲线的相关系数如表1所示，
每个菌都暴露于一定梯度浓度的几种化学物质中，与TTC一起温浴18h后，用酶标仪检测各菌细胞活性。在毒性试验中，受试生物的选择其中的重要要求为试验生物对试验毒物具有敏感度，也就是对于外来物质刺激要具备良好的剂量效应关系。以化学物剂量为横坐标，吸光度A490为纵坐标，每个菌都将得到一条不同浓度下A490的变化曲线，也就是剂量效应曲线。对于曲线下降部分的点采取线性拟合，计算相关系数的平方。从剂量反应曲线方面看(表1)，基本上所有受试菌均表现出良好的剂量反应关系，R2值都能保持在0.8以上。部分菌株下降曲线的线性度极高，保证了EC50计算的准确度，也为EC50和MTC同质化提供前提。
表1：11株菌对不同种类化学物质的剂量-效应曲线的相关系数平方R2
实施例1：
步骤1：
溶液一：将Comamonas testosterone HJK 1.4-9(1#)，Brevibacterium epidermidis HJK 2.11-1(2#)，Staphylococcus sciuri HJK8.2-17(3#)，Diaphorobacter nitroreducens HJK 2.2-7(4#)，Brevundimonas diminuta HJK 2.2-9(5#)，Pseudomonas Sp.HJK 1.6-3(6#)，Ochrobactrumanthropi HJK1.2-13(7#)，Citrobacter freundiiHJK 2.3-11(8#)，PantoeaagglomeransHJK 2.3-6(9#)和Enterococcus casseliflavus HJK 2.3-10(10#)分别接种于LB琼脂平板上进行活化，然后再分别挑取单菌落至LB液体培养基中，30℃振荡培养过夜；将Saccharomyces cerevisiaeHJK 5.1-5挑取至YPD液体培养基中，30℃振荡培养过夜。取适量菌液，用LB液体培养基将菌液密度以OD600为准调至相应浓度(表2)的菌悬液I(在该浓度下，本实验才能完成)，本实施例具体的接种浓度如表3所示，所得菌悬液I再用2倍浓度的LB液体培养基和0.01％(w/v)TTC溶液稀释100倍，制成菌悬液II，即为溶液一。
表2：各菌接种浓度范围
表3：各菌接种浓度
溶液二(样品稀释液)：以10mg/mL的KCl、NaF、Li2SO4、Ba(NO3)2、HgCl2、丝裂霉素C(MMC)、敌克松、丙烯酰胺、乙酰水杨酸、茶碱和苯酚作为待检测样品。再进行2倍梯度稀释(即用二次去离子水分别将样品稀释2、4、8、16、32、64倍待用)。
步骤2：
如图1所示，TOXPlate 96孔板，其横向12列，每一列作为一种受试微生物的反应孔，每一列的8个孔加入待测样品的n倍梯度浓度稀释液(本实施例是2倍)，即在第1列每孔加入菌株1#菌悬液II(溶液一)50μl，第2列每孔加入菌株2#菌悬液II(溶液一)50μl，如此类推，第11列每孔加入菌株11#菌悬液II(溶液一)50μl。往第H行加入50μL未经稀释的待检测样品(原样)，由G往上至B依次是加入2、4、8、16、32、64倍梯度稀释液各50μl，第A行每孔加入50μl纯水作为阴性对照；合上盖子，30℃恒温培养18h，用酶标仪测定490nm吸光值。
计算MTC值，试验结果如表4所示：
表4：11种微生物对待检测样品测定的MTC值(mg/mL)
由此可见，用本发明的方法检测KCl、NaF、Li2SO4、Ba(NO3)2、HgCl2、丝裂霉素C(MMC)、敌克松、丙烯酰胺、乙酰水杨酸、茶碱和苯酚等化学物质，并与发光细菌，溞类试验，藻类试验和大肠杆菌抑制试验进行灵敏度比较，结果显示用本发明的方法的灵敏度与大肠杆菌抑制试验、发光细菌试验等微生物试验处于同一水平，与大型溞急性毒性试验、藻类生长抑制试验、萼花臂尾轮虫试验等相差1-2个数量级。11株试验微生物对各种不同化学物质的反应显示，试验结果较为稳定，均MTC的变异系数CV远小于20％，而个别菌MTC有CV大于30％的情况，表明单个菌稳定性不如平均值可靠，总体试验重复性较好。测试结果表达方面，MTC与传统的EC50基本保持一致，数值上略低于EC50。
Claims (4)
1.一种基于多种微生物的急性毒性试验方法，其特征在于，包括以下步骤：
以Comamonas testosterone HJK 1.4-9，Brevibacterium epidermidis HJK 2.11-1，Staphylococcus sciuri HJK8.2-17，Diaphorobacter nitroreducens HJK 2.2-7，Brevundimonasdiminuta HJK 2.2-9，Pseudomonas Sp.HJK 1.6-3，Ochrobactrum anthropi HJK1.2-13，Citrobacterfreundii HJK 2.3-11，Pantoea agglomerans HJK 2.3-6，Enterococcus casseliflavus HJK 2.3-10，Saccharomyces cerevisiae HJK 5.1-5作为受试微生物，利用脱氢酶活性法检测待测样品对上述11种微生物细胞的脱氢酶活性变化来评价待测样品的毒性大小。
2.一种检测待测样品急性毒性的检测试剂盒，包括受试微生物、培养受试微生物的培养液、培养受试微生物的器皿和四氮唑盐，其特征在于，所述的受试微生物为Comamonastestosterone HJK 1.4-9，Brevibacterium epidermidis HJK 2.11-1，Staphylococcus sciuri HJK8.2-17，Diaphorobacter nitroreducens HJK 2.2-7，Brevundimonas diminuta HJK 2.2-9，Pseudomonas Sp.HJK 1.6-3，Ochrobactrum anthropi HJK1.2-13，Citrobacter freundii HJK 2.3-11，Pantoeaagglomerans HJK 2.3-6，Enterococcus casseliflavus HJK 2.3-10和Saccharomyces cerevisiae HJK5.1-5。
3.根据权利要求2所述的检测待测样品急性毒性的检测试剂盒，其特征在于，所述的培养受试微生物的器皿为96孔板。
4.根据权利要求2所述的检测待测样品急性毒性的检测试剂盒，其特征在于，所述的四氮唑盐为2，3，5-氯化三苯基四氮唑。
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