CN102268420B - 一株多节孢菌的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株多节孢菌的应用。该多节孢菌株为多节孢(Nodulisporium sp.)CTB-1 CGMCC No.2482，可用于制备复合酶制剂，所述复合酶制剂的活性成分为下述四种酶中四种、任意三种或任意两种酶：木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶和β-葡聚糖酶。利用多节孢CTB-1 CGMCC No.2482制备复合酶制剂无需(或稍微)进行多组分酶的复配，得到的产品即可符合要求，成本低廉，可以广泛地用于纺织、饲料、纤维素乙醇、植物提取等行业。

Description

一株多节孢菌的应用
技术领域
本发明涉及一株多节孢菌的应用，特别涉及多节孢(Nodulisporium sp.)CTB-1CGMCC No.2482在制备含有木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶和β-葡聚糖酶的复合酶制剂中的应用。
背景技术
纤维素酶是降解纤维素生成纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，纤维素酶几乎可以用于所有以植物和植物籽实为原料的加工业，应用领域非常广泛。目前纤维素酶的应用开发正以前所未有的速度迅速延伸到纺织、食品、饲料加工、植物有效成分的提取、造纸、石油开采、燃料酒精等许多领域。
木聚糖是一种多聚五碳糖，主要成分是D-木糖，是植物半纤维素的重要组成部分。木聚糖酶是一类以内切和外切方式降解木聚糖分子中β-1，4-木糖苷键的酶系，该酶系也可广泛应用于纺织、造纸、食品、饲料添加剂、燃料酒精等领域。在利用植物纤维质原料生产酒精的领域中，木聚糖酶把半纤维素最终分解为木糖，以便于同化木糖的酵母菌把木糖转化为酒精，增加纤维质原料的乙醇产出率。因此，在许多利用植物纤维质为原料的工业领域，都同时需要纤维素酶和木聚糖酶的作用，而目前酶制剂的工业生产还是生产单一的酶系。
我国农业废弃物和造纸工业排放的废水量都很大，仅秸秆年产量就达7亿吨，这些农业废弃物大多被农民焚烧掉，而排放的造纸废水中含有大量可再利用的废纸浆，这不仅严重污染环境，而且浪费了宝贵资源。
多节孢属真菌目前有文献报道的应用研究不多，其用途多为发酵生产紫杉醇，还没有用于生产纤维素酶和木聚糖酶的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株多节孢(Nodulisporium sp.)CTB-1CGMCC No.2482的应用。
本发明所提供的多节孢(Nodulisporium sp.)CTB-1CGMCC No.2482可用于制备复合酶制剂。
所述复合酶制剂的活性成分为下述四种酶中四种、任意三种或任意两种酶：木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶和β-葡聚糖酶；
所述制备复合酶制剂包括如下步骤：将多节孢(Nodulisporium sp.)CTB-1CGMCCNo.2482进行液体发酵收集发酵液，从所述发酵液中提取所述复合酶制剂的活性成分。
所述发酵使用的培养基由水和以下组分组成：
1)葡萄糖；
2)至少一种含纤维素的工农业废弃物；
3)选自下述六种原料中的至少一种原料：豆粕、棉粕、花生粕、酵母粉、玉米浆和麸皮；
4)营养盐；
5)微量元素；
所述培养基的pH＝5.0±0.2。
所述各组分在所述培养基中的浓度如下：所述葡萄糖2g/L-10g/L，具体可为2g/L-4g/L；所述含纤维素的工农业废弃物总量5g/L-50g/L，具体可为25g/L-40g/L；所述原料总量5g/L-60g/L，具体可为13g/L-32g/L；所述营养盐由CaCl2、尿素、KH2PO4、(NH4)2SO4和MgSO4组成，所述培养基中，所述CaCl2的浓度为0.6g/L、所述尿素的浓度为0.6g/L、所述KH2PO4的浓度为4g/L、所述(NH4)2SO4的浓度为2.8g/L和所述MgSO4的浓度为0.6g/L；所述微量元素由FeSO4、MnSO4、ZnSO4和CoCl2组成，所述培养基中所述FeSO4的浓度为0.01g/L、所述MnSO4的浓度为0.0032g/L、所述ZnSO4的浓度为0.0028g/L和所述CoCl2的浓度为0.0074g/L。
所述含纤维素的工农业废弃物为稻草粉、麦秸粉、玉米秸杆粉、甜菜渣、锯木屑、废纸浆和玉米皮。
所述发酵的温度为33℃。
从所述发酵液中提取所述复合酶制剂的活性成分包括以下步骤：通过过滤去除所述发酵液中的固体残渣和菌体，然后经过超滤浓缩和喷雾干燥，得到固体复合酶制剂。
所述喷雾干燥的入口温度为170℃，出口温度为70℃。
所述固体复合酶制剂还包括辅剂麦芽糊精。
多节孢(Nodulisporium sp.)CTB-1菌株是从无锡市郊一处农田的土样中筛选分离获得的菌株作为原始菌株，经多次诱变选育得到的，经鉴定为多节孢菌。多节孢(Nodulisporium sp.)CTB-1菌株于2008年05月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，其注册登记编号为CGMCC No.2482。
本发明提供的多节孢(Nodulisporium sp.)CTB-1CGMCC No.2482具有以下微生物学特征：
在PDA平板上25℃培养7天后菌落的直径为60-70mm。初期为白色菌丝，后期可形成绿色产孢区。培养基渐呈淡黄色。分生孢子梗菌丝形或瓶形，长7.5-30μm，直径2-4μm，产孢细胞顶部有明显疤痕。分生孢子卵形、椭圆形至柱形，3.0-7.5μm×2.0-3.5μm，单细胞，淡褐色，光滑。厚垣孢子顶生或间生，近球形，直径5-12μm。
本发明采用工农业废弃物通过液体发酵培养多节孢(Nodulisporium sp.)CTB-1CGMCC No.2482，生产纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶和果胶酶这四种酶，该方法具有以下优点：
1)生产的纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶和果胶酶这四种酶可将植物生物质降解为单糖；
2)以工农业废弃物作为发酵培养基的主要组分，且液体发酵产物可直接制备复合酶，使酶制剂的生产成本降低，应用性能提高，同时还可促进植物纤维质原料的利用，减少环境污染；
3)采用过滤方法去除发酵液固体残渣和菌体，保证了酶液性质不受这些物质的干扰；通过超滤浓缩进一步纯化酶制剂，降低了干燥成本；通过喷雾干燥，使活性酶回收；
4)本发明产生的酶产品应用在纺织行业，可使棉、麻织物的前后整理同浴进行，缩短工艺过程，提高生产效率；应用在饲料行业和秸杆饲料化处理方面可大幅提高饲料效价、分解饲料中含有的抗营养吸收因子、促进动物对营养的消化吸收率；应用在纤维素乙醇的生产方面，可提高植物纤维质原料的利用率、大大降低生产成本，减少木材消耗、保护植被，节约能源。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中发酵培养基中所采用的原料来源如下：
麦秸粉：小麦秸秆粉碎物，粒径40目。
玉米秸秆粉：玉米秸秆粉碎物，粒径40目。
稻草粉：稻草粉碎物，粒径40目。
酵母粉：啤酒等食品饮料发酵工业副产物。
花生粕：是以脱壳花生米为原料，经压榨或浸提取油后的副产物。下述实施例中花生粕购自山东玉皇粮油食品有限公司。
豆粕：是大豆提取豆油后得到的一种副产品。下述实施例中豆粕购自河北三河汇福粮油集团有限公司。
麸皮：小麦最外层的表皮，小麦被磨面机加工后，变成面粉和麸皮两部分，麸皮就是小麦的外皮。麸皮含氮量的范围在10-30％。
玉米皮：是玉米果穗外的苞叶的粉碎物，粒径40目。
玉米浆：是制玉米淀粉的副产物，即将玉米粒先用亚硫酸浸泡，浸泡液浓缩制成黄褐色的液体为玉米浆。下述实施例中玉米浆购自鲁洲生物科技(山东)有限公司。
废纸浆：报纸等废纸经过粉碎、净化、浮选脱墨、脱水、干燥等工艺制成的纤维素物质。
下述实施例中所提到的营养盐、微量元素由如下物质组成：
营养盐：由CaCl2、尿素、KH2PO4、(NH4)2SO4和MgSO4组成；
微量元素：由FeSO4、MnSO4、ZnSO4和CoCl2组成。
下述实施例中，所使用的种子斜面培养基和种子罐培养基的配方如下：
种子斜面培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)15g/L，蛋白胨5g/L，琼脂15g/L，CaCl2 0.3g/L、尿素0.3g/L、KH2PO4 2g/L、(NH4)2SO4 1.4g/L、MgSO4 0.3g/L，FeSO40.005g/L，MnSO4 0.0016g/L，ZnSO4 0.0014g/L，CoCl2 0.0037g/L，以水为溶剂，pH值为6.0±0.1。
种子罐培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，CaCl2 0.3g/L、尿素0.3g/L、KH2PO42g/L、(NH4)2SO4 1.4g/L、MgSO4 0.3g/L，FeSO4 0.025g/L，MnSO4 0.008g/L，ZnSO40.007g/L，CoCl2 0.0185g/L，柠檬酸5.7g/L，柠檬酸钠6.73g/L，以水为溶剂，pH值为5.0±0.2。
下述实施例中，所涉及的酶活定义如下：
纤维素酶(CMC)活力：采用DNS法，在pH＝4.8，50℃条件下，1ml酶液催化2％羧甲基纤维素钠分解，每小时产生1.0mg还原糖(以葡萄糖计)定义为一个活力单位，以U/mL或U/g表示。
木聚糖酶活力：采用DNS法，在pH＝4.8，50℃条件下，1ml酶液催化0.5％木聚糖分解，每小时产生1.0mg还原糖(以木糖计)定义为一个活力单位，以U/mL或U/g表示。
果胶酶定性检测：制作孢子悬液，稀释适当倍数后涂布于以果胶为唯一碳源的平板，置于28℃的恒温培养箱中培养3天，取出，喷以0.005％溴甲酚蓝溶液，可明显地看到黄色的色变圈(果胶被果胶酶水解后生成游离果胶酸呈酸性而使指示剂变色)，说明该多节孢菌株能够产生果胶酶，并分解利用果胶。
β-葡聚糖酶定性检测：制作孢子悬液，稀释适当倍数后涂布于β-葡聚糖刚果红营养平板(GCN平板)，置于28℃的恒温培养箱中培养3天，可看见明显的透明圈(β-葡聚糖被水解成葡萄糖等小分子不能与刚果红显红色)，说明该多节孢菌株能够产生β-葡聚糖酶。
实施例1、多节孢(Nodulisporium sp.)CTB-1CGMCC No.2482的分离、纯化与鉴定
1、多节孢(Nodulisporium sp.)的分离
取无锡市郊一处农田的下层土壤，用无菌生理盐水稀释到适当倍数，涂平板，选择培养基分别以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)和木聚糖为唯一碳源，用影印法筛选出能同时在两种单一碳源的平板上生长的菌落，挑选出12株菌纯化保藏；用刚果红染色透明圈法，选出透明圈和菌落直径比较大的5株菌，经过摇瓶复筛得到一株产纤维素酶活力和木聚糖酶活力都相对较高的菌C1。
2、多节孢(Nodulisporium sp.)的诱变选育
以菌株C1作为出发菌，经紫外线、亚硝基胍复合诱变处理，得到诱变株CTB-1。具体方法如下：
用生理盐水冲洗出发菌株C1斜面，用脱脂棉过滤后，配制成106个/ml的孢子悬浮液，将孢子悬浮液置于紫外光(30W，30cm)下，暗室搅拌4min。然后向该孢子悬浮液中加入1mg/mL亚硝基胍，33℃恒温水浴，诱变40min。
诱变后进行平皿分离筛选，挑选20-30个单菌落，做摇瓶发酵试验，测定产酶活力，以木聚糖酶和纤维素酶的产酶活力为主要检测指标，选择2～3株酶活高的菌株作为高产菌株重复试验，选择一株产量最高的菌株作为下一次诱变的出发菌株，经过几次诱变后获得一株高产木聚糖酶和纤维素酶的菌株，将该菌株命名为CTB-1。
菌株CTB-1经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)鉴定为多节孢(Nodulisporium sp.)，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2482。其生物学特性如下：
在PDA平板上25℃培养7天后菌落直径60-70mm。初期为白色菌丝，后期可形成绿色产孢区。培养基渐呈淡黄色。分生孢子梗菌丝形或瓶形，长7.5-30μm，直径2-4μm，产孢细胞顶部有明显疤痕。分生孢子卵形、椭圆形至柱形，3.0-7.5μm×2.0-3.5μm，单细胞，淡褐色，光滑。厚垣孢子顶生或间生，近球形，直径5-12μm。
实施例2、多节孢(Nodulisporium sp.)CTB-1CGMCC No.2482利用工农业废弃物同时高产纤维素酶和木聚糖酶复合酶及其酶活测定
1、将实施例1的多节孢(Nodulisporium sp.)CTB-1 CGMCC No.2482接入种子斜面培养基上，于33℃恒温箱培养5天后，用无菌生理盐水洗脱，制作成菌悬液。
2、菌悬液转入投料灭菌完毕的种子罐中，于33℃搅拌通气培养36小时得到种子液。
3、种子液经移种管路转接到投料灭菌完毕的发酵罐(发酵培养基：麦秸粉10g/L，玉米秸秆粉15g/L，酵母粉2g/L，花生粕10g/L，麸皮3g/L，葡萄糖2g/L，CaCl20.6g/L，尿素0.6g/L，KH2PO4 4g/L，(NH4)2SO4 2.8g/L，MgSO4 0.6g/L，FeSO4 0.01g/L，MnSO40.0032g/L，ZnSO4 0.0028g/L，CoCl2 0.0074g/L，以水为溶剂，pH值为5.0±0.2)中，于33℃搅拌通气，培养160小时，得到含纤维素酶活力为1896U/ml和木聚糖酶活力为3309U/ml的发酵液。
4、发酵液经放料管路放入絮凝罐，在絮凝罐内加入20g/L硅藻土助滤剂(700目，内蒙古春生硅藻土有限责任公司)，经板框压滤机压滤，清液打入恒温储液罐经5000分子量超滤设备进行超滤浓缩8倍得到酶液半成品。
5、酶液半成品加入100g/L麦芽糊精，经入口温度为170℃、出口温度为70℃的喷雾干燥制成固体复合酶制剂，其纤维素酶活力达到10.6万U/g，木聚糖酶活力达到19.4万U/g，经定性检测，还具有果胶酶和β-葡聚糖酶活性。
实施例3、多节孢(Nodulisporium sp.)CTB-1CGMCC No.2482利用工农业废弃物同时高产纤维素酶和木聚糖酶复合酶及其酶活测定
1、将实施例1的多节孢(Nodulisporium sp.)CTB-1CGMCC No.2482接入种子斜面培养基上，于33℃恒温箱培养5天后，用无菌生理盐水洗脱，制作成菌悬液。
2、菌悬液转入投料灭菌完毕的种子罐中，于33℃搅拌通气培养36小时得到种子液。
3、种子液经移种管路转接到投料灭菌完毕的发酵罐(发酵培养基：稻草粉15g/L，玉米皮25g/L，豆粕10g/L，麸皮3g/L，葡萄糖2g/L，CaCl2 0.6g/L，尿素0.6g/L，KH2PO44g/L，(NH4)2SO4 2.8g/L，MgSO4 0.6g/L，FeSO4 0.01g/L，MnSO4 0.0032g/L，ZnSO40.0028g/L，CoCl2 0.0074g/L，以水为溶剂，pH值为5.0±0.2)中，于33℃搅拌通气，培养160小时，得到含纤维素酶活力为1983U/ml和木聚糖酶活力为3420U/ml的发酵液。
4、发酵液经放料管路放入絮凝罐，在絮凝罐内加入20g/L硅藻土助滤剂(700目，内蒙古春生硅藻土有限责任公司)，经板框压滤机压滤，清液打入恒温储液罐经5000分子量超滤设备进行超滤浓缩8倍得到酶液半成品。
5、酶液半成品中加入100g/L麦芽糊精，经入口温度为170℃、出口温度为70℃的喷雾干燥制成固体复合酶，其纤维素酶活力达到11.8万U/g，木聚糖酶活力达到20万U/g，经定性检测，还含有果胶酶和β-葡聚糖酶活性。
实施例4、多节孢(Nodulisporium sp.)CTB-1CGMCC No.2482利用工农业废弃物同时高产纤维素酶和木聚糖酶复合酶及其酶活测定
1、将实施例1的多节孢(Nodulisporium sp.)CTB-1CGMCC No.2482接入种子斜面培养基上，于33℃恒温箱培养5天后，用无菌生理盐水洗脱，制作成菌悬液。
2、菌悬液转入投料灭菌完毕的种子罐中，于33℃搅拌通气培养36小时得到种子液。
3、种子液经移种管路转接到投料灭菌完毕的发酵罐(发酵培养基：废纸浆15g/L，玉米浆20g/L，玉米皮25g/L，麸皮3g/L，葡萄糖2g/L，CaCl2 0.6g/L，尿素0.6g/L，KH2PO44g/L，(NH4)2SO4 2.8g/L，MgSO4 0.6g/L，FeSO4 0.01g/L，MnSO4 0.0032g/L，ZnSO40.0028g/L，CoCl2 0.0074g/L，以水为溶剂，pH值为5.0±0.2)中，于33℃搅拌通气，培养160小时，得到含纤维素酶活力为2140U/ml和木聚糖酶活力为3554U/ml的发酵液。
4、发酵液经放料管路放入絮凝罐，在絮凝罐内加入20g/L硅藻土助滤剂(700目，内蒙古春生硅藻土有限责任公司)，经板框压滤机压滤，清液打入恒温储液罐经5000分子量超滤设备进行超滤浓缩8倍得到酶液半成品。
5、酶液半成品中加入100g/L麦芽糊精，经入口温度为170℃、出口温度为70℃的喷雾干燥制成固体复合酶，其纤维素酶活力达到12万U/g，木聚糖酶活力达到21万U/g，经定性检测，还含有果胶酶和β-葡聚糖酶活性。
实施例5、多节孢(Nodulisporium sp.)CTB-1CGMCC No.2482利用工农业废弃物同时高产纤维素酶和木聚糖酶复合酶及其酶活测定
1、将实施例1的多节孢(Nodulisporium sp.)CTB-1CGMCC No.2482接入种子斜面培养基上，于33℃恒温箱培养5天后，用无菌生理盐水洗脱，制作成菌悬液。
2、菌悬液转入投料灭菌完毕的种子罐中，于33℃搅拌通气培养36小时得到种子液。
3、种子液经移种管路转接到投料灭菌完毕的发酵罐(发酵培养基：稻草粉10g/L，玉米秸秆粉15g/L，酵母粉2g/L，豆粕10g/L，玉米浆10g/L，麸皮10g/L，葡萄糖4g/L，CaCl2 0.6g/L，尿素0.6g/L，KH2PO4 4g/L，(NH4)2SO4 2.8g/L，MgSO4 0.6g/L，FeSO4 0.01g/L，MnSO4 0.0032g/L，ZnSO4 0.0028g/L，CoCl2 0.0074g/L，以水为溶剂，pH值为5.0±0.2)中，于33℃搅拌通气，培养160小时，得到含纤维素酶活力为1983U/ml和木聚糖酶活力为3710U/ml的发酵液。
4、发酵液经放料管路放入絮凝罐，在絮凝罐内加入20g/L硅藻土助滤剂(700目，内蒙古春生硅藻土有限责任公司)，经板框压滤机压滤，清液打入恒温储液罐经5000分子量超滤设备进行超滤浓缩8倍得到酶液半成品。
5、酶液半成品中加入100g/L麦芽糊精，经入口温度为170℃、出口温度为70℃的喷雾干燥制成固体复合酶，其纤维素酶活力达到11.3万U/g，木聚糖酶活力达到22万U/g，经定性检测，还含有果胶酶和β-葡聚糖酶活性。

Claims (4)

1.多节孢（Nodulisporium sp.）CTB-1 CGMCC No.2482在制备复合酶制剂中的应用；
所述复合酶制剂的活性成分为木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶和β-葡聚糖酶；
所述制备复合酶制剂包括如下步骤：将多节孢（Nodulisporium sp.）CTB-1 CGMCCNo.2482进行液体发酵收集发酵液，从所述发酵液中提取所述复合酶制剂的活性成分；
所述发酵使用的培养基由水和以下组分组成：
1）葡萄糖；
2）至少一种含纤维素的工农业废弃物；
3）选自下述六种原料中的至少一种原料：豆粕、棉粕、花生粕、酵母粉、玉米浆和麸皮；
4）营养盐；
5）微量元素；
所述培养基的pH=5.0±0.2；
所述各组分在所述培养基中的浓度如下：所述葡萄糖2g/L-10g/L；所述含纤维素的工农业废弃物总量5g/L-50g/L；所述原料总量5g/L-60g/L；所述营养盐由CaCl2、尿素、KH2PO4、(NH4)2SO4和MgSO4组成，所述培养基中，所述CaCl2的浓度为0.6g/L、所述尿素的浓度为0.6g/L、所述KH2PO4的浓度为4g/L、所述(NH4)2SO4的浓度为2.8g/L和所述MgSO4的浓度为0.6g/L；所述微量元素由FeSO4、MnSO4、ZnSO4和CoCl2组成，所述培养基中所述FeSO4的浓度为0.01g/L、所述MnSO4的浓度为0.0032g/L、所述ZnSO4的浓度为0.0028g/L和所述CoCl2的浓度为0.0074g/L；
所述含纤维素的工农业废弃物为稻草粉、麦秸粉、玉米秸杆粉、甜菜渣、锯木屑、废纸浆和玉米皮。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述发酵的温度为33℃。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：从所述发酵液中提取所述复合酶制剂的活性成分包括以下步骤：通过过滤去除所述发酵液中的固体残渣和菌体，然后经过超滤浓缩和喷雾干燥，得到固体复合酶制剂；
所述喷雾干燥的入口温度为170℃，出口温度为70℃。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述固体复合酶制剂还包括辅剂麦芽糊精。
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MIA M. TAUK-TORNISIELO等.Soilborne filamentous fungi in Brazil.《J. Basic Microbiol.》.2005,第45卷(第1期),72-82.
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