CN102266433B - 金腰带在制备治疗急性脊髓损伤的药中的应用 - Google Patents

Abstract

金腰带在制备治疗急性脊髓损伤的药中的应用，特别涉及一种金腰带在制药领域中的新用途。金腰带治疗急性脊髓损伤损伤确切有效，毒副作用小，安全性较高，金腰带在治疗脊髓损伤时，能够上调BDNF表达，同时下调NMDA受体表达，有效改善SCI大鼠运动功能。

Description

金腰带在制备治疗急性脊髓损伤的药中的应用

技术领域

本发明涉及金腰带的用途，特别涉及一种金腰带在制药领域中的用途。 

背景技术

金腰带为瑞香科植物芫花的根皮加工制成品，即芫花根制成品，民间俗称为“贼药”。 

芫花根，英文名称：Root of Lilac Daphne，别名：黄大戟、金腰带、蜀桑、铁牛皮、浮胀草；拉丁植物动物矿物名：Daphne genkwa Sieb.et Zucc。芫花根味辛；苦；性温；有毒；归肺；脾；肝；肾经；功能逐水；解毒；散结。主水肿；瘰疬；乳痈；痔瘘；疥疮；风湿痹痛；用法用量：内服：煎汤，1.5-4.5g；捣汁或入丸、散。外用：适量，捣敷；或研末调敷；或熬膏涂。《吴普本草》：久服令人泄；《本草经集注》：决明为之使。反甘草。 

芫花根全年均可采，挖根或剥取根皮，洗净，鲜用或切片晒干。芫花为直立落叶灌木，高达1m。根长者可达10cm，主根直径0.6-1.5cm，有分歧，外表黄棕色至黄褐色；根皮富韧性。茎直径至1cm，暗棕色；枝细长，褐紫色，幼时密生绢状短柔毛。叶对生，间或互生；有短柄，长约1mm，被短柔毛；叶片椭圆形至长椭圆形，长2.5-5cm，宽0.8-2cm，稍带革质，先端尖，全缘，幼时叶之两面流生绢状短柔毛，以脉上为密，老则渐脱。花淡紫色，腋生，先叶开放，通常3-7朵生叶腋间短梗上，以枝端为多；花两性，无花瓣；花被管细长，长约1cm，密被绢状短柔毛，先端4裂，裂片卵形，长不及1cm；雄蕊8，2轮，着生于花被管上，不具花丝；雌蕊1，子房上位，1室，花柱极短或缺如，柱头头状。核果革质，白色。种子1颗，黑色。花期3-4月，果期5月。生于路旁、山坡或栽培于庭园。分布于华东及河北、陕西、河南、湖北、湖南、四川、贵州等地。 

脊髓损伤，英文名称：spinal cord injury，以下简称SCI，脊髓顿挫损伤在临床较为常见。挫损可致脊髓导致局部神经元受损，胶质细胞激活。特别是因外力和炎症导致的脊髓继发损伤可进一步加重对神经元和轴索的损害，进而导致感觉运动和传导功能障碍。 

脑源性神经营养因子，英文名：brain derived neurophic factor，以下简称：BDNF，是在脑内合成的一种蛋白质，它广泛分布于中枢神经系统内，在中枢神经系统发育过程中，对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用，并能防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化等生物效应，而且也是成熟的中枢及周围神经系统的神经元维持生存及正常生理功能所必需。 

BDNF于1982年被纯化，是神经生长因子(英文名：Nerve Growth Factor，以下简称：NGF)家族的第二成员。大量的研究已显示其生理作用不仅涉及神经神经元存活、增殖、分化和诱导神经突起生长，而且对损伤后的神经再生亦有促进作用。BDNF不仅支持神经脊源性感觉和基板源性运动神经元的存活。而且对培养中的本体感觉神经元亦有作用。此外，在鹌鹑胚胎DRG和结状节神经元的自然死亡期应用BDNF可阻止其细胞死亡(in vivo)。脑内BDNFmRNA的高峰分别是生后2周。BDNF作用的发挥是通过与高亲和力受体trkB结合而后激活第二信使传导途径来实现的。trkBmRNA在神经元和非神经元广泛表达，包括脊髓和大多数感觉和交感节，遍及神经系统的大多数区域。BDNF和trkB突变小鼠大多在生后几天内死亡。表现为前庭节丧失，感觉神经元中度丧失，但交感节不受影响。近年将胚胎组织脊髓移植入成体脊髓后发现移植物周围BDNF的表达均明显增加。因而一些学者认为，损伤刺激或胚胎移植可能诱发了宿主脊髓在胚胎发生过程中曾经拥有的BDNF的表达模式，以增强这些因子的表达方式来为损伤神经元提供营养支持，以有利于损伤后的突触重建和功能恢复。因此，BDNF在神经元发育和神经损伤修复中具有重要作用，是一个十分重要的分子。文献报道，BDNF对运动神经元的发育有重要作用。缺乏BDNF可导致胚胎发育中的脊髓运动神经元发生细胞凋亡。 

在相关研究中，有学者认为，随着反应进程，神经元对神经营养因子(NTF)的依赖作用减弱。如在胚胎发育期，NTF表达水平较高，而随发育进程，NTF表达逐渐减少，成年动物神经组织内往往NTF的含量较低。至今对NTF在成年神经组织中的作用缺乏系统认识。有学者甚至认为NTF在成年组织中的作用不大。然而，有趣的是，神经损伤后，成年组织内的一些NTF往往明显增加，提示NTF可能重演其在胚胎时的角色，发挥保护神经元，促进神经再生的功能。因此，成年脊髓内的BDNF作为一种备用分子，尽管其含量较低，但对神经元的正常功能维持和对神经元损伤后的营救功能是不能忽视的。 

在半横断或者全横断损伤脊髓，BDNF表达被明显上调。提示BDNF增加与自主运动功能部分恢复有关。提示BDNF在SCI修复中的重要作用。 

目前的文献支持BDNF在损伤脊髓中的作用是有益的。BDNF在脊髓损伤后可能参与损伤运动神经元存活的维持和调节突触信息传递，影响其它神经营养因子合成等。BDNF的生物学作用可总结为：①对中脑内多巴胺能(DA)神经元的存活和分化的促进作用。 ②对运动神经元的营养作用(容易被运动神经逆行运输，可维持体外培养的大鼠脊髓和脑的运动神经元存活)。③支持感觉神经元存活(节结状神经细胞)，和成年鼠损伤后溃变轴突出芽。④调节神经元的连接(BDNF或NT-3能迅速增加培养的海马神经元内的细胞内Ca²⁺，因而能增加神经递质的释放。⑤支持基底前脑胆碱能神经元的存活和生长。关于脊髓内BDNF的来源可能有两种途径：一，从外周逆行转运而来，已报导BDNF可在初级感觉神经元的轴突转运至脊髓。其转运过程是在转运蛋白Hungtinting的帮助下完成的。另一可能是在神经元自身合成，尽管在正常情况下脊髓BDNF的表达水平较低，但损伤后，BDNF基因表达可能明显上调。这可能是损伤神经元启动了自救机制，增加各种因子表达一对损伤刺激，进而有利于神经元抗损伤反应。 

N-甲基-D-天门冬氨酸，英文名：N-methyl-D-aspartic acid，以下简称：NMDA； 

N-甲基-D-天门冬氨酸受体，英文名：N-methyl-D-aspartic acid receptor，以下简称：NMDA受体，是离子型谷氨酸受体的一个亚型，作为一种兴奋性氨基酸，其在神经损伤修复中能诱导神经元凋亡。各种因素引起神经系统损伤时，神经末稍释放大量谷氨酸等兴奋性氨基酸，激活N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体，从而产生严重的神经毒性，引起神经元的损伤或死亡[1]。Monnerie H，Shashidhara S，Le Roux PD.Effect of excess extracellular glutamate on dendrite growth from cerebral cortical neurons at 3 days in vitro：Involvement of NMDA receptors[J].J Neurosci Res，2003，74(5)：688-700.(《神经元研究月刊》2003年第74(5)期第688-700页，“在三天时间内超量细胞外谷氨酸对体外大脑皮层神经元树突生长的效果”，作者：马尼瑞H，沙斯哈瑞S，列罗克斯PD)有文献报道，谷氨酸通过上调Bax及下调Bcl-2蛋白的表达水平从而诱导小鼠海马神经元HT22细胞系发生凋亡。在原代培养的皮层细胞中，谷氨酸经由线粒体信号转导的caspase活化通路上调caspase-3的表达水平诱导细胞凋亡。因此，研究NMDA受体通路寻找抑制神经元凋亡的途径可成为治疗某些神经系统疾病的关键。 

内源性兴奋性氨基酸的释放对损伤的中枢神经系统有毒性作用，分布在脊髓的NMDA受体在中枢神经系统毒性损害中可能起主要作用，其机制主要通过细胞的离子改变造成神经损伤，早期是Na离子和C1离子在细胞内积聚导致细胞毒性水肿和细胞外Ca向细胞内流，导致迟发性神经细胞死亡。最近的研究表明将NMDA直接应用于脊髓损伤部位激活NMDA受体可以加重大鼠的瘫痪，而NMDA拮抗剂的应用可以明显促进神经功能的恢复。文献报道，脊髓内的大部分神经递质是谷氨酸能的，包括脑下行纤维，初级传入纤维，和脊髓神经元之间都用谷氨酸作为兴奋性神经递质。NMDA受体主要存在于脊髓背角。特 别是脊髓背角浅层(1、II板层)伤害性信息传递通路中的数量最为丰富。不同NMDA受体亚型在脊髓的分布也不同。脊髓后角I，II板层的突触后膜主要表达NR1亚型。NR2各亚型在脊髓上的分布具有明显的区域特征，NR2B表达的密度最高，主要分布在脊髓后角；NR2A和NR2D中等强度的分布于髓全层，NR2C在脊髓上表达较少。正因为NMDA在这种伤害性传导通路中的特异性分布，目前认为这是其参与伤害性信息传递的物质基础。根据分布，NMDA受体可分为以下几类：(1)突触后NMDA受体：分布于脊髓背角神经元上的NMDA受体可看做第一级感觉突触的突触后受体。突触后NMDA受体与PsD～95/SAP90的相互作用和脊髓伤害感受信息的传递有关：“一，NMDA受体通过NR2亚基的胞浆c一末端和PSD一9SAP90的PDZ区域相互作用锚定于突触后。PsD一95/SAt 90能集合NMDA受体周围的特殊系列信号蛋白(nNOS、SynGAP和SPAR)，这些信号蛋白可能位于NMDA受体信号转导的下游”；“二，使脊髓背角神经细胞内发生蛋白质翻译后加工修饰和核内基因转录水平的变化，形成痛觉过敏和异常痛觉。”(2)突触前NMDA受体：分布于传入神经末梢及背根神经节神经元上的NMDA受体可被看做是突触前受体。原位杂交和免疫组化实验提示NMDA受体也存在背根神经节上。应用全细胞膜片钳技术在成年大鼠新鲜分离的DRG细胞证实了NMDA受体的存在。再以免疫细胞化学方法显示其胞浆中的Glu样免疫反应性，从而确证了大鼠神经元NMDA自身受体的存在。NMDA受体作为DRG的自身受体，在外周末梢促进伤害信息的传递，在中枢端增加神经递质从传入末梢的释放而易化突触传递.起到突触前调制的作用。大鼠DRG神经元有NR2B、NR2C亚基，而NR2B亚基主要存在于小直径的初级传入纤维。(3)突触外NMDA受体：分布于第一级感觉突触之外的细胞膜上，称之为突触外NMDA受体。分布于突触外的NMDA受体主要是NR2B和NR2D亚型。在成年鼠脊髓第U板层用膜片钳记录技术发现”，NR2B亚基主要存在于突触外而不参与突触传递，而在疼痛状态下，突触外谷氨酸的增加能激活突触外的NMDA受体，由此表明突触外NR2B亚基在痛觉传递中的可能作用。 

NMDA受体可提高脊髓背角神经元的兴奋性，参与脊髓水平伤害性信息传递，在伤害性感受及痛觉过敏形成中起着重要的作用。NMDA受体在中枢敏感化中的重要作用体现在两个方面：一是NMDA受体的激活常发生于反复刺激C纤维所致的wind-up现象；二是鞘内应用竞争性或非竞争性NMDA受体拮抗剂可抑制中枢敏感化。累积的生物学、电生理学及行为学资料指出NMDA受体可介导持续数小时到数天的长时程突触可塑性变化一，证明NMDA受体在中枢敏化及慢性痛的形成中扮演重要角色。当持续性伤害性刺激通过外周神经纤维传递至脊髓后角时，可引起兴奋性氨基酸(主要为谷氨酸和天冬氩酸)释放，激活NMDA受体，引起ca²⁺内流，进而激活PKC。同时促进NO产生增多，再通过PKC使包括NMDA受体在内的多种受体蛋白和离子通道磷酸化，同时通过NO的复杂作用改变神 经元的兴奋性，并以这种正反馈放大效应将伤害性信息进一步向中枢传递，引起痛觉过敏。 

发明内容

本发明的目的在于提供金腰带的新用途，即在制药领域中的新应用。 

本发明涉及金腰带在制备治疗急性脊髓损伤的药中的应用。 

为了更好地理解本发明的实质，下面将用金腰带的动物试验和临床试验结果来说明其在制药领域中的新用途。 

制备金腰带： 

(1)将芫花根用清水浸泡冲洗7天，剥取根皮，去除木质心及杂质，洗净后晒干，破碎成直径约1平方厘米的小块状； 

(2)取1000克上述芫花根，加入浓度为60％的乙醇5000毫升，用回流提取法提取1小时，制得乙醇提取液； 

(3)取以下重量份配比的原料：溶水性糊精1重量份，淀粉1重量份；将上述原料均匀混合，制得吸收剂； 

(4)取以上333.3克吸收剂加入到乙醇提取液中，使成清膏状物料，将清膏状物料放在干燥箱中低温干燥，收集干燥物研成细粉，即制成金腰带。 

以下公开用上述制备的金腰带所进行的动物试验和临床试验结果： 

金腰带的小鼠经口给药急性毒性试验 

(本实验由国家中医药管理局中医药三级实验室云南中医学院中药药理实验室承办) 

1、实验材料 

1.1动物：昆明种小鼠，清洁级，雌雄各半，体重18-22g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，合格证号：SCXK(川)2008-24，批号：Dossy2011-01. 

1.2药物：“金腰带”散剂，每克含3克原生药，由玉溪市中医院提供，临床成人日剂量为1.5g散剂/日(按60kg/人，即0.075g生药/Kg体重)。 

1.3药物配制：“金腰带”散剂临用前以蒸馏水稀释成所需浓度，给药前旋涡混匀。 

2、方法与结果 

经预试验，“金腰带”药液最大浓度、最大体积灌胃给予小鼠，动物给药后自发活动减少、呼吸急促、口唇紫绀、而后俯卧不动，7小时后开始出现死亡。动物死亡率为90％，因此求其半数致死量(LD50)。调整给药浓度进行预试，得出90％小鼠死亡率的致死量为60g生药/Kg体重，最小致死量为10.68g生药/Kg体重，所以在这两个剂量之间，按1∶0.75的比例设置6个剂量组。 

取清洁级昆明种小鼠70只，雌雄各半，按体重、性别随机分7组，每组10只。试验前禁食不禁水12小时，6个给药组小鼠分别按60g生药/Kg、45g生药/Kg、33.75g生药/Kg、25.31g生药/Kg、18.98g生药/Kg、14.24g生药/Kg体重一次灌胃给予“金腰带”药液，给药体积均为0.4ml/10g体重，空白对照组给予等体积的蒸馏水。密切观察12小时，以后上、下午各观察一次，连续观察14天。每天观察各组小鼠的外观、行为和毒性反应，并记录各组小鼠的死亡数【1、2、3】。用Bliss法计算小鼠的半数致死量，结果见表1。 

表1“金腰带”药液LD50测试小鼠用药、死亡及有关计算 

半数致死量(LD₅₀)：34.22g生药/Kg 

半数致死量LD₅₀的95％可信限：27.58～44.60g 生药/Kg 

小鼠灌胃给予“金腰带”药液后7小时出现死亡，死亡动物临死前自发活动减少、呼吸急促、口唇紫绀、而后俯卧不动，继而死亡。死亡小鼠解剖，肉眼观察主要脏器未见明显异常改变。空白对照组小鼠无死亡。 

3、结论 

“金腰带”药液(1.5g生药/ml)进行了小鼠急性毒性试验，结果显示：“金腰带”药液小鼠24小时内一次性灌胃给药，LD₅₀为34.22g生药/Kg体重，95％的可信限为27.58～44.60生药/Kg体重。小鼠灌胃给予“金腰带”药液后，中毒表现主要为自发活动减少、扎堆、呼吸急促、口唇紫绀、而后俯卧不动，继而死亡。动物出现死亡的时间在给药后7小时至12小时之间。试验结束后解剖小鼠，肉眼观察，主要脏器未见明显异常改变。 

本研究结果表明：“金腰带”散剂经口给药，对小鼠有一定的急性毒性。但半数致死量(LD₅₀)34.22g生药/Kg及最小致死量10.68g生药/Kg体重与临床成人日有剂量0.075g生药/Kg体重相差150倍以上，安全性较高。 

金腰带对脊髓损伤大鼠行为学和BDNF和NMDA受体表达的影响 

(本实验由云南省高校神经科学重点实验室昆明医学院神经科学研究所承办) 

一、材料与方法 

1、材料 

脑源性神经营养因子(BDNF)多克隆抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司)、二抗Streptavidin-HRP复合物美国sigrna公司、)恒冷冰冻切片机、5mmol/L Tris-HCL、[3H]MK-801、二氨基联苯胺，光学显微镜，闪烁液、闪烁杯等及金腰带(图3为干生药) 

2、实验动物及分组： 

采用清洁级成年雄性大鼠80只，随机分为5组，每组16只(其中8只用于行为学评价，另8只用于NMDA检测)。①假手术组，②脊髓挫伤组，③甲基强的松龙组，④金腰带治疗组，⑤联合组。 

3、脊髓顿挫伤模型模制备 

用1％戊巴比妥钠(30mg/kg)经腹腔注射麻醉大鼠，固定于自制的手术台上，无菌条件下进行背中段正中切口，分离椎旁肌，咬除T8-T10棘突椎板，暴露脊髓硬膜，使用Allen’s脊髓打击器，采用10g重锤自距硬膜25mm的高度垂直落下，造成大鼠脊髓中度损伤。各组大鼠分笼饲养，喂全价饲料，自由饮水，室温(24±5℃)，每日行人工膀胱排尿3次。术后5天，各组均肌注青霉素16万iu/kg.d 

4、金腰带治疗 

金腰带治疗组每日1次胃内灌服金腰带50mg/kg.d；甲基强的松龙组术后8小时内肌注甲基强的松龙50mg/kg，此后每天甲基强的松龙肌注量减少10mg/kg；联合组将上述前金腰带和甲基强的松龙两种方法相加进行，即在灌服金腰带的同时还肌注甲基强的松龙。 

5、神经行为学BBB评分 

按文献报道采用神经行为学BBB评分，即开放性神经功能评分对大鼠后肢运动行为进行评价。联合考察大鼠后肢的运动、躯干位置及稳定性、步态、协调性、爪的置放、足趾间隙及尾的位置。大鼠被允许在4分钟内在足够宽阔的空间自由走动，其后肢的运动可以近距离地进行观察。为避免评分的级别的主观偏见，我们有三个评分组(其没有手术操作及步骤的相关知识)进行BBB评分，且手术组和正常组大鼠的存活时间均符合对双侧后肢功能的要求。三个评分组获得的BBB评分除与3获得平均值。所有行为学评估实验均在术后相应天数的早上8-9点进行。 

6、样本获取 

术后2周组大鼠用3.6％的水合氯醛麻醉(1ml/100g)，取脊髓液氮中保存，用于随后NMDA检测；4周组大鼠完成行为学评价后，用3.6％的水合氯醛麻醉(1ml/100g)，4％多聚甲醛心内灌注固定后，取脊髓置于含20％蔗糖的0.1mol/L磷酸缓冲液(PB)中。标本沉底后，将其取出置于冰冻切片机(Leica CM1900，Germany)上行冠状切片，片厚20μm。用于免疫组化染色，计数BDNF阳性细胞数。 

7、NMDA受体检测 

大鼠突触后膜液的制备：将脊髓组织加入冷的0.32mol/L蔗糖溶液匀浆，然后10000×g离心10min，取上清液20000×g离心20min，将沉淀加入5mmol/LTris-HCL(PH7.5，4℃)后480000×g离心20min。弃去上清，所得沉淀即为突触后膜。蛋白浓度测定应用Lowry方法。分别取各实验组250uL膜蛋白，与终浓度为5、10、15、20、25、30、35、40nm的[3H]MK-801混合，并加入5mmol/LTris-HCL(PH7.5，4℃)使其总体积为500ul，此为总结合管，非特异性结合管加入10nmol/L的MK-801，特异结合＝总结合-非特异结合。抽滤、加样后震荡10min，23℃水浴120min，加入预冷的Tris-HCL液2ml终止反应后，立即用玻璃纤维滤膜负压抽滤，将膜片在60℃烤箱中烤干，再移入闪烁杯，加闪烁液5ml，放置过夜，测其放射性。采用液体闪烁计数器进行测量，Scatchard分析求得受体最大结合容量和平均解离常数值。 

8、BDNF检测 

术后4周，将剩余动物麻醉、开胸，经心灌注等渗盐水，再灌注多聚甲醛，取伤段脊 髓8mm。在多聚甲醛固定后，移入蔗糖，4℃下过夜，冰冻切片，隔5取1，贴片。丙酮固定、甲醇加H202浸泡、水洗。按下列程序进行免疫组化染色：切片在0.1mol/L PBS中漂洗3次(每次5min)，而后切片自由漂片与3％过氧化氢一起孵育30min，并浸入5％含0.3％Triton X-100的正常羊血清中37℃反应30min。而后转入各自的含2％正常羊血清和0.3％Triton X-100的I抗(兔多克隆NT-3抗血清，稀释倍数为1∶1000和小鼠多克隆BDNF抗血清，稀释倍数为1∶1000)于4℃孵育48h。而后用0.1mol/L PBS再次漂洗5min×3次，切片与Reagent Kit的试剂I和II(Chemicon，Anti-Rabbit/Mouse Poly-HRP IHCDetection Kit，USA)于37℃下每种抗体反应30min。而后用0.1mol/L PBS漂洗5min×3次。免疫反应的产物直视下放入含0.05％3，30-二氨基联苯胺，0.1％硫酸镍和0.01％的过氧化氢的染色液中反应10min。棕色反应显色。水洗、脱水、透明、封片。经以上处理的脊髓切片标本用光学显微镜(Leica DMI 6000 B inverted microscope，Germany)观察，用配套的显微照相系统(Leica，Germany)摄片。 

阳性染色结果判定：光镜下观察染色结果，并按照McCarthy等的方法对免疫组化染色结果进行判定：按细胞着色的程度分为0、1、2、3四级，分别对应无着色、轻度着色、明显着色和深度着色。其中达到1级为阳性(若用灰度表示，一般染色深度至少比对照大5倍)。 

细胞计数：每例动物取5张切片，每张切片取5个视野，计数BDNF阳性细胞数。 

9、统计学分析 

各组动物经造模和相应处理后，行单盲实验检测。采用“检验和单因素分差分析进行统计学处理。 

二、结果 

1、BDNF在脊髓的分布和细胞定位 

BDNF样免疫反应阳性产物主要分布于大鼠脊髓灰质腹角(如图1A所示)和背角(如图1B所示)神经元。阳性产物主要分布于胞核和胞浆，神经元突起着色较浅。 

2、SCI后BDNF在损伤脊髓腹角和背角的变化 

SCI后28d，腹角BDNF样阳性神经元数量较假手术组(6.2±1.3)增高，差异有统计学意义(P＜0.01)。在背角，BDNF阳性神经元数量亦较假手术组显著增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与SCI组比较，甲基强的松龙组的BDNF阳性神经元数量进一步增加 差异有统计学意义(P＜0.05)，而金腰带组又较甲基强的松龙组增加差异有统计学意义(P＜0.05)，且联合组用最佳差异有统计学意义(P＜0.05)。说明甲基强的松龙和金腰带治疗均能增加BDNF表达，而金腰带的作用效果明显较甲基强的松龙强。两者联合显示了对BDNF表达的最佳调节作用。(如表2，以及图2、图3所示)。 

表2挤压伤后28天脊髓BDNF阳性神经元数量变化(x±s) 

注：*，与假手术组比较(P＜0.05)；#，与挤压伤组比较(P＜0.05)；Δ，与挤甲基强的松龙组比较(P＜0.05)；θ，与金腰带组比较(P＜0.05)； 

本实验结果发现，与SCI组比较，甲基强的松龙组的BDNF阳性神经元数量进一步增加差异有统计学意义(P＜0.05)，说明甲基强的松龙能增加损伤脊髓BDNF表达，其功能意义有利于损伤神经元功能或者存活维持。本实验中，金腰带组的BDNF阳性神经元数量与SCI组比较，也明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明，金腰带治疗有效增加损伤脊髓BDNF表达，从而为金腰带用于SCI治疗提供了重要的实验支持。有趣的是比较金腰带和甲基强的松龙对BDNF表达的影响发现：金腰带组的BDNF的神经元数量明显多于甲基强的松龙组，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明金腰带的效果好于甲基强的松龙组。这说金腰带是目前可用于SCI治疗的有效药物。由于甲基强的松龙和金腰带均对SCI有正向作用，故而两者联合治疗脊髓损伤应该是可行高效的策略。本实验中，甲基强的松龙和金腰带的联合应用显示出对BDNF表达的的最强促进作用，说明两者联合是目前较有效的治疗方案。(P＜0.05)。 

3、NMDA的变化 

正常脊髓组织[H]MK一801放射配基与NMDA受体结合具有特异性和饱和性，NMDA受体的亲和力Kd值为3.9±0.4mmol/L，最大结合容量Bmax为498.5±71.38fmol/mg。SCI后14d，脊髓内NMD受体水平与假手术组比较明显增高，差异有统计学意义(P＜0.01)。甲基强的松龙组的NMDA受体水平SCI组比较明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。金腰带组的NMDA受体水平不仅较SCI组明显减少，而且较甲基强的松龙组减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。甲基强的松龙和金腰带联合组的NMDA受体水平又较单纯金腰带组，和单纯甲基强的松龙治疗组的NMDA受体水平低，差异有统计学意义(P＜0.05)。说明甲基强的松龙和金腰带治疗均能下调NMDA表达，且金腰带的作用效果明显较甲基强 的松龙强。两者联合显示了对NMDA受体表达的下调的最佳作用。 

上述情况如表3所示： 

表3手术后14d各组NMDA受体数量和亲和力的变化(x±s) 

注：*，与假手术组比较(P＜0.05)；#，与挤压伤组比较(P＜0.05)；Δ，与挤甲基强的松龙组比较(P＜0.05)；θ，与金腰带组比较(P＜0.05)； 

4、动物行为学变化 

假手术组大鼠BBB评分显示，术后1天大鼠的运动功能有所减弱，但术后3天即恢复正常至21分。然而，与假手术组比较，脊髓损伤大鼠的BBB评分从术后1明显减少。动物后肢运动功能几乎完全消失。但随后特别是7天后逐渐有一定恢复。比较之，给予甲基强的松龙和金腰带治疗的大鼠显示了较好的运动功能改进，而两者联合应用效果最佳，各组间比较均有统计学意义。(p＜0.05) 

上述情况如表4所示： 

表4脊髓挤压伤大鼠后肢运动功能BBB评分变化(x±s) 

注：Sham(假手术组)；SCI组(挤压伤组)；MP组(甲基强的松龙组)；DSFR(金腰带，英文名Root of Lilac Daphne；其中，a，b，c，d，e，其含义为：与假手术组相比 较(P＜0.05)；f，其含义为：与SCI组相比较(P＜0.05)；g，其含义为：与MP组相比较(P＜0.05)；h，其含义为：与MP组和DSFR组相比较(P＜0.05)； 

金腰带临床使用及结果 

目的：评估本发明药物(金腰带)对急性脊髓损伤的临床疗效 

方法：对口服本发明药物(金腰带)与安慰剂对比，病人治疗前后临床疗效观察。 

1、临床资料 

1.1纳入标准：按Frankel分级在四级以上者纳入研究范围。 

1.2排除标准：1.2.1脊髓损伤合并骨折脱位，未经整复固定解除压迫者。1.2.2脊髓损伤合并感染、心脑疾患、糖尿病、恶性肿瘤等。1.2.360岁以上老人和14岁以下儿童。1.3.4脊髓损伤半年以上者。 

1.3对象：符合前两项标准者随机分为治疗组11例和对照组10例。 

1.4疾病构成：治疗组：男性7例，女性3例；年龄最小20岁，最大48岁；颈髓损伤2例，胸腰段脊髓损伤7例，圆锥和马尾损伤1例；对照组：男性6例，女性4例；年龄最小21岁，最大49岁；颈髓损伤3例，胸腰段脊髓损伤6例，圆锥和马尾损伤1例。 

1.5治疗方法：治疗组：成人1次1.5克本发明药物(金腰带成品胶囊分装0.25g/粒)，隔日1次，500ml凉开水送服；疗程2周；对照组：成人弥可保0.5mg/次，三次/日。 

疗程2周。两组均同时合用抗炎、抗水肿、营养支持等基础治疗。 

1.6观察指标：治疗前后截瘫指数差值、起效时间及毒副作用。 

2、临床结果：治疗组10例治疗前后截瘫指数差总和32，起效时间总和46h；对照组10例治疗前后截瘫指数差总和18，起效时间总和292h。与对照组对比，病人治疗前后截瘫指数差、起效时间均有明显差异。治疗组3例出现腹泻，2例停药及缓解，1例经补液恢复；6例出现便秘超过1周，1例出现恶心、食欲不振。 

3.结论：口服本发明药物(金腰带)与对照组对比，病人治疗前后截瘫指数差、起效时间均有明显差异；说明金腰带治疗能有效改善大小便困难、及感觉、运动功能，治疗急性脊髓损伤损伤确切有效，毒副作用小，安全性较高。 

综上所述，本发明对已知药物金腰带发掘了新的医疗用途，经动物实验证实：金腰带治疗急性脊髓损伤损伤确切有效，毒副作用小，安全性较高，金腰带在治疗脊髓损伤，即SCI时，能够上调BDNF表达，同时下调NMDA受体表达，有效改善SCI大鼠运动功能，SCI后各组[H]MK-801放射性配基分析最大结合容量都有不同程度的减少。其减少程度顺序由大到小分别是：假手术组，挤压伤组，甲基强的松龙组，金腰带组，联合组。说明应用甲基强的松龙(MP)和金腰带治疗可以通过影响脊髓NMDA受体减轻脊髓继发性损伤，金腰带疗效优于甲基强的松龙且与甲基强的松龙有协同作用。 

经临床实践证明，本发明明显改善便秘及感觉、运动评分，与安慰剂对比，病人治疗前后截瘫指数差、起效时间均有明显差异。不仅使用简便、疗效确切，而且毒副作用小，安全性较高。患者容易接受，治疗依从性好。该药一次药量成人仅需1～2克，且只需隔日一次。该药药源广泛，制作简便，易于批量生产，具有很好的开发应用前景。 

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明： 

图1为本发明药物金腰带对脊髓损伤大鼠行为学和BDNF和NMDA受体表达的实验中，大鼠脊髓BDNF免疫组化染色200倍放大图(图中A为脊髓腹角，B为脊髓背角)； 

图2为本发明药物金腰带对脊髓损伤大鼠行为学和BDNF和NMDA受体表达的实验中，大鼠脊髓腹角BDNF免疫组化染色200倍放大图(图中A为假手术组，B为挤压伤组，C为甲基强的松龙组，D为金腰带组，E为联合组)； 

图3为本发明药物金腰带对脊髓损伤大鼠行为学和BDNF和NMDA受体表达的实验中，大鼠脊髓背角BDNF免疫组化染色200倍放大图(图中A为假手术组，B为挤压伤组，C为甲基强的松龙组，D为金腰带组，E为联合组)。 

具体实施方式

实施例1： 

(1)将芫花根用清水浸泡冲洗7天，剥取根皮，去除木质心及杂质，洗净后晒干，破碎成直径约1平方厘米的小块状； 

(2)取1800克上述芫花根放入容器中，在容器中加入浓度为60％的乙醇8000毫升，用回流提取法提取1小时，制得乙醇提取液，所述的回流提取法如下：将芫花根在 乙醇中的浸出液加热蒸馏，其中挥发性溶剂馏出后又被冷却，弃药渣后重复流回浸出容器中浸提芫花根原料，这样周而复始，直至有效成分回流提取完全； 

(3)取以下重量份的原料：溶水性糊精400克，淀粉400克；将上述原料均匀混合，制得800克吸收剂； 

(4)取以上400克吸收剂加入到步骤(2)制得的乙醇提取液中，使成清膏状物料，将清膏状物料放在干燥箱中低温干燥，收集干燥物研成520克细粉，再添加80克吸收剂至总重600克，即制成金腰带。 

实施例2： 

(1)将芫花根用清水浸泡冲洗7天，剥取根皮，去除木质心及杂质，洗净后晒干，破碎成直径约1平方厘米的小块状； 

(2)取900克上述芫花根，加入浓度为60％的乙醇4000毫升，用回流提取法提取1小时，去渣留液，制得乙醇提取液； 

(3)取以下重量份的原料：溶水性糊精200克，淀粉200克；将上述原料均匀混合，制得400克吸收剂； 

(4)取以上200克吸收剂加入到步骤(2)制得的乙醇提取液中，使成清膏状物料，将清膏状物料放在干燥箱中低温干燥，收集于燥物研成260克细粉，再添加40克吸收剂至总重300克，即制成金腰带。 

Claims (1)

1.金腰带作为唯一的原料药在制备治疗急性脊髓损伤的药中的应用，其中金腰带为瑞香科植物芫花的根皮加工制成品。

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