CN102265908B - 一种烟草基质复合生物杀虫剂及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种烟草基质复合生物杀虫剂及其制造方法。该复合生物杀虫剂中至少包含至一种烟草植物源杀虫组分和至少一种微生物源杀虫组分，选取烟草废料为原料，经杀虫微生物发酵而制成。操作步骤包括培养基的制备、菌种的扩大培养、生物杀虫剂发酵及提取等；发酵工艺可采用液态发酵法或固态发酵法。本发明烟草基质复合生物杀虫剂不仅含有杀虫微生物及其代谢产物，而且含有烟草杀虫成分(如烟碱等)，具有双重杀虫效果；本发明方法可充分利用目前尚未得到合理利用的烟草废料资源，节约粮食资源，产生良好的经济效益、生态效益和社会效益。

Description

一种烟草基质复合生物杀虫剂及其制造方法

技术领域

本发明涉及生物杀虫剂生产技术领域，尤其是利用生物质废料生产生物杀虫剂的方法。更详细地说涉及一种烟草基质复合生物杀虫剂及其制造方法。

背景技术

生物杀虫剂具有生产原料来源广泛，对非靶标生物安全、毒副作用小、对环境兼容性好等特点，已成为全球农药产业发展的新趋势。因此，发展生物杀虫剂产业对保证农业可持续发展、保障人们的生命与健康、保护生态环境都十分重要。

目前生物杀虫剂主要利用农副产品原料发酵法生产，主要原料为黄豆饼粉、花生饼粉、鱼粉、谷糠、麸皮、以及蛋白胨和酵母膏等，原料成本占生产成本30％以上。随着农副产品原料价格上升，原料成本将进一步制约其对化学农药的竞争力及其产业的扩大。如何降低生产成本已是目前市场的核心问题。另外，这些原料均可制成很好的饲料，利用这些原料发酵法生产杀虫剂，会消耗大量的饲料资源。因此，选择低成本的原料是生物杀虫剂商业化生产和广泛应用的关键。

专利申请(申请号200510094429.2)公开了一种利用城市生活污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法，用含固率为1.5～5％的污水污泥作为发酵苏云金杆菌(B.t)的原料。

专利申请(申请号200610000899.2)公开了一种淀粉废水生产苏云金杆菌微生物杀虫剂的方法，可获得杀虫效果良好并且环境友好的微生物杀虫剂，既实现了淀粉废水的资源化利用，又降低了微生物杀虫剂的生产成本。

专利申请(申请号200610011155.0)公开了一种以剩饭菜为原料制备苏云金芽孢杆菌生物农药的方法，优点在于工艺简单、原料易得、生产成本低、变废为宝。

以上专利申请均未涉及烟草废料的利用。

我国是世界上烟叶和卷烟生产的大国，在烟草生产过程中产生的废弃物量非常大。这些废弃物主要包括废烟梗、废烟叶、烟渣和烟秸秆等，为生物杀虫剂和有机肥生产提供了生物资源。

专利申请(申请号98110276.X)公开了一种植物组合物杀虫剂及其制备方法，将苦参、百部、烟梗、牙皂、草乌直接混配制成杀虫剂，利用植物有效成分发挥杀虫效果。

专利申请(申请号99118757.1)公开了一种绿色杀虫剂及其制备方法，它以废烟草，如烟梗、烟茎、烟根、烟末等以天然植物为原料，通过酸浸—加热陈化—过滤—中和—离子交换—煤油萃取—过滤等工艺，制成一种毒性低微、无公害、使用方便、并具有良好杀虫效果的绿色杀虫剂。

专利申请(申请号200510044494.4)公开了一种烟草废料浸提物防治棉铃虫和烟青虫的技术，它由烟草废料、肥皂和水的浸提液组成，烟草废料在4.7～6.9％、水93～95％和肥皂0.1～0.3％浸提液的比例范围防治效果甚佳。

以上专利申请虽涉及烟草废料，但未涉及烟草废料的发酵过程，属单一的植物源杀虫剂类。

由于烟草废料中含有多种天然杀虫成分，如烟草生物碱、烟草精油等，可作为无公害植物源杀虫剂使用。但直接利用烟草废料作杀虫剂，对资源的利用率不高，且杀虫效果有限。烟草废料中富含蛋白质、糖类、木质素、纤维素、有机酸、果胶质等，氮、磷、钾素含量普遍高于粮食作物秸秆，是一宝贵的生物质资源。直接利用烟草废料作杀虫剂，上述资源未得到充分利用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用烟草废料发酵生产生物杀虫剂的方法，本方法生产的生物杀虫剂不同于常规的植物源或微生物源杀虫剂，而是一种植物源和微生物源复合杀虫剂。同时，达到提高烟草废料资源利用率和产品性能的双重目的。

本发明实现上述目的所采取的技术方案是：一种烟草基质复合生物杀虫剂及其制造方法，该复合生物杀虫剂中包含至少一种烟草植物源杀虫组分和至少一种微生物源杀虫组分，选取烟草废料为原料，经杀虫微生物发酵而制成。操作步骤、工艺是：

方案一：液态发酵法：

(1)烟草废料液体培养基的制备：

将烟草废料打碎至适当粒度(以0.2～5cm为宜，如果原料粒度合适，则不必打碎)，加入3～100倍重量的水和适量助剂，混合均匀，于10～100℃浸提0.5～72小时，使可溶物充分溶出。然后将混合物沥干、压榨或离心进行固液分离，得到烟草废料的浸提液和固相烟草渣。将烟草废料的浸提液添加适量营养源，调整碳氮比至5～35，pH至5～8.5，得烟草废料液体培养基，灭菌后备用。

(2)菌种的扩大培养：

一级斜面菌种的驯化、培养：取步骤(1)所述烟草废料液体培养基，接入杀虫菌株的斜面培养物，25～45℃条件下在摇床上振荡培养10～200小时，然后转接到相同的培养基中培养，照此方法连续转接3～5次，将获得的培养液稀释后涂布到预先制备的烟草浸提液固体培养基(烟草废料液体培养基加1.9％的琼脂)上，25～45℃条件下培养1～15天，待长出菌落后，挑取大菌落在同样的固体平板培养基上划线，挑选单菌落转接到固体斜面培养基，培养得到驯化菌株，保存备用。经驯化后的菌株对烟草废料培养基质产生高效特异适应性，发酵性能大幅提高。

二级摇瓶菌种培养：取步骤(1)所述烟草废料液体培养基，接入一级斜面菌种，于20～45℃下培养6～100小时，得二级摇瓶种子液；根据生产规模，可进一步采用种子罐进行种子的放大培养。

(3)液体发酵生产生物杀虫剂：

取步骤(1)所述烟草废料液体培养基，按0.5～10％的比例(按质量计)接入所述步骤(2)制备的发酵种子液，于pH 5～8.5、温度25～45℃发酵1～12天；发酵完成后放罐，即得到烟草废料复合生物杀虫剂初产品。发酵液经进一步浓缩、提取或干燥，配以助剂，即得到本发明液态、颗粒状或粉状烟草废料复合生物杀虫剂。

方案二：固态发酵法：

(1)烟草废料固体培养基的制备：

将烟草废料打碎至0.2～2cm的粒度，加入0.3～1.5倍重量的水和适量营养源，调整碳氮比至5～35，pH至5～8.5，灭菌后备用。

(2)菌种的扩大培养：

一级斜面菌种的驯化、培养：同方案一。

二级固体菌种培养：取步骤(1)所述烟草废料固体培养基，接入一级斜面菌种，于20～45℃下培养15～300小时，得二级固体菌种；根据生产规模，可进一步采用固体培养进行种子的放大培养。

(3)固态发酵生产生物杀虫剂：

取步骤(1)所述烟草废料固体培养基，按1～50％的比例(按质量计)接入所述步骤(2)制备的固体发酵种子，于pH 5.5～8.5，温度25～45℃，发酵1～12天；得到发酵料，即为烟草废料复合生物杀虫剂初产品。发酵料经进一步提取或干燥粉碎，配以助剂，即得到本分明液态、颗粒状或粉状烟草废料复合生物杀虫剂。

本发明中所用的烟草废料可以是废烟梗、废烟叶、烟末、烟秸秆、烟根、烟杈、烟顶芽等中的一种或多种混合物。本发明优先选用的烟草废料为烟草打叶复烤过程中产生的废烟梗，即打叶复烤线产生的烟梗经在线筛分，分出长梗(用于制梗丝)后所得的短烟梗，具有原料集中，可以省去粉碎工序的优点，有利于规模生产和降低生产成本。

本发明烟草废料液体培养基的制备工艺中，烟草废料液的浸提也可采用多级萃取或逆流萃取的方法，以提高提取效率。在浸提过程中，还可通过适当翻动或搅拌物料，甚至可以采用搅拌打碎的方式使烟草废料适当破碎或解纤至纤维状，以提高提取效率。浸提溶剂通常采用清水，浸提时可加入适量的助剂，以促进烟草废料中可溶性营养物质的溶出。所述的助剂通常包含氨(铵)类、碱金属化合物、表面活性剂、酶制剂中的一种或多种混合物。所述氨(铵)类优选氨水、碳酸铵、磷酸氢二铵、磷酸铵中的一种或多种混合物。所述碱金属化合物优选氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化铝、氧化钙、氧化镁、碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、亚硫酸钠中的一种或多种混合物；所述表面活性剂优选无泡或低泡表面活性剂；所述酶制剂包含蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶中的一种或多种混合物。

本发明利用烟草废料制备的液体培养基和固体培养基，本身含有丰富的矿物质营养和协调的碳氮比(一般为15～25)，通常不需添加营养源即可满足杀虫微生物生长需要。但根据不同杀虫微生物的营养需求特点，适当添加营养源以调整营养配比，有利于提高杀虫微生物和代谢产物产量。例如，可通过添加适量蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、豆饼粉、氨水、碳酸铵、磷酸氢二铵、磷酸铵等，增加氮素营养，也可通过添加适量葡萄糖、淀粉等增加碳源；还可通过添加适量硫酸镁、碳酸钙、硫酸锰等增加矿物质营养。

本发明烟草废料发酵所用的杀虫微生物通常为目前科研、生产中常用的各种常规已知杀虫微生物，也可采用自行分离筛选的杀虫微生物。本发明所用的杀虫微生物包含芽孢杆菌属(Bacillus)、白僵菌属(Beauveria)、绿僵菌属(Metarhizium)、虫霉菌属(Entomophthora)、链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)、小单孢菌属(Micromonospora)、马杜拉放线菌属(Actinomadura)、放线菌属(actinomyces)、沙雷氏菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、异短杆菌属(Xenorhabdus)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、团孢霉属(Massopora)、拟小孢霉属(Sporodiniella)、耳霉属(Conidiobolus)、巴科霉属(Batkoa)、拟虫疫霉属(Eryniopsis)、虫疫霉属(Erynia)、噬虫霉属(Entomophaga)、斯魏氏属(Strongwellsea)、顶裂霉属(Meristacrum)、新接霉属(Neozygites)、斯氏毛菌属(Smittium)、蝇壶菌属(Myiophagus)、腔壶菌属(Coelomycidium)、链壶菌属(Lagenidium)、亚肉座菌属(Hypocrella)、丛赤壳属(Nectria)、多腔菌属(Myriangium)、虫草属(Cordyceps)、虫壳属(Torrubiella)、隔担耳属(Septobasidium)、拟锈菌属(Uredinella)、座壳孢属(Aschersonia)、四臂壳孢属(Tetranacrium)、虫座孢属(Aegerita)、小无孢霉属(Aposporella)、拟索链霉属(Hormiscioideus)、顶孢霉属(Acremonium)、顶齿霉属(Acrodontium)、刺束梗孢属(Akanthomyces)、拟角霉属(Antennopsis)、曲霉属(Aspergillus)、蚊霉属(Culicinomyces)、星藻霉属(Desmidiospora)、侧齿霉属(Engyodontium)、镰孢属(Fusarium)、单梗孢属(Haplographium)、层束梗孢属(Hymenostilbe)、小马蒂霉属(Mattirolella)、蝇梭孢属(Muiaria)、蝇层孢属(Muiogone)、野村菌属(Nomuraea)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、座毛孢属(Peziotrichum)、侧链孢属(Pleurodesmospora)、拟球束梗孢属(Pseudogibellula)、小团孢属(Sorosporella)、簇孢霉属(Sporothrix)、侧孢霉属(Sporotrichum)、束梗孢属(Stilbella)、共胶霉属(Syngliocladium)、拟多头束霉属(Tilachlidiopsis)、穴霉属(Troglobiomyces)、轮枝孢属(Verticillum)、穗霉属(Spicaria)、节丛孢属(Arthrobotrys)、单顶孢霉属(Monacrosporium)中的一种或多种混合菌种。

上述芽孢杆菌属杀虫微生物优选苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、日本金龟子芽孢杆菌(Bacillus popilliae)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、缓病芽孢杆菌(Bacillus lentimorbus)、侧芽孢杆菌(Bacilluslatersporus)、穿刺芽孢杆菌(Bacillus penetrans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、青虫菌(Entobactenin)、松毛虫杆菌(Bacillus thuringiensis var.dendrolimus)中的一种或多种混合菌种；上述链霉菌属杀虫微生物优选阿维链霉菌(Streptomyces avermitlis)、吸水链霉菌(Streptomyces hyroscupicusvar)、茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、南昌链霉菌(Streptomyces nanchangensis)、金色链霉菌(Streptomyces aureus)、唐德链霉菌(Streptomyces tendae)、稀产链霉菌(Streptomycessparsogenes)中的一种或多种混合菌种；所述的白僵菌属杀虫微生物优选球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、小球孢白僵菌(Beauveria globulifera)、卵孢白僵菌(Beauveriatenella)、多形白僵菌(Beauveria amorpha)、布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)、粘孢白僵菌(Beauveria velata)中的一种或多种混合菌种；所述的绿僵菌属杀虫微生物优选金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、平沙绿僵菌(Metarhizium pingshaense)、柱孢绿僵菌(Metarhizium cylindrospora)；贵州绿僵菌(Metarhizium guizhouense)、黄绿绿僵菌(Metarhizium flavoviride)、双型孢绿僵菌(Metarhizium biformisporae)、戴氏绿僵菌(Metarhizium taii)中的一种或多种混合菌种；所述的假单胞菌属杀虫微生物优选荧光极毛杆菌(Pseudomonas fluorescens)；所述的异短杆菌属杀虫微生物优选发光异短杆菌(Xenorhabdus luminescens)；所述的糖多孢菌属杀虫微生物优选刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)；所述的沙雷氏菌属杀虫微生物优选粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)；所述的轮枝孢属杀虫微生物优选蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)。

本发明方法可以单独选用一种杀虫微生物作菌种，也可使用混合菌种。斜面菌种和扩大菌种的培养方法以及培养基配制可按常规方法进行(具体操作方法是专业人员熟知的，不再赘述)，也可采用烟草废料或烟草废料浸提液作营养源经多级驯化、培养而成。

采用本发明方法生产的杀虫剂是一种植物源和微生物源复合杀虫剂，该复合生物杀虫剂中包含至少一种烟草植物源杀虫组分和至少一种微生物源杀虫组分，所述的烟草植物源杀虫组分包含烟草生物碱类、烟碱、烟草萜烯类、烟草酚类、烟草醌类、烟草黄酮类、烟草香豆素类、烟草木聚糖类、烟草甾类、烟草有机酸类、烟草醛类、烟草酮类、烟草醇类、烟草酯类、烟草糖苷类、烟草多糖类、烟草杂环类、烟草胺类、烟草氮杂环类、烟草烃类、烟草挥发碱类、烟草精油成分中的一种或多种混合物。所述的微生物源杀虫组分包含杀虫微生物的活菌体、杀虫微生物的孢子、杀虫微生物的芽孢、杀虫微生物的代谢产物中的一种或多种混合物。所述的杀虫微生物的代谢产物包含杀虫毒素、杀虫酶类、杀虫抗生素类中的一种或多种成分。所述的杀虫毒素包含伴孢晶体、a-外毒素、β-外毒素、γ-外毒素、δ-内毒素、白僵素(Beauvericin)，卵孢白僵菌素(Tenellin)、卵孢子素(Oosporein)、绿僵菌素(Destruxins)中的一种或多种成分。所述的杀虫酶类包含脂肪酶、蛋白酶、几丁质酶中的一种或多种成分。所述的杀虫抗生素类包含阿维菌素(Avermectin)、杀蝶素(Piericidin)、杀螨素、井冈霉素(Jinggangmycin)、日光霉素(nikkomycin)、紫菜霉素(Porfiromycin)、密旋霉素(Pactamycin)、稀疏霉素(Sparsomycin)、四活菌素(Tetranactin)、潮霉素(Hygromycin)、越霉素(Destomycin)、米尔比霉素(Milbemycin)、刺糖菌素(Spinosads)、放线酮(Actidione)、抗霉素(Actimycin)、多抗霉素(Polyoxin)、浏阳霉素、杀蚜素(aphicidin)、南昌霉素(Nanchangmycin)、韶关霉素(Shaoguanmycin)、梅岭霉素(Meilingmycin)、浏阳霉(Liuyangmycin)中的一种或多种成分。

本发明生产的烟草废料复合生物杀虫剂外观呈灰色至褐色液态、颗粒状或粉状，可加工成各种剂型。产品中一般含有0.1～30％(按质量计)的烟草植物源杀虫组分和0.1～30％(按质量计)的微生物源杀虫组分，杀虫微生物数量一般达10⁸～10¹²个/mL(g)。本发明生产的烟草废料复合生物杀虫剂可广泛应用于大田作物、园艺植物、果蔬、森林虫害的生物防治；也可用于烟草仓库害虫的生物防治，可在仓库中喷洒，也可在打叶复烤过程中直接喷加到烟叶中。

本发明生产生物杀虫剂过程中产生的固相烟草渣可优先用于烟草废料有机肥和人工草炭的发酵生产，也可作为基料用于其他发酵生产，从而实现烟草废料的全效利用。

本发明利用烟草废料生产复合生物杀虫剂方法的优点是：

1、本发明生产的生物杀虫剂不同于常规的植物源或微生物源杀虫剂，而是一种植物源和微生物源复合杀虫剂，不仅含有杀虫微生物及其代谢产物，而且含有烟草杀虫成分(如烟碱等)，具有双重杀虫效果，显著优于单一的植物源或微生物源杀虫剂。

2、本发明在利用烟草废料生产植物源和微生物源复合杀虫剂的同时，实现了提高烟草废料资源利用率和提高产品性能的双重目的，一举多得。

3、本发明方法可充分利用目前尚未得到合理利用的烟草废料资源，节约大量粮食资源的消耗，减少烟草废料焚烧造成的环境污染；同时可消除废弃烟草向其它不法渠道的流失，起到阻断非法卷烟生产源头的作用，可产生良好的经济效益、生态效益和社会效益。

4、本发明方法生产的烟草废料复合生物杀虫剂不仅可广泛应用于各种大田作物、园艺植物、果蔬、森林虫害的生物防治，还非常适用于烟草仓库害虫的生物防治，可在仓库中喷洒，也可在打叶复烤过程中直接喷加到烟叶中，避免常规微生物源杀虫剂的生产原料成分(非烟草的粮食作物成分)在使用时引入烟草产品，影响烟草产品吸味。

5、本发明方法可充分利用目前尚未得到合理利用的打叶复烤厂产生的废烟梗资源，不仅可节约大量的仓库投入，解决企业燃眉之急，而且打叶复烤厂产生的烟梗具有原料集中，可以省去收集、运输、粉碎工序的优点，有利于规模生产和降低生产成本。

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是要对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容的技术特征所做的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。

实施例一：

选取打叶复烤厂产生的废烟梗1000kg，置于浸泡池中，加入10000kg水，混合均匀，于室温浸泡2天，其间适当搅拌，使可溶物充分溶出；然后放出浸提液，将物料沥干，送入压榨机进行固液分离，液体与前述浸提液合并，加入0.5％的蛋白胨，0.3％的碳酸钙，调节pH值至7.2，高温灭菌后得到烟梗液体培养基，备用。

苏云金芽孢杆菌(B.t)一级斜面菌种的驯化、培养：取上述液体培养基少量，将苏云金芽孢杆菌(B.t)斜面菌种接入烟梗液体培养基中，28℃条件下振荡培养24小时，然后转接到相同的培养基中培养，照此方法连续转接3～5次，将获得的培养液稀释后涂布到烟梗废料固体培养基(烟梗液体培养基加1.9％的琼脂)上，28℃条件下培养36小时，待长出菌落后，挑取大菌落在同样的固体平板培养基上划线，挑选单菌落转接到固体斜面培养基，培养得到驯化菌株，保存备用。

苏云金芽孢杆菌(B.t)二级菌种的扩大培养：将上述驯化菌株的斜面培养物接入高温灭菌后的烟梗液体培养基中，于pH 7.2、28℃条件下通气培养20小时，得到二级扩大培养菌种的菌悬液，作为发酵菌种，备用。

烟梗液体培养基发酵生产烟草基质苏云金芽孢杆菌(B.t)复合杀虫剂：取上述烟梗烟梗液体培养基，接入5％的苏云金芽孢杆菌(B.t)液体发酵菌种，于温度28℃，转速120转/分钟，通气发酵29小时；发酵完成后放罐(此时活菌数达1.5×10¹⁰个/mL)，即得到烟草废料生物杀虫剂初产品。将发酵液经进一步浓缩、喷雾干燥，配以助剂，即得到粉状烟草基质苏云金芽孢杆菌(B.t)复合杀虫剂，测定其烟碱含量为2.29％。

上述固液分离得到的固相烟梗废渣用于发酵生产烟梗有机肥。

实施例二：

按照实施例一的方法，进行烟梗液体培养基的制备和人苏云金芽孢杆菌(B.t)二级菌种的扩大培养，然后采用固态发酵生产苏云金芽孢杆菌(B.t)杀虫剂：将1000kg烟梗废料打碎至0.2～2cm的粒度，加水800kg，混合均匀，调整pH至7.2，于121℃灭菌20分钟，冷却后接入苏云金芽孢杆菌(B.t)二级菌种(接种量为30％)，于温度28～35℃，通气培养3天得发酵料，发酵料经干燥、粉碎，即得到粉状烟草基质苏云金芽孢杆菌(B.t)复合杀虫剂，测定其含菌量为1.5×10¹⁰个/g，烟草杀虫成分总量为12％。

实施例三：

选取打叶复烤厂产生的废烟梗1000kg，置于浸泡池中，加入10000kg水，水温60℃，混合均匀，浸泡1天，其间适当搅拌，使可溶物充分溶出；然后放出浸提液，将物料沥干，送入压榨机进行固液分离，液体与前述浸提液合并，经高温灭菌后得到烟梗液体培养基，备用。

白僵菌(Beauveria bassiana)一级斜面菌种的驯化、培养：取上述液体培养基少量，接入白僵菌(Beauveria bassiana)斜面菌种，于25℃条件下在摇床上振荡培养3天，然后转接到相同的培养基中培养，照此方法连续转接3～5次，将获得的培养液稀释后涂布到烟梗废料固体培养基(烟梗液体培养基加1.9％的琼脂)上，25℃条件下培养3天，待长出菌落后，挑取大菌落在同样的固体平板培养基上划线，挑选单菌落转接到固体斜面培养基，培养得到驯化菌株，保存备用。

白僵菌(Beauveria bassiana)二级菌种的扩大培养：将上述驯化菌株的斜面培养物接入高温灭菌后的烟梗液体培养基中，于pH 6.0、25℃条件下通气培养3天，得到二级扩大培养菌种的菌悬液，作为发酵菌种，备用。

烟梗液体培养基发酵生产烟草基质白僵菌(Beauveria bassiana)复合杀虫剂：将上述烟梗浸提液于121℃灭菌20分钟，冷却后接入5％的白僵菌(Beauveria bassiana)液体发酵菌种，于温度25℃，转速120转/分钟，通气发酵4天；发酵完成后放罐，即得到白僵菌(Beauveriabassiana)杀虫剂初产品。将发酵液经进一步浓缩、喷雾干燥，配以助剂，即得到粉状烟草基质白僵菌(Beauveria bassiana)复合杀虫剂，测定其含孢子数为6×10⁹个/g，烟草杀虫成分总量20％。

实施例四：

按照实施例三的方法，进行白僵菌(Beauveria bassiana)二级菌种的扩大培养，然后采用固态发酵生产白僵菌(Beauveria bassiana)：将1000kg烟梗废料打碎至0.2～2cm的粒度，加入水800kg，混合均匀，自然pH，于121℃灭菌20分钟，冷却后接入白僵菌(Beauveriabassiana)二级菌种(接种量为30％)，于温度24℃培养2天，再升温至28℃培养6天得发酵料，发酵料经干燥、粉碎，过筛，即得到粉状烟草基质白僵菌(Beauveria bassiana)复合杀虫剂。测定其含孢子数2×10¹⁰个/g，白僵菌菌体组分含量为25％，烟碱含量为0.68％。

实施例五：

选取打叶复烤厂产生的废烟梗1000kg，置于浸泡池中，加入10000kg水，混合均匀，于室温浸泡2天，其间适当搅拌，使可溶物充分溶出；然后放出浸提液，将物料沥干，送入压榨机进行固液分离，液体与前述浸提液合并，加入1％的液化玉米淀粉，0.3％的碳酸钙，调节pH值至7.2，高温灭菌后得到烟梗液体培养基，备用。

阿维链霉菌(Streptomyces avermitlis)一级斜面菌种的驯化、培养：取上述液体培养基少量，将阿维链霉菌(Streptomyces avermitlis)斜面菌种接入上述烟梗液体培养基中，25℃条件下在摇床上振荡培养24小时，然后转接到相同的培养基中培养，照此方法连续转接3～5次，将获得的培养液稀释后涂布到烟梗废料固体培养基(烟梗液体培养基加1.9％的琼脂)，25℃条件下培养7～9天，待长出丰富的灰色孢子后，转接在同样的固体平板培养基上，挑选单菌落转接到固体斜面培养基，培养得到驯化菌株，保存备用。

阿维链霉菌(Streptomyces avermitlis)二级菌种的扩大培养：将上述驯化菌株的斜面培养物接入高温灭菌后的烟梗液体培养基中，于pH7.2、28℃条件下通气培养30小时，得到二级扩大培养菌种的菌悬液，作为发酵菌种，备用。

烟梗液体培养基发酵生产烟草基质阿维菌素(Avermectin)复合杀虫剂：取上述烟梗液体培养基，接入5％的阿维链霉菌(Streptomyces avermitlis)液体发酵菌种，于温度28℃，通气发酵9天；发酵完成后放罐，即得到烟草基质阿维菌素(Avermectin)复合杀虫剂初产品。将发酵液经进一步浓缩、喷雾干燥，配以助剂，即得到粉状烟草基质阿维菌素(Avermectin)复合杀虫剂，测定其阿维菌素(Avermectin)含量为1.8％，烟碱含量为1.95％。

Claims (10)

1.一种烟草基质复合生物杀虫剂，其特征在于：该复合生物杀虫剂中含有至少一种烟草植物源杀虫组分和至少一种微生物源杀虫组分，是由烟草废料经杀虫微生物发酵而制成；所述的杀虫微生物包含芽孢杆菌属(Bacillus)、白僵菌属(Beauveria)、绿僵菌属(Metarhizium)、链霉菌属(Streptomyces)中的一种或多种混合菌种。

2.根据权利要求1所述的一种烟草基质复合生物杀虫剂，其特征在于：所述的芽孢杆菌属杀虫微生物为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)；所述的链霉菌属杀虫微生物为阿维链霉菌(Streptomyces avermitlis)；所述的白僵菌属杀虫微生物为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)；所述的绿僵菌属杀虫微生物为金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)。

3.根据权利要求1所述的一种烟草基质复合生物杀虫剂，其特征在于：该复合生物杀虫剂中烟草植物源杀虫组分的含量按质量计为0.1％～30％，微生物源杀虫组分的含量按质量计为0.1％～30％。

4.根据权利要求1所述的一种烟草基质复合生物杀虫剂，其特征在于：所述的烟草植物源杀虫组分包含烟草生物碱类、烟草萜烯类、烟草酚类、烟草醌类、烟草黄酮类、烟草香豆素类、烟草木聚糖类、烟草甾类、烟草有机酸类、烟草醛类、烟草酮类、烟草醇类、烟草酯类、烟草糖苷类、烟草多糖类、烟草杂环类、烟草胺类、烟草氮杂环类、烟草烃类、烟草挥发碱类、烟草精油成分中的一种或多种混合物；所述的微生物源杀虫组分包含杀虫微生物的活菌体、杀虫微生物的孢子、杀虫微生物的芽孢、杀虫微生物的代谢产物中的一种或多种混合物。

5.根据权利要求4所述的一种烟草基质复合生物杀虫剂，其特征在于：所述的杀虫微生物的代谢产物包含伴孢晶体、a-外毒素、β-外毒素、γ-外毒素、6-内毒素、白僵素(Beauvericin)，卵孢白僵菌素(Tenellin)、卵孢子素(Oosporein)、绿僵菌素(Destruxins)、脂肪酶、蛋白酶、几丁质酶、阿维菌素(Avermectin)中的一种或多种成分。

6.根据权利要求1所述的一种烟草基质复合生物杀虫剂，其特征在于：所述的烟草废料包括废烟梗、废烟叶、烟末、烟秸秆中的一种或多种混合物。

7.根据权利要求1所述的一种烟草基质复合生物杀虫剂，其特征在于：所述的烟草废料为烟草打叶复烤过程中产生的废烟梗。

8.一种权利要求1～7所述烟草基质复合生物杀虫剂的制造方法，其特征在于：按如下步骤、工艺生产：

方案一：液态发酵法

(1)烟草废料液体培养基的制备：

将烟草废料打碎至0.2～5cm粒度，加入3～100倍重量的水和适量助剂，混合均匀，于10～100℃浸提0.5～72小时，使可溶物充分溶出；然后将混合物沥干、压榨或离心进行固液分离，得到烟草废料的浸提液和固相烟草渣；将烟草废料的浸提液添加适量营养源，调整碳氮比至5～35，pH至5～8.5，得烟草废料液体培养基，灭菌后备用；

(2)菌种的扩大培养：

一级斜面菌种的驯化、培养：取步骤(1)所述烟草废料液体培养基，接入杀虫微生物的斜面培养物，25～45℃条件下在摇床上振荡培养10～200小时，然后转接到相同的培养基中培养，照此方法连续转接3～5次，将获得的培养液稀释后涂布到预先制备的由烟草废料液体培养基加1.9％的琼脂得到的烟草浸提液固体培养基上，25～45℃条件下培养1～15天，待长出菌落后，挑取大菌落在同样的固体平板培养基上划线，挑选单菌落转接到固体斜面培养基，培养得到驯化菌株，保存备用；

二级摇瓶菌种培养：取步骤(1)所述烟草废料液体培养基，接入一级斜面菌种，于20～45℃下培养6～100小时，得二级摇瓶种子液；根据生产规模，可进一步采用种子罐进行种子的放大培养；

(3)液体发酵生产生物杀虫剂：

取步骤(1)所述烟草废料液体培养基，按0.5％～10％的比例(按质量计)接入所述步骤(2)制备的发酵种子液，于pH5～8.5、温度25～45℃发酵1～12天；发酵完成后放罐，即得到烟草废料复合生物杀虫剂初产品；发酵液经进一步浓缩、提取或干燥，配以助剂，即得到本发明液态、颗粒状或粉状烟草废料复合生物杀虫剂；

或

方案二：固态发酵法

(1)烟草废料固体培养基的制备：

将烟草废料打碎至0.2～2cm的粒度，加入0.3～1.5倍重量的水和适量营养源，调整碳氮比至5～35，pH至5～8.5，灭菌后备用；

(2)菌种的扩大培养：

一级斜面菌种的驯化、培养：同方案一；

二级固体菌种培养：取步骤(1)所述烟草废料固体培养基，接入一级斜面菌种，于20～45℃下培养15～300小时，得二级固体菌种；根据生产规模，可进一步采用固体培养进行种子的放大培养；

(3)固态发酵生产生物杀虫剂：

取步骤(1)所述烟草废料固体培养基，按1％～50％的比例(按质量计)接入所述步骤(2)制备的固体发酵种子，于pH5.5～8.5，温度25～45℃，发酵1～12天；得到发酵料，即为烟草废料复合生物杀虫剂初产品；发酵料经进一步提取或干燥粉碎，配以助剂，即得到本分明液态、颗粒状或粉状烟草废料复合生物杀虫剂。

9.根据权利要求8所述的一种烟草基质复合生物杀虫剂的制造方法，其特征在于：所述方案一中的二级液体发酵菌种可替代方案二中的二级固体菌种接入烟草废料固体培养基中，用于固态发酵生产烟草基质复合生物杀虫剂。

10.根据权利要求8所述的一种烟草基质复合生物杀虫剂的制造方法，其特征在于：所述烟草废料为烟草打叶复烤过程中产生的废烟梗；所述杀虫微生物为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitlis)、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)中的一种或几种混合菌种。