CN102253201A - 一种基于表面印记空心粒子的化学发光免疫传感器的研制 - Google Patents

Abstract

一种新型的基于分子印记空心纳米粒子的化学发光免疫传感器，并用于有机磷农药残留物高选择性的在线富集和高灵敏的化学发光探测。主要包括在功能化双键修饰的SiO₂表面印记CPF分子，形成颗粒均匀的芯-壳型印记纳米粒子，利用HF蚀刻芯-壳型印记粒子中SiO₂核，获得印记空心粒子。通过PVA固定印记空心粒子于聚丙烯柱内，以制备稳定的分子印记柱，并将该分子印记柱连接到一个流动体系中，通过计算机程序精确控制实现分析样品的在线富集和化学发光检测的自动化和程序化。

Description

一种基于表面印记空心粒子的化学发光免疫传感器的研制

技术领域

本发明涉及分子印记传感技术领域，特别是构建基于表面印记空心粒子的化学发光免疫传感器的方法，实现对环境中痕量有机磷农药残留物的在线富集和发光探测。

背景技术

有机磷毒死蜱(CPF)能抑制神经系统正常功能所必需乙酰胆碱酯酶的活性，因而，CPF广泛用作为农业、家庭等场所的杀虫剂。残留到农产品和自然环境中CPF会对人类健康和生态环境造成极大危害。为了人类健康和环境保护，当务之急是建立一个选择性好和灵敏度高的CPF检测方法。到目前为止，CPF及其代谢物的分析方法主要包括气相色谱/质谱(GC/MS)和液相色谱/质谱(LC/MS)等。但这些仪器分析技术需要昂贵的仪器，繁琐的样品预处理和准备，以及训练有素的技术人员。另一方面，目前基于抗体、酶、特异蛋白和DNA等生物活性物质作为识别元件的化学/生物传感器在有机磷农残检测中取得重大突破，但是生物识别敏感材料如抗体、酶、特异蛋白和DNA等生物分子性质不稳定，受环境影响大，价格极为昂贵。因此使用生物敏感材料制作的化学/生物传感器比较脆弱，使用寿命短，在苛刻条件下可能失去敏感特性，这严重阻碍了化学/生物传感器的发展和普及。

近来，使用分子印记材料代替生物材料作为识别元件的化学传感器取得一些进展，但目前分子印记在传感器中应用主要存在以下两方面困难，一是通过传统方法制得的印记聚合物的模板分子及其被除去后留下的识别位点大都包埋在高交联密度的聚合物内部，从而导致了分子印记效率的严重降低，印记材料结合动力学慢，限制其作为有效的传感器识别元件。二是如何将目标分子与分子印记位点的敏感结合作用转化成易于读出的信号。一般来说，印记聚合物具有较弱的导电性和光学性质，因此分子印记传感器的信号获取也限制分子印记传感器的发展。

发明内容

为了克服上述现有方法的诸多不足，本发明的目的是提供一种基于分子印记空心纳米粒子作为高选择性分子识别元件的化学发光免疫传感器的方法，并用于环境样品中痕量CPF的高选择富集和高灵敏探测。

本发明的技术方案如下：一种新型的基于分子印记空心粒子的化学发光免疫传感器研制的方法。其特征在于：在含有功能化双键基团修饰的SiO₂粒子表面制备含有拥有高密度有效印记位点的芯-壳型CPF分子印记纳米粒子，再利用HF溶液蚀刻芯-壳型印记材料中二氧化硅核，以获得CPF印记空心纳米粒子。进一步通过用PVA作为固定剂将制备的CPF印记空心纳米粒子固定在一个聚丙烯柱中，并安装到一个流动体系中，实现对样品中痕量的CPF分子高选择在线富集，结合高灵敏的化学发光反应，实现对痕量CPF的高灵敏的探测。其具体包括以下步骤：

1、通过表面印记技术制备CPF分子印记空心纳米粒子，其主要过程包括：(1)在无水甲苯溶剂中，利用硅烷化反应将3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)接枝到SiO₂纳米粒子表面，形成含有功能化双键修饰的MPS-SiO₂粒子；(2)MPS-SiO₂粒子悬浮在含有功能单体(丙烯酸)和交联剂(EGDMA)，模板分子(CPF)和引发剂(AIBN)的乙腈溶液中，通过控制聚合温度来控制聚合反应选择性地发生在MPS-SiO₂粒子表面，以形成颗粒均匀的芯-壳型印记纳米粒子；(3)用HF溶液蚀刻芯-壳型印记纳米粒子中SiO₂核，获得分子印记空心纳米粒子；(4)用50mM NaOH的90％甲醇溶液作为提取溶剂，除去分子印记空心纳米粒子中的模板CPF分子，即得到具有对CPF分子高选择识别功能的分子印记空心纳米粒子。

2、通过流动体系实现对CPF分子高选择在线富集和高灵敏发光检测，建立了基于分子印记空心粒子的化学发光免疫传感分析。其主要过程包括：(1)20mg的印记空心纳米粒子被装进一个聚丙烯柱内，以制备分子印记柱，为了避免分子印记柱中印记空心纳米粒子的泄漏，本发明采用0.2％PVA作为固定试剂用于固定印迹纳米粒子，以提高分子印记柱的使用寿命；(2)将分子印记柱连接到图1的流动体系中，以实现对复杂体系中CPF的高选择性富集与检测。具体过程为通过蠕动泵将含有CPF溶液泵入分子印记柱，利用分子印记柱中的印记空心纳米粒子实现对CPF的高选择性在线富集，再用蠕动泵将二次水泵入柱中，以除去非选择性吸附物质，提高分析选择性；然后将化学发光试剂鲁米诺和过氧化氢泵入分子印记柱，并与吸附到柱中的CPF反应，产生强烈的化学发光信号，实现对CPF的化学发光探测。最后在用蠕动泵泵入二次水清洗反应后的分子印记柱，以除去化学发光后残余在柱中的物质，使之重新恢复其分子识别功能，可用下一次发光测定。

本发明的有益效果：

本发明建立的基于分子印记空心纳米粒子作为CPF高选择性分子识别元件的化学发光免疫传感器的方法，并用于环境样品中痕量CPF的高选择富集和高灵敏探测。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明采用表面功能单体诱导技术在功能化双键修饰的SiO₂表面印记CPF分子，以形成颗粒均匀的芯-壳型印记纳米粒子，进一步利用HF溶液蚀刻芯-壳型印记纳米粒子中SiO₂核，获得CPF分子印记空心纳米粒子。与传统的分子印记聚合物相比较，分子印记空心纳米粒子具有较大的比表面积，较多的表面识别位点，较大的结合量和快速结合动力学。

2、本发明采用0.2％PVA固定CPF分子印记空心纳米粒子于一个聚丙烯柱内，以制备分子印记柱，本法有效地避免印记空心纳米粒子从分子印记柱中泄漏现象，以提高分子印记柱的使用寿命，实验证明该分子印记柱重复使用200次可以获得良好的重现性。

3、本发明采用的流动系统通过计算机程序精确控制，分析样品的在线富集和检测实现自动化和程序化。

4、本发明利用具有较大的比表面积的分子印记空心纳米粒子作为分子识别元件，因此对目标分子拥有较高分子识别选择性，能实现对复杂样品中CPF的选择性检测。

5、本发明利用高灵敏的化学发光信号表征目标分子与分子印记位点的敏感结合作用，因此该传感器具有较高的灵敏度，实验结果表明测定CPF检测限为0.92nM。

附图说明

图1是本发明所采用的分子印记空心粒子化学发光免疫分析传感器示意图。

图2是本发明制备CPF分子印记空心纳米粒子的原理示意图。

图3是本发明所制备SiO₂粒子的SEM及其功能化修饰前后SiO₂的红外光谱图。

图4是本发明制得的CPF芯-壳印记粒子及其CPF空心印记粒子的扫描、透射图。

图5是本发明合成的CPF空心壳粒子的饱和结合量曲线和动力学曲线图

图6是本发明合成的CPF印记或非印记空心粒子对水相中CPF选择性吸附。

图7是本发明合成的CPF印记空心粒子非选择性吸附物质的洗脱。

图8是本发明采用分子印记空心粒子化学发光免疫分析的化学发光响应曲线。根据附图进一步解释具体实施方式

图1是本发明采用的分子印记空心粒子化学发光免疫分析传感器示意图。本发明通过图1流动体系实现对CPF分子高选择在线富集和高灵敏发光检测，首先将换向阀连接到蠕动泵2，蠕动泵2以3.0mL min^-1速度将CPF溶液泵入分子印记柱中，溶液中的CPF被选择性吸附到分子印记柱中。经过120秒的吸附后，以二次水替代样品溶液，蠕动泵2以3.0mL min^-1速度将二次水泵入分子印记柱中，洗脱非选择性吸附到印记材料物质，提高分析的选择性，当清洗90秒后，蠕动泵2关闭，换向阀转向蠕动泵1，通过蠕动泵1将化学发光试剂鲁米诺和过氧化氢溶液分别以2.5mL min^-1流速泵入分子印记柱中，并与吸附到分子印记材料中的CPF反应而产生强烈的化学发光，当化学发光信号衰减到鲁米诺-过氧化氢本底信号后，蠕动泵1停止，换向阀转向蠕动泵2上，蠕动泵2以1.5mL min-1速度将二次水泵入分子印记柱中，清洗印记材料上因化学发光反应后残留物质，以便进行下一次富集与检测。本发明采用MPI-B化学发光仪(西安瑞买)检测化学发光信号，富集和检测过程控制是通过MPI-B发光仪数据处理程序得以精确控制，以保证整个测定自动化和程序化。

图2是本发明制备CPF分子印记空心纳米粒子的原理示意图。本发明采用表面功能单体诱导技术在功能化双键修饰的SiO₂表面印记CPF分子，其过程主要包括：将3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)修饰到SiO₂纳米粒子表面，形成含有功能化双键修饰的MPS-SiO₂粒子；在MPS-SiO₂粒子表面印记CPF以制备芯-壳印记纳米粒子；除去芯-壳印记纳米粒子中的SiO₂核，以制备CPF印记空心纳米粒子；除去印记空心纳米粒子中模板分子。

图3是本发明所制备的SiO₂粒子的SEM及其修饰前后SiO₂的红外光谱图。本发明所用SiO₂粒子是采用

方法制得，即在室温条件下，利用正硅酸乙酯(TEOS)在氨性介质中水解而制备单分散好SiO₂纳米粒子，其直径约为200nm，如图3A所示。进一步利用硅烷化反应将3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)接枝到SiO₂纳米粒子表面，形成含有功能化双键修饰的MPS-SiO₂粒子。具体实施是将0.1g SiO₂纳米粒子分散到20mL无水甲苯中，加入1mL MPS于上述混合溶液，超声分散15min，在惰性气氛下回流24小时，所得MPS-SiO₂粒子离心分离，并分别用乙醇、乙腈洗涤，真空干燥24h。对比纯SiO₂粒子的红外谱曲线(图3B，a)，MPS-SiO₂粒子的红外光谱可以清晰看出修饰上MPS的特征峰位分别为羰基峰位1719cm^-1和CH₂/CH₃基团峰位在2979、2916、2853和1451cm^-1。尽管纯SiO₂粒子也出现2979和1451cm^-1的CH₂/CH₃峰，这可能是由于TEOS分子中没有完全水解的乙氧基造成的，但纯SiO₂的CH₂/CH₃峰强度明显弱于修饰后的强度，因此，SiO₂已成功修饰上MPS，使其表面含有功能化双键基团。

图4是本发明制得的CPF芯-壳印记粒子及其CPF空心印记粒子的扫描、透射图。按照图2的步骤在功能化MPS-SiO₂粒子表面印记CPF分子，具体是将20mg MPS-SiO₂粒子超声分散到50mL乙腈中，将CPF(0.1mmol)，功能单体丙烯酸(0.4mmol)，交联剂EGDMA(1.6mmol)和引发剂AIBN(15mg)分散到上述混合溶液中，混合溶液置于在冰水溶液中通氮除氧20min后密封，并置于在一个气浴摇床中，控制转速为300rpm，通过三步程序升温控制印记聚合反应定向发生MPS-SiO₂粒子表面，已获得芯-壳型印记材料。首先聚合溶液升温到30℃并保持2h，此时保证MPS-SiO₂粒子完全被聚合溶液润湿，有利于聚合反应定向发生在MPS-SiO₂粒子表面；在将聚合溶液温度升到50℃并保持6h，在这个阶段预聚合反应已经缓慢地发生在MPS-SiO₂粒子表面，少量低聚体已沉积到MPS-SiO₂粒子表面；随后，将聚合温度上升到60℃并保持24h，此时MPS-SiO₂粒子表面的低聚体进一步长大并在MPS-SiO₂粒子表面沉淀形成均匀的芯-壳型印记纳米粒子。进一步为了增加印记聚合物在化学发光分析中稳定性，延长分子印记材料的使用寿命，在聚合反应完成后，在将反应体系升温到80℃反应6小时，以保证在交联聚合过程中SiO₂粒子表面的包覆聚合物层进一步熟化，形成了高度交联的聚合物外壳，使聚合物的外壳的刚性强，形成位点中的空间结构稳定。图4A是本发明在200nmMPS-SiO₂粒子表面印记聚合物壳层，扫描照片上可以清晰看到中间的SiO₂模板和很薄的聚合物外壳，即芯-壳结构，芯-壳型结构可以从TEM中得到进一步证实。本发明通过利用20％的HF蚀刻芯-壳型印记纳米粒子中SiO₂核，以获得CPF分子印记空心纳米粒子。如图4B所示，表示经过HF蚀刻后，几乎所有的SiO₂核均被成功除去，形成一个聚合物空心壳层，高分辨的SEM清楚显示其空心结构，其壳层厚度约为40nm。

图5是本发明合成的CPF空心壳粒子的饱和结合量曲线和动力学曲线图。其中图5A是三种分子印记材料的饱和吸收曲线：(□)是CPF印记空心纳米粒子；(△)是传统的聚合物微球；(○)是非印记空心纳米粒子。可见，印记空心纳米粒子(□)对CPF具有更高的饱和吸附量，分别是传统印记聚合物微球(△)和非印记空心纳米粒子(○)的3和6倍。图5B是印记空心纳米粒子(□)和传统印记聚合物微球(△)的吸附动力学曲线，显然，前者具有更快的结合速率。

图6是本发明合成的CPF空心壳粒子在水相中吸附CPF以及吸附后洗脱液的气相色谱曲线变化。为了验证含有20mg CPF空心印记纳米粒子在水相中选择性吸附CPF能力，通过蠕动泵以3.0mL min^-1的流速将5mL分别含有10μM CPF(1)、甲基对硫磷MP(2)和对硫磷PT(3)混合溶液泵入分子印记柱，随着泵入时间的增加，混合溶液的气相色谱变化如图6A所示，显然，相比MP(2)和PT(3)的色谱峰，CPF(1)的色谱峰随富集时间的增大而显著降低，约120s得到吸附平衡，通过计算，在120s的富集时间内，分子印记柱能分别从5mL10μM CPF(1)、MP(2)和PT(3)混合溶液中吸附CPF(1)、MP(2)和PT(3)为44、5.5和12.5nmol，这表明CPF空心印记纳米粒子对CPF具有较高的选择性。而在相同条件下，非印记空心粒子对CPF分子却没有任何选择性(如图6B)所示。

图7是本发明合成的CPF印记空心粒子非选择性吸附。由图6A知，尽管CPF印记空心粒子对CPF有高的选择性，但是任有少量的其他物质如MP(2)、PT(3)通过非选择性吸附到印记聚合物阵列中，这将对化学发光测定产生干扰，因此在进行化学发光探测前，利用二次水对上述吸附120s的分子印记柱进行清洗以除去柱中非选择性杂质，图7表示随着二次水清洗，洗脱液的气相色谱随洗脱时间的渐变关系，显然的非选择性吸附的MP(2)和PT(3)能很快被洗出，约90s几乎看不到任何MP(2)和PT(3)峰，表明此时分子印记柱内的MP(2)和PT(3)已被洗脱，而另一方面，虽然CPF是通过选择性吸附到印记柱中，但长时间洗脱也能洗出部分CPF，造成测定灵敏度降低，因此控制合适的清洗时间对提高化学发光的选择性和灵敏性有十分重要的作用，本发明采用的清洗时间控制为90s。

图8是本发明采用分子印记空心粒子化学发光免疫分析的化学发光响应曲线。按照图1的程序，传感器对不同浓度CPF的化学发光响应曲线被记录，结果如图8A所示，显然，传感器对空白溶液几乎没有出现化学发光峰，化学发光信号仅仅保持鲁米诺-H₂O₂发光体系的本底信号(如图8，a)；而传感器对CPF溶液却表现出强烈的化学发光峰值信号，而且化学发光峰值随着CPF浓度的增加而增大，其化学发光峰高可作为CPF定量分析指标。图8A曲线b、c和d分别表示传感器分别对2.5×10^-9、1.5×10^-8和2.5×10^-7M的CPF的化学发光信号。图8B分别表示CPF-H₂O₂(a)、鲁米诺-H₂O₂(b)和鲁米诺-H₂O₂-CPF(c)体系的化学发光光谱曲线，显然CPF与H₂O₂反应几乎不能产生化学发光，而鲁米诺与H₂O₂反应能产生化学发光，且其化学发光强度能被CPF进一步增强。

Claims (4)

1.一种新型的基于分子印记空心纳米粒子的化学发光免疫传感器，并用于有机磷农药残留物高选择性在线富集和高灵敏的化学发光探测。其特征是：在含有功能基双键修饰的SiO₂粒子表面制备含有高密度有效印记位点的芯-壳型有分子印记纳米粒子，通过利用HF溶液蚀刻芯-壳型印记材料中SiO₂核，以获得分子印记空心纳米粒子，进一步通过用聚乙烯醇作为固定剂将制备的印记空心纳米粒子固定在一个聚丙烯柱中，结合高灵敏的化学发光反应，一种基于分子印记空心纳米粒子作为选择性识别元件的化学发光免疫传感被建立，该传感器适用于用于环境样品中痕量有机磷残留物的在线富集和检测。

2.一种制备权利要求1所述的高密度有效印记位点的分子印记空心纳米粒子，由下列步骤组成：

(1)在无水甲苯溶剂中，利用硅烷化反应将3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)接枝到SiO₂纳米粒子表面，形成含有功能化双键修饰的MPS-SiO₂粒子。

(2)MPS-SiO₂纳米粒子悬浮在含有功能性单体(丙烯酸)和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸甲酯(EGDMA)，模板分子毒死蜱(CPF)和引发剂偶氮二异丁氰(AIBN)的乙腈溶液中。通过一个三步程序升温控制聚合反应选择性发生在MPS-SiO₂粒子表面，以形成颗粒均匀的芯-壳型印记纳米粒子；步骤2所述的三步程序升温是在程序升温的气浴摇床中进行的，保持摇床转速300rpm，控制反应液30℃2h，50℃6h，60℃24h。最后反应体系温度升高到80℃，老化6h以便获得高交联的印记聚合物。

(3)用20％HF溶液蚀刻芯-壳型印记纳米粒子中SiO₂核，获得分子印记空心纳米粒子。

(4)用50mM NaOH的90％甲醇溶液作为提取溶剂，将分子印记空心纳米粒子中的模板分子(CPF)除去，即得到具有对CPF分子高选择识别功能的分子印记空心纳米粒子。

3.一种制备权利要求1所述的新型基于分子印记空心纳米粒子的化学发光免疫传感器，基本上由下列步骤组成：

(1)20mg的印记空心纳米粒子分散在1mL 0.2％聚乙烯醇(PVA)热溶液中，将该悬浊液装入一个聚丙烯柱(4mm i.d.×10cm)内，两端用少量的玻璃棉填塞，聚丙烯柱置于70℃烘箱中干燥2h，即制备分子印记柱。

(2)将分子印记柱连接到图1所示的流动体系中，通过MPI-B发光仪数据处理程序精确控制换向阀将蠕动泵1或2连接到分子印记柱上，并与MPI-B化学发光仪(西安瑞买)相连接，以便实现对复杂体系中CPF的高选择性富集与和化学发光检测。

(3)首先将换向阀转向到蠕动泵2，以3.0mL min^-1速度将CPF溶液泵入分子印记柱中，溶液中的CPF被选择性吸附到印记柱上，经过120秒的吸附后，以二次水替代CPF样品溶液，蠕动泵2以3.0mL min^-1速度将二次水泵入分子印记柱中，洗脱非选择性吸附到印记材料物质，提高分析的选择性，清洗90秒后，蠕动泵2关闭，换向阀转向蠕动泵1，通过蠕动泵1将化学发光试剂鲁米诺和过氧化氢溶液分别以2.5mL min^-1流速泵入分子印记柱中，并与吸附到分子印记材料中的CPF反应而产生强烈的化学发光，当化学发光信号衰减到鲁米诺-过氧化氢本底信号后，蠕动泵1停止，换向阀转向蠕动泵2上，蠕动泵2以1.5mLmin^-1速度将二次水泵入分子印记柱中，以便清洗印记材料上因化学发光反应后残留物质，以便进行下一次富集与检测。

4.权利要求1所述的分子印记空心纳米粒子的化学发光免疫传感器对CPF的分析中的应用。其特征是：该传感器不仅能明显提高检测CPF灵敏度和选择性，而且还取得了良好的重现性，适合于在线富集和检测有机磷农药残留以及环境有害化学物质。

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