CN102228425B - 一种肿瘤靶向磁性水凝胶纳米递药系统及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肿瘤靶向磁性水凝胶纳米递药系统及其构建方法和应用。本发明所述肿瘤靶向磁性纳米递药系统是通过光化学固定法将具有温度和pH敏感性的水凝胶接枝到四氧化三铁纳米粒表面形成磁性水凝胶载体，并在其表面接枝肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ和靶向分子配体叶酸，再吸附阿霉素。本发明所述系统可以利用主动靶向将抗肿瘤药物运送至肿瘤细胞周围，肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ与肿瘤细胞表面受体结合并诱导肿瘤细胞程序性死亡，抗肿瘤药物阿霉素随载体进入细胞后释放。实验证明本发明所述递药系统具有可忽略的毒副作用，并且通过肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ协同抗肿瘤药物阿霉素于肿瘤细胞内外的共同作用机制，高效抑制癌细胞生长。
Description
技术领域
本发明涉及抗癌药物制备技术领域，具体涉及一种肿瘤靶向磁性水凝胶纳米递药系统及其构建方法和应用。
背景技术
世界卫生组织国际癌症研究中心于2011年4月公布的一份研究报告称，根据目前癌症的发病趋势，2020年全世界癌症发病率将比现在增加50%，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人。在这些众多类型的癌症中，肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，它具有发病率高、病程短、恶性程度大、预后差等特点。临床上一般采取西医的手术、放化疗与中药结合疗法，但都存在毒副作用大、治愈率低等问题，其主要原因在于抗肿瘤药物及治疗疗法的靶向选择性不高，在杀死肿瘤细胞的同时，对正常组织也产生较大的毒副作用或损害；同时肿瘤细胞易对化疗药物产生多药耐药性，引发自身免疫反应清除药物或阻断其发挥药效。因此，构建靶向肿瘤组织的递药系统(Drug Delivery System)以提高抗癌药物对癌细胞的高靶向选择性，增强对药物的控释能力(Controlled Released)以长效抑制肿瘤，成为治疗癌症的有效途径。
1.1靶向递药系统(Drug Delivery System)的构建
靶向递药系统将抗癌药物直接靶向肿瘤组织，在降低治疗剂量的同时提高抗肿瘤药物的疗效,避免其在非靶向部位的聚集。肿瘤靶向递药系统可分为被动靶向和主动靶向两大类，前者主要借助于纳米尺度的递药载体实现，后者则建立在纳米递药系统的基础上通过肿瘤细胞膜表面的特异性受体介导。
自20世纪70年代以来，无数的科研工作者们尝试利用脂质体、胶囊、微球、纳米粒子等载体运输抗肿瘤药物，以期最大限度地增强药物疗效。在诸多的递药载体中，纳米粒子倍受研究者的青睐。其作为一种新型的药物载体,由于粒径小，能穿过组织间隙并被细胞吸收， 通过人体最细的毛细血管,还可透过血脑屏障；同时由于其比表面积大，吸附能力强，经过表面修饰后可高效装载多种抗癌药物，并对药物进行保护，使药物在进入人体过程中不被胃酸和酶类等侵蚀降解,提高了药物稳定性,使药物只在特定的病灶部位释放,避免全身性的副作用。而磁性纳米粒子由于其具有超顺磁性，可以在外加磁场作用下被动靶向运输抗肿瘤药物，结合核磁共振成像及荧光成像可进行实时监测的特点，展现出极大的应用前景。
主动靶向给药系统能使抗肿瘤药物选择性地与靶组织在细胞或亚细胞水平上结合并起作用，可使药物能够可控性地分布于靶区并持续缓慢地释放药物,在提高药物抗癌效果的同时可降低其对正常组织的不良反应。目前，主动靶向给药系统研究较多的主要有三个方面，分别是：抗体介导的肿瘤靶向给药系统、前体药物的肿瘤靶向给药系统、受体介导内化的肿瘤靶向给药系统。抗体介导的肿瘤靶向给药系统是指利用抗原-抗体之间的特异性识别机制发挥主动靶向特定细胞作用，例如以单克隆抗体、免疫脂质体、单抗偶联物。前体药物的肿瘤靶向给药系统是利用肿瘤中某些酶的水平的升高，活化前体药物，从而释放出具有活性的原药。受体介导内化的肿瘤靶向给药系统主要是指以肿瘤细胞表面特异性或过度表达的受体为靶点，以受体对应的配体或配体结合物为载体，利用受体和配体的特异性反应，将药物递送至受体表达阳性的肿瘤细胞的一种治疗系统，包括：表皮生长因子受体、 唾液酸糖蛋白受体、低密度脂蛋白受体、转铁蛋白受体、叶酸受体等。其中叶酸受体(Folic acid Receptor, FR)在多数恶性肿瘤中呈过表达,而在正常组织细胞中不表达，因此FR介导的靶向传递成为受体介导的主动靶向给药系统中的研究热点。叶酸(Folic Acid, FA)是一种小分子维生素，与其他靶向分子相比，FA相对分子质量小，价廉易得，具有较高的稳定性，并且无免疫原性，与肿瘤细胞表面的受体有相对较高的亲和力。
1.2药物控释(Controlled Released)系统的构建
药物的控制释放是一门新兴的交叉学科，药物控制释放技术就是选用适当的载体将药物按设计的剂量，在要求的时间范围内以一定的模式在体内释放或使药物在指定部位释放而达到治疗某种疾病的目的。与传统给药方式相比，药物控释剂不仅可以减少给药次数、维持血液中药物的浓度，从而解决了药物浓度不稳定的问题,而且还降低了药物毒性，提高了药物的疗效。理想的药物载体应具有很好的生物相容性、生物可降解性、理化及生物稳定性和极低的毒性，且有较高的载药性。目前用作药物载体的材料很多，包括聚乳酸(PLA)/乳酸-羟基乙酸(PLGA)、壳聚糖及其衍生物、丝素蛋白、高分子凝胶等。
水凝胶是一类水溶胀性，通过共价键、氢键或范德华力等相互作用形成交联结构的亲水纳米高分子材料。利用其对环境温度和pH具有敏感性，体积随着温度、pH变化发生相变而溶胀或收缩的特性，可以利用其装载抗癌药物并实现控释。其具有相变温度LCST(Lower Critical Solution Temperature)，当环境温度低于LCST时，水凝胶吸水溶胀，凝胶溶于水；当环境温度高于LCST时,水凝胶发生相变，收缩失水。利用水凝胶的这一特性，我们使其在低温下吸附抗肿瘤药物阿霉素，并当局部温度高于其LCST时释放。
1.3靶向给药系统与药物控释的结合
为使化疗药物既能高靶向运输至肿瘤细胞周围，并能进行有效的控制释放，研究者们尝试将靶向给药系统——磁性纳米粒和药物控释载体——水凝胶进行有机结合。据已有文献报道，水凝胶和磁性纳米粒的结合方式主要有四种：通过聚合反应结合、通过形成化学键(比如酰胺键、硫醚键、Fe-S键)结合，通过直接包裹吸附，以及通过直接在水凝胶内原位聚合生成Fe3O4。但聚合反应结合可能出现聚合不完全，包裹不均匀，水凝胶基质混凝；化学键结合方式往往需要复杂的化学反应，形成特殊的化学键，比如巯基、氨基、乙烯基等等，需要催化剂及合适的反应温度，反应难以控制，且效率不高；直接包裹吸附则容易导致包裹吸附不紧密，不均匀。原位生成的纳米粒是碱性条件下，在水凝胶中直接共沉淀生成Fe3O4粒子，但pH难以控制，Fe3O4粒子难以生成；而且碱性环境也很容易破坏水凝胶结构。
光化学固定法—液态光接枝法操作简单方便，接枝效率高，为解决磁性纳米粒与水凝胶的高效结合提供了有效解决途径。目前，用液态光接枝法形成磁性水凝胶的研究还未见报道。在我们的发明中，我们通过液态光接枝的手段将水凝胶粒子接枝到油酸改性的四氧化三铁纳米粒表面，形成磁性水凝胶载体。同时，我们在水凝胶最外层光接枝叶酸分子，使得我们的系统模型既可以利用叶酸配体与肿瘤细胞表面受体高亲和力结合而主动靶向，也可以在外加磁场作用下使纳米药物被动靶向运输至肿瘤细胞周围；而且，利用外加磁场诱导磁性纳米粒的磁热效应，使局部温度升高超过水凝胶的最低临界溶解温度(LCST)，进而对药物进行有效的控制释放。
1.4内外调控机制的构建
传统化疗药物疗效低的原因之一是肿瘤细胞易对化疗药物产生多药耐药性，引发自身免疫反应清除药物或阻断其发挥药效。在我们发明的纳米递药系统中，我们以磁性水凝胶为载体吸附运载阿霉素，通过叶酸分子的主动靶向作用及外加磁场的定向引导，进入细胞后进行控制释放阿霉素；同时，我们在磁性水凝胶表面通过光化学固定法接枝上具有肿瘤抑制作用的肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ，肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ可以分别和肿瘤细胞表面的肿瘤坏死因子-α受体、干扰素-γ受体结合，进而诱导细胞程序性死亡途径。
阿霉素(Doxorubicin, DOX)是一种传统的广谱抗肿瘤抗生素,目前是肝癌化疗的一线用药。阿霉素的化学名称为10-[(3-氨基-2,3,6-三去氧-a-L-来苏己吡喃基)-氧]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-8-(羟乙酰基)-1-甲氧基-5,12-萘二酮盐酸盐，其结构中具有脂溶性的蒽环配基，水溶性的柔红糖胺，又有酸性酚羟基和碱性氨基,因此具有很强的抗癌活性。其分子结构可嵌入到DNA双链中形成稳定的复合物,影响DNA的结构和功能，阻止肿瘤细胞DNA复制和RNA的合成。由于耐药性的产生，阿霉素的有效率低于20%；同时，由于其对血液系统的毒性和胃肠道反应十分明显，可引起恶心、呕吐、脱发、高热等不良反应。因此，利用纳米载体靶向运输阿霉素，可以更大程度地发挥传统抗肿瘤药物的优势作用，在强效抑制肿瘤的同时，减少对正常组织毒副作用。
肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α)是一种由单核巨噬细胞对细菌感染或其他免疫源反应自然产生的细胞因子，可使瘤体缩小或消失，在体内体外均能有效杀伤肿瘤细胞。干扰素-γ(Interferon-γ, IFN-γ)是T细胞和NK细胞产生的具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能的一类蛋白质，可抑制快速分裂的细胞，如各种肿瘤细胞，临床可用于肿瘤的辅助治疗。TNF-α与IFN-γ协同抗肿瘤，可在一定程度上减轻各自的毒副反应，我们的前期研究也证明了两者的协同作用抑制率明显高于单独使用任何一种细胞因子的抑制率，同时降低了单一细胞因子的剂量。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中存在的上述不足，提供一种以油酸改性的四氧化三铁纳米粒子为核心，通过光化学固定法将水凝胶固定于纳米粒表面形成磁性水凝胶(Fe3O4-OA /NIPA-AA)，在磁性水凝胶表面光接枝肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ，并在其最外层光接枝靶向分子配体叶酸Fe3O4-OA /NIPA-AA/ TNF-α/IFN-γ/FA)，最后以此给药系统吸附阿霉素形成多功能纳米药物(Fe3O4-OA /NIPA-AA/TNF-α/IFN-γ/FA/DOX)。可利用外加磁场的定向引导及叶酸介导的主动靶向将抗肿瘤药物阿霉素运输至肿瘤细胞周围：肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ与肿瘤细胞细胞表面受体结合并诱导肿瘤细胞程序性死亡；阿霉素随载体进入细胞后通过磁性水凝胶的磁热效应控制释放。体内、体外实验证明这种纳米药物具有较小的毒副作用，并且通过瘤坏死因子-α、干扰素-γ协同阿霉素于肿瘤细胞内外的共同作用机制，高效抑制肝癌细胞生长。
本发明另一目的在于提供上述肿瘤靶向磁性纳米递药系统的构建方法。
本发明还有一个目的在于提供上述肿瘤靶向磁性纳米递药系统的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
一种肿瘤靶向磁性纳米递药系统，包括磁性水凝胶载体和在其表面接枝的肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ和靶向分子配体叶酸；所述磁性水凝胶载体是具有温度和pH敏感性的水凝胶接枝到四氧化三铁纳米粒上而得。
本发明上述肿瘤靶向磁性纳米递药系统的构建方法中，所述磁性水凝胶载体的制备方法包括如下步骤：
（1）超顺磁性四氧化三铁纳米粒的合成及表面改性：称取FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O，加入超纯水，置于油浴锅内，通入氮气保护，60℃下搅拌30min；取NaOH加入超纯水，在60℃下搅拌使其充分溶解，再将溶解的NaOH加入到铁盐溶液中，反应10min后，升温至70℃，然后向其中加入HCl溶液至pH等于3，最后加入油酸，搅拌3h后，在磁铁辅助下用无水乙醇洗涤，再用丙酮洗涤，得到油酸包裹的四氧化三铁纳米粒，将其真空抽干备用；
（2）通过微乳液聚合法合成水凝胶：取异丙基丙烯酰胺、丙烯酸、亚甲基双丙烯酸酰胺和十二烷基磺酸钠，溶于超纯水中，室温下在N2氛围保护下搅拌20min；向溶液中加入过硫酸钾于70℃下聚合反应4h，反应结束后，冷却至室温，用透析袋除去未反应完的单体，透析两周，每两个小时更换一次新鲜的超纯水，最后用真空管冷冻干燥机将其冻干储存待用；
（3）光活性水凝胶的制备：称取水凝胶，溶于pH=7.4的PBS缓冲液中，吸取1ml水凝胶溶液加入到4ml含有59.19mg叠氮苯胺盐酸盐的二甲基甲酰胺DMF/PBS(pH=7.4，体积比为4:1)溶液中，在冰浴条件下搅拌反应48h，将混合溶液转移至透析袋纯化叠氮苯基衍生物，透析三天后取出溶液用真空冷冻干燥机冻干，冻干后，向其中加入PBS溶液溶解；
（4）磁性水凝胶载体的合成：避光条件下，将光活性水凝胶溶于PBS缓冲溶液中，加入油酸改性后的四氧化三铁纳米粒，混合均匀，并用超声波清洗器分散后转移至培养皿中，振荡条件下，于125W紫外灯下10cm处照射20min；
（5）接枝肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ和靶向分子配体叶酸的方法如下：分别将50μg的IFN-γ、TNF-α、FA加入25ml含768μg N-琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，在4℃的条件下搅拌反应48h，合成结束后，分别用超滤离心管在4000rpm/min的转速下，离心30min以纯化叠氮苯基衍生物，冷冻干燥备用。
本发明所述肿瘤靶向磁性纳米递药系统可以用于制备治疗癌症的药物，特别是可以将所述肿瘤靶向磁性纳米递药系统溶于PBS缓冲液中，加入阿霉素溶液溶解，冰浴搅拌三天，使肿瘤靶向磁性纳米递药系统充分吸附阿霉素，用于治疗癌症。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的创新点主要体现在以下三个方面：（1）采用光化学固定法，在磁性纳米粒表面光接枝具有温度、PH敏感性的水凝胶，形成磁性水凝胶载体并装载可磁热控释阿霉素；（2）在磁性水凝胶表面光接枝叶酸分子，利用叶酸介导的主动靶向给药(并可结合外加磁场实现抗肿瘤药物的双重靶向运输)；（3）利用靶向给药载体表面结合的肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ的受体信号传导作用配合细胞内水凝胶释放阿霉素的DNA破坏作用，实现药物的细胞内外双重调控作用机制。
附图说明
图1显示油酸包裹的Fe3O4纳米粒全面的表征结果。A为纳米粒的透射电镜TEM的图片，纳米粒分散较为均匀，粒径约为20nm；B为纳米粒的粒径分布，其平均直径在13.5±1.45nm；C为纳米粒于300K下测得的的磁性大小，为60 emu/g；D 为纳米粒在X射线衍射仪中的衍射图谱，与标准的四氧化三铁的衍射图谱基本吻合；E为纳米粒在油酸改性前和包裹油酸后的红外图谱，通过对比官能团的变化，证明油酸包裹四氧化三铁纳米粒成功；
图2为水凝胶(NIPA-AA)及其合成原料的红外图谱(A)及其LCST的测定曲线(B)。A显示了异丙基丙烯酰胺(NIPA)、丙烯酸(AA)及水凝胶(NIPA-AA)的红外图谱，通过比较官能团的变化初步证明水凝胶NIPA-AA合成成功。B显示水凝胶的最低临界溶解温度(LCST)为38.7℃；
图3显示了四氧化三铁、油酸、油酸包裹的四氧化三铁、光活性水凝胶及光活性水凝胶接枝到油酸包裹的四氧化三铁纳米粒表面后的红外图谱，通过比较官能团特征峰的前后变化，初步证明光活性水凝胶成功接枝到油酸包裹的四氧化三铁纳米粒表面；
图4显示了磁性水凝胶(Fe3O4-OA /NIPA-AA)充分吸附阿霉素后于37℃、41℃下在72h内的释放动力学特征；
图5为AzPh-TNF-α/AzPh-IFN-γ的合成流程图；
图6为AzPh-FA的合成流程图；
图7显示了傅里叶转换红外线光谱分析仪表征比较光活性IFN-γ、TNF-α、FA制备前后官能团的红外图谱的变化；
图8通过傅里叶转换红外线光谱分析仪表征比较光活性IFN-γ、TNF-α及Fe3O4-OA /NIPA-AA在接枝前后红外图谱中官能团的变化；
图9中的A显示了通过细胞计数测定空白组a(单纯细胞培养)，b游离药物1(Free TNF-α+IFN-γ+FA+DOX)、c游离药物组2(Free Fe3O4-OA/NIPA-AA +TNF-α +IFN-γ+FA+DOX)、d共固定药物组(Fe3O4-OA/NIPA-AA/TNF-α/IFN-γ/FA)与HepG2细胞共孵育24h后细胞存活率；B显示了分别以阿霉素量为0 ng/well、10ng/well、20ng/well、30ng/well计的纳米药物与HepG2细胞共孵育24h后通过细胞计数计算得到的细胞存活率；
图10显示了裸鼠的存活率，最早出现死亡的是生理盐水组，接着是游离药物组、共固定药物但不给予加热处理组、固定药物并加热处理组。阴性对照组(正常裸鼠组)和给予共固定药物但不加热处理组裸鼠的总体存活天数最长，只注射生理盐水的阳性对照组裸鼠的总体存活天数最短；
图11显示了各组裸鼠的体重变化曲线，B至F图分别是正常组、生理盐水组、游离药物组、固定药物非加热处理组、固定药物加热处理组的体重变化曲线图；
图12显示的是裸鼠处死前(第36天)从A、B、C、D、E组各取一只具有代表性裸鼠拍摄的图片及其对应的肿瘤图片，左图中箭头所指位置为瘤的生长部位，右图中显示的是与左图相对应的裸鼠的瘤；
图13显示的是B、C、D、E组裸鼠从第一次给药时开始计算的瘤体积大小随时间的变化曲线；
图14为给药前后裸鼠体内血小板、白细胞、红细胞数量的变化；
图15显示了各组裸鼠的肿瘤组织HE染色的结果，A1、B1、C1、D1是光学显微镜下100倍所观察到的结果，A2、B2、C2、D2是400倍数下观察到的结果。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1 肿瘤靶向磁性纳米递药系统的制备及表征
1.1超顺磁性Fe
3
O
4
纳米粒的合成及表面改性
采用化学共沉淀法合成出四氧化三铁(Fe3O4)纳米粒子。称取0.1mol FeSO4·7H2O，0.16mol FeCl3·6H2O置于三颈烧瓶中，向其中加入140ml超纯水，将三颈烧瓶装上电动搅拌器，置于油浴锅内，通入氮气保护，60℃下搅拌30min；称取0.84mol NaOH置于烧杯中，加入280ml超纯水，在60℃下用玻璃棒搅拌使其充分溶解。将NaOH溶液缓慢加入到铁盐溶液中(此时混合溶液的pH=12)，反应10min后，升温至70℃，然后向其中加入HCl溶液至pH=3，最后再加入20ml油酸(Oleic acid, OA)，搅拌3h后，在磁铁辅助下用无水乙醇洗涤数次，最后用丙酮洗涤后即得到油酸包裹的四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4-OA)，将其真空抽干备用。
油酸改性的Fe
3
O
4
纳米粒(Fe
3
O
4
-OA)的表征
油酸改性的四氧化三铁纳米粒制备成功后，取适量分散于无水乙醇中，超声分散30min后，利用透射电镜TEM(JEM-100CXII)表征其形貌；将分散于无水乙醇的纳米粒用激光粒度仪(Nano-ZS90，Malvern，UK)检测其粒径分布；取粉末状油酸改性的四氧化三铁纳米粒研磨后，称取一定量后用磁学性质测量系统(MPMS XL-7，美国QUANTUM DESIGN公司)测其磁饱和强度大小；用X射线衍射仪(日本岛津 XRD-6000)检测纳米粒的衍射图谱；用傅里叶变换红外光谱仪(NEXUS870，美国NICOLET公司)检测了比较四氧化三铁纳米粒在用油酸改性钱和油酸改性后的红外图谱（图1）。
水凝胶(NIPA-AA)的合成
通过微乳液聚合法合成水凝胶(NIPA-AA)。称取3.779g异丙基丙烯酰胺(NIPA)，1.296g丙烯酸(AA)，0.70g亚甲基双丙烯酸酰胺(BIS)，0.395g十二烷基磺酸钠(SDS)，溶于100ml超纯水中，室温下在N2氛围保护下搅拌20min；向溶液中加入0.166g过硫酸钾(KPS)于70℃下聚合反应4h，反应结束后，冷却至室温，用透析袋出去未反应完的单体，透析两周，每两个小时更换一次新鲜的超纯水。最后用真空管冷冻干燥机将其冻干储存待用。
水凝胶的表征及其最低临界溶解温度(LCST)的测定
水凝胶合成并冻干后，通过傅里叶变换红外光谱仪(NEXUS870，美国NICOLE公司)表征比较异丙基丙烯酰胺(NIPA)、丙烯酸(AA)及水凝胶(NIPA-AA)的官能团红外图谱的变化；用pH=7.4的PBS缓冲溶液配制质量分数为5%的水凝胶溶液，用紫外-可见分光光谱仪(LAMBDA-35, 美国PE公司)测量水凝胶溶液的吸光度值，从20℃至50℃每0.5℃取一个点，每个温度点静置5min待其达到平衡后再进行测量，绘制水凝胶溶液的吸光度值随温度升高的变化曲线，并计算水凝胶的最低临界溶解温度(LCST)(图2)。
光活性水凝胶的制备及表征
称取0.01g水凝胶，溶于10ml pH=7.4的PBS缓冲液中，吸取1ml水凝胶溶液加入到4ml含有59.19mg叠氮苯胺盐酸盐的二甲基甲酰胺DMF/PBS(pH=7.4，体积比为4：1)溶液中，在冰浴条件下搅拌反应48h。将混合溶液转移至透析袋(MWCO:Nominal:500)纯化叠氮苯基衍生物，透析三天后取出溶液用真空冷冻干燥机(LGJ-12，BYLABO)冻干。冻干后，向其中加入PBS溶液溶解。
光活性水凝胶制备成功后，在避光条件下取适量用傅里叶转换红外线光谱分析仪(Vector-33，德国Bruker公司)进行表征比较水凝胶光活化前后官能团的变化（图2）。
磁性水凝胶载体(Fe
3
O
4
-OA /NIPA-AA)的合成及表征
通过光化学固定法—液态光接枝法将水凝胶接枝到纳米粒表面。避光条件下，将之前制备的光活性水凝胶溶于PBS缓冲溶液中，加入油酸改性后的四氧化三铁纳米粒(Fe3O4-OA)，混合均匀，并用超声波清洗器分散一段时间后转移至培养皿中，振荡条件下，于125W紫外灯下10cm处照射20min后，真空冻干备用。
光活性水凝胶接枝到油酸改性的Fe3O4纳米粒上之后，取适量通过傅里叶转换红外线光谱分析仪(Vector-33，德国Bruker公司)进行表征，比较光活性水凝胶接枝前后及油酸包裹的四氧化三铁纳米粒接枝前后官能团的变化(图3)，通过比较官能团特征峰的前后变化，初步证明光活性水凝胶成功接枝到油酸包裹的四氧化三铁纳米粒表面。
水凝胶的装载效率及阿霉素释放动力学测定
1.7.1水凝胶的装载效率的测定
光活性水凝胶接枝到油酸包裹的四氧化三铁纳米粒上之后，称取5mg溶于PBS缓冲溶液中，并加入3ml溶于PBS缓冲溶液的1mg/ml阿霉素溶液，于4℃下搅拌孵育三天，使水凝胶充分溶胀吸附阿霉素；之后将孵育的水溶液转移至透析袋中，4℃下透析三天，以除去未吸附在水凝胶里的阿霉素。通过高效液相色谱(HPLC)定量测定透析液中阿霉素的含量，并计算水凝胶对阿霉素的装载效率。
磁性水凝胶Fe
3
O
4
-OA /NIPA-AA装载阿霉素后释放动力学的测定
取充分吸附装载了阿霉素的磁性水凝胶(即Fe3O4-OA/NIPA-AA/DOX)转移至透析袋中，分别置于4℃、37℃、41℃下的PBS缓冲溶液中进行透析，分别在0min、15min、30min、45min、1h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、72h时间点从透析液中取出1ml置于EP管中，并向透析液中加入等体积的PBS缓冲液。最后，用高效液相色谱定量检测各时间点收集的透析液中阿霉素的含量，并绘制其释放动力学曲线(图4)。
将磁性水凝胶与阿霉素水溶液在4℃下搅拌孵育三天后在PBS缓冲液中进行透析，通过高效液相色谱(HPLC)定量测定透析液中阿霉素的含量，并计算得到水凝胶对阿霉素的装载效率为50.16%。
图4显示了磁性水凝胶(Fe3O4-OA/NIPA-AA)充分吸附阿霉素后于37℃、41℃下在72h内的释放动力学特征。从图中可以看出，在0到72h内，阿霉素在41℃下的释放速率比37℃下的更大；同时，阿霉素在41℃下的总释放率为51.39%，比在37℃下的总释放率(仅为33.91%)大。这一结果一方面间接证明水凝胶确已成功接枝到纳米粒上，另一方面有效证明磁性水凝胶在环境温度低于其最低临界溶解温度LCST时(如在37℃下)可以很好吸附阿霉素，而在环境温度高于其最低临界溶解温度LCST时(如在41℃下)可以较大程度地释放阿霉素，这一结果为利用磁性水凝胶载体装载抗癌药物靶向运输并控释提供了有力证据。
装载了药物的肿瘤靶向磁性纳米递药系统(Fe
3
O
4
-OA/NIPA-AA/ TNF-α/IFN-γ/FA/DOX)的制备及表征
1.8.1光活性IFN-γ、TNF-α、FA的合成及表征
分别将50μg的IFN-γ、TNF-α、FA加入25ml含768μgN-琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS(pH=7.4，体积比为4:1)溶液中，在4℃(冰浴、避光)的条件下搅拌反应48h。合成结束后，分别用超滤离心管(Milipore Molecut Ⅱ，10KNa)，在4000rpm/min的转速下，离心30min以纯化叠氮苯基衍生物，冷冻干燥备用。使用前，加入50ml的PBS溶液溶解，并调整至所需浓度1ng/μl。
取适量冻干的光活性IFN-γ、TNF-α、FA，通过傅里叶转换红外线光谱分析仪(Vector-33，德国Bruker公司)进行表征比较IFN-γ、TNF-α、FA在改性前后官能团的变化(图5~7)。
34
α/IFN-γ/FA的合成及表征
称取1mg磁性水凝胶(Fe3O4-OA /NIPA-AA)溶于10ml PBS缓冲溶液中，吸取1ml磁性水凝胶溶液，向其中加入1μg光活性TNF-α、1μg光活性IFN-γ及1μg光活性FA(AzPh-TNF-α、AzPh-IFN-γ、AzPh-FA的比例为1:1:1，Fe3O4-OA /NIPA-AA与AzPh-TNF-α、AzPh-IFN-γ、AzPh-FA的比例均为100:1)，在避光条件下混合均匀，并用超声波清洗器分散一段时间后转移至培养皿中，于125W紫外灯下10cm处照射20min，真空冻干备用。
将冻干的Fe3O4-OA /NIPA-AA/TNF-α/IFN-γ/FA用傅里叶转换红外线光谱分析仪(Vector-33，德国Bruker公司)表征，比较光接枝前后官能团红外图谱的变化(图8)。图8通过傅里叶转换红外线光谱分析仪表征比较光活性IFN-γ、TNF-α及Fe3O4-OA /NIPA-AA在接枝前后红外图谱中官能团的变化，初步证明光活性IFN-γ、TNF-α、FA成功地接枝到Fe3O4-OA /NIPA-AA磁性水凝胶上。
34
α/IFN-γ/FA/DOX的合成
称取1mg纳米药物Fe3O4-OA/NIPA-AA/TNF-α/IFN-γ/FA溶于4ml PBS缓冲液中，向其中加入1ml溶于PBS缓冲溶液的1mg/ml阿霉素溶液溶，冰浴搅拌三天，使Fe3O4-OA/NIPA-AA/TNF-α/IFN-γ/FA充分吸附阿霉素。之后，将混合溶液转移至透析袋中，置于4℃下透析三天，以除去未吸附到水凝胶里的阿霉素。透析结束后，将药物溶液取出并通过过滤除菌，调整至合适浓度备用。
实施例2 Fe 3 O 4 -OA /NIPA-AA/TNF-α/IFN-γ/FA/DOX对HepG2细胞体外抑制
1 药物对细胞抑制作用的研究
将HepG2细胞用胰酶消化后收集，吸打均匀后按每孔1×106细胞接种于24孔板中。实验分为四组：A空白对照组(单纯细胞培养)；B游离TNF-α(1.5ng/well)+IFN-γ(1.5ng/well)+FA(1.5ng/well)+DOX(20 ng/well)；C游离Fe3O4-OA/NIPA-AA(1.5ng/well)+TNF-α(1.5ng/well)+IFN-γ(1.5ng/well)+FA(1.5ng/well)+DOX(20ng/well)；D共固定药物组Fe3O4-OA/NIPA-AA/TNF-α/IFN-γ/FA/ DOX(药量以阿霉素量为20ng/well计)。在相同条件下(37℃,5%CO2)培养24h后，通过细胞计数比较实验组相对于空白组的细胞数量，计算细胞存活率。
不同剂量纳米药物对细胞抑制作用的研究
通过细胞计数法验证不同剂量纳米药物对HepG2细胞的抑制作用。将HepG2细胞用胰酶消化后收集，吸打均匀后按每孔1×106细胞接种于24孔板中。实验分为四组：A空白对照组(单纯细胞培养)；B、C、D组均为共固定药物组，各组中纳米药物的量分别以阿霉素的量为10ng/well、20ng/well、30ng/well计。在相同条件下(37℃,5%CO2)培养24h后，通过细胞计数比较实验组相对于空白组的细胞数量，计算细胞存活率(图9)。图9A显示通过细胞计数测定空白组a(单纯细胞培养)，b游离药物1(Free TNF-α+IFN-γ+FA+DOX)、c游离药物组2(Free Fe3O4-OA/NIPA-AA+TNF-α+IFN-γ+FA+DOX)、d共固定药物组(Fe3O4-OA /NIPA-AA/TNF-α/IFN-γ/FA)与HepG2细胞共孵育24h后细胞存活率。从图中可以看出，共固定药物比游离药物相比，其对HepG2细胞的抑制作用要更明显。图9B显示了分别以阿霉素量为0 ng/well、10ng/well、20ng/well、30ng/well计的纳米药物与HepG2细胞共孵育24h后通过细胞计数计算得到的细胞存活率。从图中可以看出，不同剂量的纳米药物对HepG2细胞都有较大程度的抑制作用，但当纳米药物以20ng/well的浓度共孵育HepG2细胞时，其对HepG2细胞的抑制作用最为明显。
实施例3 Fe
3
O
4
-OA /NIPA-AA/TNF-α/IFN-γ/FA对HepG2细胞体内抑制作用
1肝癌细胞(HepG2细胞系)的培养
使用DMEM培养基(含10%新生小牛血清、0.03mg/ml青霉素、0.05mg/ml链霉素，pH=7.2~7.4)，在37℃，5%CO2培养箱中进行传代培养。
肝癌动物模型的建立
动物实验选取四周龄BALB/c-nu/nu裸鼠(nude mice)，共购买20只，均为雄性，体质量14.5±3.2g，均购于广东省医学实验动物中心生产部，SPF级，许可证号： SCXK(粤)2008-0002；裸鼠批次为0079266。裸鼠购买后寄养于中山大学北校区动物实验中心SPF级裸鼠房(许可证号SYXK(粤)2007-0081)。将20只裸鼠随机分为5组，每组4只，编号为A、B、C、D、E组，其中A组为阴性对照组，不接种HepG2细胞，B、C、D、E组均接种HepG2细胞。待裸鼠适应性生长3天后，在B、C、D、E组裸鼠右前腋下接种HepG2细胞1×107cell/ml，每只注射0.1ml。观察三天后，再次对B、C、D、E组裸鼠右前腋下相同部位接种HepG2细胞1×107cell/ml，每只注射0.1ml，共给瘤3次，直至实验组所有裸鼠成瘤率达100%。
多功能纳米药物的注射
待每组各只裸鼠的瘤平均大小达到3～5mm以后，分别对裸鼠进行腹腔注射药物， 其中，A组是阴性对照组，没有接种HepG2细胞，不做任何处理；B组组是阳性对照组，接种HepG2细胞，只注射生理盐水(0.1ml/只)；C组为游离药物组，接种HepG2细胞，并注射游离药物Fe3O4-OA/NIPA-AA(1.5ng/只)+ TNF-α（1.5ng/只）+ IFN-γ（1.5ng/只）+FA(1.5ng/只)+DOX(40ng/只)，注射药物体积为0.1ml/只；D组为共固定药物组1，接种HepG2细胞，注射共固定药物Fe3O4-OA /NIPA-AA/TNF-α/IFN-γ/FA/DOX(药量以阿霉素量为40ng/只计)，注射药物体积为0.1ml/只；E组共固定药物组2，接种HepG2细胞，注射共固定药物Fe3O4-OA /NIPA-AA/TNF-α/IFN-γ/FA/DOX(药量以阿霉素量为40ng/只计)，注射药物体积为0.1ml/只，每隔一天用电吹风对长瘤部位给予加热处理10min，适当控制热源的位置使肿瘤表面温度不超过41℃。从第一次给瘤时间开始算起，给药时间分别为第20天、第23天、第27天、第30天，共给药4次。
裸鼠一般生物学特征的观察及记录
每隔两天称量、记录裸鼠的体重，绘制裸鼠体重变化曲线；用游标卡尺测量、记录肿瘤最最长径a(mm)与最短径b(mm)，同时观察裸鼠的精神状态、活动力、反应及皮下接种区域外观及触感。按公式V＝1/2(ab2)计算肿瘤体积，以肿瘤体积(mm3)为纵坐标、以时间(days)为坐标绘制不同药物处理下的肿瘤生长曲线。
血液常规及病理学检查
裸鼠在给药前和给药两周后，在A、B、C、D、E组中各取两只裸鼠从尾部取血并进行血清检测，比较给药前后裸鼠体内白细胞、红细胞、血小板数量的变化。
给药两周后，处死全部的裸鼠，解剖取出裸鼠的肿瘤、心脏、肝脏组织，分别置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋、切片，进行HE染色，光学显微镜下观察肿瘤组织、心脏、肝脏病理改变。
统计学分析
血液常规检测及肿瘤组织检查采用 SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料均以x±s表示，利用单因素方差分析比较各组数值间的差异，P < 0.05为差异有统计学意义。
在实验过程中，记录每组裸鼠死亡时间，绘制裸鼠存活时间曲线。每隔两天称量、记录裸鼠的体重，并绘制裸鼠体重变化曲线。用游标卡尺测量、记录肿瘤最最长径a(mm)与最短径b(mm)，同时观察裸鼠的精神状态、活动力、反应及皮下接种区域外观及触感。按公式V＝1/2(ab2)计算肿瘤体积，以肿瘤体积(mm3)为纵坐标、以时间(days)为纵坐标绘制不同药物处理下的肿瘤生长曲线（图10~15）。
图10显示了裸鼠的存活率，最早出现死亡的是生理盐水组，接着是游离药物组、共固定药物但不给予加热处理组、固定药物并加热处理组。阴性对照组（正常裸鼠组）和给予共固定药物但不加热处理组裸鼠的总体存活天数最长，只注射生理盐水的阳性对照组裸鼠的总体存活天数最短。
图11显示了各组裸鼠的体重变化曲线，B至F图分别是正常组、生理盐水组、游离药物组、固定药物非加热处理组、固定药物加热处理组的体重变化曲线图。给药时间分别在第20d、23d、27d、30d，几乎所有组的裸鼠的体重都从第一次给药后(第20天)呈现明显下降趋势，阳性对照组(接种HepG2细胞，只注射生理盐水)的裸鼠体重下降最为明显；其次是共固定药物并给予加热处理组裸鼠体重下降比较明显。
图12显示的是裸鼠处死前(第36天)从A、B、C、D、E组各取一只具有代表性裸鼠拍摄的图片及其对应的肿瘤图片，左图中箭头所指位置为瘤的生长部位，右图中显示的是与左图相对应的裸鼠的瘤。从图中可以看出各组裸鼠的肿瘤均呈不规则状，界限清楚，无明显周围组织和皮肤浸润。而且,B图生理盐水组的裸鼠的瘤平均体积最大(195.54 mm3±12.82mm3)，其次是D图(183.32mm3±20.64mm3)、C图(159.54mm3±19.05mm3)，E图共固定药物但不给予加热处理组裸鼠的瘤的平均体积最小(85.33mm3±14.26mm3)。说明共固定药物并给予加热处理组裸鼠在经过药物治疗后，瘤的体积得到明显下降。
图13显示的是B、C、D、E组裸鼠从第一次给药时开始计算的瘤体积大小随时间的变化曲线。如图中所示，裸鼠给药时间为第0 天、第3天 、第7天 、第10天，其中第0天时各组裸鼠移植瘤的平均体积约100mm3。生理盐水组给药量为(0.9% NaCl，0.1ml/d，共四次)，其他组包括游离和固定药物组参考临床上阿霉素给药标准，给药量为(28.35kg/m2，0.1ml/d，共四次)。四次给药结束后，注射共固定药物并给予加热处理组裸鼠的移植瘤体积明显下降，而空白组、游离组和没有给予加热处理的共固定药物组的移植瘤仍处于增长趋势。裸鼠在给药前和给药两周后，在生理盐水组、游离药物组、共固定药物但不给予加热处理组、共固定药物且给予加热处理组中各取两只裸鼠从尾部取血并进行血清检测，比较给药前后裸鼠体内血小板、白细胞、红细胞数量的变化。
图14所示，给药前后血小板、白细胞、红细胞数量均无明显差异，表明各实验组药物对裸鼠都有一定的骨髓抑制，但都没有明显的毒副作用。给药两周后，处死小鼠，解剖取出裸鼠的肿瘤组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋、切片，进行HE染色，光学显微镜下观察肿瘤组织病理改变。Fig 15显示了各组裸鼠的肿瘤组织HE染色的结果，A1、B1、C1、D1是光学显微镜下100倍所观察到的结果，A2、B2、C2、D2是400倍数下观察到的结果。结果显示生理盐水组有很明显的癌巢(A1)和完整的HepG2肝癌细胞，有些甚至是巨核癌细胞。游离组的癌巢并不明显(B1)且部分癌细胞呈现出坏死和凋亡(B2)。固定药物非加热处理组癌巢跟生理盐水组相似，有明显的癌巢(C1)及较多正常的HEpG2肝癌细胞(C2)。而固定药物并给予加热处理组却有很多的坏死和凋亡，显示固定药物并给予加热处理组对HepG2肿瘤的抑制作用最明显。
通过上述实验可知，本发明以磁性水凝胶为载体的肿瘤靶向纳米递药系统可以装载阿霉素并靶向运输至肿瘤细胞周围并进行有效磁热控制释放；以磁性水凝胶为载体的肿瘤靶向纳米递药系统(Fe3O4-OA/NIPA-AA/TNF-α/IFN-γ/FA/ DOX)对机体具有较小的毒副作用，并且通过肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ协同阿霉素于肿瘤细胞内外的共同作用机制，高效抑制肝癌细胞生长。
Claims (3)
1.一种肿瘤靶向磁性水凝胶纳米递药系统，其特征在于所述系统包括磁性水凝胶载体和在其表面接枝的肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ和靶向分子配体叶酸，以及吸附的阿霉素；所述磁性水凝胶载体是具有温度和pH敏感性的水凝胶接枝到油酸包裹的四氧化三铁纳米粒上而得；
其制备方法包括如下步骤：
（1）超顺磁性四氧化三铁纳米粒的合成及表面改性：称取FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O，加入超纯水，置于油浴锅内，通入氮气保护，60℃下搅拌30min；取NaOH加入超纯水，在60℃下搅拌使其充分溶解，再将溶解的NaOH加入到铁盐溶液中，反应10min后，升温至70℃，然后向其中加入HCl溶液至pH等于3，最后加入油酸，搅拌3h后，在磁铁辅助下用无水乙醇洗涤，再用丙酮洗涤，得到油酸包裹的四氧化三铁纳米粒，将其真空抽干备用；
（2）通过微乳液聚合法合成水凝胶：取异丙基丙烯酰胺、丙烯酸、亚甲基双丙烯酸酰胺和十二烷基磺酸钠，溶于超纯水中，室温下在N2氛围保护下搅拌20min；向溶液中加入过硫酸钾于70℃下聚合反应4h，反应结束后，冷却至室温，用透析袋除去未反应完的单体，透析两周，每两个小时更换一次新鲜的超纯水，最后用真空管冷冻干燥机将其冻干储存待用；
（3）光活性水凝胶的制备：称取水凝胶，溶于pH=7.4的PBS缓冲液中，吸取1ml水凝胶溶液加入到4ml含有59.19mg、pH=7.4，体积比为4：1的叠氮苯胺盐酸盐的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，在冰浴条件下搅拌反应48h，将混合溶液转移至透析袋纯化叠氮苯基衍生物，透析三天后取出溶液用真空冷冻干燥机冻干，冻干后，向其中加入PBS溶液溶解；
（4）磁性水凝胶载体的合成：避光条件下，将光活性水凝胶溶于PBS缓冲溶液中，加入油酸改性后的四氧化三铁纳米粒，混合均匀，并用超声波清洗器分散后转移至培养皿中，振荡条件下，于125W紫外灯下10cm处照射20min；
（5）接枝肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ和靶向分子配体叶酸：分别将50μg的IFN-γ、TNF-α、FA加入25ml含768μg N-琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，在4℃的条件下搅拌反应48h，合成结束后，分别用超滤离心管在4000rpm/min的转速下，离心30min以纯化叠氮苯基衍生物，冷冻干燥备用。
2.权利要求1所述肿瘤靶向磁性纳米递药系统在制备治疗癌症的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述肿瘤靶向磁性纳米递药系统的应用，其特征在于将所述肿瘤靶向磁性纳米递药系统溶于PBS缓冲液中，加入阿霉素溶液溶解，冰浴搅拌三天，使肿瘤靶向磁性纳米递药系统充分吸附阿霉素，用于治疗癌症。
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