CN104225599B - 共载化疗和基因药物的非对称磁介孔二氧化硅棒及其在肿瘤诊治方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及纳米药物载体领域，具体的说涉及一种共载化疗和基因药物的非对称磁介孔二氧化硅棒及其在肿瘤诊治方面的应用，采用球状磁性铁氧体纳米粒子、正硅酸乙酯，通过溶胶凝胶法制备出非对称磁介孔二氧化硅棒，并对该非对称磁介孔二氧化硅棒上进行表面功能化修饰，依次装载化疗药物、包覆阳性高分子聚合物、担载基因药物得到目标产品；通过介孔表面功能化连接化疗药物，并赋予其pH响应释药的特点，同时增加复合材料的生物相容性和延长体内循环时间，并以静电吸附形式担载基因，并将此复合材料静脉注射到活体，运用其纳米粒子的体内被动靶向、基因导向和PH响应释药，抗多药耐药基因和化疗药物协同性，体外磁靶向，核磁成像等多种技术用于恶性肿瘤的诊断和治疗。
Description
技术领域
本发明涉及纳米药物载体领域，具体的说涉及一种共载化疗和基因药物的非对称磁介孔二氧化硅棒及其在肿瘤诊治方面的应用，该非对称磁介孔二氧化硅棒具备高磁性能和高载药量，能够将化疗药物与肿瘤多药耐药基因共载于一种输送体，并有序可控释放药物，集磁热、核磁成像等诊治功能为一体。
背景技术
目前恶性肿瘤已经成为严重威胁人类健康的首要疾病。肿瘤化疗作为主要的三大治疗手段之一，由于靶向性差和多药耐药逐渐限制了其临床应用。传统的化疗靶向性差和毒副作用大，且治疗后肿瘤的多药耐药成为了患者死亡的主要原因。靶向性差是由于小分子化疗药物进入体循环后分布于全身，不能靶向富集于肿瘤部位，从而导致机体正常细胞或组织受损，产生毒性或不良反应。因此，提高抗肿瘤药物的靶向性、降低其对正常组织、器官的毒性，逆转肿瘤的多药耐药，开发多模式的肿瘤诊治策略具有重大的理论和现实意义，并将产生巨大的社会和经济效益。
磁性纳米药物输送体是近几年发展起来的一种复合型靶向药物传输系统，由可作为核磁成像造影剂的磁性纳米粒子和作为药物载体的介孔二氧化硅组成，因其独特的性质已成功的用于肿瘤诊断和治疗。磁介孔二氧化硅棒（Fe3O4-MSN），具备生物相容性好、细胞内吞率高、肿瘤细胞内pH响应性释药、增强核磁成像效果、毒性低等特点，因此，通过调控磁靶向纳米药物输送体粒径和外加磁场可达到被动靶向和磁靶向肿瘤细胞作用，另外，铁和二氧化硅材料生物相容性好，是化疗药物、基因药物（DNA，RNA，miRNA，dsRNA）、蛋白质、生物素、染料和量子点等优良的载体，因此，磁介孔二氧化硅棒是理想的药物载体。
尽管近年来传统的核壳状磁介孔二氧化硅棒在肿瘤诊断和治疗中取得了不错的效果，但是因为二氧化硅的包裹导致磁性能减弱和载药量降低限制了核壳磁介孔二氧化硅棒的生物应用。因此，急需开发一种具备高磁性能和载药量的磁介孔二氧化硅棒应用于肿瘤的诊断和治疗。此外，肿瘤的诊治呈现多元化趋势，而将化疗药物与肿瘤多药耐药基因共载于一种输送体并有序可控释放药物，集磁热、核磁成像等诊治功能为一体的纳米制剂还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的共载化疗和基因药物的非对称磁介孔二氧化硅棒纳米药物载体，该载体具备载药容量大、生物相容性好、细胞内吞率高、肿瘤细胞内pH响应性释药、磁性能高、增强核磁成像效果、毒性低等特点，可共载化疗药物和基因，在肿瘤细胞内有序释放，降低传统化疗的毒副作用，逆转肿瘤的多药耐药，同时将这种非对称磁介孔二氧化硅棒纳米药物载体用于肿瘤的诊治，提供一种集化疗、基因治疗、磁靶向、磁热、核磁成像等多功能为一体的诊断和治疗肿瘤的新体系。
本发明的目的是这样实现的：采用碱水解法制备球状磁性铁氧体纳米粒子，以阳离子表面活性剂和正硅酸乙酯制备出非对称磁介孔二氧化硅棒，通过介孔表面功能化连接化疗药物，并赋予其pH响应释药的特点。然后在非对称磁介孔二氧化硅棒表面包覆阳性高分子聚合物，增加复合材料的生物相容性和延长体内循环时间，并以静电吸附形式担载基因，并将此复合材料静脉注射到活体，运用其纳米粒子的体内被动靶向、基因导向和PH响应释药，抗多药耐药基因和化疗药物协同性，体外磁靶向，核磁成像等多种技术用于恶性肿瘤的诊断和治疗。
该共载化疗和基因药物的非对称磁介孔二氧化硅棒是采用球状磁性铁氧体纳米粒子、正硅酸乙酯，通过溶胶凝胶法制备出非对称磁介孔二氧化硅棒，并对该非对称磁介孔二氧化硅棒上进行表面功能化修饰，依次装载化疗药物、包覆阳性高分子聚合物、担载基因药物得到目标产品；所述目标产品棒长100-1000nm，棒宽50-200nm，比表面积为500-1000m2/g，介孔的孔径为2-20nm。饱和磁场强度为50-100emu/g，磁响应能力为：对10mL微粒的水溶液，在0.2T的外加磁场下，微粒富集时间在30秒以内；是以磁性铁氧体纳米粒子为头，介孔二氧化硅为棒的球-棒状非对称纳米载体。
具体制备步骤如下：
1）球状磁性铁氧体纳米粒子的制备：在二甘醇(DEG)溶液中，加入表面包覆材料聚丙烯酸（PAA）和三氯化铁（FeCl3），在氮气的保护下搅拌加热至220℃。30分钟后加入80℃的氢氧化钠（NaOH）的二甘醇溶液，搅拌反应1小时；将反应产物磁吸分离、水洗、干燥，制备出球状磁性铁氧体纳米粒子（Fe3O4）。反应物的用量为：按每34mL二甘醇中加入聚丙烯酸0.576g（8mmol），三氯化铁0.13g(0.8mmol）；氢氧化钠的二甘醇溶液的浓度为0.1g/mL,用量为1.9～5.7mL；搅拌速度为100～1000rpm。
2）非对称磁介孔二氧化硅棒制备：将步骤1)制备得到的球状磁性铁氧体纳米粒子（Fe3O4）分散在去离子水中，加入阳离子表面活性剂，超声40分钟后加入氨水，搅拌加热至40℃。缓慢滴加正硅酸乙酯（TEOS）,搅拌反应30分钟；将反应产物磁吸分离、水洗、干燥，制备出非对称磁介孔二氧化硅棒。反应物的用量为：反应物摩尔比[TEOSX10-7]/[Fe3O4]=2:1～7:1；阳离子表面活性剂的浓度为10-2～102mg/mL,氨水的用量为0.1～1mL，搅拌速度为100～1000rpm。
所述的阳离子表面活性剂是烷基季铵盐类CXTAB（X=12～18）中一种或几种混合。
3）非对称磁介孔二氧化硅棒的表面功能化处理：将非对称磁介孔二氧化硅棒在反应溶剂中超声分散后，加入功能化有机硅源，搅拌均匀后加入去离子水、盐酸或者氨水；搅拌反应，将反应产物磁吸分离、水洗、干燥后得到表面功能化的非对称磁介孔二氧化硅棒。所述的反应溶剂选自乙醇、乙二醇、异丙醇、甲苯中一种或大于一种以上。
所述的功能化有机硅源选自APS、APTS、AEAPS、APTES、GPTES、APDES、APTMS中一种或大于一种以上。
所述的搅拌反应温度为15～250℃，反应时间为1～96小时，搅拌速度为100～1000rpm。
4）装载化疗药物：将步骤3）中经表面功能化的非对称磁介孔二氧化硅棒分散在一定浓度的细胞毒性抗肿瘤药物的溶液中，搅拌反应，将反应产物磁吸分离、水洗、低温真空干燥后得到担载药物的非对称磁介孔二氧化硅棒。小分子抗肿瘤药物的浓度为0.1M～饱和浓度，溶剂为水、甘油、DMSO和异丙醇中的一种或大于一种以上，时间为2～96小时，低温干燥温度为-50℃～0℃。通过介孔表面与小分子抗肿瘤药物将功能基团的偶联赋予其pH响应释药的特点。
所述的抗肿瘤小分子化学药物选自阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、硫酸长春新碱、氟脲嘧啶、甲氨蝶呤、米托蒽醌、环磷腺苷、环磷酰胺、硫酸培洛霉素、卡介、亚胺醌、盐酸阿柔比星、卡莫丝汀、替莫唑胺、洛莫司汀、卡莫氟、替加氟、放线菌素D、丝裂霉素、安吖啶、氨磷汀、顺铂、阿拉瑞林、氨鲁米特、盐酸氮芥、索拉非尼、尼洛替尼、达沙替尼中的一种或大于一种以上;或选择上述抗肿瘤药物的衍生物中一种或大于一种以上；或选自上述抗肿瘤药物与上述抗肿瘤药物的衍生物中一种或大于一种以上的混合物。
5）担载基因：将表面功能化的非对称磁介孔二氧化硅棒在反应溶剂中超声分散后，加入阳性高分子聚合物，搅拌均匀后加入去离子水、盐酸或者氨水；搅拌反应温度为15～250℃，搅拌速度为100～1000rpm。反应时间为1～96小时，将反应产物磁吸分离、水洗、干燥后得到阳性高分子聚合物包覆的非对称磁介孔二氧化硅棒。将阳性高分子聚合物包覆的非对称磁介孔二氧化硅棒分散在一定浓度的抗肿瘤基因药物的水溶液中，搅拌反应，将反应产物磁吸分离、水洗、低温真空干燥后得到担载药物的非对称磁介孔二氧化硅棒。抗肿瘤基因药物的浓度为0.1M～饱和浓度，时间为2～96小时，低温干燥温度为-50℃～0℃。
所述的阳性高分子聚合物包括聚醚酰亚胺、聚酰胺-胺树形高分子、脱乙酰壳聚糖、透明质酸、阳离子多肽、明胶、阳离子聚酯、阳离子聚磷酸酯、聚乙烯基吡啶盐、聚（二甲氨基）乙基甲基丙烯酸酯的一种或大于一种以上；或选择上述阳性高分子聚合物的衍生物中一种或大于一种以上；或选自上述阳性高分子聚合物与上述阳性高分子聚合物的衍生物中一种或大于一种以上的混合物。
所述的抗肿瘤基因药物包括肿瘤治疗用的DNA、siRNA、microRNA中的一种或大于一种以上的混合物。
针对本发明的共载化疗和基因药物的非对称非对称磁介孔二氧化硅棒，进行如下鉴定和功能确认：
(1)表征、性能鉴定：研究生理环境对新组装体系的尺寸、分散度和结构稳定性的影响，通过红外、动态光散射、透射电镜，氮气吸附-脱附曲线表，磁滞回线等方法表征其分子结构、磁学性质及其他理化性质。
(2)体外载药和释药：取一定量的复合材料与含化疗药物的溶液混合,室温下搅拌24h，离心后收集上清液。通过紫外可见光吸收光谱法检测上清液中化疗药物的含量，计算载药率和包封率。体外释药：将复合材料分散于去离子水，装入的透析袋中，然后放入缓冲溶液中透析。缓冲液温度为25℃，pH值分别为4.2，5.6，6.5，7.4。每间隔2h取少量缓冲溶液进行紫外可见吸收光谱法测定，测定后再将取出的少量缓冲液倒回至释放体系。测定24h内不同时间点、不同pH值环境缓冲液吸光度值，计算释药率，绘制释药曲线。
(3)体内抑肿瘤率评价：Nu/nu BAlB/c雄性小鼠背部接种细胞株，待肿瘤大小为60mm3-100mm3时开始给药，分组如下，待肿瘤大小为60mm3-100mm3时开始给药，每组10只动物，在d1、d8、d15和d22静脉给药4次。第30d处死动物，通过肿瘤生长容积曲线、肿瘤重量计算不同组别抑瘤率。
（4）体内核磁共振成像：选取d0，d1、d8、d15、d22和d30时间点，用氯胺酮和甲苯噻嗪复合麻醉剂麻醉小鼠。采用1.5T磁共振成像仪，选择多功能腕关节小线圈。快速自旋回波(FSE)序列，T1W I(TR400ms,TE11ms)，T2W I(R2000ms,TE91ms)，层厚2mm，层数7，视野(FOV)60mm，矩阵256×224，实时评价每组治疗肿瘤的效果。
本发明具有以下优点和积极效果;
1、本发明的共载化疗和基因药物的非对称磁介孔二氧化硅棒具备如下优点：①生物相容性：药物载体需采用生物相容性好，可降解，毒性小的材料，延长在血液中的循环时间，减少或避免单核-巨噬细胞系统的吞噬作用；②靶向性：载体能通过磁靶向至肿瘤细胞，提高药物的治疗效果，降低毒副作用；③细胞内可控释药：携带药物的载体进入细胞内，并通过pH响应或热响应、磁响应等机制有效释放药物，在时间和空间上可调控；④协同治疗：一方面携带两种或两种以上药物时，药物间起协同或相加作用；另一方面利用磁热反应和化疗和基因治疗相结合，产生协同作用。⑤实时成像：通过核磁成像对治疗效果进行实时监测。
2、本发明的共载化疗和基因药物的非对称核壳磁介孔二氧化硅棒与传统的磁性能弱和载药量低的核壳磁介孔二氧化硅棒相比，具备载药容量大、生物相容性好、细胞内吞率高、肿瘤细胞内pH响应性释药、磁性能高、增强核磁成像效果、毒性低等优点，可共载化疗药物和基因，在肿瘤细胞内有序释放，降低传统化疗的毒副作用，逆转肿瘤的多药耐药。
3、本发明的共载化疗和基因药物的非对称核壳磁介孔二氧化硅棒可以担载化疗药物进行抗肿瘤治疗，降低了化疗药物的毒副作用，取得不错的效果。
4、本发明的共载化疗和基因药物的共载化疗和基因药物的非对称核壳磁介孔二氧化硅棒可以担载基因药物进行抗肿瘤治疗，提高了基因治疗的靶向性，取得不错的效果。
5、本发明的共载化疗和基因药物的非对称核壳磁介孔二氧化硅棒可以通过交变磁场的产热效应进行抗肿瘤治疗，提高了磁热治疗的效率，取得不错的效果。
6、本发明的共载化疗和基因药物的非对称核壳磁介孔二氧化硅棒可以通过核磁共振成像实时监测抗肿瘤效果，提高了核磁共振的成像效果。
7、本发明的共载化疗和基因药物的非对称核壳磁介孔二氧化硅棒可以同时提供一种集化疗、基因治疗、磁热、核磁成像等多功能为一体的诊断和治疗肿瘤的新体系。
附图说明
图1共载化疗和基因药物的非对称磁介孔二氧化硅棒的合成图。
图2共载化疗和基因药物的非对称磁介孔二氧化硅棒磁滞回线图。
图3共载化疗和基因药物的非对称磁介孔二氧化硅释药图。
图4共载化疗和基因药物的非对称磁介孔二氧化硅体内抑制肿瘤图。
图5共载化疗和基因药物的非对称磁介孔二氧化硅核磁成像图。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明，而并非用于限制本发明的范围。
实施例1：
（1）在34mL二甘醇(DEG)溶液中，加入0.576g PAA和0.13g FeCl3，在氮气的保护下搅拌加热至250℃，20分钟后加入2.8mL80℃的氢氧化钠（NaOH）的二甘醇溶液(0.1g/mL)，搅拌反应1小时后将反应产物磁吸分离、水洗、干燥，制备出球状磁性铁氧体纳米粒子（Fe3O4）。
（2）将Fe3O4分散在去离子水中，加入50mg CTAB，超声40分钟后加入0.5mL氨水，搅拌加热至40℃，缓慢滴加15uL TEOS，搅拌反应20分钟；将反应产物分离纯化，得到非对称磁介孔二氧化硅棒。将其分散在100mL0.5%的硝酸铵乙醇溶液中，搅拌加热回流三次以除去CTAB。得到球状磁性铁氧体纳米粒子直径为100nm，介孔二氧化硅棒的棒长200nm，棒宽100nm，比表面积为675m2/g，介孔的孔径为2nm的非对称磁介孔二氧化硅棒(Fe3O4-MSN)。
（3）将30mg非对称磁介孔二氧化硅棒溶于30ml乙醇中超声20min，加入1mL APS搅拌过夜，105℃回流3-4h，磁吸分离后乙醇洗涤。将产物溶于50mL DMF中，加入0.5g丁二酸酐搅拌24h。磁吸分离后乙醇洗涤，干燥后得到羧基修饰的非对称磁介孔二氧化硅棒。将羧基修饰的非对称磁介孔二氧化硅棒溶于10mL0.5mg/mL阿霉素的PBS溶液中，搅拌24小时后磁吸分离水洗，得到载阿霉素的非对称磁介孔二氧化硅棒。
（4）将载阿霉素的非对称磁介孔二氧化硅棒溶于10mL PBS溶液中，加入100mg EDC和50mg NHS，搅拌反应30分钟后加入25mg聚酰胺-胺树形高分子（G2PAMAM）,搅拌反应4小时，磁吸分离水洗得到G2PAMAM包裹的担载阿霉素的非对称磁介孔二氧化硅棒。将G2PAMAM包裹的担载阿霉素的非对称磁介孔二氧化硅棒。溶于10mL PBS溶液中，加入10uM siRNA，搅拌24h后，磁吸分离水洗冷冻干燥得到共载阿霉素和P-gp siRNA的非对称磁介孔二氧化硅棒(Fe3O4-MSN/DOX/G2-siRNA)。
（5）如图1和2所示，经过透射电镜和磁滞回线表征共载阿霉素和P-gp siRNA的非对称磁介孔二氧化硅棒(Fe3O4-MSN/DOX/G2-siRNA)，由图可见该共载阿霉素和P-gp siRNA的非对称磁介孔二氧化硅棒(Fe3O4-MSN/DOX/G2-siRNA)载体为球-棒状纳米粒子，其棒长200nm，棒宽100nm，磁性能为60emu/g。10mg上述制备得到的共载阿霉素和P-gp siRNA的非对称磁介孔二氧化硅棒(Fe3O4-MSN/DOX/G2-siRNA)置于透析袋中，加入pH=5.5或7.4的缓冲溶液搅拌，120小时内药物在酸性条件（pH=5.5）下释放率约为50%，而在中性条件（pH=7.4）下释放率小于5%，该载体的载药量约为30%。
实施例2：
（1）在50mL二甘醇(DEG)溶液中，加入0.8g PAA和0.2g FeCl3，在氮气的保护下搅拌加热至250℃。20分钟后加入4.0mL80℃的氢氧化钠（NaOH）的二甘醇溶液(0.1g/mL)，搅拌反应1小时后将反应产物磁吸分离、水洗、干燥，制备出球状磁性铁氧体纳米粒子（Fe3O4）。
（2）将Fe3O4分散在去离子水中，加入50mg CTAB，超声40分钟后加入1mL氨水，搅拌加热至40℃。缓慢滴加25uL TEOS,搅拌反应20分钟；将反应产物分离纯化，得到非对称磁介孔二氧化硅棒。将其分散在100mL0.5%的硝酸铵乙醇溶液中，搅拌加热回流三次以除去CTAB。得到球状磁性铁氧体纳米粒子直径为100nm，介孔二氧化硅棒的棒长300nm，棒宽100nm，比表面积为800m2/g，介孔的孔径为2nm的非对称磁介孔二氧化硅棒(Fe3O4-MSN)。
（3）将30mg非对称磁介孔二氧化硅棒溶于30ml乙醇中超声20min，加入1mL APTS搅拌过夜，105℃回流3-4h，磁吸分离后乙醇洗涤。将产物溶于50mL DMF中，加入0.5g丁二酸酐搅拌24h。磁吸分离后乙醇洗涤，干燥后得到羧基修饰的非对称磁介孔二氧化硅棒。将羧基修饰的非对称磁介孔二氧化硅棒溶于10mL0.3mg/mL长春新碱的PBS溶液中，搅拌24小时后磁吸分离水洗，得到载长春新碱的非对称磁介孔二氧化硅棒。
（4）将载长春新碱的非对称磁介孔二氧化硅棒溶于10mLPBS溶液中，加入100mgEDC和50mg NHS，搅拌反应30分钟后加入40mg聚醚酰亚胺（PEI）,搅拌反应4小时，磁吸分离水洗得到PEI包裹的担载长春新碱的非对称磁介孔二氧化硅棒。将PEI包裹的担载长春新碱的非对称磁介孔二氧化硅棒溶于10mL PBS溶液中，加入20uM mir-21，搅拌24h后，磁吸分离水洗冷冻干燥得到共载聚醚酰亚胺和miRNA的非对称磁介孔二氧化硅棒(Fe3O4-MSN/VCR/PEI-miRNA)。
（5）将10mg上述制备得到的共载聚醚酰亚胺和miRNA的非对称磁介孔二氧化硅棒(Fe3O4-MSN/VCR/PEI-miRNA)。置于透析袋中，加入pH=5.5或7.4的缓冲溶液搅拌，如图3所示，120小时内药物在酸性条件（pH=5.5）下释放率约为60%，而在中性条件（pH=7.4）下释放率小于5%，该载体的载药量为40%。
实施例3：
（1）在50mL二甘醇(DEG)溶液中，加入0.6g PAA和0.15g FeCl3，在氮气的保护下搅拌加热至250℃。20分钟后加入3.0mL80℃的氢氧化钠（NaOH）的二甘醇溶液(0.1g/mL)，搅拌反应1小时后将反应产物磁吸分离、水洗、干燥，制备出球状磁性铁氧体纳米粒子（Fe3O4）。
（2）将Fe3O4分散在去离子水中，加入40mg CTAB，超声40分钟后加入0.8mL氨水，搅拌加热至40℃。缓慢滴加50uL TEOS,搅拌反应20分钟；将反应产物分离纯化，得到非对称磁介孔二氧化硅棒。将其分散在100mL0.5%的硝酸铵乙醇溶液中，搅拌加热回流三次以除去CTAB。得到球状磁性铁氧体纳米粒子直径为100nm，介孔二氧化硅棒的棒长400nm，棒宽150nm，比表面积为1000m2/g，介孔的孔径为2nm的非对称磁介孔二氧化硅棒(Fe3O4-MSN)。
（3）将30mg非对称磁介孔二氧化硅棒溶于30ml乙醇中超声20min，加入1mL APTMS搅拌过夜，105℃回流3-4h，磁吸分离后乙醇洗涤。将产物溶于50mL DMF中，加入0.5g丁二酸酐搅拌24h。磁吸分离后乙醇洗涤，干燥后得到羧基修饰的非对称磁介孔二氧化硅棒。将羧基修饰的非对称磁介孔二氧化硅棒溶于10mL0.1mg/mL多西紫杉醇的PBS溶液中，搅拌24小时后磁吸分离水洗，得到载多西紫杉醇的非对称磁介孔二氧化硅棒。
（4）将载多西紫杉醇的非对称磁介孔二氧化硅棒溶于10mLPBS溶液中，加入100mgEDC和50mg NHS，搅拌反应30分钟后加入30mg功能化透明质酸（HA-ADH）,搅拌反应4小时，磁吸分离水洗得到HA包裹的担载多西紫杉醇的非对称磁介孔二氧化硅棒。将HA包裹的担载多西紫杉醇的非对称磁介孔二氧化硅棒溶于10mL PBS溶液中，加入10uM siRNA，搅拌24h后，磁吸分离水洗冷冻干燥得到共载多西紫杉醇和Bcl-2siRNA的非对称磁介孔二氧化硅棒(Fe3O4-MSN/TAX/HA-siRNA)。
（5）将10mg上述制备得到的共载多西紫杉醇和Bcl-2siRNA的非对称磁介孔二氧化硅棒(Fe3O4-MSN/TAX/HA-siRNA)置于透析袋中，加入pH=5.5或7.4的缓冲溶液搅拌，120小时内药物在酸性条件（pH=5.5）下释放率约为75%，而在中性条件（pH=7.4）下释放率小于5%，该载体的载药量为40%。
实施例4：采用实施例1的共载阿霉素和P-gp siRNA的非对称磁介孔二氧化硅棒(Fe3O4-MSN/DOX/G2-siRNA)治疗耐药乳腺癌Nu/nu BAlB/c雌性小鼠模型。Nu/nu BAlB/c雌性小鼠背部接种耐阿霉素MCF-7/DOX细胞株，待肿瘤大小为60mm3-100mm3时开始给药，分组如下：
①Fe3O4-MSN/DOX/G2-siRNA
②Fe3O4-MSN组
③siRNA组
④Dox对照组
⑤生理盐水组
每组10只动物，在d1、d8、d15和d22静脉给药4次。第30d处死动物，通过肿瘤生长容积曲线、肿瘤重量计算得到Fe3O4-MSN/DOX/G2-siRNA的抑瘤率为70%，高于siRNA和Dox组的10%和20%。
实施例5：采用实施例2的共载长春新碱和miRNA-21的非对称磁介孔二氧化硅棒(Fe3O4-MSN/VCR/PEI-miRNA)治疗耐药肝癌Nu/nu BAlB/c雄性小鼠模型。Nu/nu BAlB/c雄性小鼠背部接种耐长春新碱HepG2/VCR细胞株，待肿瘤大小为60mm3-100mm3时开始给药，分组如下：
①Fe3O4-MSN/VCR/PEI-miRNA
②Fe3O4-MSN组
③miRNA组
④VCR对照组
⑤生理盐水组
每组10只动物，在d1、d8、d15和d22静脉给药4次。第30d处死动物，通过肿瘤生长容积曲线、肿瘤重量计算得到Fe3O4-MSN/VCR/PEI-miRNA的抑瘤率为60%，高于miRNA和VCR组的20%和25%。
实施例6：采用实施例3的共载多西紫杉醇和bcl-2siRNA的非对称磁介孔二氧化硅棒(Fe3O4-MSN/TAX/HA-siRNA)治疗耐药肝癌Nu/nu BAlB/c雄性小鼠模型。Nu/nu BAlB/c雄性小鼠背部接种耐多西紫杉醇A549/TAX细胞株，待肿瘤大小为60mm3-100mm3时开始给药，分组如下：
①Fe3O4-MSN/TAX/HA-siRNA
②Fe3O4-MSN组
③siRNA组
④TAX对照组
⑤生理盐水组
每组10只动物，在d1、d8、d15和d22静脉给药4次。第30d处死动物，如图4所示，通过肿瘤生长容积曲线、肿瘤重量计算得到Fe3O4-MSN/TAX/HA-siRNA的抑瘤率为80%，高于siRNA和TAX组的25%和30%。
实施例7：采用实例1的共载阿霉素和P-gp siRNA的非对称磁介孔二氧化硅棒(Fe3O4-MSN/DOX/G2-siRNA)进行荷瘤小鼠的核磁成像检测。采用1.5T磁共振成像仪，选择多功能腕关节小线圈。快速自旋回波(FSE)序列，T1W I(TR400ms,TE11ms)，T2W I(R2000ms,TE91ms)，层厚2mm，层数7，视野(FOV)60mm，矩阵256×224。如果5所示，结果显示给药后较给药前肿瘤区域的T2信号明显增强，取得了良好的核磁成像增强效果。
实施例8：采用实例1的共载阿霉素和P-gp siRNA的非对称磁介孔二氧化硅棒(Fe3O4-MSN/DOX/G2-siRNA)进行荷瘤小鼠化疗、基因治疗和热疗三位一体的治疗模式。Nu/nu BAlB/c雌性小鼠背部接种耐阿霉素MCF-7/DOX细胞株，待肿瘤大小为60mm3-100mm3时开始给药，分组如下：
①Fe3O4-MSN/DOX/G2-siRNA+磁热
②Fe3O4-MSN/DOX
③Fe3O4-MSN/G2-siRNA
④Fe3O4-MSN+磁热
⑤DOX
⑥Fe3O4-MSN组
⑦生理盐水组
每组10只动物，在d1、d8、d15和d22静脉给药4次，加磁热组每次给药后利用交变磁场发生仪器在肿瘤部位进行一次磁热治疗。第30d处死动物，通过肿瘤生长容积曲线、肿瘤重量计算得到Fe3O4-MSN/DOX/G2-siRNA+磁热的抑瘤率为90%，高于其他组别。
Claims (8)
1.一种共载化疗和基因药物的非对称磁介孔二氧化硅棒，其特征在于：它是采用球状磁性铁氧体纳米粒子、正硅酸乙酯，通过溶胶凝胶法制备出非对称磁介孔二氧化硅棒，并对该非对称磁介孔二氧化硅棒上进行表面功能化修饰，依次装载化疗药物、包覆阳性高分子聚合物、担载基因药物得到目标产品；所述目标产品棒长100-1000nm，棒宽50-200nm，比表面积为500-1000m2/g，介孔的孔径为2-20nm，饱和磁场强度为50-100emu/g，磁响应能力为：对10mL微粒的水溶液，在0.2T的外加磁场下，微粒富集时间在30秒以内；是以磁性铁氧体纳米粒子为头，介孔二氧化硅为棒的球-棒状非对称纳米载体。
2.根据权利要求1所述的一种共载化疗和基因药物的非对称磁介孔二氧化硅棒的制备方法，其特征在于：该方法的具体步骤如下：
1)球状磁性铁氧体纳米粒子的制备：在二甘醇溶液中，加入表面包覆材料聚丙烯酸和三氯化铁，在氮气的保护下搅拌加热至220℃，30分钟后加入80℃的氢氧化钠的二甘醇溶液，搅拌反应1小时；将反应产物磁吸分离、水洗、干燥，制备出球状磁性铁氧体纳米粒子Fe3O4，反应物的用量为：按每34mL二甘醇中加入聚丙烯酸0.576g，三氯化铁0.13g；氢氧化钠的二甘醇溶液的浓度为0.1g/mL,用量为1.9～5.7mL；搅拌速度为100～1000rpm；
2)非对称磁介孔二氧化硅棒制备：将步骤1)制备得到的球状磁性铁氧体纳米粒子Fe3O4分散在去离子水中，加入阳离子表面活性剂，超声40分钟后加入氨水，搅拌加热至40℃，缓慢滴加正硅酸乙酯TEOS，搅拌反应30分钟；将反应产物磁吸分离、水洗、干燥，制备出非对称磁介孔二氧化硅棒，反应物的用量为：反应物摩尔比TEOS×10-7/Fe3O4＝2:1～7:1；阳离子表面活性剂的浓度为10-2～102mg/mL,氨水的用量为0.1～1mL，搅拌速度为100～1000rpm；
3)非对称磁介孔二氧化硅棒的表面功能化处理：将非对称磁介孔二氧化硅棒在反应溶剂中超声分散后，加入功能化有机硅源，搅拌均匀后加入去离子水、盐酸或者氨水；搅拌反应，将反应产物磁吸分离、水洗、干燥后得到表面功能化的非对称磁介孔二氧化硅棒；
4)装载化疗药物：将步骤3)中经表面功能化的非对称磁介孔二氧化硅棒分散在一定浓度的细胞毒性抗肿瘤药物的溶液中，搅拌反应，将反应产物磁吸分 离、水洗、低温真空干燥后得到担载药物的非对称磁介孔二氧化硅棒，小分子抗肿瘤药物的浓度为0.1M～饱和浓度，溶剂为水、甘油、DMSO和异丙醇中的一种或大于一种以上，时间为2～96小时，低温干燥温度为-50℃～0℃，通过介孔表面的功能化修饰，使得小分子抗肿瘤药物与非对称磁介孔二氧化硅棒结合，赋予非对称磁介孔二氧化硅棒pH响应释药的特点；
5)担载基因：将表面功能化的非对称磁介孔二氧化硅棒在反应溶剂中超声分散后，加入阳性高分子聚合物，搅拌均匀后加入去离子水、盐酸或者氨水；搅拌反应温度为15～250℃，搅拌速度为100～1000rpm，反应时间为1～96小时，将反应产物磁吸分离、水洗、干燥后得到阳性高分子聚合物包覆的非对称磁介孔二氧化硅棒；将阳性高分子聚合物包覆的非对称磁介孔二氧化硅棒分散在一定浓度的抗肿瘤基因药物的水溶液中，搅拌反应，将反应产物磁吸分离、水洗、低温真空干燥后得到担载药物的非对称磁介孔二氧化硅棒，抗肿瘤基因药物的浓度为0.1M～饱和浓度，时间为2～96小时，低温干燥温度为-50℃～0℃。
3.根据权利要求2所述的一种共载化疗和基因药物的非对称磁介孔二氧化硅棒的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述的阳离子表面活性剂是三甲基十六烷基溴化氨CTAB。
4.根据权利要求2所述的一种共载化疗和基因药物的非对称磁介孔二氧化硅棒的制备方法，其特征在于：步骤3)中所述的反应溶剂选自乙醇、乙二醇、异丙醇、甲苯中一种或大于一种以上；所述的功能化有机硅源选自APS、APTS、AEAPS、APTES、GPTES、APDES、APTMS中一种或大于一种以上；所述的搅拌反应温度为15～250℃，反应时间为1～96小时，搅拌速度为100～1000rpm。
5.根据权利要求2所述的一种共载化疗和基因药物的非对称磁介孔二氧化硅棒的制备方法，其特征在于：步骤4)中所述的抗肿瘤小分子化学药物选自阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、硫酸长春新碱、氟脲嘧啶、甲氨蝶呤、米托蒽醌、环磷腺苷、环磷酰胺、硫酸培洛霉素、卡介、亚胺醌、盐酸阿柔比星、卡莫丝汀、替莫唑胺、洛莫司汀、卡莫氟、替加氟、放线菌素D、丝裂霉素、安吖啶、氨磷汀、顺铂、阿拉瑞林、氨鲁米特、盐酸氮芥、索拉非尼、尼洛替尼、达沙替尼中的一种或大于一种以上的混合物。
6.根据权利要求2所述的一种共载化疗和基因药物的非对称磁介孔二氧化硅棒的制备方法，其特征在于：步骤5)中所述的阳性高分子聚合物选自聚醚酰 亚胺、聚酰胺-胺树形高分子、脱乙酰壳聚糖、透明质酸、阳离子多肽、明胶、阳离子聚酯、阳离子聚磷酸酯、聚乙烯基吡啶盐、聚丙烯酸二甲氨基乙酯的一种或大于一种以上的混合物；所述的抗肿瘤基因药物选自肿瘤治疗用的DNA、siRNA、microRNA中的一种或大于一种以上的混合物。
7.根据权利要求1所述的一种共载化疗和基因药物的非对称磁介孔二氧化硅棒应用于制备诊治肿瘤共载化疗药物或/和基因药物的载体。
8.根据权利要求1所述的一种共载化疗和基因药物的非对称磁介孔二氧化硅棒应用于制备集化疗、基因治疗、磁靶向、磁热和核磁成像多功能为一体的肿瘤诊治药物的载体。
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