CN102226203B - 双chU6启动子双shRNA表达质粒的构建及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及双chU6启动子双shRNA表达质粒的构建及应用，属于生物制药领域。构建鸡U6启动子（chU6），设计两个靶向分别针对IBDVVP1和VP2基因的小发夹RNA（shRNA）：VP1-shRNA2550和VP2-shRNA392。构建表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA，转染鸡胚成纤维细胞（CEF），接种IBDV，可抑制病毒复制。将表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA与IBDV混合，接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，可保护鸡胚免受IBDV感染。本发明构建的双chU6启动子双shRNA表达质粒是一种新型IBDV防治制剂，具有良好的实用价值和推广前景。
Description
一、技术领域
本发明涉及双chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA的构建及应用，属于生物制药领域。
二、背景技术
传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease, IBD）是一种高度危害养鸡业的传染病，它是由传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus, IBDV）引起，以侵害雏鸡淋巴组织，特别是中枢免疫器官—法氏囊为主要特征，被称为世界三大禽病之一。IBDV感染后，会引起鸡的免疫抑制，使鸡的免疫能力下降、疫苗免疫失败、导致易感其它疾病。长期以来，对IBDV采取了免疫预防为主的综合性防控措施，该病的大规模流行已得到有效控制，但由于近期各地变异株和超强毒株 (vvIBDV) 的出现使该病的防控难度加大，IBD免疫预防失败已成为各区域禽病防控中的重要问题[王永山 等. 近期引起免疫失败的传染性法氏囊病病毒VP2基因的分子特征. 中国兽医科学，2008, 38(12): 1013-1019]。
目前，使用的常规弱毒疫苗和灭活疫苗，其安全性和制造工艺仍存在不足：为预防变异毒株而采用中强毒力活疫苗存在着较大的生物安全问题，因为在不同IBDV毒株之间潜在着基因重配的可能，给该病的防控带来隐患；灭活疫苗存在着抗原制备的困难；以VP2为靶基因的IBD基因工程疫苗，采用的表达系统包括：大肠杆菌、酵母、鸡痘病毒载体、杆状病毒表达载体、核酸疫苗以及多表位疫苗等，各有所长，仍需改进。因此，探索新的IBDV防控技术是十分必要的。
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。RNAi现象自发现以来，其研究领域从基因功能扩展到抗肿瘤和抗病毒，RNAi被认为是机体阻止外来病毒感染、保护细胞免受病毒入侵的一种细胞自我保护机制，以病毒基因和宿主细胞分子为靶点，引入外源的小干扰RNA（short interfering RNA，siRNA）或小发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）能显著抑制病毒的表达。RNAi作为一种抗病毒感染的新途径已成功地应用于多种病毒，显示出了良好的应用前景。
IBDV属双RNA病毒科双RNA病毒属，基因组包括大（A）小（B）两个片段。VP1是病毒的非结构蛋白，是由B片段编码的一种依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp），VP1与病毒RNA的复制和毒力有关。VP2是病毒的主要结构蛋白之一，由A片段编码的多聚蛋白加工而成，位于病毒粒子的外表面，占总结构蛋白量的51%，既是病毒的主要结构蛋白，又是病毒的主要保护性抗原，与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异以及细胞凋亡的诱导等有关。因此，选择IBDV VP1和IBDV VP2基因为靶标，构建了一个同时靶向IBDV VP1和VP2基因的双chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA，既可以保证两个shRNA被同时高效转录，不受转录位置先后的影响；又可以同时敲除IBDV的两个重要基因，高效抑制的IBDV复制，是一种新型IBDV防治制剂，具有良好的实用价值和推广前景。
三、发明内容
技术问题
目前，使用的IBDV常规弱毒疫苗和灭活疫苗，其安全性和制造工艺仍存在不足：为预防变异毒株而采用中强毒力活疫苗存在着较大的生物安全问题，因为在不同IBDV毒株之间潜在着基因重配的可能，给该病的防控带来隐患；灭活疫苗存在着抗原制备的困难；以VP2为靶基因的IBD基因工程疫苗，采用的表达系统包括：大肠杆菌、酵母、鸡痘病毒载体、杆状病毒表达载体、核酸疫苗以及多表位疫苗等，各有所长，仍需改进。
siRNA因其合成价格昂贵、稳定性差、毒性大，而使其使用受到限制；shRNA表达载体则克服了上述缺点，它具有稳定性好、毒性小，在细胞中持续抑制靶基因的表达可持续数星期甚至更久。 但是，目前shRNA表达载体使用的RNA聚合酶III 启动子(pol III) 主要为人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子，它们在禽源细胞中的转录活性并不理想，且目前市场上尚无禽源细胞特异性RNA聚合酶III 启动子，因此开发高效的禽源细胞特异性shRNA启动子具有重要意义。本发明选择IBDV VP1和IBDV VP2基因为靶标，构建一个同时靶向IBDV VP1和VP2基因的双chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA，既可以保证两个shRNA被同时高效转录，又可以同时敲除IBDV的两个重要基因，高效抑制IBDV的复制，在IBDV新型防治制剂方面具有良好的应用前景。
技术方案
运用基因工程方法构建鸡U6启动子（chU6）；设计两个靶向分别为IBDV VP1和VP2基因的shRNA分子；构建双chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA；应用表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA在CEF细胞和SPF鸡胚上进行功能分析。具体包括：
1、鸡U6启动子（chU6）的构建
根据参考文献设计引物，上游引物引入EcoR I、Sal I位点，下游引物引入Hind III、XhoI、BamH I位点，引物由Invitrogen公司合成：
chU6(F)：5- CG GAATTC ACGCGTCGAC GCGGCCGCGACAACACAAGCATCGAG-3
chU6(R)：5-CCCAAGCTTCCGCTCGAGCGGGATCCTAGTATATGTGCTGCCGAAGCGAGCACGGAC-3
取新鲜的鸡肝脏组织（100mg）充分剪碎，按TIANDZ公司的柱式动物DNAout说明书提取基因组DNA。以鸡的基因组DNA为模板，按下面50μL PCR反应体系扩增chU6启动子：鸡基因组DNA 100ng，10×PCR Reaction Buffer 5μL，25 mmol.L-1MgCl2 4μL，2.5mmol.L-1 dNTP mix 4μL，10pmol.L-1 chU6(F) 1μL，10pmol.L-1 chU6(R) 1μL，Taq DNA polymerase 5U，ddH2O 32μL。
PCR扩增条件：94℃ 3min，94℃ 45s，62℃ 45s，72℃ 45s，32个循环；72℃ 10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，DNA胶回收试剂盒纯化，T4 DNA Ligase连接，转化E. coli TOP10感受态细菌，涂布在用LB配制的1.5％琼脂平皿上 (含100μg/ml氨苄青霉素、100 μg/ml X-gal和40 μg/ml IPTG)，37℃培养14 h。挑单菌落接种入LB (含氨苄青霉素100μg/ml)，振摇培养12 h，用MiniBEST 质粒纯化试剂盒提取质粒，EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，获得含有chU6序列的重组质粒pMD18-chU6。测序分析。
构建的chU6启动子其特征具有RNA聚合酶Ⅲ的三个上游元件：OCT、PSE、TATA。
2、两个靶向分别为IBDV VP1和VP2基因的小发夹RNA（shRNA）分子设计
| shRNA名称 | 编码shRNA的DNA序列 |
| VP1-shRNA2550(F) | 5-GATCCCCGTACCCAGAAGTCAAGAACTTCAAGAGAGTTCTTGACTTCTGGGTACTTTTTC-3 |
| VP1-shRNA2550(R) | 5-TCGAGAAAAAGTACCCAGAAGTCAAGAACTCTCTTGAAGTTCTTGACTTCTGGGTACGGG-3 |
| VP2-shRNA392(F) | 5-GATCCCCGAAGCCTGAGTGAACTGACTTCAAGAGAGTCAGTTCACTCAGGCTTCTTTTTC-3 |
| VP2-shRNA392(R) | 5-TCGAGAAAAAGAAGCCTGAGTGAACTGACTCTCTTGAAGTCAGTTCACTCAGGCTTCGGG-3 |
将合成的编码VP1-shRNA2550、VP2-shRNA392的单链DNA序列分别按照F与R的方法配对退火，分别得到双链shRNA。反应体系为：正义DNA模板（100 pmol/μL）10 μL，反义DNA模板（100 pmol/μL）10 μL，5×Annealing Buffer for DNA Oligos 20 μL，Nuclease-Free Water 60 μL，95℃ 5 min，室温退火30 min，制备双链shRNA。
3、双chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA的构建
将制备的VP1-shRNA2550、VP2-shRNA392分别插入pMD18-chU6的BamHⅠ与XhoⅠ位点，获得重组质粒pMD18-chU6+VP1-shRNA2550和pMD18-chU6+ VP2-shRNA392。将pMD18-chU6+ VP2-shRNA392质粒用XhoⅠ单酶切，1%琼脂糖凝胶电泳、DNA凝胶回收试剂盒回收pMD18-chU6+VP2-shRNA392片段；将pMD18-chU6+VP1-shRNA2550质粒用SalI与XhoⅠ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳、DNA凝胶回收试剂盒回收chU6+VP1-shRNA2550片段；T4 DNA Ligase连接，转化E. coli TOP10感受态细菌，涂布在用LB配制的1.5 %琼脂平皿上（含氨苄青霉素100 μg/ml），37 ℃培养14 h，挑单菌落接种入LB，振摇培养12 h，用MiniBEST 质粒纯化试剂盒提取质粒，BamH I单酶切鉴定，获得重组质粒pMD18+2chU6+VP1VP2shRNA。
将质粒pMD18+2chU6+VP1VP2shRNA和质粒pSilencer 2.1-U6 neo分别用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，用1%的琼脂糖凝胶电泳回收2chU6+VP1VP2shRNA片段和pSilencer 2.1-U6 neo载体片段，DNA凝胶回收试剂盒纯化，T4 DNA Ligase连接，转化E. coli TOP10感受态细菌，涂布在用LB配制的1.5 %琼脂平皿上（含氨苄青霉素100 μg/ml），37 ℃培养14 h，挑单菌落接种入LB，振摇培养12 h，用MiniBEST 质粒纯化试剂盒提取质粒，EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，获得表达质粒p Silencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA。
双chU6启动子双shRNA表达质粒p Silencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA的特点为：①启动shRNA的转录为禽源的chU6启动子；② VP1-shRNA2550和VP2-shRNA392分别由独立的chU6启动子转录，可以同时被高效转录，不受转录位置先后的影响；③可以同时敲除IBDV的两个重要基因，双重保证RNAi的效果，提高RNAi的成功率。
所述表达质粒p Silencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA可以在IBDV防治方面得到应用。
有益效果 本发明的特点和优点如下：
我国是世界上养鸡大国，从近几年对鸡的传染病流行病学调查分析、发病的临床表现与检测结果来看，IBDV在我国广泛存在，鸡群的发病、免疫失败等与IBDV感染有着很大的相关性。目前，使用的常规弱毒疫苗和灭活疫苗，其安全性和制造工艺仍存在不足：为预防变异毒株而采用中强毒力活疫苗存在着较大的生物安全问题，因为在不同IBDV毒株之间潜在着基因重配的可能，给该病的防控带来隐患；灭活疫苗存在着抗原制备的困难；以VP2为靶基因的IBD基因工程疫苗，采用的表达系统包括：大肠杆菌、酵母、鸡痘病毒载体、杆状病毒表达载体、核酸疫苗以及多表位疫苗等，各有所长，仍需改进。因此，探索新的IBDV防控技术是十分必要的。
RNA干扰（RNAi）被认为是机体阻止外来病毒感染、保护细胞免受病毒入侵的一种细胞自我保护机制，以病毒基因和宿主细胞分子为靶点，引入外源的小干扰RNA（short interfering RNA，siRNA）或小发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）能显著抑制病毒的表达。RNAi作为一种抗病毒感染的新途径已成功地应用于多种病毒，可以抑制IBDV病毒粒子复制和转录模板的生成，从源头上清除IBDV。siRNA因其合成价格昂贵、稳定性差、毒性大，而使其使用受到限制；shRNA表达载体则克服了上述缺点，它具有稳定性好、毒性小，在细胞中持续抑制靶基因的表达可持续数星期甚至更久。
目前，shRNA表达载体使用的RNA聚合酶III 启动子(pol III) 主要为人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。它们在禽源细胞中的转录活性并不理想，且目前市场上尚无禽源细胞特异性RNA聚合酶III 启动子，因此开发禽源细胞特异性shRNA启动子具有重要意义。本发明构建的RNA聚合酶III 启动子(pol III) chU6启动子，其特征具有RNA聚合酶Ⅲ的三个上游元件：OCT、PSE、TATA。在RNA聚合酶Ⅲ启动子的上游元件中，只要靠近起点存在TATA元件，就能起始转录。而PSE和OCT元件的存在将会提高转录效率。
IBDV属双RNA病毒科双RNA病毒属，基因组包括大（A）小（B）两个片段。VP1是病毒的非结构蛋白，是由B片段编码的一种依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp），VP1与病毒RNA的复制和毒力有关。VP2是病毒的主要结构蛋白之一，由A片段编码的多聚蛋白加工而成，位于病毒粒子的外表面，占总结构蛋白量的51%，既是病毒的主要结构蛋白，又是病毒的主要保护性抗原，与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异以及细胞凋亡的诱导等有关。因此，本实验在前期RNAi实验的基础上，挑选高效的VP1-siRNA2550、VP2-siRNA 392序列，设计VP1-shRNA2550、VP2-shRNA392，构建shRNA表达载体。为了防止某个基因突变和转录效率低而使RNAi失败，因而本发明选择构建一个同时针对IBDV VP1和VP2基因的双chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA，VP1- shRNA2550和VP2-shRNA392分别由独立的chU6驱动表达。双chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA的优势有两点：①可以保证VP1-shRNA2550和VP2-shRNA392同时被高效转录，不受转录位置先后的影响；②可以同时敲除IBDV的两个重要基因，双重保证RNAi的效果，提高RNAi的成功率。
用所构建的双chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA转染CEF细胞，接种IBDV，进行IBDV病毒复制抑制实验，细胞形态学观察发现，可明显抑制细胞病变效应（CPE）和病毒滴度。将pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA与IBDV混合，接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，可保护鸡胚免受IBDV感染，鸡胚发育正常；用荧光定量RT-PCR分析鸡胚组织和尿囊液中VP1和VP2基因的表达水平，pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA转染组VP1基因水平与对照组（单独接种IBDV组）VP1基因水平相比降低了92%， VP2基因水平与对照组（单独接种IBDV组）VP2基因水平相比降低了95%。
综合分析双chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA在CEF和鸡胚中的实验结果，本发明设计的两个shRNA：VP1-shRNA2550和VP2-shRNA392及其构建的双chU6启动子双shRNA的表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA是一种新型IBDV防治制剂，具有良好的实用价值和推广前景。
四、附图说明
图1 shRNA模板的设计
图2 双chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA的分子图谱
图3 chU6启动子的酶切图谱
图4 双chU6启动子双shRNA表达质粒p Silencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA的酶切图谱
图5 双chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA对IBDV致CEF病变的抑制效果（CPE）
图6 双chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA对IBDV在CEF中复制的抑制效果（TCID50）
图7 双chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA对IBDV在SPF鸡胚中复制的抑制效果（形态学观察）
图8 双chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA对IBDV在SPF鸡胚中复制的抑制效果（荧光定量RT-PCR检测结果）
五、具体实施方式
1 实验材料
鸡抗IBDV高免血清系用IBD弱毒疫苗（B87株，购自南京天邦生物科技有限公司）对SPF鸡（购自南京天邦生物科技有限公司）免疫5次获得，用DEAE纤维素（DE32）纯化（刘玉斌，苟仕金 主编. 动物免疫学实验技术. 长春：吉林科学技术出版社，1989，8-15）；
HRP标记的鸡抗IBDV IgG抗体参照文献制备（刘玉斌，苟仕金 主编. 动物免疫学实验技术. 长春：吉林科学技术出版社，1989，150-151；王永山，郝崇，侯世宽，刘子，马从林，殷震. 抗鸡IgG单克隆抗体的研究. 兽医大学学报, 1989, 9(2):109-114）。
Ex Taq DNA合成酶、T4 DNA连接酶、Sal I、Hind III、XhoI、BamH I、EcoRI、DNA Marker、X-gal、IPTG、MiniBEST质粒纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、克隆载体pMD18-T simple Vector、SYBR PrimeScript RT-PCR Kit均购自TaKaRa公司。
E.coli TOP10购自Invitrogen公司。引物合成、DNA序列测定由Invitrogen公司完成。
实验方法
2.1 鸡U6启动子(chU6)的构建
根据参考文献设计引物，上游引物引入EcoR I、Sal I位点，下游引物引入Hind III、XhoI、BamH I位点，引物由Invitrogen公司合成：
chU6(F)：5- CG GAATTC ACGCGTCGAC GCGGCCGCGACAACACAAGCATCGAG-3
chU6(R)：5-CCCAAGCTTCCGCTCGAGCGGGATCCTAGTATATGTGCTGCCGAAGCGAGCACGGAC-3
取新鲜的鸡（白来航鸡）肝脏组织（100mg）充分剪碎，按TIANDZ公司的柱式动物DNAout说明书提取基因组DNA。以鸡的基因组DNA为模板，按下面50μL PCR反应体系扩增chU6启动子：鸡基因组DNA 100ng，10×PCR Reaction Buffer 5μL，25 mmol.L-1MgCl2 4μL，2.5mmol.L-1 dNTP mix 4μL，10pmol.L-1 chU6(F) 1μL，10pmol.L-1 chU6(R) 1μL，Taq DNA polymerase 5U，ddH2O 32μL。
PCR扩增条件：94℃ 3min，94℃ 45s，62℃ 45s，72℃ 45s，32个循环；72℃ 10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，DNA胶回收试剂盒纯化（chU6基因片段593bp），T4 DNA Ligase连接（pMD18-T载体），转化E. coli TOP10感受态细菌，涂布在用LB配制的1.5％琼脂平皿上 (含100μg/ml氨苄青霉素、100 μg/ml X-gal和40 μg/ml IPTG)，37℃培养14 h。挑单菌落接种入LB (含氨苄青霉素100μg/ml)，振摇培养12 h，用MiniBEST 质粒纯化试剂盒提取质粒，重组质粒pMD18-chU6经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，用含EB的1 %琼脂糖凝胶电泳分析，可见2条长度分别约593bp和2.7 Kb的DNA片段，与chU6基因片段和pMD18-T载体大小理论值相符合（图3中1, 2泳道）。测序分析。将克隆的序列提交GenBank，用Nucleotide blast程序进行比对分析，发现克隆的chU6启动子序列其173-566位核苷酸序列与已发表的鸡U6-3(DQ531569)启动子序列同源性为96%，据此将173-566位核苷酸序列定为chU6启动子区域。
构建的chU6启动子其特征具有RNA聚合酶Ⅲ的三个上游元件：OCT、PSE、TATA。
2.2两个靶向分别为IBDV VP1和VP2基因的shRNA分子设计
根据shRNA设计原则，选择IBDV VP1基因（DQ403249）的2550和IBDV VP2基因（AF508177）的392序列为靶标，设计shRNA，同时设立阴性shRNA对照，设计的序列见表1：
表1 shRNA的设计
| shRNA名称 | 编码shRNA的DNA序列 |
| VP1-shRNA2550(F) | 5-GATCCCCGTACCCAGAAGTCAAGAACTTCAAGAGAGTTCTTGACTTCTGGGTACTTTTTC-3 |
| VP1-shRNA2550(R) | 5-TCGAGAAAAAGTACCCAGAAGTCAAGAACTCTCTTGAAGTTCTTGACTTCTGGGTACGGG-3 |
| VP2-shRNA392(F) | 5-GATCCCCGAAGCCTGAGTGAACTGACTTCAAGAGAGTCAGTTCACTCAGGCTTCTTTTTC-3 |
| VP2-shRNA392(R) | 5-TCGAGAAAAAGAAGCCTGAGTGAACTGACTCTCTTGAAGTCAGTTCACTCAGGCTTCGGG-3 |
| shRNA-CON(F) | 5-GATCCCC GTCAGACAAAGCGAAACTCTTCAAGAGAGAGTTTCGCTTTGTCTGACTTTTTC-3 |
| shRNA-CON(R) | 5-TCGAGAAAAAGTCAGACAAAGCGAAACTCTCTCTTGAAGAGTTTCGCTTTGTCTGACGGG-3 |
将合成的编码VP1-shRNA2550、VP2-shRNA392和shRNA-CON的单链DNA序列分别按照F与R的方法配对退火（图1），分别得到双链shRNA。反应体系为：正义DNA模板（100 pmol/μL）10 μL，反义DNA模板（100 pmol/μL）10 μL，5×Annealing Buffer for DNA Oligos 20 μL，Nuclease-Free Water 60 μL，95℃ 5 min，室温退火30 min，制备双链shRNA。
2.3双chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA的构建
将制备的VP1-shRNA2550、VP2-shRNA392分别插入pMD18-chU6的BamHⅠ与XhoⅠ位点，获得重组质粒pMD18-chU6+VP1-shRNA2550和pMD18-chU6+ VP2-shRNA392。将pMD18-chU6+ VP2-shRNA392质粒用XhoⅠ单酶切，1%琼脂糖凝胶电泳、DNA凝胶回收试剂盒回收pMD18-chU6+ VP2-shRNA392片段；将pMD18-chU6+VP1-shRNA2550质粒用SalI与XhoⅠ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳、DNA凝胶回收试剂盒回收chU6+VP1-shRNA2550片段；T4 DNA Ligase连接，转化E. coli TOP10感受态细菌，涂布在用LB配制的1.5 %琼脂平皿上（含氨苄青霉素100 μg/ml），37 ℃培养14 h，挑单菌落接种入LB，振摇培养12 h，用MiniBEST 质粒纯化试剂盒提取质粒，BamH I单酶切鉴定，获得重组质粒pMD18+2chU6+VP1VP2shRNA。
将质粒pMD18+2chU6+VP1VP2shRNA和质粒pSilencer 2.1-U6 neo分别用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，用1%的琼脂糖凝胶电泳回收2chU6+VP1VP2shRNA片段和pSilencer 2.1-U6 neo载体片段，DNA凝胶回收试剂盒纯化，T4 DNA Ligase连接，转化E. coli TOP10感受态细菌，涂布在用LB配制的1.5 %琼脂平皿上（含氨苄青霉素100 μg/ml），37 ℃培养14 h，挑单菌落接种入LB，振摇培养12 h，用MiniBEST 质粒纯化试剂盒提取质粒，EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，用含EB的1 %琼脂糖凝胶电泳分析，可见2条长度分别约1324bp和4.2 Kb的DNA片段，与2chU6+VP1VP2shRNA基因片段和pSilencer 2.1-U6 neo的理论值相符合（图4中1泳道），获得双chU6启动子双shRNA表达质粒p Silencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA。
该表达质粒p Silencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA能同时表达VP1-shRNA2550和VP2-shRNA392, 且它们分别由独立的chU6启动子转录。
2.4表达质粒pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA的功能分析
2.4.1在CEF细胞上的功能分析
2.4.1.1 pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA转染CEF
在转染前24 h，用无抗生素的RPMI1640培养液（含6% FBS）预铺次代鸡胚成纤维细胞（CEF）于6孔板（每孔4×105个细胞），37℃，5% CO2培养。转染时，弃去孔中培养基，并用无血清无抗生素的RPMI1640液洗涤细胞3次，然后用孵育好的pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA-Lipofectamine2000混合物平铺CEF细胞单层（pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA终浓度为4μg/mL），轻轻混匀，37℃，5% CO2，5 h，弃去混合物，用含1%FBS的RPMI1640换液，24 h后接种103TCID50的IBDV(B87毒株)，置37℃，5% CO2，吸附1 h，吸去病毒液，用含1% FBS的RPMI1640换液，连续观察细胞病变， 72 h后，pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA组的CEF无明显的CPE出现（图5，A），而p Silencer 2.1+ chU6+ shRNA-CON转染CEF细胞（图5，C）和病毒感染CEF细胞对照组则呈现典型的CPE，表现为细胞圆缩、脱落（图5，D）；正常CEF对照生长良好（图5，B）。72 h后，经反复冻融三次后，收集病毒悬液，-20℃冻存。
2.4.1.2夹心ELISA检测IBDV含量
用包被液稀释鸡抗IBDV IgG至5 mg/L，包被酶标板，100 μL/孔，4℃过夜，PBST洗涤3次，每次5 min，拍干；用封闭液 (含10％ FBS的PBST) 满孔封闭，37℃，2 h，PBST洗涤3次，每次5 min，拍干；加入2.4.1.1中收集的病毒悬液， 2倍系列稀释，100 μL/孔，37℃，2 h，PBST洗涤3次，每次5 min，拍干；加入1：1000稀释的HRP标记的鸡抗IBDV IgG，100 μL/孔，37℃，1 h，PBST洗涤3次，每次5 min，拍干；显色；2 mol/L H2SO4终止，测A 450值，判定结果。pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA转染CEF组抗原效价为1:2，p Silencer 2.1+ chU6+ shRNA-CON转染CEF细胞和病毒感染CEF细胞对照组抗原效价均为1:32。
2.4.1.3 病毒滴度测定
用质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA转染CEF细胞（pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA终浓度为4μg/mL），24 h后接种103TCID50的IBDV（B87毒株) ，置37℃，5% CO2，吸附1 h，吸去病毒液，用含1% FBS的RPMI1640换液，连续观察细胞病变，72 h后，取细胞培养液于96孔培养板中进行滴度测定。用无血清的RPMI1640培养液以10倍系列稀释6个梯度，每孔0.1 mL，每个稀释度设置8孔，同时设立病毒感染阳性对照和正常细胞对照。37℃，5% CO2培养，每天观察细胞病变，记录病变孔数，按Reed-Muench法计算细胞培养液的TCID50。转染pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA、p Silencer 2.1+ chU6+ shRNA-CON实验组与IBDV对照组的病毒滴度分别为101TCID50/0.1mL 、104.75 TCID50/0.1mL和104.75TCID50/0.1mL（图 6）。
上述试验表明，双chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA在CEF细胞上可抑制病毒复制。
2.4.2在SPF鸡胚上的功能分析
2.4.2.1pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA转染SPF鸡胚
将质粒pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA与0.2ml IBDV（103TCID50）混合，一起接种于10日龄SPF鸡胚的尿囊腔中（pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA终浓度为8μg/mL），同时设立阴性质粒与IBDV及单独接种IBDV于10日龄SPF鸡胚对照，96h后，pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA转染组鸡胚存活，发育正常（图7, C）；而接种阴性质粒与IBDV(图7, B)及单独接种IBDV（图7, A）的10日龄SPF鸡胚均死亡，鸡胚发育阻滞，胚体全身出血。收集鸡胚组织及尿囊液，测病毒含量。
2.4.2.2夹心ELISA检测IBDV含量
用包被液稀释鸡抗IBDV IgG至5 mg/L，然后包被酶标板，100 μL/孔，4℃过夜，PBST洗涤3次，每次5 min，拍干；用封闭液 (含10％ FBS的PBST) 满孔封闭，37℃，2 h，PBST洗涤3次，每次5 min，拍干；加入2.4.2.1中收集的鸡胚组织及尿囊液裂解物， 2倍系列稀释，100 μL/孔，37℃，2 h，PBST洗涤3次，每次5 min，拍干；加入1:1000稀释的HRP标记的鸡抗IBDV IgG，100 μL/孔，37℃，1 h，PBST洗涤3次，每次5 min，拍干；显色；2 mol/L H2SO4终止，测A 450值，判定结果。pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA转染组抗原效价为1:2，接种阴性质粒与IBDV及单独接种IBDV组的抗原效价均为1:64。
2.4.2.3荧光定量RT-PCR检测IBDV含量
根据IBDV VP1基因、VP2基因和鸡β-actin基因（作为内参基因）序列分别设计引物（表2），引物由上海Invitrogen公司合成。
表2 荧光定量RT-PCR引物
| 引物名称 | 引物序列（5’-3’） | 产物长度 |
| VP1 Foward | CTTGCACAACCAGGGTACCTG | 251bp |
| VP1 Reverse | CCTACCAACCTCAACGCCT | |
| VP2 Foward | CAGAGCAATGGGAACTACAA | 165bp |
| VP2 Reverse | GAAGGTCACGGCGTTTAT | |
| β-actin Foward | TTGGAGGCTCTATCCTGG | 106bp |
| β-actin Reverse | TAGAAGCATTTGCGGTGG |
用Trizol法提取2.4.2.1中收集的病毒悬液总RNA，按照TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit使用说明进行反转录合成cDNA，将反转录得到的cDNA溶液用EASY Dilution按10倍梯度稀释，再将各稀释度的cDNA作为模板以SYBR Green Ⅰ嵌合荧光法在LightCycler 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪(Roche公司)上进行real-time PCR扩增，采用25 μL PCR反应体系：SYBR Premix ExTaq（2×）12.5 μL，PCR Forward 引物（10 μM）0.5 μL，PCR Reverse 引物（10 μM）0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-free Water 9.5 μL；PCR反应条件： 95℃ 30 s， 95℃ 5 s、60℃ 20 s、40 个循环，融解曲线分析95℃ 15 s，65℃ 15 s，升温到95℃的同时连续检测荧光信号，制作标准曲线。根据标准曲线得到检测样品中目的基因的拷贝数，同时用β-actin基因为内参照，相对定量数据分析采用Roche LightCycler480 SW1.5.0软件，计算抑制效率。pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA转染组VP1基因水平与对照组（单独接种IBDV组）VP1基因水平相比降低了92%， VP2基因水平与对照组（单独接种IBDV组）VP2基因水平相比降低了95%。（图8）。
上述试验表明，双chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA在SPF鸡胚上可保护鸡胚免受IBDV感染。
综合分析双chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA在CEF和鸡胚中的实验结果，本发明设计的两个shRNA：VP1-shRNA2550和VP2-shRNA392及其构建的双chU6启动子双shRNA的表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA是一种新型IBDV防治制剂，具有良好的实用价值和推广前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 双chU6启动子双shRNA表达质粒的构建及应用
<130> 说明书
<160> 6
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> chU6(F)
<222> (1)..(44)
<223>
<400> 1
cggaattcac gcgtcgacgc ggccgcgaca acacaagcat cgag 44
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> chU6(R)
<222> (1)..(57)
<223>
<400> 2
cccaagcttc cgctcgagcg ggatcctagt atatgtgctg ccgaagcgag cacggac 57
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> VP1-shRNA2250(F)
<222> (1)..(60)
<223>
<400> 3
gatccccgta cccagaagtc aagaacttca agagagttct tgacttctgg gtactttttc 60
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> VP1-shRNA2250(R)
<222> (1)..(60)
<223>
<400> 4
tcgagaaaaa gtacccagaa gtcaagaact ctcttgaagt tcttgacttc tgggtacggg 60
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> VP2-shRNA392(F)
<222> (1)..(60)
<223>
<400> 5
gatccccgaa gcctgagtga actgacttca agagagtcag ttcactcagg cttctttttc 60
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> VP2-shRNA392(R)
<222> (1)..(60)
<223>
<400> 6
tcgagaaaaa gaagcctgag tgaactgact ctcttgaagt cagttcactc aggcttcggg 60
Claims (1)
1.一种双chU6启动子双shRNA表达质粒，其构建方法为：
1）鸡U6启动子chU6的构建
设计引物，上游引物引入EcoR I、Sal I位点，下游引物引入Hind III、XhoI、BamH I位点：
chU6(F)：5- CG GAATTC ACGCGTCGAC GCGGCCGCGACAACACAAGCATCGAG-3
chU6(R)：5-CCCAAGCTTCCGCTCGAGCGGGATCCTAGTATATGTGCTGCCGAAGCGAGCACGGAC-3
以白来航鸡肝脏组织提取的基因组DNA为模板，按下面50μL PCR反应体系扩增chU6启动子：鸡基因组DNA 100ng，10×PCR Reaction Buffer 5μL，25 mmol.L-1MgCl2 4μL，2.5mmol.L-1 dNTP mix 4μL，10pmol.L-1 chU6(F) 1μL，10pmol.L-1 chU6(R) 1μL，Taq DNA polymerase 5U，ddH2O 32μL；
PCR扩增条件：94℃ 3min，94℃ 45s，62℃ 45s，72℃ 45s，32个循环；72℃ 10min；PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，DNA胶回收试剂盒纯化，T4 DNA Ligase连接，转化E. coli TOP10感受态细菌，纯化，EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，获得含有chU6序列的重组质粒pMD18-chU6，构建的chU6启动子具有RNA聚合酶Ⅲ的三个上游元件：OCT、PSE、TATA；
2）两个靶向分别为IBDV VP1和VP2基因的shRNA分子设计
shRNA名称和编码shRNA的DNA序列如下：
VP1-shRNA2550(F) 5-GATCCCCGTACCCAGAAGTCAAGAACTTCAAGAGAGTTCTTGACTTCTGGGTACTTTTTC-3
VP1-shRNA2550(R) 5-TCGAGAAAAAGTACCCAGAAGTCAAGAACTCTCTTGAAGTTCTTGACTTCTGGGTACGGG-3
VP2-shRNA392(F) 5-GATCCCCGAAGCCTGAGTGAACTGACTTCAAGAGAGTCAGTTCACTCAGGCTTCTTTTTC-3
VP2-shRNA392(R) 5-TCGAGAAAAAGAAGCCTGAGTGAACTGACTCTCTTGAAGTCAGTTCACTCAGGCTTCGGG-3
将合成的编码VP1-shRNA2550、VP2-shRNA392的单链DNA序列分别按照F链与R链配对退火，分别得到双链shRNA，反应体系为：100 pmol/μL的正义DNA模板10 μL，100 pmol/μL的反义DNA模板10 μL，5×Annealing Buffer for DNA Oligos 20 μL，Nuclease-Free Water 60 μL，95℃ 5 min，室温退火30 min，制备双链shRNA；
3）双chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA的构建
将制备的VP1-shRNA2550、VP2-shRNA392分别插入pMD18-chU6的BamHⅠ与XhoⅠ位点，获得重组质粒pMD18-chU6+VP1-shRNA2550和pMD18-chU6+ VP2-shRNA392；
将pMD18-chU6+ VP2-shRNA392质粒用XhoⅠ单酶切，1%琼脂糖凝胶电泳、DNA凝胶回收试剂盒回收pMD18-chU6+VP2-shRNA392片段；将pMD18-chU6+VP1-shRNA2550质粒用SalI与XhoⅠ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳、DNA凝胶回收试剂盒回收chU6+VP1-shRNA2550片段；T4 DNA Ligase连接，转化E. coli TOP10感受态细菌，纯化，BamH I单酶切鉴定，获得重组质粒pMD18+2chU6+VP1VP2shRNA；
将质粒pMD18+2chU6+VP1VP2shRNA和质粒pSilencer 2.1-U6 neo分别用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，用1%的琼脂糖凝胶电泳回收2chU6+VP1VP2shRNA片段和pSilencer 2.1-U6 neo载体片段，DNA凝胶回收试剂盒纯化，T4 DNA Ligase连接，转化E. coli TOP10感受态细菌，纯化，EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，获得表达质粒p Silencer 2.1+2chU6+VP1VP2shRNA。
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| CN101402945A (zh) * | 2008-11-14 | 2009-04-08 | 扬州大学 | 表达抗传染性法氏囊病病毒微小rna重组禽腺联病毒的制备方法 |
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| 娜仁."双启动子shRNA表达载体的构建及其在抑制肿瘤增殖研究中的应用".《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊)基础科学辑》.2011,第5-11页(1.2方法),第17最后一段-18页最后一段. * |
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