CN102226173A - 一种稳定型酶制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到一种酶制剂的稳定化处理方法，该方法将融化的油脂和酶制剂进行混合制备成油脂包裹型酶制剂，其中，油脂和酶制剂的比例不低于2∶1(w/w)；搅拌均匀后，在真空条件下对油脂包裹型酶制剂脱水至水分占酶制剂的3.5％(w/w)以内，采用以上方法可以获得具有更好耐热性能的酶制剂。本发明进一步包括该稳定化酶制剂的应用，该应用为利用该稳定化酶制剂生产加酶饲料。采用以上方法对酶制剂进行稳定化处理和应用，具有简便、低成本的特点，特别适合在饲料行业应用。

Description

一种稳定型酶制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及到一种稳定型酶制剂及其制备方法，该方法通过制备油脂包裹型酶新剂型并在真空条件下进行脱水获得稳定化的酶制剂，进一步利用该稳定型酶制剂生产加酶饲料，形成一种加酶饲料的生产方法。

背景技术

酶的稳定性关系到它在工业实践中的成败，稳定性不足大大限制了酶的应用范围，因此改善酶分子的稳定性具有重要价值。

稳定的空间结构是酶催化活性稳定的基础，从分子水平上看，一系列共价键和非共价键都对稳定性有影响，特别是各种非共价键间的微妙平衡尤为重要。对酶分子稳定性贡献较大的共价键主要有肽键和二硫键，它们的作用力比非共价键强，并且以影响酶分子一级结构为主。酶分子空间结构通常比一级结构更为脆弱，因此作用较弱的非共价键对酶稳定性的影响更引人关注。为提高酶的稳定性，一是改造酶分子，通过破译高稳定性酶分子的特殊结构规律，就可指导我们利用蛋白质工程或化学修饰手段设计并获得所需的高稳定性酶；二是通过选用合适的稳定剂来提高酶的稳定性，常用的稳定剂主要包括甘油、多羟基化合物、食用胶、蛋白酶抑制剂、盐类、还原剂、氨基酸等物质。

饲料行业是酶制剂的重要应用领域，饲料中的酶制剂，可借助动物消化道内环境，将饲料中的蛋白质、淀粉、纤维素、果胶等成分分解，形成易被动物机体吸收的营养物质，从而提高饲料的消化利用率；减少肠道内氨浓度过高对动物产生的毒性，增加泌乳量和乳脂量，增进消化道功能，减少消化道疾病，提高饲料效益，降低养殖成本。饲料分为通常含水量在12～13％，在此高湿环境下，酶制剂容易失活，影响其使用效果。如果饲料为颗粒饲料，其生产过程还要经受高温、高湿的造粒过程，这一过程中温度通常为60～120℃，湿度介于10～20％，这一过程很容易导致酶制剂失活，这也造成很多饲料无法添加酶制剂。因此，研发一种具有热稳定性和保存稳定性好的酶制剂至关重要。

针对酶制剂的稳定性问题，人们已经进行了广泛研究，开发出了多种可以提高酶制剂稳定性的方法。

WO 03/059087描述了一种制备含酶颗粒的方法，首先将水性的液体酶添加载体加工成为颗粒、干燥，再用聚烯烃包衣。WO 03/059086描述了一种含酶颗粒的制备方法，首先将水性的液体酶添加载体后加工成颗粒、干燥，再用疏水物质包衣，优选聚烯烃。CN96190833.5描述了一种将无机盐例如MgSO₄溶于含酶溶液中，接着进行干燥，不但盐的加入提高了干燥后的酶活性，而且所得含酶及无机盐的固体组合物的贮存和加工稳定性也得到了改善。CN200580003612.5描述了一种稳定的固态或者液态酶制剂，其包含至少一种酶和至少一种选自阿拉伯胶、至少一种植物蛋白及其混合物的稳定剂。该发明也涉及用于制备这些制剂，特别是固态制剂(例如颗粒)的方法及其在动物和/或人类营养品中的用途。200580002895.1描述了至少一种磷酸酶和至少一种稳定剂的稳定化固体或液体酶制剂，所述稳定剂选自琼脂、藻胶、角叉菜胶、红藻胶、印度胶、黄蓍胶、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角胶(＝角豆胶)、罗晃子胶、阿拉伯半乳聚糖、黄素(胶)、至少一种动物蛋白质及它们的混合物，条件是如果在作为固体制剂的颗粒中使用明胶作为唯一的稳定剂，则其后需包被颗粒。该发明还涉及生产这些制剂(特别是固体制剂如颗粒)的方法以及它们在动物和/或人营养物中的用途。200810195183.1描述了一种提高酶制剂热稳定性的方法，是将酶吸附于微孔淀粉的孔里，用明胶作壁材包衣；微孔吸附物为芯材，用喷雾干燥法制成微胶囊，提高热稳定性。

在以上的提高酶制剂稳定性方案中，所应用的方法主要是添加无机盐、胶类、糖类等保护剂或者包衣的方式，可以达到提高酶制剂的保存稳定性和一定的耐高温性能的目的，这种保护效果也很容易为人所理解。尽管这种方法可以提高酶对多种不良环境的耐受性和提高保存稳定性，但对于饲料制粒温度和湿度，通常是难以达到理想效果。

专利WO 97/16076描述了一种稳定化的酶制剂颗粒，该酶制剂颗粒含有至少1％的疏水物质和75％的水不溶性物质。专利描述酶制剂的制备首先是将液体酶和水不溶性的物质进行混合造粒，经流化床干燥，然后喷涂以疏水物质。这种酶制剂在饲料制粒环节可以保持高的稳定性，通常适合于80℃左右的制粒温度，对于更高制粒温度，其不足仍很突出。这种方法需要酶制剂供应商预先制备好专用的疏水包埋的酶制剂颗粒，和普通酶制剂相比，增加了成本，而且这种酶制剂的活力分析前要除去疏水物质，使得饲料企业的品控工作变得更加复杂。另外，饲料企业经常要面对来自多个供应商的酶制剂和不同品种的酶制剂，这些酶制剂的稳定性差异很大，给生产管理带来很大困难。饲料行业特别需要一种更加容易控制的、更高效地提高酶制剂稳定性的方法。

发明内容

本发明目的之一是提供一种提高酶制剂的稳定性的方法，该方法将油脂包埋和水分控制结合起来，使得酶制剂可以更好适用于饲料造粒高温高湿环节。本发明另一目的是提供上述方法在生产加酶饲料中的应用。

酶是蛋白质，蛋白质折叠一般是将疏水氨基酸分布在内部，而亲水氨基酸多分布在表面，通常认为天然的蛋白质处于热力学能量最小状态。理论上，酶蛋白处于水介质中，才可以保持蛋白质处于能力最低状态，也就是，蛋白质可以保持更好的稳定性。事实上，多数酶蛋白在非水相环境中并不会发生明显的活性损失。经实验证明，水分的控制是一个关键环节，采用常压的热空气为干燥介质的干燥方法无法使得酶制剂中的含水量降低至令人满意的程度，限制了酶制剂性能的发挥。进一步实验证明，水分是影响酶制剂稳定性的关键因素，在高含水量条件下可以耐受60℃温度的酶制剂，通过降低其酶制剂含水量，可以使得其耐受温度提高120℃以上，低含水量酶制剂经过油脂包裹处理以后再经真空脱水，其耐高温性能可以进一步提升达到150℃左右，甚至可以承受200℃以上的高温处理而仍保留有一定活力。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种酶制剂稳定化处理方法，其步骤包括：

1)将融化的油脂和酶制剂进行混合形成油脂包裹型酶制剂，所述油脂和酶制剂的比例不低于2∶1w/w；

2)搅拌均匀后，真空条件下对油脂包裹型酶制剂脱水至水分占酶制剂的3.5％w/w以内，即得到稳定型酶制剂。

油脂包裹型酶制剂可以从液态酶制剂出发制备，也可以从固态酶制剂出发制备。采用液态酶制剂和油脂混合，然后经真空脱水，可以制备一种悬浮形式的油脂包裹型酶制剂，这种酶制剂也具有很高的热稳定性，但是，这种制备过程对于很多酶分子存在一定程度上的活性损失，该活性损失的幅度通常大于没有油脂参与的酶制剂干燥过程。分析原因，一方面液态酶制剂中酶分子处于更高的柔性，容易失活，另一方面，这种方法比较难以添加保护剂。在本发明中，优选的油脂包裹型酶制剂的制备方法是以固态酶制剂为原料进行制备。固态酶制剂可以包含一种酶或多种酶，固态酶制剂通常是粗品酶制剂，包含了多种杂质，也可能添加了保护剂或填充剂等，如糖、淀粉、纤维素、蛋白质、胶类等，通常酶分子只占不足20％的比例。固态酶制剂的干燥方法可以采用喷雾干燥、流化床干燥等干燥方式，本发明对固态酶制剂的生产方法不做限定。固态酶制剂的含水量是个关键参数，采用常规干燥方法获得固态酶制剂，含水量一般处于5～15％之间，处于该含水量的酶制剂在抵御高温方面存在不足。尽管采用真空干燥的方式可以获得更低含水量的酶制剂，但这种酶制剂极易吸水，增加生产管理复杂性。本发明首先制备油脂分散型酶制剂，然后将该酶制剂进行真空脱水。真空是一很重要的操作手段，真空不仅仅有利于脱水，而且真空可以促使油脂和酶制剂充分接触，从而使得保护作用得以加强。为使得操作方便，油脂的加量不得过低，通常要求油脂和酶制剂的比例不低于2∶1，优选地，不低于5∶1，更优选地，不低于20∶1。真空技术是常规技术，真空的提供可以采用通常的抽真空方式，如蒸汽喷射真空泵、罗茨机械泵抽真空等方式提供真空。通过真空脱水，使得水分降低至占原固态酶制剂的3.5％以内，优选降低至占原固态酶制剂的2％以内。

油脂包括动物油、植物油、微生物油脂等来源的油脂，这些油脂的主要成分为甘油三酯，也就是一个甘油分子和三个脂肪酸链结合的分子。油脂经过加工以后可以获得甘油二酯、单甘脂和游离脂肪酸等物质，这些物质分布具有和甘油三酯不同的性质，如熔点、亲水性、消化特性、乳化性等，这些物质在天然油脂也有少量存在。研究表明，这些物质对酶制剂的保护作用和甘油三酯是类似的。在本发明中，油脂是指甘油三酯、甘油二酯、单甘酯、脂肪酸中的一种或一种以上的混合物。本发明中，对油脂熔点不做特别限定，影响油脂熔点的主要因素是脂肪酸组成，通常，脂肪酸不饱和度高的油脂熔点低，不饱和度低的油脂熔点高。对于在饲料生产前对酶制剂进行处理的情况，通常就采用饲料本来要添加的油脂。油脂是饲料中的常规成分，通常在饲料中的添加比例为2～5％，可以取部分油脂用于制备本发明稳定性酶制剂。饲料油脂常用的品种有棕榈油、大豆油、鱼油、猪油、牛油等。

本发明的酶制剂添加在饲料的生产中，用于制备加酶饲料。所述酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、半纤维素酶、木聚糖酶、植酸酶、葡聚糖酶中的一种或一种以上的混合物。

本发明与现有技术相比具有如下优点和有益效果：

(1)经过本发明方法处理后的酶制剂具有明显耐高温和高湿损伤的效果；

(2)采用添加酶制剂的加酶饲料，具有更好的酶活保留率和更好的保存稳定性，从而提高了饲料质量的可靠性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1

1.供测试酶制剂的制备

酶制剂为酸性蛋白酶100g，活力126000U/g，含水量8.3％，购于江门金远洋生物科技公司。

a)不做处理，记为样品A。

b)样品A 100g加入到200g大豆油中，搅拌均匀，不做任何处理，得到样品B。

c)样品A 100g加入到200g大豆油中，搅拌均匀，采用水环罗茨真空机组提供真空，脱水5分钟后，得到样品C，测样品C含水量为1.1％(w/w)，折算后水分占原固态酶制剂的比例为3.3％(w/w)。

d)样品A 100g加入到500g大豆油中，搅拌均匀，采用水环罗茨真空机组提供真空，脱水30分钟后，得到样品D，测样品D的含水量为0.31％(w/w)，折算后水分占原固态酶制剂的比例为1.9％(w/w)。

2.稳定性测试

取样品A、B、C于不同温度烘箱处理30min，活力保留率数据见表1。

活力保留率是经过处理后的酶制剂活力和对应的原初蛋白酶活力的比值，在本实施例中，由于添加油脂的不同，蛋白酶被稀释的倍数不同，在计算时B和C需折换成原酶计算，即300g B可折换成100gA，600g C可折换成100A。

B和C样品酶的提取采取以下方法，在B和C样品加水多次萃取，取水相合并检测。

表1

由表1可见，油脂和酶制剂接触对酶制剂活性有轻微的抑制或失活作用，但可以大大提高酶制剂的耐热性，使得酶制剂在经受高温处理的最终保留率大幅度提高。水分是影响稳定性的关键，含水量(以原固态酶制剂为基准计算)为3.3％的酶制剂稳定性比含水量为8.3％的酶制剂稳定性有显著提高，含水量为1.9％的酶制剂更加稳定。

实施例2

1.供测试酶制剂的制备

酶制剂为植酸酶，购于江门金远洋生物科技公司，活力5600U/g，水分含量9.6％。

A)原样品，记为A。

B)样品A 1kg，经油脂喷涂，油脂喷涂量为20％，记为B。

C)样品A 1kg加入到4kg大豆油中，搅拌均匀后，真空脱水，记为样品C。测得样品C含水量为0.33％。

2.稳定性测试

取样品A、B和C，模拟饲料造粒条件，采用常压蒸汽加热20s，再至于80℃烘箱30min，然后自然冷却1hr后待测，处理后对应的样品名称为A’、B’和C’。B和C样品用正己烷脱脂后供测试。植酸酶活力测定方法采用通用的方法，即植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，与钒钼酸铵生成黄色的[(NH₄)₃PO₄NH₄VO₃·16MoO₃]复合物，在波长405nm下进行比色测定。所有结果均处理成酶活保留率，酶活保留率是样品中残留酶活和该样品对应的原初酶制剂活力的比值。结果见表2。

表2

样品	含水量*(％)	酶活保留率(％)
			A	9.6	100
B	9.6	93.5
			C	1.7	92.8
A’	-	5.8
			B’	-	23.3
C’	-	56.8

*以原固态酶制剂为基准计算

由表2结果可见，采用脂肪包埋和脱水处理后可以显著提高酶制剂在高温湿热环境中的稳定性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种稳定型酶制剂的制备方法，其步骤包括：

1)将融化的油脂和酶制剂进行混合形成油脂包裹型酶制剂，所述油脂和酶制剂的比例不低于2∶1w/w；

2)搅拌均匀后，真空条件下对油脂包裹型酶制剂脱水至水分占酶制剂的3.5％w/w以内，即制得稳定型酶制剂。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶制剂是固态分散状酶制剂。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述油脂和酶制剂的比例不低于5∶1w/w。

4.根据权利要求3任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述油脂悬浮型酶制剂脱水后的水分占酶制剂的2％w/w以内。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述油脂是甘油三酯、甘油二酯、单甘酯、脂肪酸中的一种或两种以上的混合物。

6.根据权利要求1～4任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述酶制剂为蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、半纤维素酶、木聚糖酶、植酸酶、葡聚糖酶中的一种或两种以上的混合物。

7.根据权利要求5任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述酶制剂为蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、半纤维素酶、木聚糖酶、植酸酶、葡聚糖酶中的一种或两种以上的混合物。

8.一种稳定型酶制剂，其特征在于，是由权利要求1～7任意一项权利要求的方法制备而成的。

9.一种稳定型酶制剂的应用，其特征在于，在饲料的生产中添加权利要求8的酶制剂以制备加酶饲料。