CN102216325A

CN102216325A - 使用包括特异性配体的亲和树脂用于纯化人生长激素多肽的方法

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Publication number: CN102216325A
Application number: CN2009801453383A
Authority: CN
Inventors: J.E.拉斯姆森; P.M.圣希莱雷; M.罗伊斯; C.B.席奥特; K.J.詹森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2008-11-13
Filing date: 2009-11-13
Publication date: 2011-10-12
Also published as: JP2012508728A; WO2010055135A1; EP2356141A1; US20120116027A1

Abstract

本发明涉及用于纯化生长激素多肽例如重组人生长激素的新型方法。该方法利用包括固相材料的亲和树脂，所述固相材料具有与之固定的一种或多种低分子量合成配体。亲和树脂能够使生长激素与紧密相关蛋白质分离。

Description

使用包括特异性配体的亲和树脂用于纯化人生长激素多肽的方法

技术领域

背景技术

治疗蛋白质在活细胞中产生，并且在患者中使用前必须从蛋白质和其他生物种类的复杂混合物中纯化。这种分离可以是非常费力且昂贵的。已描述了用于在此类分离中使用的众多层析材料。

亲和层析使得生物物质例如蛋白质能够与互补结合物质选择性且可逆地吸附，所述互补结合物质例如固定在固相材料上的亲和配体，所述固相材料通常是填充在亲和柱中的多孔、聚合物基质。合适的配体直接或借助于接头与固相材料共价连接。含有对于配体具有亲和力的生物物质的样品可以在合适结合条件下与共价固定至固相材料的亲和配体接触，所述结合条件促进配体和对于配体具有亲和力的生物物质之间的特异性结合。亲和柱可以随后用缓冲液洗涤，以去除未结合的材料，并且在进一步的步骤中，对于配体具有亲和力的生物物质可以被洗脱且以纯化或甚至分离形式获得。因此，配体应优选显示出对于生物物质的特异性和可逆结合特征，所述生物物质是纯化或分离的目标。

已描述了用于纯化人生长激素（hGH）的众多层析材料和过程。

US 5,047,333公开了使用离子交换层析或固定金属亲和层析用于纯化人生长激素的方法。

US 4,332,717公开了使用疏水性相互作用层析用于纯化人生长激素的方法，其中具有疏水基团例如烷基或苯基基团的水不溶性载体用作层析材料。

上述2种方法依赖于采用化合物的物理化学性质中的差异的常规纯化技术。然而，这些通常需要数个费力的纯化步骤，因而导致较低得率和较高成本。

US 6,117,996公开了包括具有通式的配体的亲和配体-基质缀合物

。

使配体与支持基质在位置（A）处连接，任选通过置于基质和配体之间的间隔臂。还公开了使用此类亲和配体-基质缀合物纯化蛋白质性质材料，举例来说例如免疫球蛋白、胰岛素、因子VII或人生长激素或其类似物、衍生物和其片段以及前体。

US 5,760,187公开了使用蓝色染料例如所示Cibacron 3GA用于纯化人生长激素的方法：

所述蓝色染料与支持基质连接。蓝色染料很久以来已用于含腺嘌呤基辅因子依赖性酶例如胰蛋白酶或乳酸脱氢酶的亲和层析纯化中。然而，生长激素从载体中洗脱要求蛋白质变性剂例如6 M尿素。

上文现有技术中描述的层析材料确实可以用于纯化hGH。然而，仍需要针对hGH具有高特异性的层析材料，并且所述材料包括合成亲和配体，并且所述材料进一步能够进行涉及较少步骤和较温和洗脱条件的纯化方法。

目前的重组人生长激素（rhGH）可以通过不同方法从发酵上清液中纯化：

采用多个层析步骤的常规层析，例如通过US 5,268,277和US 5,633,352中公开的方法；

采用具有蛋白质配体的亲和树脂的亲和层析，例如如在US 5,350,836中；或

采用具有合成小分子配体的亲和树脂的亲和层析，例如如在US 5,760,187中。

涉及多个步骤的常规层析具有下述一个或多个缺点：总体得率低、缓冲液消耗高、过程时间长和过程设备中的投入大、劳力增加。

具有蛋白质配体的亲和树脂导致选择性增加、得率更高、缓冲液消耗更低、和过程设备中的投入减少。

然而，具有蛋白质配体的亲和树脂的制造是非常昂贵的，以及与小合成配体比较在化学上和构象上较不稳定的，并且固有地具有纯化rhGH被来自蛋白质配体的蛋白质片段或来自具有蛋白质配体的亲和树脂生产的其他生物物质污染的危险。

目前报道的用于人生长激素亲和层析的合成配体例如US 5,760,187中公开的那些要求使用强蛋白质变性剂，以从亲和树脂中释放蛋白质。

因此，需要更好的亲和树脂用于纯化重组人生长激素（rhGH）。

发明概述

本发明提供了使用新亲和树脂用于纯化生长激素多肽的方法。本发明提供了包括新合成亲和配体的亲和树脂，所述新合成亲和配体对于生长激素多肽特别是人生长激素（hGH）例如rhGH是选择性的，并且不基于蛋白质配体且是廉价且基本稳定的。

附图说明

图1. 关于AA1（上）、AA2（中）和CA（下）的平均荧光值（任意单位）。

图2. 来自在Fractogel Amino上配体11（左）和在Fractogel Amino上配体6（右）的选择性测试的SDS page凝胶。

图3. 显示使用具有配体L10的亲和树脂的一般运行的层析谱。

图4. 使用具有配体L10的亲和树脂的纯化的SDS-PAGE凝胶。泳道1：Mark 12标记；泳道2：流出物；泳道3：洗脱物（具有配体L10的亲和树脂）；泳道4：纯化的hGH（缺乏氨基延长部分）；泳道5：微量过滤的大肠杆菌细胞培养液。

图5. 使用对于Fractogel Amino M的配体L10从来自hGH收获物的微量滤液中亲和纯化hGH的层析谱。

图6. 使用具有配体L10的亲和树脂的纯化的SDS-PAGE。泳道1（从左起）：蛋白质标记Mark12（Invitrogen）；泳道2：流出物（合并的级分1+2+3，在凝胶上的10 μL样品）；泳道3：洗脱物（合并的级分6+7+8，在凝胶上的10 μL样品）；泳道4：CIP（合并的级分10+11+12，在凝胶上的10 μL样品）；泳道5：参考微量滤液样品（稀释x50）。

图7. SDS-PAGE中泳道3中所示的合并级分的HPLC。纯度74 ％，在T_r = 22分钟处的hGH。

图8. 用上样缓冲液获得的层析谱：以pH 6.25的50 mM BisTris。

图9. 使用具有配体L10的亲和树脂的纯化的SDS-PAGE。泳道1（从左起）：蛋白质标记Mark12（Invitrogen）；泳道2：流出物（合并的级分1+2+3，在凝胶上的10 μL样品）；泳道3：洗脱物（合并的级分6+7+8，在凝胶上的10 μL样品）；泳道4：CIP（合并的级分10+11+12，在凝胶上的10 μL样品）；泳道5：参考微量滤液样品（稀释x50）。

图10. 合并洗脱级分（级分6-8）的HPLC层析谱，在T_r = 21.5分钟处的hGH。

图11. 来自在Fractogel上使用配体L14的hGH亲和纯化的层析谱。

图12. 使用具有配体L14的亲和树脂的纯化的SDS-PAGE。凝胶分析。泳道1（从左起）：蛋白质标记Mark12（Invitrogen）；泳道2：流出物（合并的级分1+2，在凝胶上的10 μL样品）；泳道3：洗脱物（级分8，在凝胶上的10 μL样品）；泳道4：洗脱物（级分9（在凝胶上的10 μL样品））；泳道5：洗脱物（合并的级分7+8+9，在凝胶上的10 μL样品）；泳道6：CIP（合并的级分16+17，在凝胶上的10 μL样品）；泳道7：hGH参考；泳道5：参考微量滤液样品（稀释x50）。

图13. 级分9的洗脱物的HPLC层析谱。

图14. 来自在Fractogel上使用配体L16的hGH亲和纯化的层析谱。

图15. 使用具有配体L16的亲和树脂的纯化的SDS-PAGE。泳道1：蛋白质标记Mark12（Invitrogen）；泳道2：流出物（合并的级分1+2，在凝胶上的10 μL样品）；泳道3：洗脱物（级分7+8，在凝胶上的10 μL样品）；泳道4：洗脱物（级分9，在凝胶上的10 μL样品）；泳道5：洗脱物（合并的级分7+8+9（在凝胶上的10 μL样品））；泳道6：CIP（合并的级分16+17，在凝胶上的10 μL样品）；泳道7：hGH参考；泳道5：参考微量滤液样品（稀释x50）。

图16. 合并的洗脱级分7、8和9的HPLC层析谱。

图17. 来自在Fractogel上使用配体L14的高糖基化hGH亲和纯化的层析谱。

发明详述

本发明提供了用于纯化生长激素多肽的方法。

本发明公开了用于纯化生长激素（GH）多肽的方法，其涉及亲和配体和亲和树脂的使用，其中配体是生长激素多肽的特异性结合配偶体并且因此可以用于纯化所述多肽。

因此，本发明的一个实施方案涉及用于纯化生长激素多肽的方法，所述方法包括步骤：

（a）在促进生长激素多肽的部分与亲和树脂结合的条件下，使所述生长激素多肽与所述亲和树脂接触；

（b）任选地用洗涤缓冲液洗涤含有结合的生长激素多肽的所述亲和树脂；和

（c）用洗脱缓冲液洗脱含有生长激素多肽的所述亲和树脂，并且收集作为洗脱物的纯化生长激素多肽。

在本发明的一个实施方案中，亲和树脂是固相材料，所述固相材料具有与之共价固定的具有通式（I）的配体

，

其中

i = 1、2、...、m，并且j =1、2、...、n；

m和n是独立地在0-3范围中的整数，条件是n+m总和在1-4范围中；

p、q和r是独立地在0-6范围中的整数；

A11、…、A1m和A21、…、A2n独立地选自α-氨基酸部分、β-氨基酸部分、α-氨基磺酸部分和β-氨基磺酸部分；

Z1和Z2独立地选自氢、C_1-6烷基、羧酸部分（Z-C(=O)-）和磺酸部分（Z-S(=O)₂-），其中Z选自氢、任选取代的C_1-12-烷基、任选取代的C_3-12-环烷基、任选取代的C_1-12-烯基、任选取代的C_1-12-炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂环基；

R1和R2独立地选自氢和C_1-6-烷基；

X是直接或经由接头用于使配体与固相材料连接的基团，X选自羧酸（-COOH）、羧酸酯（-COOR）、羧酸酐（-COOCOR）、羧酸卤化物（-COHal）、磺酸（-S(=O)₂OH）、磺酰氯（-S(=O)₂Cl）、巯基（-SH）、二硫化物（-S-S-R）、羟基（-OH）、醛（C(=O)H）、环氧化物（-CH(O)CH₂）、氰化物（-CN）、卤素（-Hal）、伯胺（-NH₂）、仲胺（-NHR）、酰肼（-NH=NH₂）和叠氮化物（-N₃），其中R选自任选取代的C_1-12-烷基，并且Hal是卤素；和

所述配体（排除“X”和任何接头）的总分子量是200-2000 g/mol。

已惊奇地发现基于例如α,ω-二氨基-羧酸和相似类型的支架提供有利的配体类别，所述相似类型例如α,β-二氨基-丙酸（p=1，q=r=0）、α,γ-二氨基-丁酸、和α,δ-二氨基-戊酸，特别是α,β-二氨基-丙酸（p=1，q=r=0），所述配体具有针对hGH多肽极佳的结合性质，并且与例如细胞培养上清液或血浆中存在的其他蛋白质比较，进一步显示与hGH多肽的特异性结合。

另外并且同样由上述假设支持的，排除“X”和任何接头的配体优选具有超过200 Da的分子量，例如超过300 Da、例如超过400 Da、例如超过500 Da、例如超过600 Da、例如超过700 Da、例如超过800 Da的分子量。不依赖于其，配体优选具有小于5000 Da的分子量，例如小于4000 Da、例如小于3000 Da、例如小于2500 Da、例如小于2000 Da、例如小于1500 Da、例如小于1000 Da的分子量。

在本发明的一个实施方案中，Z1-（A1i）_m-N（R1）-和Z2-（A2j）_n- N（R2）-各自代表分子量50-500 g/mol的有机部分，其中配体的总分子量是250-1500 g/mol，例如300-1200 g/mol、例如350-1000 g/mol。

在本发明的一个实施方案中，A11、…、A1m和A21、…、A2n独立地选自α-氨基酸部分和β-氨基酸部分，特别是α-氨基酸部分。

在本发明的一个实施方案中，A11、…、A1m和A21、…、A2n独立地选自以L和D形式任一种的下述氨基酸：Tyr、Phe、Arg、Trp、Ile、Pro、Thr、Lys、Gln、Asn和Asp。

在本发明的一个实施方案中，A11、…、A1m和A21、…、A2n独立地选自D-Tyr、D-Phe、D-Arg、D-Trp、D-Ile、D-Pro、D-Thr、D-Lys、D-Gln、D-Asn和D-Asp。

在本发明的一个实施方案中，A11、…、A1m和A21、…、A2n独立地选自L-Tyr、L-Phe、L-Arg、L-Trp、L-Ile、L-Pro、L-Thr、L- Lys、L-Gln、L-Asn和L-Asp。

在本发明的一个实施方案中，A11、…、A1m和A21、…、A2n中的至少一个选自L-Tyr、L-Phe、L-Arg、L-Trp、L-Ile、L-Pro、L-Thr、L-Lys、L-Gln、L-Asn和L-Asp。

在本发明的一个实施方案中，A11、…、A1_m、A21、…、A2_n包括选自Arg、Phe、Ile和Tyr的至少一个氨基酸部分，特别是选自L-Arg、L-Phe和L-Ile的至少一个氨基酸部分。

在本发明的一个实施方案中，Z1和Z2独立地选自氢、C_1-6烷基、羧酸部分和磺酸部分。

在本发明的一个实施方案中，Z1和Z2包括至少一个羧酸部分或磺酸部分，特别是至少一个羧酸部分。

在本发明的另一个实施方案中，Z1和Z2独立地选自氢、C_1-6烷基、呫吨-9-基-羰基、5-甲基-2-苯基-2H-1,2,3-三唑-4-基-羰基、3-氨基-（苯磺酰）-噻吩-2-基-羰基、（+/-）-3-氧代-1-茚满基-羰基、5,6,7,8-四氢吖啶-9-基-羰基和2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基-羰基。

特别优选的例子是选自下表给出的那些（为了明确起见提供相应羧酸结构）：

。

在本发明的一个实施方案中，Z1选自1,2,3,4-四氢吖啶-9-基-羰基、呫吨-9-基-羰基、2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基-羰基和3-氧代-茚满-1-基-羰基。

在本发明的一个实施方案中，Z1包括三环杂芳族基团，例如Z1是5,6,7,8-四氢吖啶-9-基-羰基或呫吨-9-基-羰基。

在本发明的一个实施方案中，就氨基酸/氨基磺酸数目而言，n优选0-2，例如0-1，特别是0，并且m优选1-3，例如2-3，特别是2。n+m总和优选2-4，例如2-3，特别是2或3。

在本发明的一个实施方案中，当n是0时，Z2优选选自羧酸部分和磺酸部分。此外，当m是0时，Z1优选选自羧酸部分和磺酸部分。

在本发明的一个实施方案中，就支架中的碳原子数目而言，p优选0-3，例如0-2，例如1-2，特别是2，并且q优选0-3，例如0-2，特别是0或1。总和p+q优选1-7，例如2-5，特别是2或3。不依赖于其，r优选0-6，例如0-4，例如0-2，特别是0或1，更优选0。

在本发明的一个实施方案中，就支架中的碳原子数目而言的进一步变体，（p,q）是（0,1）、（0,2）、（0,3）、（0,4）、（1,0）、（2,0）、（3,0）或（4,0）。

在本发明的一个实施方案中，由此的r变体优选0。

在本发明的一个实施方案中，X是直接或经由接头用于使配体与固相材料连接的反应基团（进一步参见下文）。在优选实施方案中，接头经由区段-CON（R）-（特别是-NHCO-）与支架连接，其中羰基是表示“X”的支架的一部分，因为这将使得能够通过由固相肽合成已知的标准方法制备配体。

在本发明的一个实施方案中，X一般选自羧酸（-COOH）、羧酸酯（-COOR）、羧酸酐（-COOCOR）、羧酸卤化物（-COHal）、磺酸（-S(=O)₂OH）、磺酰氯（-S(=O)₂Cl）、巯基（-SH）、二硫化物（-S-S-R）、羟基（-OH）、醛（C(=O)H）、环氧化物（-CH(O)CH₂）、氰化物（-CN）、卤素（-Hal）、伯胺（-NH₂）、仲胺（-NHR）、酰肼（-NH=NH₂）和叠氮化物（-N₃），其中R选自任选取代的C_1-12-烷基，并且Hal是卤素。

在本发明的一个实施方案中，X是COOH。

在本发明的一个实施方案中，亲和树脂包括具有任选经由接头连接的配体（具有通式（I））的固相材料，其中

A21、…、A2n独立地选自Tyr、Phe、Arg、Trp、Ile、Pro、Thr、Lys、Gln、Asn和Asp，特别选自L-Tyr、L-Phe、L-Arg、L-Trp、L-Ile、L-Pro、L-Th r、L-Lys、L-Gln、L-Asn和L-Asp；

Z1选自氢、C_1-6烷基、呫吨-9-羰基、2-氨基烟酰基、2-喹哪啶羰基、4,8-二羟基-2-喹啉羰基、4-喹啉羰基、5-甲基-2-硝基苯甲酰基、2-（巯基苯并咪唑）乙酰基、5-甲基-2-苯基-2H- 1,2,3-三唑-4-羰基、6-羟基-2-萘甲酰基、4,7-二甲基吡唑并[5,1-c][1,2,4]三嗪-3-羰基、3-氨基-4-（苯磺酰）-2-噻吩羰基、（+/-）-3-氧代-1-茚满羰基、5,6,7,8-四氢吖啶-9-羰基、2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-3-羰基、5-（4-甲基-2-硝基苯基）糠酰基、1-环己基-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羰基、喹喔啉-6-羰基和4-甲基-2-苯基嘧啶-5-羰基；

Z2是H；

R1和R2独立地选自氢和C_1-6-烷基；

m = 0，n = 2，p = 1，q = 0，r = 0；

是优选的。

A21、…、A2n独立地选自Tyr、Phe、Arg、Trp、Ile、Pro、Thr、Lys、Gln、Asn和Asp，特别选自L-Tyr、L-Phe、L-Arg、L-Trp、L-Ile、L-Pro、L- Thr、L-Lys、L-Gln、L-Asn和L-Asp；

Z1选自氢、C_1-6烷基、呫吨-9-基-羰基、5-甲基-2-苯基-2H-1,2,3-三唑-4-基-羰基、3-氨基-（苯磺酰）-噻吩-2-基-羰基、（+/-）-3-氧代-1-茚满-羰基、5,6,7,8-四氢吖啶-9-基-羰基和2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基-羰基；

Z2是H；

R1和R2独立地选自氢和C_1-6-烷基；

m = 0，n = 2，p = 1，q = 0，r = 0；

是优选的。

在本发明的一个实施方案中，配体具有通式（II），

其中Z1、Z2、A21和A22如上文对于通式（I）定义的，包括对于这个通式描述的实施方案。

特别优选的是通式（II）的那些配体，其中

Z1是Z-C(=O)-，其中Z选自任选取代的芳基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂环基；

Z2选自氢和Z-C(=O)-，其中Z选自任选取代的C_1-12-烷基、任选取代的C_3-12-环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂环基；和

A2₁和A2₂各自独立地选自α-氨基酸和β-氨基酸。

在本发明的一个实施方案中，配体具有通式（II），其中A2₁优选选自精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸和赖氨酸，并且A2₂选自精氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸和色氨酸。

本发明的一个实施方案，通式（II）的配体具有优选通式（III），

其中R'和R"独立地选自α-氨基酸的侧链，并且R'"选自任选取代的芳基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂环基。

在本发明的一个实施方案中，配体具有选自下述配体编号（1）-（16）的结构：

。

在一个进一步优选的实施方案中，配体具有通式（I），其中Z1和Z2独立地选自氢、C_1-6烷基、5,6,7,8-四氢吖啶-9-羰基和2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-3-羰基。

本文描述的配体包括如由本文描述或叙述显而易见的，在任何或所有不对称原子上富集或分辨的光学异构体。消旋和非对映混合物以及个别光学异构体可以这样分离或合成，以便基本上不含其对映或非对映配对物，并且这些都在本发明的范围内。

定义

“α-氨基酸部分”指天然存在的和合成氨基酸（包括必需氨基酸），其中氨基基团与α-碳共价键合。当存在于本发明的配体中时，α-氨基酸部分作为-N（R）-X-C(=O)-片段存在，其中X代表α-碳和任何一个或多个侧链。

“β-氨基酸部分”指天然存在的和合成氨基酸（包括必需氨基酸），其中氨基基团与β-碳共价键合。当存在于本发明的配体中时，β-氨基酸部分作为-N（R）-X-C(=O)-片段存在，其中X代表α-和β-碳和任何一个或多个侧链。

“α-氨基磺酸部分”与“α-氨基酸部分”对应，其中羰基基团（-C(=O)-）已由磺基基团（-S(=O)₂-）替换。当存在于本发明的配体中时，α-氨基磺酸部分作为-N（R）-X-S(=O)₂-片段存在，其中X代表α-碳和任何一个或多个侧链。

“β-氨基磺酸部分”与“β-氨基酸部分”对应，其中羰基基团（-C(=O)-）已由磺基基团（-S(=O)₂-）替换。当存在于本发明的配体中时，β-氨基磺酸部分作为-N（R）-X-S(=O)₂-片段存在，其中X代表α-和β-碳和任何一个或多个侧链。

术语“必需氨基酸”指20种遗传编码的L-α-氨基酸及其立体异构D-α-氨基酸中的任何一种。因此，在本发明范围内的术语“氨基酸部分”以其最广泛含义使用，并且意欲包括其天然存在的L-氨基酸。通常使用的关于天然存在氨基酸的单和三字母缩写在本文中使用（Lehninger，Biochemistry，第2版，第71-92页,（Worth Publishers：New York，1975）。该术语还包括D-氨基酸（及其残基）以及化学修饰的氨基酸，例如氨基酸类似物，包括通常不掺入蛋白质内的天然存在的氨基酸，例如正亮氨酸，以及具有本领域已知为氨基酸特征的性质的化学合成的化合物。

一般能够作为“氨基酸部分”掺入根据本发明的配体内的氨基酸的例子在本文中如下列出：

甘氨酰（GLY）；氨基多聚羧酸，例如天冬氨酸（ASP）、对羟基天冬氨酸、谷氨酸（GLU）、β-羟基谷氨酸、β-甲基天冬氨酸、β-甲基谷氨酸、β,β-二甲基天冬氨酸、γ-羟基谷氨酸、β,γ-二羟基谷氨酸、β-苯基谷氨酸、γ-亚甲基谷氨酸、3-氨基己二酸、2-氨基庚二酸、2-氨基辛二酸和2-氨基癸二酸残基；谷氨酰胺（GLN）；天冬酰胺（ASN）；精氨酸（ARG）、赖氨酸（LYS）、β-氨基丙氨酸、γ-氨基α氨基丁酸、鸟氨酸（ORN）、瓜氨酸、高精氨酸、高瓜氨酸、5-羟基-2,6-二氨基己酸、二氨基丁酸；组氨酸（HIS）；α,α'-二氨基琥珀酸、α,α'-二氨基戊二酸、α,α'-二氨基己二酸、α,α'-二氨基庚二酸、α,α'-二氨基β-羟基庚二酸、α,α'-二氨基辛二酸、α,α'-二氨基壬二酸和α,α'-二氨基癸二酸残基；脯氨酸（PRO）、4-或3-羟基-2-吡咯烷-羧酸、γ-甲基脯氨酸、哌可酸、5-羟基哌可酸、-N[CH₂]₂CO-、吖丁啶-2-羧酸；丙氨酸（ALA）、缬氨酸（VAL）、亮氨酸（LEU）、烯丙甘氨酸、α氨基丁酸、正缬氨酸、正亮氨酸（NLE）、α-氨基庚酸、α-甲基丝氨酸、α-氨基-α-甲基-γ-羟基戊酸、α-氨基-α-甲基-6-羟基戊酸、α-氨基-α-甲基-ε-羟基己酸、异缬氨酸、α-甲基谷氨酸、α-氨基异丁酸、α-氨基二乙基乙酸、α-氨基二异丙基乙酸、α-氨基二-正丙基乙酸、α-氨基异丙基乙酸、α-氨基二-正丁基乙酸、α-氨基乙基异丙基乙酸、α-氨基-正丙基乙酸、α-氨基二异戊基乙酸、α-甲基天冬氨酸、α-甲基谷氨酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸；异亮氨酸（ILE）、别异亮氨酸、叔亮氨酸、β-甲基色氨酸；α-氨基-α-乙基-β-苯基丙酸；β-苯基丝氨酰；丝氨酸（SER）、β-羟基亮氨酸、β-羟基正亮氨酸、β-羟基正缬氨酸、α-氨基-α-羟基硬脂酸；高丝氨酸、γ-羟基正缬氨酸、δ-羟基正缬氨酸、ε-羟基正亮氨酸；canavinyl、canalinyl；γ-羟基鸟氨酰；2-氨基己糖酸（2-hexosaminic acid）、D-氨基葡萄糖酸、D-氨基半乳糖酸；α-氨基-β-巯基、青霉胺、β-巯基正缬氨酸、β-巯基α氨基丁酸；半胱氨酸（CYS）；高胱氨酸；β-苯基甲硫氨酸；甲硫氨酸（MET）；S-烯丙基-（L）-半胱氨酸亚砜；2-巯基组氨酸；胱硫醚；苯丙氨酸（PHE）、色氨酸（TRP）、α-氨基苯基乙酸、α-氨基环己基乙酸、α-氨基-β-环己基丙酸；芳基、C₁₆烷基、羟基、卤素、胍、氧代烷基醚、硝基、硫磺或卤素取代的苯基（例如，酪氨酸（TYR）、甲基酪氨酸和邻-氯-，对-氯-，3,4-二氯，邻、间或对甲基-，2,4,6-三甲基-，2-乙氧基-5-硝基，2-羟基-5-硝基和对硝基-苯丙氨酸）；呋喃基-、噻吩基-、吡啶基-、嘧啶基-、嘌呤或萘基丙氨酸；犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸、2-羟基色氨酸、4-羧基色氨酸；肌氨酸（N-甲基甘氨酸；SAR）、N-苄基甘氨酸、N-甲基丙氨酸、N-苄基丙氨酸、N-甲基苯丙氨酸、N-苄基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸和N-苄基缬氨酸；苏氨酸（THR）、别苏氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸。

术语“α-氨基酸的侧链”指构成上文公开的氨基酸的侧链的基团。一般地，此类侧链选自氢（代表甘氨酸）、甲基（丙氨酸）、2-丙基（缬氨酸）、2-甲基-1-丙基（亮氨酸）、2-丁基（异亮氨酸）、甲基巯基乙基（甲硫氨酸）、苄基（苯丙氨酸）、3-吲哚基甲基（色氨酸）、羟甲基（丝氨酸）、1-羟乙基（苏氨酸）、巯甲基（半胱氨酸）、4-羟基苄基（酪氨酸）、氨基羰基甲基（天冬酰胺）、2-氨基羰基乙基（谷氨酰胺）、羧甲基（天冬氨酸）、2-羧乙基（谷氨酸）、4-氨基-1-丁基（赖氨酸）、3-胍基-1-丙基（精氨酸）和4-吲哚基甲基（组氨酸），或侧链连同插入碳和邻近氮原子一起构成吡咯烷环（脯氨酸）。

“α-氨基磺酸部分”指其中羰基氧(=O)已由硫(=S）替换的“α-氨基酸部分”。“β-氨基磺酸部分”指其中羰基氧(=O)已由硫(=S）替换的“β-氨基酸部分”。

在本文背景中，术语“C_1-12-烷基”和“C_1-6-烷基”分别意指具有1-12个碳原子和1-6个碳原子的线性、环状或分支烃基团，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、戊基、环戊基、己基、环己基。术语“C_1-4-烷基”意欲涵盖具有1-4个碳原子的线性、环状或分支烃基团，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丁基。

尽管术语“C_3-12-环烷基”由术语“C_1-12-烷基”包含，但它特指单和二环配对物，包括具有环外原子的烷基基团，例如环己基-甲基。

类似地，术语“C_2-12-烯基”和“C_2-6-烯基”分别意欲涵盖具有2-12个碳原子和2-6个碳原子的线性、环状或分支烃基团，并且包括（至少）一个不饱和键。烯基基团的例子是乙烯基、烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、十七碳烯基（heptadecaenyl）。烯基的优选例子是乙烯基、烯丙基、丁烯基，特别是烯丙基。

尽管术语“C_3-12-环烯基”由术语“C_2-12-烯基”包含，但它特指单和二环配对物，包括具有环外原子的烯基基团，例如环己烯基-甲基。

类似地，术语“C_2-12-炔基”和“C_2-6-炔基”分别意欲涵盖具有2-12个碳原子和2-6个碳原子的线性、环状或分支烃基团，并且包括（至少）一个三键。

术语“C_1-6-烷氧基”意指“C_1-6-烷基-O”。

在本文背景中，即与术语“烷基”、“烷氧基”、“烯基”、“炔基”等结合，术语“任选取代的”意指所讨论的基团可以用选自下述的一个或多个基团取代一次或数次，优选1-3次：羟基（这当与不饱和碳原子结合时，可以以互变异构酮式存在）、C_1-6-烷氧基（即C_1-6-烷基-氧）、C_2-6-烯氧基、羧基、氧代（形成酮或醛功能性）、C_1-6-烷氧基羰基、C_1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基、芳基氨基、芳基羰基、芳氧基羰基、芳基羰基氧、芳基氨基羰基、芳基羰基氨基、杂芳基、杂芳氧基、杂芳基氨基、杂芳基羰基、杂芳氧基羰基、杂芳基羰基氧、杂芳基氨基羰基、杂芳基羰基氨基、杂环基、杂环基氧、杂环基氨基、杂环基羰基、杂环基氧基羰基、杂环基羰基氧、杂环基氨基羰基、杂环基羰基氨基、氨基、单和二（C_1-6-烷基）氨基、-N（C_1-4-烷基）₃ ⁺、氨基甲酰、单和二（C_1-6-烷基）氨基羰基、C_1-6-烷基羰基氨基、氰基、胍基、脲基、C_1-6-烷基-磺酰-氨基、芳基-磺酰-氨基、杂芳基-磺酰-氨基、C_1-6-烷酰氧、C_1-6-烷基-磺酰、C_1-6-烷基-亚磺酰、C_1-6-烷基磺酰氧、硝基、C_1-6-烷基巯基和卤素，其中任何芳基、杂芳基和杂环基可以如下文对于芳基、杂芳基和杂环基，以及任何烷基、烷氧基等具体描述的进行取代，代表取代基可以由羟基、C_1-6-烷氧基、氨基、单和二（C_1-6-烷基）氨基、羧基、C_1-6-烷基羰基氨基、C_1-6-烷基氨基羰基或一种或多种卤素取代。

一般地，取代基选自羟基（这当与不饱和碳原子结合时，可以以互变异构酮式存在）、C_1-6-烷氧基（即C_1-6-烷基-氧）、C_2-6-烯氧基、羧基、氧代（形成酮或醛功能性）、C_1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基、芳基氨基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基、杂芳基氨基、杂芳基羰基、杂环基、杂环基氧、杂环基氨基、杂环基羰基、氨基、单和二（C_1-6-烷基）氨基；氨基甲酰、单和二（C_1-6-烷基）氨基羰基、氨基-C_1-6-烷基氨基羰基、单和二（C_1-6-烷基）氨基-C_1-6-烷基-氨基羰基、C_1-6-烷基羰基氨基、胍基、脲基、C_1-6-烷基-磺酰-氨基、C_1-6-烷基-磺酰、C_1-6-烷基-亚磺酰、C_1-6-烷基巯基、卤素，其中任何芳基、杂芳基和杂环基可以如下文对于芳基、杂芳基和杂环基具体描述的进行取代。

在某些实施方案中，取代基选自羟基、C_1-6-烷氧基、氨基、单和二（C_1-6-烷基）氨基、羧基、C_1-6-烷基羰基氨基、C_1-6-烷基氨基羰基或卤素。

术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。

在本文背景中，术语“芳基”意指全部或部分芳香族的碳环或环系统，例如苯基、萘基、1,2,3,4-四氢萘基、联苯基、蒽基、菲基、芘基、苯并芘基、芴基和呫吨基，其中苯基是优选例子。

术语“杂芳基”意指全部或部分芳香族的碳环或环系统，其中一个或多个碳原子已由杂原子取代，所述杂原子例如氮(=N-或-NH-）、硫和/或氧原子。此类杂芳基基团的例子是唑基、异

唑基、噻唑基、异噻唑基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、香豆酰基、呋喃基、噻吩基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并二唑基、苯并

唑基（benzooxozolyl）、2,3二氮杂萘基（phthalazinyl）、phthalanyl、三唑基、四唑基、异喹啉基、吖啶基、咔唑基、二苯并氮

基、吲哚基、苯并吡唑基、吩

嗪酮基。特别有利的杂芳基基团是苯并咪唑基、

唑基、异

唑基、噻唑基、异噻唑基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、呋喃基、噻吩基、喹啉基、三唑基、四唑基、异喹啉基、吲哚基，特别是苯并咪唑基、吡咯基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、喹啉基、四唑基和异喹啉基。

术语“杂环基”意指非芳香族的碳环或环系统，其中一个或多个碳原子已由杂原子替换，所述杂原子例如氮(=N-或-NH-）、硫和/或氧原子。此类杂环基基团（根据环命名）的例子是咪唑啉、哌嗪、六氢哒嗪、六氢嘧啶、二氮杂环庚烷、二氮杂环辛烷、吡咯烷、哌啶、氮杂

、氮杂环庚烷、氮丙啶、氮丙啶、吖丁啶、吡咯啉、托品烷、嗪烷（吗啉）、氮杂

、二氢氮杂

、四氢氮杂

和六氢氮杂

、oxazolane、

氮杂烷、oxazacane、噻唑烷、噻嗪烷、thiazepane、thiazacane、oxazetane、diazetane、thiazetane、四氢呋喃、四氢吡喃、oxepane、四氢噻吩、四氢噻喃、硫杂环庚烷、二噻烷、二硫杂环庚烷、二

烷、二氧杂环庚烷、氧杂硫杂环己烷、氧杂硫杂环庚烷。最有利的例子是四氢呋喃、咪唑啉、哌嗪、六氢哒嗪、六氢嘧啶、二氮杂环庚烷、二氮杂环辛烷、吡咯烷、哌啶、氮杂、氮杂环庚烷、吖丁啶、托品烷、

嗪烷（吗啉）、oxazolane、

氮杂烷、噻唑烷、噻嗪烷和thiazepane，特别是四氢呋喃、咪唑啉、哌嗪、六氢哒嗪、六氢嘧啶、二氮杂环庚烷、吡咯烷、哌啶、氮杂环庚烷、

嗪烷（吗啉）和噻嗪烷。

在本文背景中，即与术语“芳基”、“杂芳基”、“杂环基”、“炔基”等（例如，“芳氧基”、“杂芳基羰基”等）结合，术语“任选取代的”意指所讨论的基团可以用选自下述的一个或多个基团取代一次或数次，优选1-5次，特别是1-3次：羟基（这当存在于烯醇系统中时，可以以互变异构酮式表示）、C_1-6-烷基、C_1-6-烷氧基、C_2-6-烯氧基、氧代（这可以以互变异构烯醇式表示）、氧化物（仅作为N-氧化物有关）、羧基、C_1-6-烷氧基羰基、C_1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基、芳基氨基、芳氧基羰基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氨基、氨基、单和二（C_1-6-烷基）氨基；氨基甲酰、单和二（C_1-6-烷基）氨基羰基、氨基-C_1-6-烷基氨基羰基、单和二（C_1-6-烷基）氨基-C_1-6-烷基-氨基羰基、C_1-6-烷基羰基氨基、氰基、胍基、脲基、C_1-6-烷酰氧、C_1-6-烷基-磺酰-氨基、芳基-磺酰-氨基、杂芳基-磺酰-氨基、C_1-6-烷基-磺酰基、C_1-6-烷基-亚磺酰基、C_1-6-烷基磺酰氧、硝基、硫烷基、氨基、氨基-磺酰基、单和二（C_1-6-烷基）氨基-磺酰基、二卤素-C_1-4-烷基、三卤素-C_1-4-烷基、卤素，其中芳基和杂芳基代表取代基可以由C_1-4-烷基、C_1-6-烷氧基、硝基、氰基、氨基或卤素和任何烷基、烷氧基等取代1-3次，代表取代基可以由羟基、C_1-6-烷氧基、C_2-6-烯氧基、氨基、单和二（C_1-6-烷基）氨基、羧基、C_1-6-烷基羰基氨基、卤素、C_1-6-烷基巯基、C_1-6-烷基-磺酰-氨基或胍基取代。

一般地，取代基选自羟基、C_1-6-烷基、C_1-6-烷氧基、氧代（这可以以互变异构烯醇式表示）、羧基、C_1-6-烷基羰基、甲酰基、氨基、单和二（C_1-6-烷基）氨基；氨基甲酰、单和二（C_1-6-烷基）氨基羰基、氨基-C_1-6-烷基氨基羰基、C_1-6-烷基羰基氨基、胍基、脲基、C_1-6-烷基-磺酰-氨基、芳基-磺酰-氨基、杂芳基-磺酰-氨基、C_1-6-烷基-磺酰、C_1-6-烷基-亚磺酰、C_1-6-烷基磺酰氧、硫烷基、氨基、氨基-磺酰、单和二（C_1-6-烷基）氨基-磺酰或卤素，其中任何烷基、烷氧基等代表取代基可以由羟基、C_1-6-烷氧基、C_2-6-烯氧基、氨基、单和二（C_1-6-烷基）氨基、羧基、C_1-6-烷基羰基氨基、卤素、C_1-6-烷基巯基、C_1-6-烷基磺酰-氨基或胍基取代。在某些实施方案中，取代基选自C_1-6-烷基、C_1-6-烷氧基、氨基、单和二（C_1-6-烷基）氨基、硫烷基、羧基或卤素，其中任何烷基、烷氧基等代表取代基可以由羟基、C_1-6-烷氧基、C_2-6-烯氧基、氨基、单和二（C_1-6-烷基）氨基、羧基、C_1-6-烷基羰基氨基、卤素、C_1-6-烷基巯基、C_1-6-烷基-磺酰-氨基或胍基取代。

羧酸部分指包括与Q-C(=O)-一样的Z1和Z2的部分，其中Q选自任选取代的C_1-12-烷基、任选取代的C_2-12-烯基、任选取代的C_1-12-炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂环基。

磺酸部分指包括与Q-S(=O)₂-一样的Z1和Z2的部分，其中Q选自任选取代的C_1-12-烷基、任选取代的C_2-12-烯基、任选取代的C_1-12-炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂环基。

当在本文中使用时，表达“有机部分”（和“多个有机部分”）意指包括共价键合的一个或多个碳原子和一个或多个氢（II）、氧(O)、氮（N）、硫（S）、溴（Br）、氯（Cl）、氟（F）或磷（P）原子的分子片段。

在本发明的特定方面，有机部分Z1-（A1i）_m- N（R1）-和Z2-（A2i）_n-N（R2）-各自一般具有通式C_aH_bO_cN_dS_eBr_fCl_gF_h,P_i，其中0≤a≤15、0≤b≤2x+1、O≤c≤x、O≤d≤x、O≤e≤x、0≤f≤3x、0≤g≤3x、0≤h≤3x、O≤i≤x和50≤12a+b+16c+14d+32e+80f+35g+19h+31i≤500。

溶液或悬浮液

表达“溶液或悬浮液”在本文中意指包括生长激素多肽特别是人生长激素多肽的固体质量和/或液体质量。表达“溶液或悬浮液”特别意指“大”体积或质量，即指由大规模和工业规模方法已知的体积和质量。

生长激素多肽的悬浮液或溶液一般源于例如细胞培养、微生物方法、克隆动物（例如牛、猪、绵羊、山羊和鱼）或昆虫等，特别源于细胞培养或工业规模生产方法。可替代地，生长激素多肽的悬浮液或溶液可以衍生自血浆等。

生长激素多肽的悬浮液或溶液一般在细胞特别是细胞培养裂解后获得或直接得自细胞培养液。需要或有利时，含有生长激素多肽的悬浮液或多肽可以随后通过改变pH、离子强度或通过二价金属离子螯合等进行调整。

在本发明的一个实施方案中，需要或有利时，含有生长激素多肽的悬浮液或多肽直接得自先前纯化步骤，或得自伴随pH、离子强度、二价金属离子螯合等的后续调整的先前纯化步骤。

配体

亲和树脂是具有与之共价固定的配体的固相材料（参见下文），所述配体具有针对生长激素多肽的高特异性，如本发明的背景中描述的。

当在本文中使用时，术语“配体”意指可以结合靶化合物的分子，所述靶化合物在本文背景中可以是生长激素多肽。优选地，配体应至少以基本上特异的方式与所讨论的生长激素多肽结合（“特异性结合”）。表达“一种或多种配体”指固相材料可以具有与之固定的超过一种类型的配体的事实。这是说，单一类型的配体（“配体”）的固定将一般涉及多个/众多种类的等同配体的固定。

在本文背景中，“特异性结合”指配体与生长激素多肽（即结合配偶体）优选这样结合的性质，使得结合的生长激素多肽的相对质量是除生长激素多肽外的其他结合种类的相对质量的至少2倍，例如50倍、例如100倍、例如1000倍。结合化合物的相对质量意指结合的特异性结合剂的相对质量=（特异性结合的质量/结合的总化合物）/（非特异性结合的质量/结合的总化合物）。

亲和配体通过虚拟组合筛选程序在计算机上虚拟进行设计，以与称为位点1的hGH多肽的hGHbp结合表位结合。配体特别设计为与hGH上的位点1表位中的残基Glu56、Ile58、Thr60、Pro61、Ser62、Asn63、Arg64、Thr67、Gln68、Gln69、Lys168、Asp171、Lys172、Thr175、Phe176和Ile179相互作用。hGH通过首先在hGH多肽的高亲和力位点1上结合，并且随后在较低亲和力位点2上与hGHbp的第二个分子结合与其受体（hGHbp）相互作用，以形成2:1受体-配体复合物（Walsh等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 2004，101，17078-17083）。hGH多肽在位点1上针对hGHbp的结合亲和力通过在hGHbp上的2个色氨酸残基占优势地得到促进，所述色氨酸残基即Trp104和Trp169，两者都位于较大位点1内的中心疏水斑片中。这些残基解释了对于hGH的大多数结合亲和力，其中hGHbp突变体W104A和W169A分别显示出相对于野生型是2500倍的减少亲和力（Clackson等人，J. Mol. Biol. 1998，277，1111-1128）。本文描述的配体已如此设计，以便模拟这些有利的相互作用，通过大量组合构建的配体计算对接到位点1的高亲和力斑片（patch）内，其与hGHbp的Trp104和Trp169相互作用，即hGH上的位点1表位中的残基Glu56、Ile58、Thr60、Pro61、Ser62、Asn63、Arg64、Thr67、Gln68、Gln69、Lys168、Asp171、Lys172、Thr175、Phe176和Ile179。

固相材料

如上所述，亲和树脂是具有与之固定的一种或多种合成配体的取代的固相材料。固相材料（有时被称为“基质”或“聚合物基质”）原则上可以选自照常规用于层析用途和肽合成的广泛范围的材料。此类材料的例子在下文描述。

配体与固相材料例如多孔、无机基质或聚合物基质共价固定，任选以交联和/或串珠形式或以统一多孔实体。优选地，聚合物基质的孔足够宽以用于靶蛋白质通过所述孔扩散且与孔的内表面上的配体相互作用。对于具有摩尔质量约22 kDa的GH多肽，20-150 nm的平均孔径是优选的，例如约75 nm。

串珠和任选交联的聚合物基质在一个实施方案中包括多个亲水部分。亲水部分可以是聚合物链，其当交联时形成交联聚合物基质。例子包括例如聚乙二醇部分、聚胺部分、聚乙烯胺部分和多元醇部分。

在本发明的一个实施方案中，串珠聚合物基质的核心和/或表面包括选自聚乙烯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚酯和聚酰胺的聚合材料。

串珠聚合物基质还可以选自PS、POEPS、POEPOP、SPOCC、PEGA、CLEAR、Expansin、聚酰胺、Jandagel、PS-BDODMA、PS-HDODA、PS-TTEGDA、PS-TEGDA、GDMA-PMMA、PS-TRPGDA、ArgoGel、Argopore树脂、ULTRAMINE、交联LUPAMINE、高容量PEGA、Silica、Fractogel、Sephadex、Sepharose、玻璃珠、交联聚丙烯酸酯和前述的衍生物；特别地，聚合物基质选自SPOCC、PEGA、HYDRA、POEPOP、PEG-聚丙烯酸酯共聚物、聚醚-聚胺共聚物和交联聚乙烯二胺。

除上述例子外，能够形成聚合物基质的任何材料原则上可以用于生产本发明的珠。优选地，珠的核心材料是聚合的。在某些实施方案中，核心包括亲水聚合材料或由亲水聚合材料组成。在其他实施方案中，核心包括疏水聚合材料或由疏水聚合材料组成。在某些实施方案中，珠的表面包括与核心相同的材料或由与核心相同的材料组成。

用于大规模应用的树脂可以是上述或其他树脂之一，例如Sephadex^TM、Sepharose^TM、Fractogel^TM、CIMGEL^TM、Toyopearl、HEMA^TM、交联琼脂糖、交联纤维素、其他基于交联碳水化合物的树脂和大孔聚苯乙烯或聚丙烯酸酯。基质还可以具有主要无机的性质，例如大孔玻璃或粘土矿物质，或树脂和无机物的组合，例如Ceramic HyperD^TM或硅胶。

根据本发明的聚合物珠可以由各种可聚合单体制备，所述可聚合单体包括苯乙烯、丙烯酸酯和不饱和氯化物、酯、乙酸盐、酰胺和醇，包括但不限于聚苯乙烯（包括高密度聚苯乙烯胶乳例如溴化聚苯乙烯）、聚甲基丙烯酸甲酯和其他聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚丙烯酰胺、聚丙烯醛、聚二甲基硅氧烷、聚丁二烯、聚异戊二烯、聚氨基甲酸酯、聚乙烯乙酸酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡啶、聚乙烯苄基氯、聚乙烯基甲苯、聚偏氯乙烯和聚二乙烯基苯。在其他实施方案中，珠由苯乙烯单体或基于PEG的大单体制备。聚合物在优选实施方案中选自聚醚、聚乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、polyacylamides、聚氨基甲酸酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚酯、聚酰胺及其组合。高度优选的表面和核心部分包括交联PEG部分、聚胺部分、聚乙烯胺部分和多元醇部分。

待用于生产本发明组合物的珠的优选疏水聚合物是PS-DVB（聚苯乙烯二乙烯基苯）。PS-DVB已广泛用于固相肽合成（SPPS），并且最近已证实用于聚合物支持的特殊有机分子制备的效用（Adams等人（1998）J.Org.Chem. 63:3706-3716）。当正确制备时（Grøtli等人（2000）J.Combi.Chem.2:108-119），PS-DVB固相材料展示出用于化学合成的极佳性质，例如高负荷、在有机溶剂中的合理膨胀和物理稳定性。

接头

上述配体可能通过接头与固相材料共价固定。在优选实施方案中，配体与接头共价连接，所述接头与聚合物基质共价连接。用于使亲和配体与固相材料交联的一般技术可以在Hermanson，Krishna Mallia和Smith，Immobilized Affinity Ligand Techniques"，Academic Press，1992中找到。

应当理解接头应提供配体的合适移动性，但不应像这样参与配体与目的抗体的结合。事实上，固定配体的结合应类似于非固定配体的结合。

接头用于使配体与固相材料例如聚合物基质或无机支持物连接。优选地，接头在配体和固相材料之间形成强且持久的键。当本发明的固相材料待用于GH多肽的重复纯化时，这是特别重要的。

然而，在本发明的一个实施方案中，接头可以是可选择切割的。当固相材料待用于分析用途时，这可以是有用的。

氨基酸和多肽是一般接头的例子。其他可能的接头包括碳水化合物和核酸。

在本发明的一个实施方案中，与聚合物基质连接的接头残基L可通过酸、碱、温度、光或通过与化学试剂接触切割。特别地，与聚合物基质连接的接头可以是（3-甲酰基吲哚-1-基）乙酸、2,4-二甲氧基-4'-羟基-二苯甲酮、HMPA、HMPB、HMPPA、Rink酸、Rink酰胺、Knorr接头、PAL接头、DCHD接头、Wang接头和Trityl接头。

配体可以通过接头与固相材料结合，所述接头具有优选小于50 Å的长度，例如3 - 30 Å的长度、例如3 - 20 Å的长度、例如3 - 10 Å的长度。

优选地，接头经由羧酸基团或氨基基团，特别经由羧酸基团与配体连接。

接头还可以包括多个共价连接的亚单位，例如从而使得亚单位选自等同和非等同的接头亚单位。在一个变体中，接头是弹性的，并且包括3到优选小于50个等同或非等同、共价连接的亚单位。

在本发明的一个实施方案中，接头L选自甘氨酸、丙氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸和HMBA。

在本发明的一个实施方案中，接头可以选自烷烃，例如线性烷烃，例如具有2-12个碳原子的线性烷烃，单分散聚乙二醇（PEG），例如具有2-20个重复单位的PEG，和肽例如包括1-20个连接氨基酸的肽。

接头还可以选自多分散的聚乙二醇；单分散的聚乙二醇，例如三甘醇、四甘醇、五甘醇、六甘醇、七甘醇；氨基酸；二肽；三肽；四肽；五肽；六肽；七肽；八肽；九肽；十肽；聚丙氨酸；聚甘氨酸，包括其任何组合。

固相材料最通常以珠的形式存在，例如具有平均直径在0.1-1000 μm范围内的颗粒材料，或以棍、膜、丸、单块等的形式存在。

肽

术语“肽”意指通过肽键连接的2个或更多个氨基酸的序列，其中个别氨基酸可以是天然存在或合成的。该术语包含术语多肽和蛋白质，其可以由通过共价相互作用例如半胱氨酸桥，或非共价相互作用结合在一起的2种或更多种多肽组成。应当理解该术语还意欲包括已例如通过亲脂基团、PEG或辅基的连接进行衍生的肽。术语肽包括任何合适的肽并且可以与术语多肽和蛋白质同义使用，除非上下文另有说明或冲突；条件是读者认识到每种类型的分别氨基酸聚合物包含分子可以以显著差异结合，并且从而构成本发明的个别实施方案（例如肽，例如抗体，其由多条多肽链组成，显著不同于例如单链抗体、肽免疫粘附素或单链免疫原性肽）。因此，术语肽在本文中应一般理解为指任何合适大小和组成的合适肽（就蛋白质分子中的氨基酸数目和结合链数目而言）。此外，本文描述的肽可以包括非天然存在的和/或非L-氨基酸残基，除非上下文另有说明或冲突。

除非上下文另有说明或冲突（并且如术语多肽和/或蛋白质的个别实施方案讨论的），术语肽还包含衍生的肽分子。简言之，在本发明的背景中，衍生物是这样的肽，其中肽的一个或多个氨基酸残基已化学修饰（例如通过烷基化、酰化、酯形成或酰胺形成）或与一个或多个非氨基酸有机和/或无机原子或分子取代基（例如聚乙二醇（PEG）基团、亲脂取代基（其任选地可以通过接头残基或基团例如β-丙氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）、L/D-谷氨酸、琥珀酸等与肽的氨基酸序列连接）、荧光团、生物素、放射性核素等）结合，并且还可以或可替代地包括非必需、非天然存在和/或非L-氨基酸残基，除非上下文另有说明或冲突（然而，应再次认识到此类衍生物本身且单独可以被视为本发明的独立特征，并且为了方便起见在描述本发明中进行此类分子在肽的含义内的包括，而不是暗示裸露肽和此类衍生物之间的任何种类的等价）。此类氨基酸残基的非限制性例子包括例如2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基-庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2,4-二氨基丁酸、锁链素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸和抑胃酶氨酸卤代氨基酸。应当理解这种衍生化不是本发明的衍生化，而是在依照本发明的方法纯化前生长激素多肽上已存在的衍生化，或在纯化后执行的衍生化。

同一性

如本领域已知的，术语“同一性”指如通过比较序列测定的，2个或更多个肽的序列之间的关系。在本领域中，“同一性”还意指如通过2个或更多个氨基酸残基串之间的匹配数目测定的，肽之间的序列亲缘关系程度。“同一性”测量通过特定数学模型或计算机程序（即，“算法”）解决的具有缺口比对（如果存在的话）的2个或更多个序列的较少之间的等同匹配百分比。相关肽的同一性可以通过已知方法容易地计算。此类方法包括但不限于，下述中描述的那些：Computational Molecular Biology，Lesk，A. M.，编辑，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics和Genome Projects，Smith，D. W.，编辑，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part 1，Griffin，A. M.和Griffin，H. G.，编辑，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑，M. Stockton Press，New York，1991；和Carillo等人，SIAM J. Applied Math. 48，1073（1988）。

测定同一性的优选方法设计为给出测试序列之间的最大匹配。测定同一性的方法在可公开获得的计算机程序中描述。测定2个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP（Devereux等人，Nucl. Acid. Res. 12，387（1984）；Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，Wis.）、BLASTP、BLASTN和FASTA（Altschul等人，J. Mol. Biol. 215，403-410（1990））。BLASTX程序可从美国国家生物技术信息中心（NCBI）和其他来源（BLAST Manual，Altschul等人NCB/NLM/NIH Bethesda，Md. 20894；Altschui等人，同上）公开获得。众所周知的Smith Waterman算法也可以用于测定同一性。

例如，使用计算机算法GAP（Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，Wis.），对于其待测定序列同一性百分比的2个肽就其分别氨基酸的最佳匹配进行比对（“匹配跨度”，如通过算法测定的）。缺口开放罚分（其计算为3乘以平均对角线；“平均对角线”是待使用的比较矩阵的对角线平均值；“对角线”是通过特定比较矩阵对每个完美氨基酸匹配指定的得分或数目）和缺口延伸罚分（这通常是{分数（1/10）}乘以缺口开放罚分），以及比较矩阵例如PAM 250或BLOSUM 62与算法结合使用。标准比较矩阵（关于PAM 250比较矩阵，参见Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequence and Structure，第5卷，supp.3（1978）；关于BLOSUM 62比较矩阵，参见Henikoff等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA 89，10915- 10919（1992））也由算法使用。

用于肽序列比较的优选参数包括下述：

算法：J. Mol. Biol. 48，443-453（1970）；比较矩阵：来自Henikoff等人，PNAS USA 89，10915-10919（1992）的BLOSUM 62；缺口罚分：12，缺口长度罚分：4，相似性阈值：0。

GAP程序对于上述参数有用。上述参数是使用GAP算法用于肽比较的缺省参数（不连同关于末端缺口的罚分）。

术语“相似性”是与同一性相关的概念，但与“同一性”形成对比，指包括等同匹配和保守置换匹配的序列关系。如果2个多肽序列具有例如（分数（10/20））等同氨基酸，并且其余部分全部是非保守置换，那么同一性和相似性百分比将都是50％。如果在相同例子中，存在其中是保守置换的5个更多位置，那么同一性百分比仍是50％，但相似性百分比将是75％（分数（15/20）））。因此，在其中存在保守置换的情况下，2个多肽之间的相似性程度将高于那2个多肽之间的同一性百分比。

包括SEQ ID No. 1的氨基酸序列的肽的保守置换（和对于编码核酸的相应修饰）将产生具有与包括SEQ ID No. 1的氨基酸序列的肽的那些类似的功能和化学特征的肽。相比之下，与包括SEQ ID No. 1的氨基酸序列的肽比较，根据本发明的肽的功能和/或化学特征中的基本修饰可以通过选择氨基酸序列中的置换来完成，所述置换在其对维持下述中的作用中显著不同：（a）分子主链在置换区域中的结构，例如作为片层或螺旋构象，（b）分子在靶位点处的电荷或疏水性，或（c）侧链的容积。

例如，“保守氨基酸置换”可以涉及用非天然残基置换天然氨基酸残基，从而使得对那个位置上的氨基酸残基的极性或电荷具有很少作用或无作用。此外，多肽中的任何天然残基还可以用丙氨酸置换，如先前已对于“丙氨酸扫描诱变”描述的（参见例如，MacLennan等人，Acta Physiol. Scand. Suppl. 643，55-67（1998）；Sasaki等人，Adv. Biophys. 35，1-24（1998），其讨论了丙氨酸扫描诱变）。

所需氨基酸置换（无论是保守还是非保守的）可以在需要此类置换时通过本领域技术人员进行测定。例如，氨基酸置换可以用于鉴定根据本发明的肽的重要残基，或加上已描述的突变增加或降低本文描述的肽对于受体的亲和力。

天然存在的氨基酸残基可以基于共同侧链性质进行分类：

1）疏水的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

2）中性亲水的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

3）酸性：Asp、Glu；

4）碱性：His、Lys、Arg；

5）影响链方向的残基：Gly、Pro；和

6）芳香族的：Trp、Tyr、Phe。

在进行此类改变中，可以考虑氨基酸的亲水指数。每个氨基酸基于其疏水性和电荷特征已指定亲水指数，这些是：异亮氨酸（+4.5）；缬氨酸（+4.2）；亮氨酸（+3.8）；苯丙氨酸（+2.8）；半胱氨酸/胱氨酸（+2.5）；甲硫氨酸（+1.9）；丙氨酸（+1.8）；甘氨酸（-0.4）；苏氨酸（-0.7）；丝氨酸（-0.8）；色氨酸（-0.9）；酪氨酸（-1.3）；脯氨酸（-1.6）；组氨酸（-3.2）；谷氨酸盐（-3.5）；谷氨酰胺（-3.5）；天冬氨酸盐（-3.5）；天冬酰胺（-3.5）；赖氨酸（-3.9）和精氨酸（-4.5）。

亲水氨基酸指数在对蛋白质赋予相互作用生物功能中的重要性是本领域理解的。Kyte等人，J. Mol. Biol.，157. 105-131（1982）。已知特定氨基酸可以置换具有相似亲水指数或得分的其他氨基酸，并且仍保留相似生物活性。在基于亲水指数进行改变中，其亲水指数在±0.2内的氨基酸的置换是优选的，在±1内的那些是特别优选的，并且在+0.5内的那些是更加特别优选的。如由其相邻氨基酸的亲水性控制的，蛋白质的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性相关，即与蛋白质的生物学性质相关。

已对氨基酸残基指定下述亲水性值：精氨酸（+3.0）；赖氨酸（+3.0）；天冬氨酸盐（+3.0±1）；谷氨酸盐（+3.0±1）；丝氨酸（+0.3）；天冬酰胺（+0.2）；谷氨酸盐（+0.2）；甘氨酸（0）；苏氨酸（-0.4）；脯氨酸（-0.5±1）；丙氨酸（-0.5）；组氨酸（-0.5）；半胱氨酸（-1.0）；甲硫氨酸（-1.3）；缬氨酸（-1.5）；亮氨酸（-1.8）；异亮氨酸（-1.8）；酪氨酸（-2.3）；苯丙氨酸（-2.5）；色氨酸（-3.4）。在基于相似亲水性值进行改变中，其亲水性值在±2内的氨基酸的置换是优选的，在±1内的那些是特别优选的，并且在+0.5内的那些是更加特别优选的。

本发明的多肽还可以包括非天然存在的氨基酸。

生长激素多肽

在本文背景中，单词“人生长激素（hGH）”和“野生型hGH（wthGH）可互换使用，并且都指具有如SEQ ID No. 1的氨基酸序列的蛋白质。

如本文使用的，在本发明的背景中，术语“生长激素多肽”意指包括氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与SEQ ID No. 1具有至少80％同一性。

在本发明的一个实施方案中，生长激素多肽是包括氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与SEQ ID No. 1具有至少85％，例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性。

在本发明的一个实施方案中，生长激素多肽是此类多肽的片段，所述片段已保留此类肽的显著量的生长激素活性，例如具有基本上相同的生长激素活性。

在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物是截短形式的hGH，即一个或多个氨基酸残基已从与SEQ No. 1对应的N和/或C末端缺失，其中所述化合物保留野生型hGH的所需生物学性质。

在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物是包括氨基酸序列的多肽，所述序列至少20％，例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％同一性、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％类似于SEQ ID No. 1，并且所述多肽在相关hGH测定中具有hGH活性至少1％，例如至少5％、例如至少10％、例如至少25％的活性。

为了避免疑问，本发明的生长激素化合物还可以具有比野生型hGH更高的活性。如果生长激素化合物以某些方式衍生，那么生长激素相对于hGH的活性应在未衍生的生长激素化合物上进行测量，因为衍生化可以显著改变活性。例如在由延长生长激素化合物体内半衰期的性质修改基团衍生的生长激素化合物的情况下，衍生的生长激素化合物的活性可以比hGH的活性低得多，所述降低由延长的停留时间抵消。在一个实施方案中，生长激素化合物是此类多肽的片段，所述片段如上所述已保留显著量的生长激素活性。

另外的二硫桥可以引入其内的GH化合物的其他例子包括下述中公开的那些：WO 92/09690（Genentech）、US 6,004931（Genentech）、US 6,143,523（Genentech）、US 6,136,536（Genentech）、US 6,057,292（Genentech）、US 5,849,535（Genentech）、WO 97/11178（Genentech）、WO 90/04788（Genentech）、WO 02/055532（Maxygen APS和Maxygen Holdings）、US 5,951,972（American Cynanamid Corporation）、US 2003/0162949（Bolder Biotechnologies，Inc.），所述专利引入本文作为参考。

在一个目前优选的实施方案中，生长激素多肽是人生长激素多肽，特别是重组人生长激素多肽。在关于此的一个重要变体中，人生长激素多肽是修饰的人生长激素多肽，特别是PEG化的人生长激素多肽、高糖基化生长激素或具有超过2个二硫桥的多肽。

亲和树脂的制备

亲和树脂原则上可以以2种根本不同的方式进行制备，即（i）通过以游离形式合成配体且随后直接或经由接头（参见上文）使配体固定到固相材料，或（ii）通过使固相材料官能化且其后顺次合成一个或多个配体。就第一种变体而言，固定技术是本领域容易获得的，例如在Hermanson等人中（参见上文）。就第二种变体而言，技术也是容易获得的，例如本领域已知的固相肽合成技术和衍生技术[Fields，G. B.等人（1992）Principles and practice of solid-phase peptide synthesis. In Synthetic Peptides：A User's Guide（Grant，G.A.,编辑），第77-183页，W. H. Freeman]和[Fields，G. B.，编辑（1997）Solid-phase peptide synthesis. Methods in Enzymology 289. 3）Dorwald，F. Z. Organic synthesis on solid phase— supports，linkers，reactions；Wiley-VCH：Weinheim，2000]。

关于此的实例在实施例1和2中提供。

步骤（ a ） - 使生长激素多肽与亲和树脂接触

在该方法的第一个步骤中，在促进所述生长激素多肽的部分与所述亲和树脂结合的条件下，使含有生长激素多肽的悬浮液或溶液与亲和树脂接触。目的是促进悬浮液含有生长激素的部分或含有GH的溶液与所述亲和树脂的结合。

术语“部分”与步骤（a）结合意指至少30％（即30- 100％）的生长激素多肽质量存在于悬浮液或溶液中。应当理解在大多数情况下希望结合远远超过30％的生长激素多肽质量，例如至少50％、或至少70％或占优势部分。术语“占优势部分”意指至少90％的生长激素多肽质量存在于悬浮液或溶液中。优选地，甚至更高的部分成为与亲和树脂结合，例如质量的至少95％、或质量的至少98％、或质量的至少99％、或甚至基本上所有的生长激素多肽质量都存在于含有生长激素多肽的悬浮液或溶液中。

亲和树脂的最常见的排列是以柱的形式。在分批容器中的排列当然也是可能的。

生长激素多肽悬浮液或溶液的接触一般根据常规方案进行，即悬浮液或溶液的浓度、温度、离子强度等可以照常，并且亲和树脂可以在应用前照常洗涤且平衡。

生长激素多肽的载量一般是至少5.6 g/L亲和树脂，例如在1-20.0 g范围内，例如3.0-10.0 g生长激素多肽/L以湿润形式的亲和树脂，并且含有生长激素多肽的悬浮液或溶液一般以1-50柱体积/小时（CV/h）的流速装载，例如25-35 CV/h。

在应用于亲和树脂前和后含有生长激素多肽的悬浮液或溶液的pH看起来对于污染物的形成例如以二聚物的形式和生长激素多肽的降解产物起相关作用。因此，优选含有生长激素多肽的悬浮液或溶液以液体形式，并且在应用于亲和树脂后具有在3.0-10.0范围中的pH，例如在3.0-7.0或6.5-10.0范围中。在某些有利的实施方案中，含有生长激素多肽的悬浮液或溶液具有在4.0-7.0范围中的pH，或在7.0-9.0范围中，或在4.5-8.5范围中。优选pH范围将是5.0-6.5。

一般地，导电性是至少1 mS/cm，例如40 mS/cm、例如至少50 mS/cm、例如至少100 mS/cm、例如至少200 mS/cm。

生长激素多肽悬浮液或溶液的温度一般是0-30℃，例如约2-25℃。

具有结合的生长激素多肽的亲和树脂的温度一般是0-30℃，例如约2-25℃，例如通过使用冷却套管和控制温度的溶液维持在指定范围内。

步骤（ b ） - 洗涤步骤（任选的）

在使生长激素多肽与亲和树脂结合后，一般执行洗涤步骤（b），以便去除与亲和树脂非特异性结合的蛋白质。通过这个步骤，在亲和树脂上的生长激素多肽的保留（结合）部分将具有低得多的污染物丰度。

这个洗涤步骤（b）优选用具有在2.0-6.9范围中的pH的洗涤缓冲液进行。在某些有利的实施方案中，在应用于亲和树脂后，洗涤缓冲液具有在3.0-10.0范围中的pH，例如在3.0-7.0或6.5-10.0范围中。在某些有利的实施方案中洗涤缓冲液具有在4.0-7.0范围中的pH，或在7.0-9.0范围中，或在4.5-8.5范围中。

洗涤步骤（b）一般以1-50柱体积/小时的流速进行。

洗涤缓冲液一般是包括缓冲试剂的水溶液，一般是包括选择下述的至少一种组分的缓冲试剂： MES、PIPES、ACES、BES、TES、HEPES、TRIS、BISTRIS、三乙醇胺、组氨酸、咪唑、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰胺、磷酸、乙酸（例如乙酸钠）、乳酸、戊二酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、马来酸和琥珀酸的酸和盐。应当理解缓冲试剂可以包括2种或更多种组分的混合物，其中所述混合物能够提供在指定范围中的pH值。作为例子可以提及乙酸和乙酸钠等。

除缓冲试剂外，洗涤缓冲液还可以含有非离子型去垢剂例如NP40、Triton-X100、Tween -80，或其他添加剂例如辛酸。

除缓冲试剂外，洗涤缓冲液还可以含有离子强度增加剂，其不改变缓冲液的pH，例如氯化钠、硫酸钠等。

在本发明的一个实施方案中，步骤（b）涉及包括在pH 6.0-6.5下的0-50 mM BisTris的至少一种洗涤缓冲液，优选在约室温下。

在本发明的一个实施方案中，步骤（b）涉及在ph 7.5下的25mM Tris-HCl的至少一种洗涤缓冲液（缓冲液A）。

应当理解洗涤步骤（b）可以通过使用一种、两种或数种不同的洗涤缓冲液，或通过应用梯度洗涤缓冲液进行。

还应当指出洗涤步骤和洗脱步骤不必是分开步骤，而是可以组合，特别是如果在洗脱步骤中利用梯度洗脱缓冲液。

步骤（ c ） - 洗脱步骤

在一个或多个洗涤步骤（c）后，用洗脱缓冲液洗脱亲和树脂，并且收集作为洗脱物的纯化生长激素多肽。

很大的变化性对于洗脱步骤（c）是可能的。

洗脱类型不是特别关键的，因此，例如可以用包括逐步减少梯度的盐的洗脱缓冲液洗脱，用线性减少梯度的盐洗脱（例如梯度保留梯度谱（gradient-hold-gradient profile）或其他变化形式），或使用pH梯度，或使用温度梯度，或前述的组合。

最终洗脱缓冲液的导电性优选高于步骤（a）中包括生长激素多肽的组合物的导电性。

在大多数情况下，步骤（c）中的洗脱缓冲液一般具有如步骤（a）和（b）中的pH。然而，步骤（c）中的洗脱缓冲液也可以具有高于步骤（a）和（b）中的pH。

还优选的是其中步骤（c）中的洗脱缓冲液具有7.0 – 8.0之间的pH的实施方案。

在一个更加优选的实施方案中，洗脱缓冲液包含在pH 6.5-7.5下的25-200 mM BisTris，优选在约室温下。

在另一个优选实施方案中，洗脱缓冲液包含在pH 7.5-8.0下的25-200 mM TRIS。

在另一个优选实施方案中，洗脱缓冲液包含在pH 8.0下的50 mM三乙醇胺。

在另一个优选实施方案中，洗脱缓冲液包含与上述缓冲液任一组合的1 M NaCl或1 M MgCl₂。

在另一个优选实施方案中，洗脱缓冲液包含与上述缓冲液任一组合的5-30％v/v甘油或丙二醇。

一般地，本发明的方法能够使其他蛋白质的含量减少至少50％，然而，更优选地且更实际地，减少是至少60％，例如至少70％或甚至至少80％或至少85％。

通常，亲和树脂可以通过一系列步骤进行再生用于后续使用的目的。

应当指出洗涤步骤和洗脱步骤不必是分开步骤，而是可以组合，特别是如果在洗脱步骤中利用梯度洗脱缓冲液。

尽管不限于其，但本发明的方法对于生长激素多肽的“工业规模”（或“大规模”）纯化特别可行。术语“工业规模”一般意指这样的方法，其中液体生长激素多肽组合物的体积是至少10 L，例如至少50 L、例如至少500 L、或至少5000 L，或其中产物的重量是至少10 g（干物质），例如至少100 g、例如至少500 g、例如1-15,000 g。

新型亲和树脂

认为本文描述的最有利的亲和树脂中的一些是如此新型的。因此，本发明还提供了包括具有与之共价固定的一种或多种配体，即上文描述的配体的固相材料的新型亲和树脂。

本发明还提供了包括具有与之共价固定的一种或多种配体，即上文描述的配体的固相材料的新型亲和树脂。

本发明的一个实施方案提供了用于纯化生长激素多肽的方法，所述方法包括步骤：

（a）在促进生长激素多肽的部分与亲和树脂结合的条件下，使含有所述生长激素多肽的悬浮液或溶液与所述亲和树脂接触；

（b）任选地用洗涤缓冲液洗涤含有生长激素多肽的所述亲和树脂；和

（c）用洗脱缓冲液洗脱含有生长激素多肽的所述亲和树脂，并且收集作为洗脱物的生长激素多肽；

其中所述亲和树脂包括具有与之共价固定的具有通式（I）的一种或多种配体的固相材料，

其中

i = 1、2、...、m，并且j =1、2、...、n；

n和m是独立地在0-3范围中的整数，条件是n+m总和在1-4范围中；

p、q和r是独立地在0-6范围中的整数；

R1和R2独立地选自氢和C_1-6-烷基；

X是直接或经由接头用于使配体与固相材料连接的基团，X选自羧酸（-COOH）、羧酸酯（-COOR）、羧酸酐（-COOCOR）、羧酸卤化物（-COHal）、磺酸（-S(=O)₂OH）、磺酰氯（-S(=O)₂Cl）、巯基（-SH）、二硫化物（-S-S-R）、羟基（-OH）、醛（C(=O)H）、环氧化物（-CH(O)CH₂）、氰化物（-CN）、卤素（-Hal）、伯胺（-NH₂）、仲胺（-NHR）、酰肼（-NH=NH₂）和叠氮化物（-N₃），其中R选自任选取代的C_1-12-烷基，并且Hal是卤素；和所述配体（排除“X”和任何接头）的总分子量是200-2000 g/mol。

在本发明的一个实施方案中，Z1和Z2独立地选自氢、C_1-6烷基、呫吨-9-羰基、2-氨基烟酰基、2-喹哪啶羰基、4,8-二羟基-2-喹啉羰基、4-喹啉羰基、5-甲基-2-硝基苯甲酰基、2-（巯基苯并咪唑）乙酰基、5-甲基-2-苯基-2H-1,2,3-三唑-4-羰基、6-羟基-2-萘甲酰基、4,7-二甲基吡唑并[5,1-c][1,2,4]三嗪-3-羰基、3-氨基-4-（苯磺酰）-2-噻吩羰基、（+/-）-3-氧代-1-茚满羰基、5,6,7,8-四氢吖啶-9-羰基、2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-3-羰基、5-（4-甲基-2-硝基苯基）糠酰基、1-环己基-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羰基、喹喔啉-6-羰基和4-甲基-2-苯基嘧啶-5-羰基。

在本发明的一个实施方案中，Z1和Z2独立地选自氢、C_1-6 烷基、呫吨-9-基-羰基、5-甲基-2-苯基-2H-1,2,3-三唑-4-基-羰基、3-氨基-（苯磺酰）-噻吩-2-基-羰基、（+/-）-3-氧代-1-茚满基、5,6,7,8-四氢吖啶-9-基-羰基和2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基-羰基。

在本发明的一个实施方案中，Z1包括三环任选取代的杂芳族基团。

在本发明的一个实施方案中，配体如上文对于通式（I）、（II）和（III）且进一步依照各种实施方案特别是通式（II）和（III）的那些实施方案指定的。目前最有利的配体是上文举例说明的配体编号（1）-（16）。

在本发明的一个实施方案中，提供了用于纯化生长激素多肽的方法，所述方法包括步骤：

其中所述配体具有通式（II），

其中

A2₁和A2₂各自独立地选自α-氨基酸和β-氨基酸。

在本发明的一个实施方案中，提供了这样的方法，其中A2₁选自精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸和赖氨酸，并且A2₂选自精氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸和色氨酸。

在本发明的一个实施方案中，提供了纯化生长激素多肽的方法，其中所述配体具有通式（III），

在本发明的一个实施方案中，提供了这样的方法，其中所述配体选自编号（1）-（16）：

。

本发明的一个实施方案提供了纯化生长激素多肽的方法，其中在步骤（b）中，至少一种洗涤缓冲液包含在pH 6.0-6.5下的0-50 mM BisTris。

本发明的一个实施方案提供了纯化生长激素多肽的方法，其中在步骤（c）中，洗脱缓冲液具有7.0 – 8.0之间的pH。

本发明的一个实施方案提供了纯化生长激素多肽的方法，其中洗脱缓冲液包含在pH 7.0-7.5下的0-200 mM BisTris。

本发明的一个实施方案提供了纯化生长激素多肽的方法，其中生长激素多肽是人生长激素多肽。

本发明的一个实施方案提供了纯化生长激素多肽的方法，其中人生长激素多肽是重组人生长激素多肽。

本发明的一个实施方案提供了纯化生长激素多肽的方法，其中人生长激素多肽是修饰的人生长激素多肽。

本发明的一个实施方案提供了纯化生长激素多肽的方法，其中修饰的人生长激素多肽是PEG化的人生长激素多肽。

本发明的一个实施方案提供了亲和树脂，其包括固相材料，所述固相材料具有与之共价固定的具有通式（I）的一种或多种配体

其中

i = 1、2、...、m，并且j =1、2、...、n；

p、q和r是独立地在0-6范围中的整数；

R1和R2独立地选自氢和C_1-6-烷基；

本发明的一个实施方案提供了亲和树脂，其中所述配体是如根据上述实施方案中任何一个指定的。

本发明的一个实施方案提供了选自如上所述的配体（1）-（16）的配体，其中所述配体经由羧酸基团、直接或经由接头与所述亲和树脂的固相材料共价连接。

本发明的一个实施方案提供了选自本文描述的配体（1）-（16）的亲和配体。

新型亲和树脂特别用于纯化和/或分离生物分子，例如蛋白质，特别是生长激素多肽。亲和配体是关于生长激素多肽的特异性结合配偶体，并且可以使所述多肽与紧密相关蛋白质分离。

在本发明的一个实施方案中，配体固定到传感器或阵列板的表面（“固相材料”），并且用于检测和/或定量生物样品中的生长激素多肽。

当在本文中使用时，术语“生物样品”包括天然样品或得自其他方法的样品，所述其他方法例如工业方法、重组方法，并且包括“体液”，即从生物或生物的组织中被提取、排泄或分泌的任何液体物质。体液不一定含有细胞。与本发明有关的体液包括但不限于全血、血清、尿、血浆、脑脊髓液、泪、乳、滑液（sinovial fluid）和羊水。

在本发明的一个实施方案中，多个配体固定到阵列板的表面（“固相材料”），并且以多个点排列，其中每个点代表一个配体。此类官能化阵列可以用于检测溶液中生长激素多肽的存在。此类阵列可以用于诊断应用，以检测生物样品中生长激素多肽的存在。

在本发明的一个实施方案中，多个配体固定到悬臂式传感器的结合表面（“固相材料”）用于检测和任选定量生长激素多肽。多个亲和配体可以固定到多个悬臂，其中每个悬臂代表一个配体。此类官能化阵列可以用于检测溶液中各种抗体的存在。此类多传感器可以用于诊断应用，以检测生物样品中特定生长激素多肽的存在。

此外，认为一些配体是由此新型的。

因此，本发明进一步提供了如上文指定的具有通式（I）、（II）和（III）的亲和配体，特别是选自配体（1）-（16）的那些配体。

实施例

实施例 1

使用固相组合方法连同编码珠技术，开发用于纯化人生长激素（hGH）的小分子亲和树脂。

hGH是在人中刺激生长和细胞繁殖的蛋白质激素。它通过形成活性1:2（hGH:hGHbp）复合物来结合其受体hGHbp。尽管激素结合在其受体上的相同位点，但hGH上的2个结合位点与具有最高亲和力的位点1在结构上不同。位点1是大蛋白质表面，包含在每个蛋白质上的超过30个氨基酸。亲和力集中于受体的少数残基，特别是Trp104和Trp169。

在计算机上虚拟 (in silico) 筛选和文库设计。

为了构建天然配体的小分子模拟物，选择具有3个多样性点的分支结构（IV）

，

其中AA2和AA1是氨基酸残基，并且CA是羧基残基。为了增加发现活性配体的可能性，针对hGH（1A22）的晶体结构在计算机上虚拟筛选虚拟40,000个化合物文库。通过从化学制品数据库（ACD）中选择一组2,500个构件块来设计文库。通过在R1、R2和R3位置中掺入构件块，在Sybyl（Legion）中构建文库。使用对接算法FlexX，同样在Sybyl中完成对接。根据这些结果，基于数种不同的评分函数以及化学稳定性、毒性和可用性，对于CA选择18个构件块的亚组，并且对于AA1和AA2各自选择11个构件块的亚组。

AA1和AA2独立地选自Asp、His、Asn、Thr、Pro、Trp、Lys、Tyr、Ile、Phe和Arg。CA选自如表I中表示的CA1-CA18

表I.

。

文库合成和筛选

在编码的聚乙二醇-丙烯酰胺（PEGA）珠上通过分开混合（split-and-mix）固相合成来合成配体文库。整个文库由2178种独特化合物组成。珠编码技术基于由固定在PEGA-珠内部的随机位置中的荧光颗粒制成的三维图像识别模式。在每次化学转化后通过配备3个垂直CCD照相机的仪器记录单个珠编码。3个图像成三角形以给出每个珠的独特编码，使得它的化学历史能够被追踪[S. F. Christensen，M. Meldal，Genetic Engineering News，25，No. 7，2005年4月1日]。

使珠与罗丹明标记的hGH一起在PBS中孵育，用PBS洗涤，并且测量其荧光且定量。具有对于hGH具有高亲和力的配体的珠具有高荧光值，并且具有对于hGH具有低亲和力的配体的珠具有低荧光。通过使每个珠的荧光值与它携带的配体的构件块顺序匹配，对于所有2178种化合物建立结构-亲和力关系。此处未显示关于每种化合物的荧光值。相反，关于各个AA1、各个AA2和各个CA的平均荧光值显示于图1中。

基于结构-亲和力数据，16种预期高亲和力配体（L1-L16）在表II中表示，

表II

并且2种预期低亲和力配体在表III中表示（编号L17和L18），

表III

将它们在Fractogel Amino（Merck）上以胺负荷0.16 mmol/g和粒径40-90 μm逐步合成。树脂用DMF、DCM和乙醇彻底洗涤，并且装进1 mL柱中，并且用0.2 M NaOH随后用20％乙醇洗涤，并且用在pH=7.50下的25 mM Tris-HCl（缓冲液A）平衡。

通过下述步骤对每种树脂样品测量对于野生型hGH的结合能力：

a）以0.5 mL/分钟的流速用在缓冲液A中的5 mg/mL hGH溶液装载柱，

b）用至少10个柱体积的缓冲液A洗涤柱，直至观察到离开柱的缓冲液稳定的低的UV吸光度，

c）通过应用在pH=7.5下的1M NaCl/25 mM Tris（缓冲液B）梯度洗脱蛋白质

d）用0.2 M NaOH、随后用缓冲液B、且随后用缓冲液A清洁柱。

通过整合步骤（c）方法中的UV信号计算结合能力，并且对于上文每种配体显示出。

通过下述步骤测试树脂选择性：

（a）用由缓冲液A稀释5倍的hGH发酵肉汤装载柱，

（b）用至少10个柱体积的缓冲液A洗涤柱，直至观察到离开柱的缓冲液稳定的低的UV吸光度，

（c）通过应用缓冲液B的梯度洗脱蛋白质

（d）用0.2 M NaOH、随后用缓冲液B、且随后用缓冲液A清洁柱。

通过在步骤（g）过程中获得的洗脱物的SDS page凝胶来判断“观察到的选择性”，并且对于上文每种配体显示出。具有“非常好”选择性的树脂的例子（在Fractogel上的配体L11）和具有“中等”选择性的树脂的例子（在Fractogel上的配体L6）在图3中给出。

实施例 2

在Fractogel Amino上合成具有下述结构的配体，

并且通过与实施例1中所述相同的操作进行测试。所得到的树脂具有<0.5 mg/mL的结合能力。未测试选择性。

L19的羧酸残基是取代的萘酰基（napthoyl），并且在结构上类似实施例1中的CA3、CA4、CA5、CA9和CA17，根据图2所有这些导致非常低到中等的平均荧光值。在这个基础上，将预期L19针对hGH具有低亲和力。另一方面，根据表1，将预期L19的氨基酸残基组合（AA1，AA2）=（Tyr，Arg）引起针对hGH的高亲和力。然而，看起来氨基酸残基组合对配体针对hGH的亲和力的预期正效应由羧酸残基的预期负效应抵消，导致L19的净低hGH亲和力。

实施例 3 –在氨基官能化的 Fractogel 树脂上直接合成来自实施例 1 的配体 L10 。

在烧结注射器中用水（3x）、乙醇（3x）和DMF（5x）洗涤Fractogel EMD-氨基树脂（70 mL，2.34 mmol，由Merck KGaA供应），并且转移至圆底烧瓶（250 mL）。使Fmoc-L-DAPA（Alloc）-OH（2.88 g，3.0 eq，7.0 mmol）和TBTU（2.10 g，2.8 eq，6.5 mmol）溶解于DMF（50 mL）和N-乙基吗啉（1.18 mL，4.0 eq，9.4 mmol）中，并且预活化10分钟。将澄清溶液加入树脂中，并且加入另外50 mL DMF。将烧瓶置于振荡器上过夜。将树脂转移至大烧结注射器，并且用DMF（5x）和DCM（5x）洗涤。通过小样品的Fmoc定量测定0.19 mmol/g的负荷。其余氨基残基用在DMF中的20％乙酸酐加帽（capped）1小时。树脂用DMF（5x）和DCM（5x）洗涤。阴性Kaiser测试指出树脂上不存在游离氨基基团。部分树脂（15 mL）用DMF（x5）洗涤，并且通过用在DMF中的20％哌啶处理2+30分钟去除Fmoc保护基团。树脂用DMF（5x）和DCM（x5）洗涤，并且小样品给出阳性Kaiser测试。树脂用DMF（5x）洗涤。使Fmoc-L-Phe-OH（582 mg，3.0 eq，1.50 mmol）和TBTU（450 mg，2.8 eq，1.40 mmol）溶解于DMF（10 mL）和NEM（254 μL，4.0 eq，2.00 mmol）中，并且预活化10分钟。将溶液加入树脂中，并且在加盖的烧结注射器中振荡过夜。树脂用DMF（x5）、DCM（x5）充分洗涤，并且给出阴性Kaiser测试。树脂用DMF（x5）洗涤，并且通过用在DMF中的20％哌啶处理2+30分钟去除Fmoc保护基团。Kaiser测试是阳性的。树脂用DMF（5x）洗涤。使Fmoc-L- He-OH（532 mg，3.0 eq，1.50 mmol）和TBTU（450 mg，2.8 eq，1.40 mmol）溶解于DMF（10 mL）和NEM（254 μL，4.0 eq，2.00 mmol）中，并且预活化10分钟。将溶液加入树脂中，并且在加盖的烧结注射器中振荡过夜。Kaiser测试是阴性的，但具有轻微青色着色。树脂用在DMF中的20 ％乙酸酐加帽1小时，并且用DMF（5x）、DCM（5x）洗涤，以给出阴性Kaiser测试。容纳树脂的注射器配备橡皮隔片，并且保持在N₂大气下。树脂用干燥DCM（2x）洗涤，所述干燥DCM（2x）已用N₂充分除气。为了去除Alloc保护基团，使Me₂NH BH₃（590 mg，20 eq，10.0 mmol）溶解于干燥除气的DCM（10 mL）中，并且加入树脂中，所述树脂振荡且静置10分钟。使Pd（PPh₃）₄（116 mg，0.2 eq，0.1 mmol）溶解于除气的DCM（1 mL）中，并且加入振荡1小时的树脂中。树脂用DCM（3x）洗涤，并且重复操作以确保完全去保护。树脂用DCM（5x）、DMF（5x）、DCM（5x）、乙醇（5x）、DCM（5x）和DMF（5x）充分洗涤。使l,2,3,4-四氢吖啶-9-羧酸（342 mg，3.0 eq，1.50 mmol）和TBTU（450 mg，2.8 eq，1.40 mmol）溶解于DMF（10 mL）、NEM（254 μL，4.0 eq，2.00 mmol）和10滴DMSO中，并且预活化10分钟。将溶液加入树脂中，并且在加盖的烧结注射器中振荡过夜。树脂用DMF（5x）、DCM（5x）和DMF（5x）洗涤，并且如上重复偶联操作。通过用在DMF中的20％哌啶处理5+40分钟去除Fmoc保护基团。具有对酸敏感的侧链保护基团的配体用TFA/水/TIS（93:5:2）处理1小时。树脂用DCM、乙醇、DCM、DMF、在DMF中的5 ％DIPEA、DMF、DCM、乙醇和水充分洗涤。

实施例 4 –合成来自实施例 1 的配体 L10 且与氨基官能化 Fractogel 树脂偶联

在氨基甲基聚苯乙烯树脂（由CBL Patras供应）上以实施例1中所述的方式合成配体L10，使用酸可切割的4-羟甲基苯氧基乙酸（HMPA，3 eq.）接头，所述接头使用在DCM中的DIC（3 eq.）和HOBt（3 eq.）连接。在干燥条件下使用在DCM中的1-（均三甲苯-2-磺酰）-3-硝基-1,2,4-三唑（MSNT，3 eq）和1-甲基咪唑（2.25 eq），使Fmoc-L-DAPA（Alloc）-OH（3 eq）与树脂连接。使用苯基硅烷作为清除剂完成Alloc基团的去保护。使用在NMP中的HATU和DIPEA完成1,2,3,4-四氢吖啶-9-羧酸的偶联。使用TFA/水/TIS（93:5:2）从树脂中切割掉仍包含N ^α-Fmoc保护基团的配体。收集配体且通过快速层析纯化。使配体（1 eq）溶解于DMF和HATU（1 eq）中，且加入DIPEA（1.2 eq）。使配体预活化10分钟，并且随后加入Fractogel EMD-氨基树脂（1 eq，由Merck KGaA供应）中，并且在60℃下振荡3小时。这个操作随后重复2次。使用在DMF中的20％哌啶去除Fmoc保护基团进行2+30分钟。用DMF（5x）、DCM（5x）、乙醇（5x）和水（5x）充分洗涤树脂。

实施例 5 – L10 与氨基官能化琼脂糖树脂的偶联。

用25％乙醇/水（5x）、50％乙醇/水（5x）、75％乙醇/水（5x）、乙醇（5x）、25％NMP/乙醇（5x）、50％NMP/乙醇（5x）、75％NMP/乙醇（5x）和NMP（10x）洗涤氨基-琼脂糖（Amino-Sepharose）树脂（5 ml，～10 μmol氨基/ml）。使在Ile氨基基团上具有Boc保护的hGh配体L10（3当量）溶解于NMP/DMSO（2:1，5 ml）中，并且加入EDC（3当量）、HOAt（3当量）和DIPEA（4当量）。使反应混合物搅拌5分钟，并且随后加入树脂中且在室温下振荡4小时。过滤掉溶剂，并且用NMP（10 x）和DCM（5x）洗涤树脂。

使用30％TFA/DCM（30分钟）切割掉Boc保护，并且用DCM（5x）洗涤树脂。用10％DIPEA/DCM（10分钟）中和树脂，并且用DCM（5x）、NMP（6x）、75％NMP/乙醇（4x）、50％NMP/乙醇（4x）、25％NMP/乙醇（4x）、乙醇（6x）、75％乙醇/水（4x）、50％乙醇/水（4x）、25％乙醇/水（4x）、水（6x）和20％乙醇/水（4x）洗涤树脂。

实施例 6 – L2 与氨基官能化 Fractogel 树脂的偶联

在精氨酸部分上具有Pbf保护基团和在苯丙氨酸的氨基基团上具有Fmoc基团的配体L2（5 g）用TFA/水/TIS（93:5:2）（20 ml）在室温下处理3小时。蒸发溶剂，并且用冷二乙醚沉淀油性残基（oily residue）。用二乙醚（10 x）洗涤沉淀产物，并且冻干，获得以97％得率的产物。

用25％乙醇/水（5x）、50％乙醇/水（5x）、75％乙醇/水（5x）、乙醇（5x）、25％NMP/乙醇（5x）、50％NMP/乙醇（5x）、75％NMP/乙醇（5x）和NMP（10x）洗涤Fractogel EMD氨基树脂（5 ml）。

使Pbf切割的配体L2（3当量）溶解于NMP/DMSO（2:1，5 ml）中，并且加入EDC（3当量）、HOAt（3当量）和DIPEA（4当量）。使反应混合物搅拌5分钟，并且加入树脂中且在室温下振荡过夜。过滤掉溶剂，并且用NMP（10 x）洗涤树脂。用20％哌啶/NMP（30分钟）切割掉Fmoc，并且用NMP（6x）、75％NMP/乙醇（4x）、50％NMP/乙醇（4x）、25％NMP/乙醇（4x）、乙醇（6x）、75％乙醇/水（4x）、50％乙醇/水（4x）、25％乙醇/水（4x）、水（6x）和20％乙醇/水（4x）洗涤树脂。

实施例 7 - L2 与氨基官能化琼脂糖树脂的偶联

用25％乙醇/水（5x）、50％乙醇/水（5x）、75％乙醇/水（5x）、乙醇（5x）、25％NMP/乙醇（5x）、50％NMP/乙醇（5x）、75％NMP/乙醇（5x）和NMP（10x）洗涤氨基-琼脂糖树脂（5 ml，～10 μmol氨基/ml）。

使来自实施例6的Pbf切割的hGh配体006（3当量）溶解于NMP/DMSO（2:1，5 ml）中，并且加入EDC（3当量）、HOAt（3当量）和DIPEA（4当量）。使反应混合物搅拌5分钟，并且随后加入树脂中且在室温下振荡4小时。过滤掉溶剂，并且用NMP（10 x）洗涤树脂。用20％哌啶/NMP（30分钟）切割掉Fmoc，并且用NMP（6x）、75％NMP/乙醇（4x）、50％NMP/乙醇（4x）、25％NMP/乙醇（4x）、乙醇（6x）、75％乙醇/水（4x）、50％乙醇/水（4x）、25％乙醇/水（4x）、水（6x）和20％乙醇/水（4x）洗涤树脂。

实施例 8 – L14 与氨基官能化 Fractogel 树脂的偶联

使在赖氨酸的α和ε氨基上具有Boc保护的配体14（3当量）溶解于NMP/DMSO（2:1，5 ml）中，并且加入EDC（3当量）、HOAt（3当量）和DIPEA（4当量）。使反应混合物搅拌5分钟，并且加入树脂中且在室温下振荡过夜。过滤掉溶剂，并且用NMP（10 x）随后用二氯甲烷（5x）洗涤树脂。树脂随后用在二氯甲烷中的30％TFA处理30分钟，并且用水（5x）和乙醇（5x）洗涤树脂。用10％DIPEA/乙醇（10分钟）中和树脂，并且用乙醇（6x）、75％乙醇/水（4x）、50％乙醇/水（4x）、25％乙醇/水（4x）、水（6x）和20％乙醇/水（4x）洗涤树脂。

实施例 9 – L14 与氨基官能化琼脂糖树脂的偶联

用25％乙醇/水（5x）、50％乙醇/水（5x）、75％乙醇/水（5x、乙醇（5x）、25％NMP/乙醇（5x）、50％NMP/乙醇（5x）、75％NMP/乙醇（5x）和NMP（10x）洗涤氨基-琼脂糖树脂（5 ml，～10 μmol氨基/ml）。

使在赖氨酸的α和ε氨基上具有Boc保护的配体14（3当量）溶解于NMP/DMSO（2:1，5 ml）中，并且加入EDC（3当量）、HOAt（3当量）和DIPEA（4当量）。使反应混合物搅拌5分钟，并且随后加入树脂中且在室温下振荡4小时。过滤掉溶剂，并且用NMP（10 x）随后用二氯甲烷（5x）洗涤树脂。树脂随后用在二氯甲烷中的30％TFA处理30分钟，并且用水（5x）和乙醇（5x）洗涤树脂。用10％DIPEA/乙醇（10分钟）中和树脂，并且用乙醇（6x）、75％洗涤树脂。

实施例10. 与琼脂糖和Fractogel树脂偶联的配体L2、L10和L14对于hGH的结合能力。

通过下述步骤对于在约2 mL柱中的每种树脂样品测量对于野生型hGH的结合能力：

a）以1 mL/分钟的流速用在缓冲液A中的0.5 mg/mL hGH溶液装载柱，

b）用5或更多个柱体积的缓冲液A洗涤柱

c）通过应用在pH=7.5下的1M NaCl/25 mM Tris（缓冲液B）梯度洗脱蛋白质，

d）用0.2 M NaOH、随后用缓冲液B、且随后用缓冲液A清洁柱。

通过整合步骤（c）方法中的UV信号计算结合能力，并且在下表IV中显示。

表IV

。

实施例 11 –重组野生型人生长激素（ hGH ）的纯化

用1.0 mL在实施例3和4中制备的任一层析树脂作为在水中的1:1浆填充Tricorn 5/50（GE Healthcare Life Sciences，1 mL）柱。使柱与冷却至16℃的Äkta Explorer（GE Healthcare Life Sciences）液体层析系统连接。用0.2 M NaOH充分洗涤树脂，直至观察到稳定UV基线。树脂随后用1 M NaCl、25 mM Tris HCl缓冲液（缓冲液B，pH = 7.50）中和，并且用25 mM Tris HCl缓冲液（缓冲液A，pH = 7.50）平衡。使用注射器驱动的滤器（Millex HV，0.45 mm，Millipore）过滤微量过滤的大肠杆菌细胞培养液（2.61 mg/mL hGH滴度），并且随后用缓冲液A将200 μL稀释至1 mL。样品中hGH的预期总量是0.52 mg。将样品以2 mL/分钟装载到在100％缓冲液A中柱上，并且收集流出物。在用缓冲液A洗涤10个柱体积后，通过在6个柱体积上应用缓冲液B梯度洗脱吸附蛋白质，并且收集洗脱物。柱随后用0.2 M NaOH就地清洗（CIP），中和且平衡用于另一个运行。使用Invitrogen Nu-PAGE系统（预形成的Novex 4-12％Bis-Tris凝胶），通过SDS-PAGE测定洗脱物的纯度。使用制造商的方案运行凝胶。洗脱蛋白质的纯度对于2种树脂都是约75％。

实施例 12

在Fractogel Amino M（由Merck KgaA供应）上逐步合成来自实施例1的配体L10，并且将所得到的亲和树脂装进Tricorn 5/50，1 mL（GE Healthcare）中。

蛋白质样品：

hGH标准：使hGH在新鲜制备的50 mM NH₄HCO₃中溶解至20 mg/mL，随后用缓冲液A（50 mM Tris-HCl，pH = 7.50，T = 15℃（在Äkta中20℃））稀释至2或3.3 mg/mL。

hGH微量滤液缓冲液：来自hGH收获物的2.61mg/mL hGH大肠杆菌微量滤液。使冷冻的15 mL样品在室温下解冻，并且使用注射器驱动的滤器（0.22 mm）过滤。用缓冲液A稀释至0.52 mg hGH/mL。

装载条件：

缓冲液A1：50 mM BisTris-HCl，pH = 6.50，T = 15℃（在Äkta中20℃）），流动0.5 mL/分钟（150 cm/h）

洗脱条件：

缓冲液Z1：25 mM Tris-HCl，1M NaCl，pH = 7.50，T = 15℃（在Äkta中20℃）），流速0.5 mL/分钟（150 cm/h）

就地清洗（ CIP ）条件：

0.2 M NaOH。

在这些条件下的动态10％BT容量（纯化hGH）是6.7 mg/mL，而关于hGH微量滤液的动态10％BT容量是3.22 mg/mL。

200 mM Tris-HCl，pH 8.00、1 M NaCl、30％丙二醇的洗脱缓冲液导致hGH的高回收。使用这种洗脱缓冲液和上述50 mM BisTris-HCl，pH 6.5装载缓冲液。用hGH过量装载柱。来自使用这些条件的实验的结果在下文显示：

将装载缓冲液变成在pH 6.25下的50 mM BisTris-HCl，并且测试在pH 7.25、7.50和8.00下的不同洗脱缓冲液。结果在表V中概括。

表V.

表5.具有配体L10的亲和树脂的性能。

在pH 7.25下观察到最高纯度（91 ％），而如预期的在pH 8.00下的回收更高。在pH 8.00下，回收率较高但存在更多杂质。

用于具有下述条件的运行的层析谱和凝胶显示于图8中：装载缓冲液：在pH 6.25下的50 mM BisTris，和洗脱缓冲液：在pH 8.00下的50 mM BisTris。

实施例 13 - Fractogel- 配体 L10 –游离配体偶联

在3种不同偶联条件下，通过使配体L10与Fractogel Amino M偶联制备一组树脂。这种树脂具有33 μmol/mL的氨基密度，并且用配体L10完全装载。

。

所有3种树脂表现类似于在Fractogel上通过直接合成而合成的树脂，尽管对于纯hGH具有略微更高的容量。关于微量滤液hGH的容量类似于直接合成的树脂。

实施例 14

在Fractogel上直接合成来自实施例1的配体L14。树脂以5 mL规模评估。

装载缓冲液：在pH 6.25下的50 mM BisTris

洗脱缓冲液：在pH 8.00梯度下的50 mM BisTris

CIP：0.2 M NaOH

流动：2 mL/分钟

温度：15℃（通过Äkta测量20°）

关于纯hGH的动态10％BT容量：16.3 mg/mL

关于微量滤液hGH的动态10％BT容量：6.7 mg/mL

回收：92％

纯度：71％。

实施例 15

在Fractogel Amino上直接合成来自实施例1的配体L16。树脂以5 mL规模评估。

装载缓冲液：在pH 6.25下的50 mM BisTris

洗脱缓冲液：在pH 8.00梯度下的50 mM BisTris

CIP：0.2 M NaOH

流动：2 mL/分钟

温度：20℃

关于纯hGH的动态10％BT容量：11.9 mg/mL

关于微量滤液hGH的动态10％BT容量：5.7 mg/mL

回收：98％

纯度：70％。

实施例 16 高糖基化 hGH 与在 Fractogel 上的配体 F10 和 F14 的结合

用0.25 M HCl使包含高糖基化hGH的3 ml细胞收获物的pH从7.7调整到6.23，并且用水稀释3x。

将收获物应用于用50 mM BIS-TRIS pH 6.23平衡的1 mL树脂柱。在应用后，用相同缓冲液洗涤树脂（15 CV），并且用200 mM TrisHCl pH 8.0（10 CV）洗脱结合蛋白质。通过2种树脂纯化的高糖基化hGH的量是3.5 mg/mL。

讨论

预期的高亲和力配体的确结合hGH而预期的低亲和力配体（如预期的）显示出低亲和力的事实，表明在实施例1中生成且在图1和表2中呈现的结构-荧光数据构成用于预测具有通式（IV）的配体针对hGH的亲和力的良好基础。

此外，假定实施例1中概述的计算和实验操作构成用于设计、合成且筛选具有通式（I）的大量hGH亲和力配体的良好基础是合理的，条件是组合合成步骤数目根据变量m和n调整，参照通式（I）。

同样地，假定实施例1中概述的实验操作构成用于针对任何蛋白质筛选具有通式（I）的大量亲和力配体的良好基础是合理的，条件是组合合成步骤数目根据变量m和n调整，参照通式（I），并且用所讨论的蛋白质代替hGH执行荧光筛选。

如实施例3-9中举例说明的根据本发明的新型亲和树脂的合成和测试证实所述亲和树脂的工业可应用性包括针对涉及暴露于NaOH溶液的就地清洗操作的树脂稳定性。

机构申请人

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街道:

城市:

州:

国家:

邮编:

电话:

传真:

电子邮件:

<110> 机构名称: Novo Nordisk

申请项目

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<120> 名称: 使用包括特异性配体的亲和树脂用于纯化人生长激素多肽的方法

<130> 申请文件参考号: 7793.204-WO

<140> 目前申请号:

<141> 目前提交日期: ____-__-__

序列

--------

<213> 生物名称: 智人

<400> PreSequenceString :

FPTIPLSRLF DNAMLRAHRL HQLAFDTYQE FEEAYIPKEQ KYSFLQNPQT SLCFSESIPT 60

PSNREETQQK SNLELLRISL LLIQSWLEPV QFLRSVFANS LVYGASDSNV YDLLKDLEEG 120

IQTLMGRLED GSPRTGQIFK QTYSKFDTNS HNDDALLKNY GLLYCFRKDM DKVETFLRIV 180

QCRSVEGSCG F 191

<212> 类型: PRT

<211> 长度: 191

序列名称: SEQ ID NO: 1

序列描述:

Claims

1.一种用于纯化生长激素多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

其中所述亲和树脂是固相材料，所述固相材料具有与之共价固定的具有通式（I）的一种或多种配体，

其中

i = 1、2、...、m，并且j =1、2、...、n；

p、q和r是独立地在0-6范围中的整数；

R1和R2独立地选自氢和C_1-6-烷基；

X是直接或经由接头用于使所述配体与所述固相材料连接的基团，X选自羧酸（-COOH）、羧酸酯（-COOR）、羧酸酐（-COOCOR）、羧酸卤化物（-COHal）、磺酸（-S(=O)₂OH）、磺酰氯（-S(=O)₂Cl）、巯基（-SH）、二硫化物（-S-S-R）、羟基（-OH）、醛（C(=O)H）、环氧化物（-CH(O)CH₂）、氰化物（-CN）、卤素（-Hal）、伯胺（-NH₂）、仲胺（-NHR）、酰肼（-NH=NH₂）和叠氮化物（-N₃），其中R选自任选取代的C_1-12-烷基，并且Hal是卤素；和

2.根据权利要求1的方法，其中Z1和Z2独立地选自氢、C_1-6烷基、呫吨-9-羰基、2-氨基烟酰基、2-喹哪啶羰基、4,8-二羟基-2-喹啉羰基、4-喹啉羰基、5-甲基-2-硝基苯甲酰基、2-（巯基苯并咪唑）乙酰基、5-甲基-2-苯基-2H-1,2,3-三唑-4-羰基、6-羟基-2-萘甲酰基、4,7-二甲基吡唑并[5,1-c][1,2,4]三嗪-3-羰基、3-氨基-4-（苯磺酰）-2-噻吩羰基、（+/-）-3-氧代-1-茚满羰基、5,6,7,8-四氢吖啶-9-羰基、2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-3-羰基、5-（4-甲基-2-硝基苯基）糠酰基、1-环己基-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羰基、喹喔啉-6-羰基和4-甲基-2-苯基嘧啶-5-羰基。

3.根据权利要求1的方法，其中Z1和Z2独立地选自氢、C_1-6烷基、呫吨-9-基-羰基、5-甲基-2-苯基-2H-1,2,3-三唑-4-基-羰基、3-氨基-（苯磺酰）-噻吩-2-基-羰基、（+/-）-3-氧代-1-茚满基、5,6,7,8-四氢吖啶-9-基-羰基和2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基-羰基。

4.根据权利要求1的方法，其中Z1包括三环任选取代的杂芳族基团。

5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述配体具有通式（II），