CN102216320B - 肽、pna或寡核苷酸的耐溶剂渗滤 - Google Patents

肽、pna或寡核苷酸的耐溶剂渗滤 Download PDF

Info

Publication number
CN102216320B
CN102216320B CN200980140616.6A CN200980140616A CN102216320B CN 102216320 B CN102216320 B CN 102216320B CN 200980140616 A CN200980140616 A CN 200980140616A CN 102216320 B CN102216320 B CN 102216320B
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
peg
film
synthesis
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200980140616.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102216320A (zh
Inventor
A·G·莱文斯顿
L·G·皮瓦
S·W·J·苏
R·坎波斯瓦斯康切勒斯
R·J·利瑟巴罗
E·W·塔特
P·R·J·加夫尼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IP2 IPO Innovation Co., Ltd.
Original Assignee
Imperial Innovations Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Imperial Innovations Ltd filed Critical Imperial Innovations Ltd
Publication of CN102216320A publication Critical patent/CN102216320A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102216320B publication Critical patent/CN102216320B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

按照本发明，提供用于制备选自肽、寡核苷酸和肽核酸的第一化合物的方法。该方法包括合成第一化合物，然后用渗滤法把在步骤(i)中形成的第一化合物与第二化合物分离，该第二化合物是第一化合物合成的反应副产物和/或用于合成第一化合物的过量试剂。用于渗滤法的膜在有机溶剂中稳定并且所提供的对第一化合物的排斥大于对第二化合物的排斥。

Description

肽、PNA或寡核苷酸的耐溶剂渗滤
发明领域
本发明涉及用于制备化合物、特别是选自肽、寡核苷酸和肽核酸的化合物的方法。
发明背景
肽、寡核苷酸和肽核酸是生物学上的重要分子，包括由不同重复单元组成的聚合物。就肽而言，重复单元是氨基酸或其衍生物，而就寡核苷酸而言，重复单元是核苷酸或其衍生物。寡核苷酸可进一步分成RNA寡核苷酸和DNA寡核苷酸，正如为本领域技术人员所熟知的，参见例如P.S.Millar，BioconjugateChemistry，1990，第1卷，第187-191页。就肽核酸(PNA)而言，骨架由通过肽键连接的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成。各种各样的嘌呤碱基和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键连接到骨架上。肽中氨基酸的序列、RNA中RNA核苷酸的序列或DNA中DNA核苷酸的序列、或PNA中嘌呤碱基和嘧啶碱基的序列，决定生物系统中所述化合物的功能与作用。
所述化合物通过将其重复单元偶联在一起而合成，以得到特定序列。可使用保护基在一个或更多个反应位点上保护重复单元，以将偶联反应导向被保护重复单元上的特定位点。在偶联反应之后可能需要脱保护反应，以除去保护基并为随后的偶联反应准备化合物。合成按周期顺序发生，每个周期包括偶联反应和紧接着的脱保护反应。在反应之间，将过量试剂和反应副产物的痕迹去除至非常低的水平对于预防重复单元序列中形成的错误序列是必要的。当偶联反应或脱保护反应在液相中进行时，该纯化通常是冗长的，而且通过耗时的沉淀、结晶或色谱操作来实现。可获得的用于肽、寡核苷酸和肽核酸偶联和脱保护的化学和方法已经有大量的文献记载。
肽合成于1963年由于固相合成的出现(MerrifieldRBJAmChemSoc8.5，(1963)2149)而得到变革。在这种方法中，序列中第一个氨基酸结合到树脂珠上。随后的氨基酸被偶联到结合于树脂的肽上，最后，当所需肽已经生长时，将其从树脂上切下。重要的是，在每个偶联反应或脱保护反应结束时，残留的未反应的受保护氨基酸、过量试剂和其他副产物可通过洗涤除去，包括在过滤器上洗涤树脂，或用溶剂冲洗树脂的填充床。固相肽合成现在是实验室和商业合成的技术标准。寡核苷酸的合成遵循与肽相似的技术发展，如Sanghvi，YS，OrgProcRes&Dev4(2000)168-169所描述的，并且依赖于固相合成，其中第一个寡核苷酸被连接到固相上。其他寡核苷酸通过偶联反应和脱保护反应的循环而连接，在反应之间通过洗涤，包括在过滤器上洗涤树脂，或用溶剂冲洗树脂的填充床来进行纯化。
膜法在分离科学领域内众所周知，可适用于液相和气相中一系列不同分子量样品的分离(参见例如″MembraneTechnology″于KirkOthmerEncyclopediaofChemicalTechnology，第4版1993，第16卷，第135-193页)。纳米过滤是使用膜的膜法，膜孔在0.5至5纳米的范围内，且具有200-3,000道尔顿的MW截止值。纳米过滤已经广泛应用于水性流体的过滤，但由于缺少适当的溶剂稳定性膜而尚未广泛应用于有机溶剂中溶质的分离。超滤膜通常具有的MW截止值在1,000至500,000道尔顿的范围内。最近已发展了新种类的膜，其甚至在最困难的溶剂中稳定，如P.Vandezande，L.E.M.Gevers和I.F.J.VankelecomChem.Soc.Rev.，(2008)，第37卷，第365-405页中所报道。这些膜可以是高分子膜或陶瓷膜、或混合基质无机/有机膜。
渗滤是液体过滤法，在该方法中，包含至少两种溶质的料液与膜接触，并经加压以使液体的某些组分通过膜，其中至少一种溶质比至少一种其他溶质对膜具有更高的排斥。将额外的液体送入膜的加压侧以补偿透过膜的液体。渗透物和保留物中更高度保留的溶质的浓度与保留较少的溶质的浓度之间的比例发生动态变化，在保留物中提高而在渗透物中下降。
膜分离对肽合成的应用已被报道用于经生物合成产生肽的再浓缩，如suruT，NakaoS，KimuraS，ShutouT，Sep.Sci.andTechnol.，第29卷，(1994)，第971-984页中所描述，或从水溶液中回收氨基酸，如LiS，LiC，LuiY，等人，J.Mem.Sci.，第222卷(2003)，第191-201页或WangX，YingA，WangW，J.Mem.Sci.，第196卷(2002)第59-67页中报道。在US3,772,264中报道了在肽合成过程中应用膜从过量试剂和反应副产物中分离生长的肽。肽在液相中合成，以聚(乙二醇)(PEG)作为分子锚定基，用水相超滤实现从杂质中分离出生长的肽链。所述分离需要在每个偶联步骤之后蒸发有机溶剂、中和、然后在每次脱保护之后进行蒸发，然后为了偶联或脱保护，在超滤之前从水溶液中吸收水。然后，在将PEG锚定肽再溶解到有机溶剂中以进行下一偶联或脱保护步骤之前，通过蒸发和/或共沸蒸馏除去水。从商业角度看，该方法的复杂性使其不合乎需要。
发明概述
根据本发明，提供用于制备选自肽、寡核苷酸和肽核酸的第一化合物的方法；该方法包括：
(i)合成所述第一化合物；和
(ii)分离步骤(i)中形成的第一化合物与第二化合物，该第二个化合物是第一个化合物合成的反应副产物和/或用于合成第一化合物的过量试剂，其中第一和第二化合物溶解于有机溶剂中并通过使用膜的渗滤法分离，其中该膜在有机溶剂中稳定，且对第一化合物提供的排斥大于对第二化合物的排斥。
本发明进一步提供用于在有机溶剂中分离第一化合物与第二化合物的方法，其中：
(i)将第一化合物和第二化合物都溶解于所述有机溶剂中；
(ii)第一化合物选自肽、寡核苷酸和肽核酸；且
(iii)第二化合物是形成第一化合物反应的副产物和/或用于所述反应的试剂；
其中所述分离通过使用膜的渗滤法进行，该膜在有机溶剂中稳定，且对第一化合物提供的排斥大于对第二化合物的排斥。
附图简述
图1显示了从A1、A2和A3的重复单元合成肽(peptide)、寡核苷酸(oligonucleotide)或肽核酸(peptidenucleicacid)(在图中统称为″tide″)的通用方法。
图2显示了膜增强的肽合成的示意图。
图3显示了实施例2和3中描述的用于膜增强的肽合成的设备，和实施例4中描述的用于寡核苷酸合成的设备。
图4显示实施例1中产生的五肽的HPLC色谱数据。
图5显示实施例1中产生的五肽的MALDI-TOF质谱。
图6显示实施例2中产生的五肽的HPLC色谱数据。
图7显示实施例2中产生的五肽的MALDI-TOF质谱。
图8显示实施例3中产生的五肽的HPLC数据。
图9显示实施例3中产生的五肽的MALDI-TOF质谱。
图10显示实施例4中产生的二聚寡核苷酸的NMR数据。
图11显示实施例4中产生的二聚寡核苷酸的NMR数据。
各种实施方案的描述
本文所使用的术语“肽”另外包括肽衍生物。肽衍生物的实例为包含一个或更多个合成的或化学修饰的氨基酸、一个或更多个保护基或位于肽链一端或两端的端基的肽。
在本发明的实施方案中，肽包含小于200个氨基酸残基。在本发明的具体实施方案中，肽包含小于100个氨基酸残基。在本发明的另一实施方案中，肽包含小于50个氨基酸残基。
本文所使用的术语“寡核苷酸”另外包括寡核苷酸衍生物，例如包含一个或更多个合成的或化学修饰的寡核苷酸、一个或更多个保护基，或一个或更多个位于寡核苷酸链末端的端基的寡核苷酸。
本文所使用的术语“肽核酸”或“PNA”另外包括肽核酸衍生物，例如包含一个或更多个化学修饰的嘌呤碱基或嘧啶碱基、一个或更多个保护基、或一个或更多个位于肽核酸链末端的端基的肽核酸。
依照本发明，第一化合物通过渗滤与第二化合物分离。渗滤可以两种操作模式进行。第一种操作模式是恒定容量渗滤，其中新鲜溶剂被送入渗滤系统，其进料速率与渗透物从系统中排出的速率相同，从而维持系统中的恒定容量。第二种操作模式是可变容量渗滤，其中过滤容量通过从系统中排出渗透物而减少，且在额外渗透物被排出之前定期向系统加入新鲜溶剂以增加系统容量。
适当的是，第一化合物具有大于200道尔顿的分子量。在本发明的具体实施方案中，第一化合物具有大于300道尔顿的分子量。在本发明的优选实施方案中，第一化合物具有大于500道尔顿的分子量。
第二化合物是形成第一化合物的合成反应的副产物，或是用于所述反应的试剂。可使用本领域内已知的合成第一化合物的任何适宜的方法。该合成反应可以是偶联反应或脱保护反应。适宜的是，合成在液相中进行。具体而言，合成可在有机溶剂存在下进行，该有机溶剂可以与用于渗滤的有机溶剂相同或不同。
在一种实施方案中，该方法包括在分离之后修饰第一化合物。例如，第一化合物可通过进行一个或更多个额外的偶联和/或脱保护步骤而被修饰。经修饰的化合物随后可被提纯，特别是使用本发明的渗滤法提纯。在一种实施方案中，本发明的方法包括多个连续的偶联、脱保护和分离步骤，从而促进各种各样的肽、寡核苷酸和肽核酸的合成。
本发明中供使用的适宜的膜包括高分子膜和陶瓷膜，和混合的高分子膜/无机膜。膜排斥Ri是本领域技术人员已知的普通术语且可如下定义：
R i = ( 1 - C Pi C Ri ) × 100 % - - - ( 1 )
其中CP，i＝渗透物中样品i的浓度，该渗透物是已穿透膜的液体，而CR，i＝保留物中样品i的浓度，该保留物是尚未穿透膜的液体。若R(第一化合物)＞R(第二化合物)，则认为该膜适用于本发明。
可由任何聚合物材料或陶瓷材料形成本发明的膜，其提供能够优先把所述tide与至少一种反应副产物或试剂分离的分离层。优选膜由选自适用于制造微滤膜、超滤膜、纳米滤膜或反渗透膜的聚合物材料的材料形成或包含所述材料，所述材料包括聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚砜、聚苯醚砜、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰亚胺、聚醚酰亚胺、醋酸纤维素、聚苯胺、聚吡咯及它们的混合物。所述膜可通过本领域已知的任何技术包括烧结、拉伸、径迹蚀刻、模板沥滤、界面聚合或相转化来制造。更优选，膜可经交联或处理以便提高其在反应溶剂中的稳定性。特别值得提及的是WO2007/125367中描述的膜，该申请的内容在此引入作为参考。
在一种实施方案中，所述膜是包含支持体和薄的选择性渗透层的复合材料，且其无孔选择性渗透层由以下材料形成或包含以下材料，该材料选自：改性聚硅氧烷基弹性体包括聚二甲硅氧烷(PDMS)基弹性体、乙烯-丙烯二烯烃(EPDM)基弹性体、聚降冰片烯基弹性体、聚辛烯基弹性体、聚氨酯基弹性体、丁二烯和丁腈橡胶基弹性体、天然橡胶、丁基橡胶基弹性体、氯丁橡胶(Neoprene)基弹性体、环氧氯丙烷弹性体、聚丙烯酸酯弹性体、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)基弹性体、聚醚嵌段酰胺(PEBAX)、聚氨酯弹性体、交联聚醚、聚酰胺、聚苯胺、聚吡咯及它们的混合物。
在另一实施方案中，所述膜由无机材料使用本领域技术人员已知的任何技术例如烧结、沥滤或溶胶-凝胶法来制备，所述无机材料例如(作为非限定性的实例)碳化硅、二氧化硅、氧化锆、钛氧化物或沸石。由InoporGmbH(德国)提供的无机膜在本发明中优选供使用。
在另一实施方案中，所述膜包含其中分散有粉状固体形式的有机或无机基质的高分子膜，其中所述基质的量多达该高分子膜的20wt％。碳分子筛基质可如美国专利6,585,802号中描述的经热分解任何适当材料来制备。美国专利6,755,900号中描述的沸石也可作为无机基质使用。可使用金属氧化物例如二氧化钛、氧化锌和二氧化硅，例如可从DegussaAG(Germany)以其Aerosol和AdNano商标获得的材料。可使用混合的金属氧化物，例如氧化铈、氧化锆和氧化镁的混合物。优选的基质将是直径小于1.0微米的微粒，优选直径小于0.1微米的微粒，优选直径小于0.01微米的微粒。
第一化合物可通过适当的化学作用被连接至支持体例如聚合物、树状大分子、树模石、超支化聚合物、或无机或有机纳米颗粒上，该支持体作为可溶性分子锚起作用以容许第一化合物在本发明的反应阶段和渗滤阶段期间于溶液中停留，并提供增大的分子体积以增强膜排斥。作为分子锚使用的适宜聚合物包括包含杂原子官能的缩聚基质或聚合基质。这些杂原子官能可包含氧、氮，或可包含超过一个杂原子，例如酰胺基。本发明中使用的聚合物实例包括聚亚烷基二醇，其包括聚乙二醇、聚己酸内酯、用柠檬酸酯化了的聚乙二醇、聚乙二醇和琥珀酸的共聚物、乙烯吡咯烷酮和丙烯酸或b-羟基-丙烯酸乙酯的共聚物；或丙烯酰胺和醋酸乙烯酯的共聚物。供本发明使用的适宜树状大分子包括聚(酰胺胺)[poly(aminoamine)]，也被称为PAMAM树状大分子；含磷树状大分子；据聚赖氨酸树状大分子；和可具有表面官能团包括-OH、-NH2、-PEG和COOH的聚丙烯亚胺(PPI)树状大分子。纳米微粒可从商业来源获得或经原位合成以提供受控的尺寸，且适宜的纳米微粒可来自SiO2、TiO2或其他有机材料或无机材料。US3,772,264报道了用于连接氨基酸和肽至分子锚上的适当化学法。Bonora等人BioconjugateChem.，(1997)第8卷(6)，第793-797页，描述了用于连接核苷酸和寡核苷酸至分子锚上的化学法。Christensen等人JPept.Sci.(1995)May-Jun；1(3)：第175-83页描述用于连接肽核酸至分子锚上的适宜技术。使用本领域技术人员所熟知的技术例如US3,772,264中报道的那些技术，可以容易完成从支持体上脱除第一化合物。
用于肽的偶联反应与脱保护反应的适宜化学法为本领域技术人员所熟知，例如参见AminoAcidandPeptideSynthesis，2ndEdn，JJones，OxfordUniversityPress2002，或Schroder-Lubbke，ThePeptides，NewYork1967。用于寡核苷酸的偶联反应与脱保护反应的适宜化学法为本领域技术人员所熟知，例如参见P.S.Millar，BioconjugateChemistry，(1990)，第1卷，第187-191页和CB.ReeseOrg.Biomol.Chem.(2005)第3卷，第3851-3868页。用于肽核酸偶联反应与脱保护反应的适宜化学法为本领域技术人员所熟知，例如参见B.Hyrup与P.E.NielsenBioorganic&MedicinalChemistry(1996)，第4卷，第1期，第5-23页。
术语“有机溶剂”将为一般技术读者所完全理解，包括例如分子量小于300道尔顿的有机液体。应当理解，术语溶剂还包括溶剂的混合物。
作为非限定性实例，溶剂包括芳香族化合物、烷烃、酮、二醇、氯化的溶剂、酯、醚、胺、腈、醛、酚、酰胺、羧酸、醇、呋喃和偶极非质子溶剂，及它们的混合物以及它们与水的混合物。
作为非限定性实例，溶剂的具体实例包括甲苯、二甲苯、苯、苯乙烯、苯甲醚、氯苯、二氯苯、氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基醚酮(MEK)、甲基异丁基酮(MIBK)、丙酮、乙二醇、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、己烷、环己烷、二甲氧基乙烷、甲基叔丁基醚(MTBE)、二乙醚、己二腈、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、N，N-二甲基乙酰胺、二烷、硝基甲烷、硝基苯、吡啶、二硫化碳、四氢呋喃、甲基四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮、N-乙基吡咯烷酮、乙腈、及它们的混合物以及它们与水的混合物。
合成流程与仪器
实施例1-3阐明五肽的合成。所使用的流程如图2所示。所采用的仪器如图3所示。该仪器不但用于进行排斥试验，还用于进行合成。偶联步骤与脱保护步骤两者都于大气压力下在反应容器(加料槽)内进行。循环泵使反应溶液通过膜滤芯再循环并自始至终确保良好的液体混合。在每个反应完成时，使用至约7barg的N2对系统加压。透过膜产生的溶剂流通过经HPLC泵从溶剂贮器向反应容器(加料槽)补给的恒定新鲜溶剂(DMF)流来达到平衡。在每一反应/洗涤周期应用相同的程序。让肽在可溶性聚合分子锚上装配以增加膜对其的保留。选择PEG作为高分子支持体。
下列缩写在实施例中使用：
实施例1
具有Tyr-Ala-Tyr-Ala-Tyr序列的模型肽使用高分子膜经膜增强的肽合成(MEPS)而制备。选择该序列是为了包含最大的常用受保护氨基酸之一Fmoc-Tyr(tBu)与最小的受保护疏水性氨基酸之一Fmoc-Ala。使用化学交联的聚酰亚胺膜(DuraMemTM，METLtd，UK，其被认为可用描述于PCT/GB2007/050218中的技术制备)进行膜分离步骤。对MeO-PEG-lnker-肽的排斥对于偶联步骤为～100％，对于脱保护步骤＞99.7％。
甲基化氨基聚乙二醇(MeO-PEG-NH 2 )的合成
用于制备MeO-PEG-NH2的程序在流程1中说明：
流程1：甲基化氨基PEG的合成
MeO-PEG-甲苯磺酸盐的合成(1).将20g聚乙二醇单甲醚(MeO-PEG，MW～5000gmol-1)在溶解于100mlDCM(25ml/mmolMeO-PEG)之前于80℃在真空中脱水4小时。向PEG溶液中加入36g对甲苯磺酰氯(46mmol/mmolMeO-PEG)和6ml吡啶(1.5ml/mmolPEG)，在氮气环境下进行反应并持续搅拌12小时。将得到的溶液在真空中浓缩并通过加入二乙醚使产物(MeO-PEG-Tos)沉淀，并在4℃保持数小时以完成沉淀。将沉淀过滤并用乙醚洗涤，用乙醇重结晶并在真空中干燥。通过测定270nm的吸收进行UV分析证实了甲苯磺酸基的存在。
MeO-PEG-邻苯二甲酰亚胺的合成(2).将18gMeO-PEG-Tos与8g邻苯二甲酰亚胺钾(10mmol/mmolMeO-PEG-Tos)溶解于50mlDMF(14ml/mmolMeO-PEG-Tos)中，并在回流和氮气环境下加热4小时。将固体残余物过滤，并向滤液中加入二乙醚以使产物从溶液中沉淀出。将溶液于4℃保持5小时以完成沉淀。将产物过滤并用乙醚洗涤，随后用50mlDCM消化。将不溶性杂质过滤，并用乙醚将MeO-PEG-Phth从滤液中沉淀出。将产物再次过滤，用乙醚洗涤并在真空中干燥。通过于292nm和264nm的UV分析证实出现了邻苯二甲酰亚胺基团。
MeO-氨基-PEG的合成(3).将16gMeO-PEG-Phth与8ml水合肼(40mmol/mmolMeO-PEG-Phth)溶解于60ml乙醇(18.5ml/mmolMeO-PEG-Phth)并在回流下加热12小时。在用二乙醚沉淀之前，将产物混合物冷却至室温。将沉淀过滤并重新溶解于30mlDCM中，使不溶性杂质过滤并从滤液中沉淀出MeO-PEG-NH2产物，用二乙醚洗涤，用乙醇重结晶并最后在真空中干燥。用UV分析分析出产物邻苯二甲酰亚胺基团的消失并应用凯瑟试验(Kaisertest)验证了氨基的存在。通过用HCl(aq)滴定测定了转化率(～80％)。
肽合成
MeO-PEG-HMPA的合成.将1gMeO-PEG-NH2(3)溶解于4mlDCM中。在加入到PEG溶液之前，将0.073gHMPA、0.21gPyBOP(两者都为2mol/molMeO-PEG-NH2)及0.0026gDIPEA(0.1mol/molMeO-PEG-NH2)在4mlDMF中预活化15分钟。用二乙醚于4℃将产物沉淀2小时并通过离心分离，随后用乙醚洗涤。通过用乙醇重结晶来纯化粗产品。MeO-PEG-HMPA产物在真空下干燥并经H1-NMR分析进行了分析。基于MeO-基团在3.4(s，3H)的峰值和HMPA连接物上芳香体系在6.7(d，2H)、6.9(d，2H)的峰值之间的比例来估计转化率。
Fmoc-Tyr-HMPA-PEG-Ome的合成.将0.5gMeO-PEG-HMPA预溶解于4mlDMF(45L/molMeO-PEG-HMPA)中。在与MeO-PEG-HMPA溶液混合2小时之前，将0.096gFmoc保护的Tyr(Fmoc-Tyr(tBu))、0.028gHOBt、0.026gDIC(全部为2mol/molMeO-PEG-HMPA)及0.0013gDIPEA(0.1mol/molMeO-PEG-HMPA)于4mlDMF(10L/molMeO-PEG-HMPA)中预活化15分钟。当反应完成时，用化学交联的聚酰亚胺膜通过渗滤(40x初始容量)来除去过量试剂。收集渗透物样品来监测PEG-锚定的肽的损失并检验杂质的除去。收集小的保留物样品并沉淀，用于H1-NMR分析以估计转化率并用于凯瑟试验以证实氨基不存在。
用Fmoc-氨基酸进行的链装配.用0.076gPyBOP、0.020gHOBt(皆为2mol/molMeO-PEG-HMPA)及0.001gDIPEA(0.1mol/molMeO-PEG-HMPA)于4mlDMF(10L/molMeO-PEG-HMPA)中将0.046gFmoc-Ala预活化15分钟。制备单独的MeO-PEG-HMA-Tyr-H于DMF中的溶液并与预活化的溶液混合。将所得溶液剧烈搅拌1小时，随后用化学交联的聚酰亚胺膜渗滤洗涤(40x初始容量)。相似的程序应用于更多氨基酸的连接。
Fmoc-脱保护.通过加入所需量的纯哌啶至已知的溶液容量来制备20％哌啶/DMF溶液。脱保护进行30分钟。脱保护后的分离用化学交联的聚酰亚胺膜通过渗滤(40x初始容量)进行。
侧链脱保护与切割反应.从过滤池中取出包含0.33gPEG-肽结构单元的溶液，用二乙醚使产物沉淀并在真空中干燥。然后将沉淀重新溶解于20ml/mmol的酸解溶液3小时。用二乙醚沉淀靶标肽连同MeO-PEG-HMPA。
肽纯度
图4与图5显示所得五肽纯度的HPLC和MALDI-TOF分析数据。从合成中没有产生随机序列，表明在进行连接之前就从体系中除去了大部分的未反应试剂和杂质。来自缺失序列的仅有的副产物因不完全反应而产生，与分离程序无关。
实施例2
再次制备模型肽序列Tyr-Ala-Tyr-Ala-Tyr，作为用陶瓷膜的膜增强肽合成的实例。本实施例中使用孔径为3nm且经疏水性表面改性的Inopor涂有氧化锆的膜(InoporGmbH，Germany)。
在第一个氨基酸和第二个氨基酸连接之后，膜对MeO-PEG-肽的排斥增加至＞99.7％，而对于以后的连接，膜对MeO-PEG-肽的排斥达～100％。
甲基化氨基聚乙二醇(MeO-PEG-NH 2 )的合成
通过实施例1中描述的相同路线，制备了在本实施例中使用的MeO-PEG-NH2。
膜排斥结果
该膜的排斥数据如表1所示。Inopor膜展现出对MeO-PEG与MeO-PEG-HMPA两者99％的排斥。
对多种Fmoc-氨基酸进行试验，涉及各种各样的性质-最低MW氨基酸与最高MW氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸和疏水性氨基酸、及在蛋白质中最常出现的某些氨基酸。对偶联活化剂和试剂进行另外的排斥试验。结果显示，PyBOP与HBTU活化剂展现出膜的相对高的排斥，推测因下述事实所致：这些活化剂是大体积盐，因而立体位阻效应和唐南效应两者都会促进其保留。然而，在偶联反应过程中这些活化剂分解成较小的分子，因此预期最终的排斥较低。偶联试剂DIC显示非常低的排斥，为13％，同样的，用于Fmoc-脱保护的脱保护试剂哌啶仅有5％的排斥。然而，DIC仅仅可与HOBt联合使用来抑制外消旋作用，因此检查对HOBt的排斥很重要。在市场上有两种类型的HOBt有售，一种是结晶性薄片HOBt，另一种是湿粉HOBt-H2O，且如表1所示，水分含量似乎影响膜对HOBt的排斥。PyBOP或HBTU的应用不需要加入HOBt，且预期对偶联反应期间由这些活化剂所裂解出的HOBt的排斥低，因为它无水分。最后，还研究了对HMPA连接物的排斥。对HMPA的排斥相对较低(39％)，对MeO-PEG-HMPA的排斥为99％。
表1：用InoporZrO2/Al2O3陶瓷膜获得的、对肽合成中所使用的PEG、被保护的氨基酸和其他普通试剂的排斥数据。实验按分批模式进行，且所述排斥根据公式1(Eq.1)来确定。
*从进料、渗透物及保留物之间的质量平衡估计的误差
肽合成
MeO-PEG-HMPA的合成.将24gMeO-PEG-NH2(3)溶解于100mlDCM中。0.9gHMPA、2.5gPyBOP(两者都为2mol/molMeO-PEG-NH2)及0.06gDIPEA(1mol/molMeO-PEG-NH2)在被加入PEG溶液之前，于80mlDMF中预活化15分钟。于4℃用二乙醚使产物沉淀2小时并通过离心分离，随后用乙醚洗涤。通过用乙醇重结晶来提纯粗产物。MeO-PEG-HMPA产物在真空下干燥并经H1-NMR分析来分析。基于MeO-基团在3.4(s，3H)的峰值及HMPA连接物上芳香体系在6.7(d，2H)、6.9(d，2H)的峰值之间的比例来估计转化率。
Fmoc-Tyr-HMPA-PEG-OMe的合成.将11gMeO-PEG-HMPA预溶解于60mlDMF(45L/molMeO-PEG-HMPA)中。在与MeO-PEG-HMPA溶液混合2小时之前，将2.0gFmoc保护的Tyr(Fmoc-Tyr)、0.5gHOBt、0.55gDIC(皆为2mol/molMeO-PEG-HMPA)及0.05gDIPEA(1mol/molMeO-PEG-HMPA)于50mlDMF(10L/molMeO-PEG-HMPA)中预活化15分钟。当反应完成时，用Inopor陶瓷膜通过恒定容量渗滤(10x初始容量)将过量试剂除去。收集渗透物样品用于PEG-肽损失监测和检验杂质的除去。收集并沉淀小的保留物样品用于H1-NMR分析以估计转化率，以及用于应用凯瑟试验以证实氨基不存在。
用Fmoc-氨基酸进行的链装配.将1.3gFmoc-Ala用2.2gPyBOP、0.6gHOBt(皆为2mol/molMeO-PEG-HMPA)和0.026gDIPEA(1mol/molMeO-PEG-HMPA)于20mlDMF(10L/molMeO-PEG-HMPA)中预活化15分钟。将预活化的溶液与来自以前的步骤中的MeO-PEG-HMPA-Tyr-H于DMF中的溶液混合。剧烈搅拌所得溶液2小时，随后用Inopor陶瓷膜进行渗滤洗涤(10x初始容量)。相似的程序用于另外的氨基酸的连接。
Fmoc-脱保护.通过加入需要量的哌啶至已知的溶液容量来制备20％哌啶/DMF溶液。脱保护进行30分钟。脱保护后的纯化用Inopor陶瓷膜通过渗滤(12x初始容量)来进行。
侧链脱保护和切割反应.从过滤池取出包含5.5gPEG-肽结构单元的溶液，用二乙醚使产物沉淀出并在真空中干燥。然后将沉淀重新溶解于20ml/mmol的酸解溶液中达3小时。用二乙醚沉淀靶标肽连同MeO-PEG-HMPA。
肽纯度
在本实施例中，制备2mmol肽，即Tyr-Ala-Tyr-Ala-Tyr，产生超过1g产物。图6中所示的HPLC结果表明：Tyr-Ala-Tyr-Ala-Tyr的纯度极佳(～100％)，图7中所示的MALDI-TOF质谱证实了产物的分子量。
实施例3
在本实施例中，五肽胸腺喷丁(H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH)用膜增强肽合成(MEPS)法制备，也使用固相肽合成(SPPS)法制备以用于对比。
甲基化氨基聚乙二醇(MeO-PEG-NH 2 )的合成
为本实施例合成的甲基化氨基聚乙二醇基于流程2中显示的程序。
流程2：甲基化氨基PEG的合成
Fmoc-Ala连接到MeO-PEG上(4).10gMeO-PEG溶解于20mlDCM(10ml/mmolMeO-PEG)中，而将1.2gFmoc-Ala和0.54gHOBt(两者皆为2mol/molMeO-PEG)溶解于8mlDMF(4ml/mmolMeO-PEG)中，然后将两种溶液混合在一起。随后加入0.25gDIC(2mol/molMeO-PEG)并于4℃剧烈混合2小时。将固体杂质过滤并用二乙醚使产物沉淀并干燥。将偶联步骤重复3次以达到转化率＞80％。先通过加入二乙醚从DMF重结晶MeO-PEG-Ala-Fmoc产物，随后用乙醇将MeO-PEG-Ala-Fmoc产物重结晶。用H1-NMR根据MeO-基团在3.4(s，3H)的峰值与丙氨酸的Me-基团在1.4(d，1H)的峰值之间的比例来测定转化率。
Fmoc-基团的脱保护(5).用标准的20％v/v哌啶/DMF溶液从(4)脱除Fmoc-保护基。在脱保护之后将产物沉淀并用二乙醚洗涤，用乙醇重结晶并在真空中干燥。用H1-NMR检验Fmoc-基团在7.2(t，2H)、7.3(t，2H)、7.5(d，2H)及7.7(d，2H)的消失。用凯瑟试验证实氨基官能团的存在。
肽合成
MeO-PEG-HMPA的合成.把10gMeO-PEG-NH2(5)溶解于50mlDCM中。0.72gHMPA、2.1gPyBOP(两者皆为2mol/molMeO-PEG-NH2)及0.026gDIPEA(1mol/molMeO-PEG-NH2)在被加入PEG溶液之前，于50mlDMF中预活化15分钟。用二乙醚于4℃使产物沉淀2小时并通过离心分离，随后经乙醚洗涤。通过用乙醇重结晶提纯粗产物。将MeO-PEG-HMPA产物在真空下干燥并通过H1-NMR分析来分析。基于MeO-基团在3.4(s，3H)的峰值与HMPA连接物上的芳香体系在6.7(d，2H)、6.9(d，2H)的峰值之间的比例来估计转化率。
Fmoc-Tyr(tBu)-HMPA-PEG-OMe的合成.将10gMeO-PEG-HMPA预溶解于60mlDMF(45L/molMeO-PEG-HMPA)中。1.8gFmoc保护的Tyr(Fmoc-Tyr(tBu))、0.54gHOBt、0.50gDIC(皆为2mol/molMeO-PEG-HMPA)及0.026gDIPEA(1mol/molMeO-PEG-HMPA)在与MeO-PEG-HMPA溶液混合2小时之前，于DMF(10L/molMeO-PEG-HMPA)中预活化15分钟。当反应完成时，用Inopor陶瓷膜通过恒定容量渗滤(10x初始容量)将过量试剂除去。收集渗透物样品用于监测PEG-肽损失并检验杂质的除去。收集并沉淀小的保留物样品用于H1-NMR分析以估计转化率，以及用于凯瑟试验以证实氨基不存在。
用Fmoc-氨基酸进行的链装配.用2.2gPyBOP、0.6gHOBt(皆为2mol/molMeO-PEG-HMPA)及0.026gDIPEA(1mol/molMeO-PEG-HMPA)的DMF(10L/molMeO-PEG-HMPA)溶液使1.4Fmoc-Val预活化15分钟。制备独立的MeO-PEG-HMPA-Tyr-H的DMF溶液并与预活化的溶液混合。将所得溶液剧烈混合1小时，随后用Inopor陶瓷膜进行渗滤洗涤(10x初始容量)。相似的程序用于其余的Fmoc-Arg(Boc)2、Fmoc-Lys(Boc)和Fmoc-Asp(OtBu)氨基酸的连接。
Fmoc-脱保护.通过加入需要量的纯哌啶至已知的溶液容量来制备20％哌啶/DMF溶液。脱保护进行30分钟。用Inopor陶瓷膜通过渗滤(12x初始容量)进行脱保护后的纯化。
侧链脱保护与切割反应.从过滤池取出包含8.5gPEG-肽结构单元的溶液，用二乙醚将产物沉淀并在真空中干燥。然后将沉淀重新溶解在20ml/mmol的酸解溶液3小时。用二乙醚沉淀靶标肽连同MeO-PEG-HMPA。
肽纯度
在本实施例中，制备1.2mmol批料的TP-5，得到超过1g产物(总产率为94％)。由MEPS和SPPS两者制备的TP-5纯度在图8中说明。MEPS产物的纯度估计为～94％，图9中所示的MALDI-TOF分析证实产物的分子量为MH+650。两种杂质(于10.0分钟与10.4分钟)被鉴定为因缺失Asp(MH+564)和缺失Lys(MH+550)所得到的肽。在每1当量肽2当量的试剂和单反应周期的相同条件下通过SPPS法产生的TP-5，其纯度仅为77％。该结果说明均相反应在所需较少过量的试剂方面的优势。SPPS中的主要杂质被鉴定为缺失Arg，MH+524。
实施例4
合成聚乙二醇化的寡核苷酸二聚体，作为使用陶瓷膜的膜增强寡核苷酸合成的实例。本实施例中使用孔径为3nm且经疏水性表面改性的Inopor涂有氧化锆的膜(InoporGmbH，Germany)，使用的仪器如图3所示。
5′-O-Dmt-dTdA Bz -3′succ-MeO-PEG的合成
测定相关反应物的排斥并在表2中显示。
表2：用InoporZrO2/Al2O3陶瓷膜获得的寡核苷酸合成中所使用的PEG和被保护的单体的排斥数据。实验在分批模式(或注释时为渗滤模式)下进行，且根据公式1来确定排斥。
(a)根据进料、渗透物及保留物之间的质量平衡估计的误差
(b)渗滤模式
5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-(N6-苯甲酰基)脱氧腺苷-3′-琥珀酸(5′-O-Dmt-dABz-3′-琥珀酸)(3)的合成.5g5′-O-Dmt-dABz-3′-OH(1，7.6mmol)与MeCN(2x10mL)一起蒸发，然后溶解于85mL干燥DCM中。向溶液中加入4.2mLTEA(11.4mmol)与478mgDMAP(3.9mmol)，于室温在氮气环境下搅拌。然后缓慢加入11.4g琥珀酸酐(2，11.4mmol)。使用TLC(CHCl3∶MeOH，9∶1，v/v+0.5％TEA)监测反应，让其反应直到起始核苷被完全消耗。然后用过量的水使反应淬灭，搅拌5至10分钟。然后将反应溶液用3x150mL水洗涤。然后收集水相，并用450mLDCM(+0.5％v/vTEA)萃取。收集有机相，用无水MgSO4干燥，并蒸发至干燥，以产率高(90％)提供白色泡沫状物，通过1H-NMR分析产物完整性。程序在流程3中说明。
(3)流程3-5′-O-Dmt-dABz-3′-琥珀酸的合成：i).TEA、DMAP、DCM。
5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-(N6-苯甲酰基)脱氧腺苷-3′succ-MeO-PEG(5′-O-Dmt-dABz-3′succ-MeO-PEG)(5)的合成.(流程4)10g聚乙二醇单甲醚(4，MeO-PEG，MW～5,000gmol-1(2mmol))和4.5g5′-O-Dmt-dABz-3′-琥珀酸(3，6mmol)与干燥的MeCN(2x10mL)一起蒸发，然后溶解于67ml干燥DCM+0.5％(v/v)干燥吡啶中。在搅拌下向溶液中加入320μlNMI(4mmol)与530μlDIC(3.4mmol)，让其于室温在氮气环境下反应24小时。然后将反应溶液过滤，蒸发至干燥并溶于加入到分离设备中的100mLDCM+1％v/vTEA中。使用20倍渗滤容量的溶剂(DCM)来纯化反应混合物。用凝胶渗透色谱(GPC)与TLC(EtOAc∶丙酮∶水，5∶10∶1，v/v)来监测过程，且当在保留物中没有分别检测出低分子量品种和高Rf品种时终止。通过1H-NMR分析产物完整性和反应转化率(71％，图10)。
流程4-5′-O-Dmt-dABz-3′succ-MeO-PEG的合成：i).NMI，DIC，DCM+0.5％吡啶。
5′-O-Dmt-dABz-3′succ-MeO-PEG的乙酰化(封端).在圆底烧瓶内将5g5′-O-Dmt-dABz-3′succ-MeO-PEG溶解于25mL干燥的DCM中。将溶液搅拌并冰冷，然后加入2，6-二甲基吡啶(2.5mL)、NMI(2.5mL)和乙酸酐(2.5mL)。让反应物在氮气环境下反应30分钟，然后将其稀释至100mLDCM+1％v/vTEA中并使用5倍容量的溶剂(DCM)通过膜渗滤来纯化。
5′-O-Dmt-dABz-3′ucc-MeO-PEG脱三苯甲基.3.7g5′-O-Dmt-dABz-3′succ-MeO-PEG(5)与2x10mL干燥的MeCN一起蒸发并溶解于19mL干燥的DCM中。在圆底烧瓶内溶解于25mL干燥的DCM中。向搅拌的溶液中加入900μL吡咯(13mmol)和570μLDCA(3％v/v)让其于室温在氮气环境下反应。该反应用TLC跟踪，当反应完成时，通过加入过量的TEA淬灭，经稀释以组成100mLDCM+1％v/vTEA，并使用膜渗滤和10倍容量的溶剂(DCM)按照以前的步骤纯化。脱三苯甲基的完成通过1H-NMR评估。
流程5-5′-OH-dABz-3′succ-MeO-PEG的合成：i).DCA、吡咯、DCM。
5′-O-Dmt-dT-亚磷酸酯-dABz-3′succ-MeO-PEG(7)的合成(流程5).2.5g5′-OH-dABz-3′succ-MeO-PEG(5，0.46mmol)和611mg′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-胸腺嘧啶-3′-(β-氰乙基-N，N′-二异丙基氨基)亚磷酰胺(6，5′-O-Dmt-dT亚酰胺化物(amidite)，0.8mmol)与2x10mL干燥的MeCN一起蒸发并溶解于30mL干燥的MeCN中。向搅拌的溶液中加入65μLNMI(0.8mmol)和155mgPyTFA(0.8mmol)，并让其于室温在氮气环境下反应。反应通过TLC跟踪，当反应完成时，通过加入过量的TEA淬灭，蒸发并经1H-NMR和31P-NMR(图11)来分析粗品。
流程5-5′-O-Dmt-dT-亚磷酸酯-dABz-3′succ-MeO-PEG的合成：i).NMI、PyTFA、MeCN。
5′-O-Dmt-dT-亚磷酸酯-dABz-3′succ-MeO-PEG的氧化.5′-O-Dmt-dT-亚磷酸酯-dABz-3′succ-MeO-PEG(7)与MeCN(2x5mL)一起蒸发并溶解于1.1MTBHP的DCM溶液，让其在室温和氮气环境下反应15分钟。溶液经蒸发，溶于100mLDCM并使用20倍容量的溶剂(DCM)如之前的步骤进行膜纯化，，从而提供1.2g聚乙二醇化的二聚体(8)。
流程6-5′-O-Dmt-dTdABz-3′succ-MeO-PEG的合成：i).TBHP、DCM。

Claims (14)

1.用于制备选自寡核苷酸和肽核酸的第一化合物的方法，该方法包括：
(i)通过在第一有机溶剂中的液相合成来合成所述第一化合物；并
(ii)分离步骤(i)中形成的第一化合物与第二化合物，该第二化合物是第一化合物合成的反应副产物和/或用于合成第一化合物的过量试剂，
其中：
在步骤(i)中第一化合物的合成涉及一个或更多个偶联反应或脱保护反应；
第一化合物和第二化合物溶解在第二有机溶剂中，并使用在第二有机溶剂中稳定的膜通过渗滤法分离，且该膜所提供的对第一化合物的排斥大于对第二化合物的排斥；并且
所述方法包括在分离之后对第一化合物进行一个或更多个偶联反应和/或脱保护反应来修饰第一化合物。
2.用于制备第一化合物的方法，该第一化合物为肽，该方法包括：
(i)通过在第一有机溶剂中的液相合成来合成所述第一化合物；并
(ii)分离步骤(i)中形成的第一化合物与第二化合物，该第二化合物是第一化合物合成的反应副产物和/或用于合成第一化合物的过量试剂，
其中：
在步骤(i)中第一化合物的合成涉及一个偶联反应；
第一化合物和第二化合物溶解在第二有机溶剂中，并使用在第二有机溶剂中稳定的膜通过渗滤法分离，且该膜所提供的对第一化合物的排斥大于对第二化合物的排斥；并且
所述方法包括在分离之后对第一化合物进行一个或更多个偶联反应和/或脱保护反应来修饰第一化合物。
3.按照权利要求1或2的方法，其中所述第一和第二有机溶剂相同。
4.按照权利要求1或2的方法，其另外包括使用如权利要求1的步骤(ii)中所定义的渗滤法来纯化修饰的化合物。
5.按照权利要求1或2的方法，其中所述膜是高分子膜。
6.按照权利要求1或2的方法，其中所述膜是陶瓷膜。
7.按照权利要求1或2的方法，其中所述膜是混合基质有机/无机膜。
8.按照权利要求1或2的方法，其中第一化合物连接到支持体上。
9.按照权利要求8的方法，其中所述支持体是高分子支持体。
10.按照权利要求9的方法，其中所述支持体包含树状高分子或超支化聚合物。
11.按照权利要求8的方法，其中所述支持体是有机或无机纳米微粒。
12.按照权利要求1或2的方法，其中第一化合物的分子量大于500道尔顿。
13.膜在如权利要求1所要求的用于制备选自寡核苷酸和肽核酸的第一化合物的方法中的用途；其中第一化合物和第二化合物溶解在有机溶剂中，并使用在有机溶剂中稳定的膜通过渗滤法分离，且该膜所提供的对第一化合物的排斥大于对第二化合物的排斥。
14.膜在如权利要求2所要求的用于制备第一化合物的方法中的用途；其中第一化合物和第二化合物溶解在有机溶剂中，并使用在有机溶剂中稳定的膜通过渗滤法分离，且该膜所提供的对第一化合物的排斥大于对第二化合物的排斥。
CN200980140616.6A 2008-08-08 2009-08-07 肽、pna或寡核苷酸的耐溶剂渗滤 Active CN102216320B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0814519.5 2008-08-08
GBGB0814519.5A GB0814519D0 (en) 2008-08-08 2008-08-08 Process
PCT/GB2009/050990 WO2010015864A1 (en) 2008-08-08 2009-08-07 Solvent resistant diafiltration of peptides, pna or oligonucleotides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102216320A CN102216320A (zh) 2011-10-12
CN102216320B true CN102216320B (zh) 2016-01-13

Family

ID=39790488

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980140616.6A Active CN102216320B (zh) 2008-08-08 2009-08-07 肽、pna或寡核苷酸的耐溶剂渗滤

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8664357B2 (zh)
EP (1) EP2321339B1 (zh)
CN (1) CN102216320B (zh)
CA (1) CA2733409A1 (zh)
ES (1) ES2609299T3 (zh)
GB (1) GB0814519D0 (zh)
HU (1) HUE031306T2 (zh)
PL (1) PL2321339T3 (zh)
WO (1) WO2010015864A1 (zh)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3498364A1 (en) * 2008-12-11 2019-06-19 The Regents of The University of California Filtration membrane and methods for making and using them
GB201012418D0 (en) * 2010-07-23 2010-09-08 Santaris Pharma As Process
US9291607B2 (en) 2012-08-14 2016-03-22 Empire Technology Development Llc Nano-antenna based infrared molecular taggants
WO2014059339A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 The Regents Of The University Of California Polyaniline membranes, uses, and methods thereto
WO2014182283A1 (en) 2013-05-07 2014-11-13 Empire Technology Development Llc Terahertz frequency tags and methods for their preparation and use
EP2996799B1 (en) 2013-05-15 2021-07-28 The Regents of the University of California Polyaniline membranes formed by phase inversion for forward osmosis applications
US10532328B2 (en) 2014-04-08 2020-01-14 The Regents Of The University Of California Polyaniline-based chlorine resistant hydrophilic filtration membranes
GB201413954D0 (en) * 2014-08-06 2014-09-17 Imp Innovations Ltd Process for preparing polymers
GB201414120D0 (en) * 2014-08-08 2014-09-24 Imp Innovations Ltd Improved polymer synthesis
GB201414213D0 (en) * 2014-08-11 2014-09-24 Imp Innovations Ltd Filtration process
KR102324819B1 (ko) 2014-12-12 2021-11-11 삼성전자주식회사 포토레지스트용 고분자, 포토레지스트 조성물, 패턴 형성 방법 및 반도체 장치의 제조 방법
SE542188C2 (en) 2015-05-22 2020-03-10 Polypeptide Laboratories Holding Ppl Ab Supports for membrane enhanced peptide synthesis
GB201516067D0 (en) * 2015-09-10 2015-10-28 Imp Innovations Ltd Defined monomer sequence polymers
US11725073B2 (en) 2020-12-29 2023-08-15 Hongene Biotech Corporation Compositions and methods for liquid phase oligonucleotide synthesis
GB202114688D0 (en) 2021-10-14 2021-12-01 Exactmer Ltd Solution phase polymer synthesis
US11851454B2 (en) 2021-12-30 2023-12-26 Hongene Biotech Corporation Compositions and methods for liquid phase oligonucleotide synthesis
CN114653226B (zh) * 2022-04-07 2022-08-23 浙江大学 一种用于血液灌流的表面多重修饰纳米纤维复合膜及其制备方法

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2047413C3 (de) 1970-09-26 1980-05-29 F. Hoffmann-La Roche & Co Ag, Basel (Schweiz) Verfahren zur Herstellung von Peptiden in homogener Phase
US4006078A (en) * 1974-07-08 1977-02-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Preparation of soluble edible protein from leafy green crops
JPS57120599A (en) 1981-01-20 1982-07-27 Nitto Electric Ind Co Ltd Treatment of protein organic solution
DE3321860A1 (de) * 1983-06-16 1984-12-20 Forschungsinstitut Berghof Gmbh, 7412 Eningen Integralasymmetrische, loesungsmittelbstaendige ulrafiltrationsmembran aus partiell sulfoniertem, aromatischem polyetheretherketon
JPS6261602A (ja) * 1985-09-13 1987-03-18 Japan Synthetic Rubber Co Ltd 液体分離膜
JPS62121602A (ja) * 1985-11-19 1987-06-02 Asahi Chem Ind Co Ltd スルホン化ポリエ−テルイミド半透膜
US5039421A (en) * 1989-10-02 1991-08-13 Aligena Ag Solvent stable membranes
US5032282A (en) * 1989-04-14 1991-07-16 Aligena Ag Solvent-stable semipermeable composite membranes
ATE115437T1 (de) * 1989-04-14 1994-12-15 Weizmann Kiryat Membrane Prod Lösungsmittelbeständige membranen.
CA2097305A1 (en) * 1990-11-30 1992-05-31 David Stevenson Solution phase process for synthesis of peptide
FR2682614B1 (fr) * 1991-10-18 1994-07-22 Tech Sep Membranes de filtration inorganique dont la couche separatrice est en ceramique sensiblement exempte d'oxygene.
UA71608C2 (en) 1999-03-11 2004-12-15 Merck Patent Gmbh A method for producing the cyclic pentapeptide
US6503295B1 (en) 2000-09-20 2003-01-07 Chevron U.S.A. Inc. Gas separations using mixed matrix membranes
JP4283469B2 (ja) * 2001-12-19 2009-06-24 独立行政法人科学技術振興機構 相溶性−多相有機溶媒システムによりアミノ酸を逐次的に付加する液相ペプチド合成法
US20030078372A1 (en) * 2001-09-19 2003-04-24 Scinopharm Singapore Process for synthesizing peptides by using a PEG polymer support
US20030131731A1 (en) 2001-12-20 2003-07-17 Koros William J. Crosslinked and crosslinkable hollow fiber mixed matrix membrane and method of making same
US7098326B2 (en) 2002-01-23 2006-08-29 Sigma-Aldrich Co. Methods for the integrated synthesis and purification of oligonucleotides
GB0229423D0 (en) * 2002-12-18 2003-01-22 Avecia Ltd Process
CN1968961A (zh) 2004-06-14 2007-05-23 Usv有限公司 制备肽的方法
US7897724B2 (en) 2004-10-10 2011-03-01 Usv, Ltd. Solid phase Fmoc chemistry process to prepare peptides
US7439291B2 (en) 2005-09-14 2008-10-21 General Electric Company Solvent-resistant membranes from solvent-inert polyimides and polyketones
WO2007099656A1 (ja) * 2006-03-01 2007-09-07 Kaneka Corporation ペプチドの製造方法
GB2437519B (en) 2006-04-28 2010-04-21 Imp Innovations Ltd Method for separation
CA2652037A1 (en) 2006-05-12 2007-11-22 Drexel University Nanoporous carbonaceous membranes and related methods
FR2915748B1 (fr) * 2007-05-03 2012-10-19 Flamel Tech Sa Acides polyglutamiques fonctionnalises par des groupes cationiques et des groupements hydrophobes et leurs applications, notamment therapeutiques

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Liquid phase Synthesis of peptides";BAYER E ET AL，;《NATURE》;19720630;第237卷(第5357期);512-513 *
"Solvent resistant nanofiltration: separating on a molecular level.";VANDEZANDE PIETER ET AL，;《CHEMICAL SOCIETY REVIEWS》;20070808;第37卷(第2期);365-405 *

Also Published As

Publication number Publication date
ES2609299T3 (es) 2017-04-19
US8664357B2 (en) 2014-03-04
PL2321339T3 (pl) 2017-06-30
EP2321339A1 (en) 2011-05-18
EP2321339B1 (en) 2016-09-28
HUE031306T2 (hu) 2017-07-28
GB0814519D0 (en) 2008-09-17
WO2010015864A1 (en) 2010-02-11
US20110245460A1 (en) 2011-10-06
CN102216320A (zh) 2011-10-12
CA2733409A1 (en) 2010-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102216320B (zh) 肽、pna或寡核苷酸的耐溶剂渗滤
US10239996B2 (en) Process for preparing polymers
US9127123B2 (en) Membrane enhanced polymer synthesis
EP3347402B1 (en) Defined monomer sequence polymers
CN106832324B (zh) 具有多种拓扑结构的葫芦脲聚合物的制备方法
WO2016020708A1 (en) Improved polymer synthesis
US20110224405A1 (en) Degradable supports for tide synthesis
WO1999041367A1 (de) Heteroaromatische oligoamide als affinitätsliganden
CN115011593B (zh) 一种高阶核酸结构及其制备方法和应用
Eriyagama Non-chromatographic Oligonucleotide Purification and Automated Polyethyleneglycol Synthesis
US20020025507A1 (en) Polymers as a support for combinatorial synthesis
CN115521358A (zh) 一种绿僵菌素b的制备方法
US20040010081A1 (en) Novel strategy for synthesizing polymers in surfaces
WO2023062389A1 (en) Solution phase polymer synthesis
CN115626951A (zh) 一种CladoamideA的制备方法
CN1978460A (zh) Pna寡聚体nh2tttoh的固相合成方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: London, England

Patentee after: IP2 IPO Innovation Co., Ltd.

Address before: London, England

Patentee before: IMP Innovations Ltd.

CP01 Change in the name or title of a patent holder