CN102212610A - 一种SecA ATPase抑制剂的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种筛选SecA ATPase抑制剂的方法，该方法提供了一种优化的ATPase酶活测定体系，建立了SecA蛋白ATPase活性抑制剂的蛋白水平筛选模型。本发明方法简单可靠，效率高，成本低，是一种理想的抗生素筛选方法。运用该筛选方法从化合物库的3220个样品中筛选得到可抑制绿脓杆菌SecA ATP酶的活性阳性化合物3个。从2096个微生物代谢粗提物中得到45个阳性样品，筛选阳性率为0.9％(以抑制率大于30％为筛选阳性标准)。

Description

一种SecA ATPase抑制剂的筛选方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种SecA ATPase抑制剂的筛选方法。

背景技术

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)，又名绿脓杆菌，是假单胞菌属中的代表菌种。绿脓杆菌是一种非发酵革兰氏阴性细菌，其营养要求不高，广泛分布于医院内各种环境。它可以引起多种类型的感染，如菌血症、肺炎、腹内感染、伤口感染、烧伤感染、尿路感染等。由于其外膜通透性低并存在着外排多种物质的主动外排系统(Active Efflux Systems)，因此多为天然耐多种抗生素菌株，感染后不易被控制。绿脓杆菌对有并发症、使用插入式导管、进行外科手术后的病人感染力特别强。研究显示，医院感染中超过60％的死亡率都与绿脓杆菌相关。绿脓杆菌通过感染病人，毒力可以增强；它甚至能攻击原是健康的人们，引起败血症、心内膜炎、脑脊髓膜炎、胸膜炎、盆腔炎、肾炎、胰腺炎等。由此可见，绿脓杆菌是一种重要的院内感染条件致病菌，是烧伤、外科手术后呼吸道感染中的主要因素。目前的临床治疗策略包括广谱抗生素的使用(如氟喹诺酮类、氨基糖苷类、碳青霉烯类、三代头孢菌素)和革兰氏阴性菌选择性药物的使用(如氨曲南和哌拉西林)，近年来又推出了β-内酰胺类抗生素联合氨基糖苷类或者氟喹诺酮类联合治疗。但是，广谱抗生素的大量使用以及药物的联合治疗导致了多药耐药株以及泛耐药株的急速出现。近年来，除了多尼培南外没有新的抗绿脓杆菌药物入市。因此，迫切需要发现新型低毒、高效抗绿脓杆菌药物。

从成千上万个微生物代谢产物或其它来源的天然产物中筛选所 需的抗菌药物是非常艰难的一个过程。目前开发新型有用的天然产物药物，虽然仍有很大的潜力，但研究工作的难度越来越大，耗时越来越长，需要的资金也越来越多。为摆脱筛选的盲目性，提高效率，有必要进行定靶筛选，从细菌生存所必须的组成成分或者临床有效抗生素的作用机理和细菌的耐药机理来设计筛选模型，有目的地筛选具有某种作用机理的抗生素，试图获得抗菌作用强、对耐药菌有效、毒性小的新抗生素。

Sec途径(即分泌途径secretion pathway)是蛋白质转运的主要途径。其中，SecA ATPase是蛋白质转运途径中的“动力泵”，它通过ATP的水解循环驱使蛋白质前体穿过细菌内膜，在细菌中是独有且不可缺少的。将SecA作为筛选抗菌药物的靶点，有望建立有效的抗菌药物筛选模型。然而，该项工作进展缓慢，到目前为止仍然没有有关可行方案的报道。

发明内容

针对上述不足，本发明提供一种SecA ATPase抑制剂的筛选方法。

本发明方法包括如下步骤：

1)配置如下反应体系：

反应物        终浓度

Hepes         90～110mM

MgCl₂         9～11mM

MnCl₂         1.8～2.2mM

ATP           9～11mM

PEP           0.9～1.1mM

NADH          1.3～1.7mM

SecAATPase    2.5～3.5μg/100μl

丙酮酸激酶    1.6～2.0U/100μl

乳酸脱氢酶    1.6～2.0U/100μl

2)设置如下各反应组：

i)样品实验组：向1)所述反应体系中加入适量已知浓度的样品溶液；

ii)阳性对照组：用等体积ddH₂O代替1)所述反应体系中的SecAATPase，抑制率设为100％，该组表征SecA ATPase的活性被完全抑制；

iii)阴性对照组：向1)所述反应体系中加入等量的i)所述样品溶液中除样品本身外的溶剂及溶质；

3)反应开始后，测定各反应组OD₃₄₀吸光值变化量，计算反应抑制率，对反应具有抑制作用的即为阳性样品。

上述步骤1)优选反应体系为：

反应           物终浓度

Hepes          100mM

MgCl₂          10mM

MnCl₂          2mM

ATP            10mM

PEP            1mM

NADH           C1.5mM

SecA ATPase    3μg/100μl

丙酮酸激酶     1.8U/100μl

乳酸脱氢酶     1.8U/100μl

上述步骤2)中样品为化合物时，优选向200μl反应体系中加入1μl 5mg/ml的样品溶液作为样品实验组；当样品为发酵液时，优选按照10μl发酵液挥干后制成1μl的样品溶液，加入反应体系作为样品实验组。

上述步骤3)从各组反应体系分别混合均匀后开始测定OD₃₄₀吸光值。具体可按照以下方法进行：将2)各组反应体系分别混匀后加入同一块96孔板中，置于酶标仪内，开启温控为37℃进行反应。以反应起始时间为0时刻，每隔2分钟检测一次各孔反应体系在340nm波长处的吸光值OD₃₄₀，连续检测50min(25次)。

结果分析：

分别计算各孔的ΔOD₃₄₀/min，

再依公式抑制率 计算各孔的抑制率。

其中：

ΔN是阴性对照孔平均每分钟吸光值的变化量。

ΔP是阳性对照孔平均每分钟吸光值的变化量。

ΔS是样品实验孔平均每分钟吸光值的变化量。

在本发明实施方案中，通过体外表达绿脓杆菌SecAN68蛋白，分离纯化得到PaSecAN68蛋白，按照上述方法从组合化学库、微生物次级代谢产物库以及天然产物库中共筛选5316个样品，其中3220个化合物，2096个发酵液样品，初筛阳性率79/5316＝1.5％，复筛阳性率49/5316＝0.9％(以抑制率大于30％为筛选阳性标准)。其中，活性化合物三个，分别为IMB2029501、IMB2030271和IMB2039021，抑制率分别为32.8％、43.0％和66.8％。抑菌试验表明这三个化合物对绿脓杆菌均具有良好的抑制作用。

本发明SecA ATPase抑制剂的筛选方法简单可靠，效率高，成本低，是一种理想的抗生素筛选方法。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1样品筛选

本例中以绿脓杆菌SecA酶为例，说明抗菌药物的筛选方法。

一、重组PaSecAN68蛋白的制备

1、pET20b/pasecAN68质粒的构建

以绿脓杆菌基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增pasecAN68基因全序列(SEQ ID No.3)。引物序列为：上游引物5’GAGATATA TTTGCGCCTTTG  3’；下游引物5’ 

ACAGCGCCTTCATGA 3’。斜体部分分别是Nde I和HindIII的酶切位点。

PCR反应体系包括：

模板(基因组DNA)    1μl

上游引物(20pM)     1μl

下游引物(20pM)     1μl

2×Pfu Mixture     25μl

无核酸酶ddH₂O      22μl

总体积             50μl

PCR反应的条件为：

95℃预变性         5min

将回收纯化的PCR产物和质粒载体pET20b经过Nde I和HindIII双酶切后，用T4DNA连接酶于16℃连接16h。

连接反应体系如下：

pET20b载体          2.8μl

PCR产物(pasecAN68)  10μl

10×T4缓冲液        1.5μl

T4连接酶            0.7μl

总体积              15μl

PCR产物与pET20b载体的摩尔比应该约为3/1。

连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养16h筛选重组子，提取质粒，双酶切鉴定插入片段后，由上海生工生物工程有限公司测序。

2、目的蛋白的诱导表达以及分离纯化

将测序无误的重组质粒pET20b/pasecAN68转化大肠杆菌B121(λDE3)。挑取转化子在含有100μg/ml氨苄青霉素的TAG液体培养基(TAG液体培养基(g/L)：K₂HPO₄ 7，KH₂PO₄3，(NH₄)₂SO₄ 1，柠檬酸钠(C₆H₅Na₃O₇·H₂O)0.47，胰蛋白胨10，葡萄糖5，NaCl 5，(pH7.0)中，37℃ 200rpm振荡培养至培养液变浑浊后，按1∶50的比例将上述培养物转接于含100μg/ml氨苄青霉素的TAG液体培养基中，37℃ 200rpm振荡培养至OD₆₆₀＝0.8左右，加入终浓度1.0mM IPTG，20℃诱导表达过夜。

离心收集菌体，超声裂解菌体后，将裂解液在4℃，15000g离心30min，上清用0.45μm滤膜过滤。通过 explorer系统，使用1ml HisTrap^TM HP镍离子亲和层析柱纯化重组PaSecAN68蛋白。

二、样品制备

化合物样品：10mg纯品化合物溶到1ml DMSO中，取10μl加10μl DMSO倍比稀释，取1μl作用于200μl反应体系，使其终浓度为25μg/ml。

发酵液样品：菌种发酵，从斜面上挑取一小块培养物种入盛有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，28℃、190转/分旋转摇床培养4天。取10ml发酵液用10ml的丙酮抽提，挥干后，用1ml的DMSO溶解。取1μl作用于200μl反应体系。

三、样品活性检测

配制如下反应体系：(每孔反应体系总体积为200μl)

反应物      终浓度

Hepes       100mM

MgCl₂       10mM

MnCl₂       2mM

ATP         10mM

PEP         1mM

NADH        1.5mM

PaSecAN68   3μg/100ul

丙酮酸激酶      1.8U/100μl

乳酸脱氢酶      1.8U/100μl

按以下分组向反应体系中添加组分：

A.阴性对照组：加入1μl DMSO(若筛选发酵液样品，此处以1μl

抽提后的发酵培养基代之，抽提过程同“样品制

备”中的发酵液样品抽提过程)

B.阳性对照组：添加等体积的ddH₂O代替PaSecAN68。

C.样品实验组：加入1μl待测样品

将上述各组反应体系分别混匀后加入同一块96孔板中，置于PerkinElmer公司的EnVision酶标仪内，开启温控为37℃进行反应。以反应起始时间为0时刻，每隔2分钟检测一次各孔反应体系在340nm波长处的吸光值OD₃₄₀，连续检测50min(25次)。

结果分析：

分别计算各孔的ΔOD₃₄₀/min，

再依公式抑制率 

计算各孔的抑制率。

其中：

ΔN是阴性对照孔平均每分钟吸光值的变化量。

ΔP是阳性对照孔平均每分钟吸光值的变化量。

ΔS是样品实验孔平均每分钟吸光值的变化量。

筛选结果为：从组合化学库、微生物次级代谢产物库以及天然产物库中共筛选5316个样品，其中3220个化合物，2096个发酵液样品，初筛阳性率79/5316＝1.5％，复筛阳性率49/5316＝0.9％(以抑制率大于30％为筛选阳性标准)。活性化合物三个，分别为IMB2029501(β-咔啉碱类化合物)、IMB2030271(β-咔啉碱类化合物)和IMB2039021(2，3-亚甲二氧基-9，10-二甲氧基-13-辛基四氢原小檗碱)，抑制率分别为32.8％、43.0％和66.8％。

实施例2抑菌试验

菌株：

大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21.19/pET20b/PasecA：高效表达绿脓杆菌SecA蛋白的温度敏感型大肠杆菌表达宿主细胞BL21.19，所述检定菌已经于2006年10月16日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院，邮政编码100101)，保藏号为CGMCC No.1838。大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21.19/pET5a/EcsecA：高效表达大肠杆菌SecA蛋白的温度敏感型大肠杆菌表达宿主细胞BL21.19，所述检定菌已经于2006年10月16日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院，邮政编码100101)，保藏号为CGMCC No.1839。BL21.19/pET20b：携带pET20b空质粒的温度敏感型大肠杆菌BL21.19，为本实验室构建并保藏。野生型绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。

培养基：

1.TA(g/L)：K₂HPO₄ 7，KH₂PO₄ 3，(NH₄)₂SO₄ 1，柠檬酸钠(C₆H₅Na₃O₇·H₂O) 0.47，胰蛋白胨 10，NaCl 5，(若需固体另加琼脂18g)，pH 7.0。

2.S(g/L)：蛋白胨 5，牛肉膏 3，(若需固体另加琼脂18g)，pH 8.0。

方法：

用纸片法进行抑菌试验。即将TAG和S固体培养基加热熔化，冷却至温度接近体温时，往TAG液体培养基(TAG液体培养基(g/L)：K₂HPO₄ 7，KH₂PO₄ 3，(NH₄)₂SO₄ 1，柠檬酸钠(C₆H₅Na₃O₇·H₂O)0.47，胰蛋白胨 10，葡萄糖 5，NaCl 5，(pH 7.0))中加入氨苄青霉素，使终浓度分别为100μg/mL。将BL21.19/pET20b/PasecA、BL21.19/pET5a/EcsecA及BL21.19/pET20b的过夜培养的菌液分别加入至含有100μg/mL氨苄青霉素的TAG培养基中，菌液终浓度为2％，将绿脓杆菌的过夜培养的菌液加入至S培养基中，菌液终浓度为1％。将含有菌液的培养基迅速倒入含有边框的透明玻璃平板，厚度约3 mm。待培养基凝固后，用直径6mm纸片沾取待测样品，然后整齐并保持一定间隔地贴在检定板上。将铺有BL21.19/pET20b/PasecA和BL21.19/pET5a/EcsecA两种检定菌的检定板放在42℃培养，BL21.19/pET20b放在30℃培养，绿脓杆菌放在37℃培养。第二天测量抑菌圈的大小。

抑菌试验结果：

通过测量抑菌圈(抑菌圈大于7mm即认为该发酵液样品为阳性)并经过两次生物学重复，得到蛋白水平筛选到的3个活性化合物的抑菌结果如表1所示：

表1阳性样品对PaSecAATP酶活的抑制作用

注：样品浓度为60μg/纸片

化合物2029501、2030271、2039021不仅对BL21.19/pET20b/PasecA(42℃)有活性，对绿脓杆菌(37℃)的生长也有抑制作用的样品。

序列表

<110>中国医学科学院医药生物技术研究所

 

<120>一种SecA ATPase抑制剂的筛选方法

 

<130>KHP10112213.6

 

<160>3

 

<170>PatentIn version 3.5

 

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>1

gagatataca tatgtttgcg cctttg                                          26

 

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>2

aagcttacag cgccttcatg a                                               21

 

<210>3

<211>1827

<212>DNA

<213>绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)

 

<400>1

atgtttgcgc ctttgttgaa gaaactcttt ggaagcaaga acgagcgtga tgtaaagcgc     60

atggccaagg ctgtacaggc catcaatgcg ctcgagcccc agatggtggc gctctccgac    120

gagcagttga aggcgaaaac ggctgaattc cagcagcgct acgccaaggg cgaaacgctc    180

gaccaattgc tgcccgaagc cttcgccgtg gttcgcgagg ctggcaagcg ggtgatgggc    240

atgcgccact tcgatgtcca gctgatcggt ggcatgaccc tgcacgacgg caagatcgcc    300

gaaatgcgta ccggcgaggg caagaccctg gtgggcaccc tgccggtcta cctcaacgcg    360

ctgtccggca agggcgtgca cgtggtcacg gtgaacgact acctggcgcg ccgcgacgcc    420

aactggatgc gcccgctgta cgagttcctc ggcctcagcg tcggcgtggt cactcccttc    480

cagccgccgg aagacaagcg cgccgcctac gccgccgaca tcacctacgg caccaacaac    540

gaattcggct tcgattacct gcgcgacaac atggccttca gcctggacga caagttccag    600

cgcgagctga acttcgccgt ggtcgacgaa gtggactcga tcctcatcga cgaggcgcgt    660

accccgctga tcatctccgg ccaggccgaa gacagctccg agctgtacat caagatcaac    720

aagctgatcc cgcgtctcaa gcgccaggtt gaagaggtcg agggcaagcc gaccgaggaa    780

ggccactaca gcatcgacga gaagacccgc caggtcgaac tcaacgagca gggccaccag    840

ttcatcgagg acctgctgag ccagaacggc ctgctcggcg aaggcgagag cctctactcg    900

gcgcacaacc tgagcctgct gacccacgtc tacgcagcgc tgcgcgcgca caccctgttc    960

caccgcaacg tcgagtacat cgtccagggc gaccagatcc tcctgatcga cgagcacacc   1020

ggccgcacca tgcctggccg acgcctgtcc gagggcctgc accaggccat cgaggcgaag   1080

gaaggcttgc cgatccaggc cgagagccag accctggcct ccaccacctt ccagaactac   1140

ttccgcctgt acaacaagct ggccggcatg accggcaccg ccgataccga ggccttcgag   1200

ttccgccaga tctacggtct cgacgtggtg gtgatcccga cccaccggcc gatcgcgcgc   1260

aaggacttca acgacctggt ctacctgacc caggaagaga agtacgcggc gatcatcacc    1320

gacatcaagc agtgccaggc cctcggccgg ccgatcctgg tcggcaccgc gtcgatcgag    1380

agttccgagt acgtttccaa gctgttgcaa gaggcaggca tcgagcacaa ggtgctcaac    1440

gccaagtacc acgagaagga agccgagatc atcgcccagg ctggcgcgcc cggttcggtg    1500

accatcgcca ccaacatggc cggccgcggt accgacatcc tcctcggcgg caactgggaa    1560

gtcgaagtcg cggccctgga gaaccccacc gaggagcaga tcgcccagat caaggccgaa    1620

tggcagaagc gccaccagca ggtgatcgag gcgggcggcc tgcacgtgat cgcctccgag    1680

cgccacgaat cccgccggat cgacaaccag ttgcgcggcc gtgccggtcg tcagggcgac    1740

ccgggttcca gccgcttcta cctgtcgctg gaagacaacc tgatgcggat cttcgcctcc    1800

gaccgggtga agaacttcat gaaggcg                                        1827

Claims (6)

1.一种筛选SecAATPase抑制剂的方法，包括如下步骤：

1)配置如下反应体系：

反应物        终浓度

Hepes         90～110mM

MgCl₂         9～11mM

MnCl₂         1.8～2.2mM

ATP           9～11mM

PEP           0.9～1.1mM

NADH          1.3～1.7mM

SecA ATPase   2.5～3.5μg/100μl

丙酮酸激酶    1.6～2.0U/100μl

乳酸脱氢酶    1.6～2.0U/100μl

2)设置如下各反应组：

i)样品实验组：向1)所述反应体系中加入适量已知浓度的样品溶液；

ii)阴性对照组：用等体积ddH₂O代替1)所述反应体系中的SecAATPase；

iii)阳性对照组：向1)所述反应体系中加入等量的i)所述样品溶液中除样品本身外的溶剂及溶质；

3)反应开始后，测定各反应组OD₃₄₀吸光值变化量，计算反应抑制率，对反应具有抑制作用的即为阳性样品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系为：

反应物     终浓度

Hepes      100mM

MgCl₂      10mM

MnCl₂      2mM

ATP        10mM

PEP        1mM

NADH          1.5mM

SecA ATPase   3μg/100μl

丙酮酸激酶    1.8U/100μl

乳酸脱氢酶    1.8U/100μl。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中步骤2)中样品为化合物时，向200μl反应体系中加入1μl 5mg/ml的样品溶液作为样品实验组；当样品为发酵液时，按照10μl发酵液挥干后制成1μl的样品溶液，加入反应体系作为样品实验组。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中步骤3)将2)各组反应体系分别混匀后加入同一块96孔板中，置于酶标仪内，开启温控为37℃进行反应，以反应起始时间为0时刻，每隔2分钟检测一次各孔反应体系在340nm波长处的吸光值OD₃₄₀，连续检测50min，

结果分析：

分别计算各孔的ΔOD₃₄₀/min，

再依公式抑制率 $\mathrm{IR}=\frac{\mathrm{\&Delta;N}-\mathrm{\&Delta;S}}{\mathrm{\&Delta;N}-\mathrm{\&Delta;P}}\&times;100\%$ 计算各孔的抑制率；

其中：

ΔN是阴性对照孔平均每分钟吸光值的变化量，

ΔP是阳性对照孔平均每分钟吸光值的变化量，

ΔS是样品实验孔平均每分钟吸光值的变化量。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，抑制率大于30％的样品为阳性样品。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述SecA ATPase为PaSecAN68蛋白。