CN102210851A - 人αB-晶体蛋白在制备保护视网膜神经节细胞的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明“人αB-晶体蛋白在制备保护视网膜神经节细胞的药物中的应用”，属于生物制药领域。所述保护视网膜神经节细胞的药物，其特征在于：其有效成分为分离纯化的αB-晶体蛋白。本发明提供的药物中的有效成分αB-晶体蛋白能够显著促进视网膜神经节细胞RGCs的存活及轴突再生，试验证明，是一种对损伤后的视神经能起到恢复视功能的有效药物。

Description

人αB-晶体蛋白在制备保护视网膜神经节细胞的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别是涉及到一种人αB-晶体蛋白在制备保护视网膜神经节细胞的药物中的应用及药物。

背景技术

视神经损伤是临床常见眼外伤类型和致盲原因。近年，随着社会经济发展，交通事故等外伤的增多，视神经损伤也明显增多，在颅脑外伤患者中其发生率为6％～12.6％。传统的观点认为：视神经损伤后发生不可逆的病理改变，神经组织不能再生，视功能损伤不能恢复。目前，尚无确切有效的治疗手段。因此在视神经损伤后，及时采取有效的治疗方法，保护和挽救视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)的存活和促进其轴突修复，已成为目前研究的热点。

视神经损伤后难以再生的主要原因有：损伤后视网膜神经节细胞(retinal ganglion cellsRGCs)的继发性凋亡；失去靶细胞提供的营养物质；损伤局部胶质瘢痕的形成以及抑制性微环境的阻碍作用。为此，以往促进视神经再生研究主要集中在：1)补充外源性神经营养因子。虽可一定程度保护RGCs存活，但作用短暂，多无促再生作用；2)干扰凋亡信号通路可减少RGCs发生凋亡，但并不能增强其轴突再生能力；3)用抗体或核酸干扰阻断髓鞘抑制物的作用能促进RGCs轴突再生，但也只是短距离再生。此外，外周神经移植可促进视神经再生，但未能实现再生纤维与视中枢形成功能联接。由此可见，目前的各种方法均不能达到神经纤维长距离有效的功能性再生。

αB-晶体蛋白是α-晶体蛋白的一个亚基，Srivastava于2002年首次从晶状体中将其片段分离出来(Srivastava OP，Srivastava K.Existence of deamidated alphaB-crystallin fragm ents innormal and cataractous human lenses[J].Mol Vis.2003，9：110-118.)。αB-晶体蛋白是小分子热休克蛋白家族中的sHspB5，因此其具有小分子热休克蛋白家族的共性，分子量小，大小约20KD，参与细胞的发育过程，并抵御多种因素引起的应激损伤和凋亡。不仅可以对变性神经组织有保护和促进修复作用，还具有抑制炎症、应激反应，维护细胞骨架蛋白和骨架网络稳定性，及抵抗缺氧、高温、反射线及药物等因素诱导的细胞凋亡的作用。国内外的研究结果也显示，αB-晶体蛋白与眼科青光眼视神经病变、视网膜撕裂、年龄相关性黄斑变性、视网膜缺血再灌注损伤，视网膜营养不良、糖尿病视网膜病变等多种病变有关。而且，重组αB-晶体蛋白用于多发性硬化的治疗，已在动物实验中取得了良好的治疗效果(Ousman SS，Tomooka BH，vanNoort JM et al.Protective and therapeutic role for alphaB-crystallin in autoimmunedemyelination[J].Nature.2007，448(7152)：474-479)。近来研究发现：既不在玻璃体腔注射神经营养因子，也不需髓鞘抑制物的中和抗体，晶状体损伤后能显著促进RGCs的存活及轴突再生，并且再生轴突可达到上丘，形成功能性突触联系，这一保护作用显著强于已知神经营养因子及中和髓鞘抑制物的作用，但尚不明确这种保护作用的机理及起保护作用的活性物质是什么。

发明内容

本发明根据上述领域的空白，提供一种保护视网膜神经节细胞的药物。

人αB-晶体蛋白在制备保护视网膜神经节细胞的药物中的应用。

所述保护视网膜神经节细胞的药物，其特征在于：其有效成分为分离纯化的重组人αB-晶体蛋白，所述重组人αB-晶体蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示。

所述药物的剂型为注射剂。

所述药物的制备方法：将分离纯化的重组人αB-晶体蛋白溶于不影响αB-晶体蛋白活性且适用于人体注射的溶剂中。

所述溶剂的配方为：20mM Tris-HCl，pH 7.5，50mM氯化钠，1mM EDTA，溶于无菌水中。

所述重组人αB-晶体蛋白是人工构建的包含有如Seq ID No.2所示的核苷酸序列的重组表达载体在体外表达，然后经分离纯化而得的重组蛋白。

所述体外表达指：将所述重组表达载体pET28a-αB-crystallin转染到BL21细胞中，诱导阳性BL21细胞表达重组人αB-晶体蛋白。

本发明基于发明人的发现：人源αB晶体蛋白是晶体源性神经保护物质并能与视网膜神经节细胞胞膜结合，而且能拮抗髓鞘抑制物的阻碍作用促进RGCs突起的生长。发明人通过一序列动物模型试验证明：重组人αB-晶体蛋白在视神经损伤后对RCGs有明显的保护作用，能够明显提高RGCs的存活率，促进RGCs突起的生长和受损的视神经轴突再生。

根据这一系列试验结果，本发明提出了重组人αB晶体蛋白在制备保护视网膜神经节细胞的药物中的应用。这类药物以人工表达的重组人αB晶体蛋白为有效成分，能够对视网膜神经细胞的损伤提供有效的保护和恢复作用，促进视网膜神经节细胞细胞突起的生长和轴突再生。本发明的药物，主要制备成注射剂，经静脉给药，注射剂的溶剂须是不影响αB-晶体蛋白活性，并适合人体注射两个条件。人αB-晶体蛋白为已知蛋白，本领域技术人员基于对αB-晶体蛋白活性及保存条件的了解，可配制多种溶剂对有效成分重组人αB-晶体蛋白进行溶解制备成本发明的药物注射剂。

本发明还提供了药物的制备方法，主要步骤是体外制备重组人αB-晶体蛋白，然后溶于溶剂中。体外制备重组人αB-晶体蛋白，包括构建重组表达载体，转染体外宿主细胞，培育细胞使其表达重组蛋白等步骤，αB-晶体蛋白可依照现有技术(Ousman SS，Tomooka BH，vanNoort JM et al.Protective and therapeutic role for alphaB-crystallin in autoimmunedemyelination[J].Nature.2007，448(7152)：474-479)来操作。

附图说明

图1-1PCR扩增产物电泳图，

1泳道：DL2000DNA marker，2泳道：PCR产物

图1-2 PMD19-T-αB-crystallin酶切鉴定电泳图，

1泳道：DNA ladder marker，2泳道：PMD 19-T-αB-crystallin酶切条带

图1-3 pET32a-αB-crystallin酶切鉴定电泳图，

1泳道：DNA ladder marker，2泳道：pET32a-αB-crystallin酶切条带

图1-6PCR扩增产物电泳图

1泳道：DNA ladder marker，2泳道：PCR产物

图1-7 pET28a-αB-crystallin酶切鉴定电泳图

1泳道：DNA ladder marker，2泳道：pET28a-αB-crystallin酶切条带

图1-8 pET28a-αB-crystallin质粒测序

图1-9重组蛋白SDS-PAGE分析

1泳道：蛋白分子量marker

2-4泳道：0.4mM和0.6mM浓度的IPTG下诱导的上清和沉淀

图1-10(a)重组αB-晶体蛋白Q柱纯化图

图1-10(b)层析过程中的αB-晶体蛋白SDS-PAGE

1-3泳道：上样样品、穿透、沉淀，4泳道：蛋白分子量marker，5-9泳道：纯化过程中p1、p2、p3、p4、p5分别收集的纯化蛋白

图1-11重组蛋白考马斯亮蓝染色

1泳道：蛋白分子量marker

2泳道：重组人aB-晶体蛋白；

图1-13重组人αB-晶体蛋白肽质量指纹质谱鉴定蛋白评分

图1-14重组人αB-晶体蛋白肽质量指纹质谱鉴定结果

图2-1实验用Long Evans大鼠

图2-2实验用中号无创血管钳

图2-3大鼠尾静脉注射

图2-4大鼠上丘和外侧膝状体定位

图2-5大鼠视网膜铺片RGCs计数示意图

图2-7正常组大鼠视网膜荧光金逆行标记的RGCs

荧光金标记的正常RGCs细胞形态呈三角形(b图粗箭头)或圆形(b图细箭头)，胞浆荧光均匀明亮。a(×100倍)，b(×400倍)

图2-8视神经损伤后2周，各组视网膜荧光金标记的RGCs

a(1)：C组(×200倍)；a(2)：C组(×400倍)

b(1)：S组(×200倍)；b(2)：S组(×400倍)

图2-9视神经损伤后4周，各组视网膜荧光金标记的RGCs

a(1)：C组(×200倍)；a(2)：C组(×400倍)

b(1)：S组(×200倍)；b(2)：S组(×400倍)

图2-11正常大鼠β-III-tubulin免疫荧光染色

a(×200倍)，b(×400倍)

图2-12视神经钳夹伤2周后，大鼠β-III-tubulin免疫荧光染色

a(1)：C组(×100倍)；a(2)：C组(×400倍)

b(1)：S组(×100倍)；b(2)：S组(×400倍)

图2-13视神经损伤后4周，各组βIII-tubulin免疫荧光染色的RGCs

a(1)：C组(×200倍)；a(2)：C组(×400倍)

b(1)：S组(×200倍)；b(2)：S组(×400倍)

具体实施方式

实施例1.人αB-晶体蛋白的制备

一、质粒、菌株和细胞

1.大肠杆菌BL21(DE3)

2.PMD19-T载体(TAKARA公司，日本)

3.DH5α菌株、pET32a质粒、pET28a质粒(Novagen公司，美国)

二、主要酶和试剂

1.逆转录试剂盒((TOYOBO公司，日本)

2.Luria-Bertani medium(Difco公司，美国)

3.KOD Plus DNA Polymerase(TOYOBO公司，日本)

4.限制性内切酶Nco、HindIII、EcoRI、XhoI(TOYOBO公司，日本)

5.DNA连接酶solution I(TAKARA公司，日本)

6.多聚酶链反应(PCR)试剂Taq聚合酶(TAKARA公司，日本)

7.dNTPs(TAKARA公司，日本)

8.DNA marker(北京天根公司，中国)

9.IPTG(Sigma公司，美国)

10.Trx and Trx antibody(R&D公司，美国)

13.a-crystallin(Sigma公司，美国)

14.aB-crystallin antibody (Santa公司，美国)

15.Primers(Sangon公司，中国)

16.aB-crystallin(Cell Sciences公司，美国)

17.Tris碱(TBD生物技术发展中心，中国)

18.甘氨酸(绿鸟科技发展有限公司，中国)

19.SDS(TBD生物技术发展中心，中国)

20.预染标准蛋白质marker(中山生物技术有限公司，中国)

22.辣根酶标记的抗兔IgG(中山生物技术有限公司，中国)

23.化学发光显影剂(Pierce公司，美国)

24.BCA法蛋白定量试剂盒(百泰克生物技术有限公司，中国)

25.碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG(中山生物技术有限公司，中国)

三、主要仪器

1.超净工作台(苏州集团安泰公司，中国)

2.转膜仪(杭州博日科技有限公司，中国)

3.图像分析仪(Leica公司，德国)

4.凝胶成像系统(BIV-RAD公司，美国)

5.自动凝胶层析仪(MB99-2)(沪西分析仪器厂，中国)

6.紫外可见分光光度计(Tu-1900)(北京普析通用仪器有限责任公司，中国)

四、主要配方

Sterile filtered liquid in 20mM Tris-HCl，pH 7.5+50mM NaCl+1mM EDTA

1.磷酸缓冲液的配制(0.05mol/L，pH6.7)：称磷酸氢二钠7.7895g，磷酸二氢钠4.407g溶于双蒸水中，定容至1L，过滤去除杂质。

2.电泳缓冲液的配制(5×)：Tris碱15.1g，SDS 5g，甘氨酸94g，加双蒸水至1000ml定容。

3.12％Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺电泳-分离胶的配制：30％丙烯酰胺溶液4.0ml，10％SDS 0.1ml，10％过硫酸胺0.1ml，1.5mmol/L Tris 2.5ml(pH8.8)，TEMED 0.004ml，双蒸水3.3ml，共10ml。

4.5％Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺电泳-积层胶的配制：30％丙烯酰胺溶液0.83ml，10％SDS 0.05ml，10％过硫酸胺0.05ml，1.0mmol/L Tris 0.63ml(pH 6.8)，TEMED 0.005ml，双蒸水3.4ml，共5ml。

5.10％过硫酸胺的配制：过硫酸胺1g，加双蒸水至10ml定容。

6.上样缓冲液的配制(2×)：双蒸水5ml，0.1mol/L Tris-HCl(pH 6.8)5ml，4％(w/v)SDS20ml，20％(v/v)甘油10ml，0.2mol/L 2-b-巯基乙醇0.25g，0.2％(w/v)溴酚蓝0.08g。

7.转膜缓冲液：甲醇200ml，甘氨酸2.9g，SDS0.37g，Tris5.8g，双蒸水1000ml。

8.TBST缓冲液(PH7.5)：Tween200.5ml，NaCl8.76g，Tris6.05g，双蒸水1000ml。

五、实验方法

(一)人αB-晶体蛋白基因获得

在GenBank中检索到人αB-晶体蛋白的序列为：Seq ID NO.1所示。根据大肠杆菌的密码子使用偏好，将人αB-crystallin的氨基酸序列转化DNA序列，人工合成cDNA序列。

(二)目的基因的PCR扩增

根据人αB-晶体蛋白的基因序列及pET32a载体的多克隆位点，采用Primer 5.0软件设计扩增人αB-晶体蛋白基因的特异性引物。上游引物序列为：5′-GGAATTGATCG CCATCCACCAC-3′，下游引物序列为：5′-CCGCTCGAGCTATTTCTTGGGGGCTGC GG-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，扩增片段长度为545bp。

1、变性：

反应体系为：

扩增条件：98℃预变性，5min后扩增30个循环，每个循环步骤包括94℃30s，62℃30s，72℃30s，循环结束后72℃10min。结果显示PCR扩增人αB-晶体蛋白编码序列cDNA，电泳可在约545bp处观察到特异性扩增条带(图1-1)。

2、电泳

取50μl扩增产物，于含有0.5mg/L溴化乙锭的1g/L的琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶自动成像系统分析结果。

3、凝胶回收

自电泳后琼脂糖凝胶中回收纯化目的基因，参照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根公司)的说明书进行操作，将收集的DNA溶液50倍稀释后，用双光束紫外可见光分光光度计测浓度，结果示48ng/ul。

4、T载体质粒构建

利用DNA连接酶的作用，将PMD19-T载体与上述凝胶回收产物进行连接，具体步骤如下：

(1)纯化后DNA片段3’末端加A尾，反应体系为：

(2)将PMD19-T载体在冰上融化后，短暂离心；

(3)按照PMD19-T载体与目的片段摩尔比＝1∶3原则，计算反应体系，具体如下：

5、转化

将连接产物转化入DH5α感受态大肠杆菌细胞，具体步骤如下：

(1)取10μl上述连接产物，加入装有已在冰上解冻的200μl感受态大肠杆菌细胞DH5α的离心管中后，冰浴30min；

(2)将离心管置于42℃水浴中，热冲击90秒，后小心取出离心管，不要摇动，并迅速将其冰浴2min；

(3)于离心管中加入800μl LB培养基，37℃，150rpm，温和摇振60min；

(4)离心5min(3000rpm)后，吸出300μl上清液；

(5)混匀残余的上清液和沉淀后，吸取100μl转化菌液，均匀的涂布于LB平板上(浓度100mg/ml，氨苄抗性，37℃预热，并已加X-Gal和IPTG于LB平板中)，培养过夜，37℃；

(6)挑取LB平板上11个形态饱满的白斑扩菌，分别移入11个离心管中，并加入1ml LB培养液，37℃培养过夜；

(7)分别从上述离心管中移400μl菌液到相应已编码的另11个离心管中，3000rpm离心，5min，弃上清；

(8)后分别加入双蒸水10μl，吹吸均匀后，分别加入50μl酚氯仿溶液，上下颠倒数次，1200rpm离心，3min；

(9)依次吸取上述离心管中上清，移到平板上，并分别加1μl上样缓冲液，混匀后，依次加入1％琼脂糖凝胶上样孔中，进行电泳(120V，30min)；

(10)根据电泳结果取1、2、4、8号菌液，加入氨苄抗性培养液，37℃，150rpm震荡培养过夜。

6、质粒提取

将转化入感受态大肠杆菌细胞DH5α的PMD19-T-αB-crystallin重组质粒抽提出来(参照北京天根公司的“质粒DNA提取试剂盒”)，对抽提的质粒进行双酶切及电泳鉴定，所用酶为Ecorl I/Xho I。电泳结果显示可在约545bp处观察到目的条带(图1-2)，表明目的基因片段成功插入PMD19-T载体。

(三)构建重组质粒pET32a-αB-crystallin

分别用限制性内切酶Ecorl I和Xho I双酶切目的基因片段和载体pET32a，在Ligase连接酶作用下进行连接并转化，步骤如下：

1、连接体系

2、转化：将连接产物全部转化入感受态细菌DH5α，步骤同前；

3、提取质粒：步骤同前；

4、酶切鉴定：将所提质粒使用限制性内切酶Ecorl I和Xho I进行双酶切电泳鉴定。电泳可在约545bp处观察到目的条带(图1-3)，表明目的基因片段成功插入表达载体。阳性克隆命名为pET32a-αB-crystallin。

(四)pET32a-αB-crystallin质粒PCR扩增αB-晶体蛋白的cDNA

根据人αB-晶体蛋白的cDNA序列及pET28a载体的多克隆位点，采用Primer 5.0软件设计扩增人αB-晶体蛋白基因的特异性引物。上游引物序列为：5′-CATGCCATGGACATCGCCATCCACCAC-3′，下游引物序列为：5′-CCGCTCG AGTTACTATTTCTTGGGGGCTGCGG-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1、变性

反应体系为：

扩增条件为：94℃预变性5min后扩增30个循环。每个循环步骤包括94℃40s，58℃45s，72℃45s。循环结束后72℃延伸5min。

2、电泳

取16μl扩增产物于1g/L的琼脂糖凝胶(含0.5mg/L溴化乙锭)中电泳，凝胶自动成像系统分析结果，电泳可在约545bp处观察到特异性扩增条带(图1-6)。

3、凝胶回收PCR目的片段，步骤同前

4、酶切PCR目的片段

(1)酶切体系：按下列加入酶切体系成分：

酶切条件：37℃，3h

(2)DNA琼脂糖凝胶电泳，后胶回收目的片段。

(五)构建重组质粒pET28a-αB-crystallin

将双酶切目的基因片段和载体pET28a在Ligase连接酶作用下进行连接并转化，步骤如下：

1、连接体系

2、转化：将连接产物全部转化入感受态细菌DH5α，步骤同前；

3、提取质粒：步骤同前；

4、酶切鉴定：将所提质粒使用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切电泳鉴定。电泳可在约545bp处观察到特异性扩增条带(图1-7)，将阳性质粒送英骏公司测序，结果示目的片段αB-晶体蛋白基因与GenBANK序列比对完全正确(图1-8)。阳性克隆命名为pET28a-αB-crystallin。

(六)重组质粒pET28a-αB-crystallin转化BL21宿主菌及诱导表达重组人αB-晶体蛋白诱导、表达目的蛋白重组人αB-晶体蛋白。

(七)重组人αB-晶体蛋白的蛋白纯化

pET28a-αB-crystallin重组质粒表达的蛋白是重组人αB-晶体蛋白，经Q柱纯(图1-10(a))和疏水柱纯化方法得到高纯度的重组蛋白，将纯化过程中收集的蛋白依次上样电泳，上样顺序：上样样品、穿透、沉淀、marker、p1、p2、p3、p4、p5、p6(图1-10(b))，将纯化的蛋白再次通过疏水柱纯化，得到纯化的蛋白微型滤器过滤后测浓度为1.72mg/ml，分装备用。

(八)重组人αB-晶体蛋白鉴定

1、聚丙烯酰胺凝胶电泳

取适量重组人αB-晶体蛋白和Trx-αB-crystallin融合蛋白样品，加等体积2×SDS LoadingBuffer，沸水煮3-5min后上样。电泳显示可观察到目的蛋白表达(图1-9)，表明重组质粒pET28a-αB-crystallin在BL21宿主菌中成功诱导表达重组蛋白。

2、考马斯亮蓝染色

用考马斯亮蓝R-250染色液将凝胶染色2h，用考马斯亮蓝染色脱色液洗脱4h，凝胶成像系统在可见光下照相。可观察到重组人αB-晶体蛋白大小约20kb(图1-11)，重组人αB-晶体蛋白的大小与GenBank上搜索查到的20.1kb相似，表明重组蛋白的大小正确。

3、重组人αB-晶体蛋白肽质量指纹质谱鉴定

(1)蛋白样本制备：将含有目的蛋白质的SDS-PAGE电泳后考马斯蓝染色的胶条切下，放入双蒸水EP管，在北京华大中生科技发展有限公司进行肽质量指纹质谱分析鉴定。采用的MALDI-TOF质谱仪为Bruker Autoflex，N2激光器(发射波长337nm)，加速电压20KV。

(2)肽质量指纹质谱所用试剂：a-氰基-4-羟基肉桂酸(a-CHCA)，ACN购自Sigma公司，TFA购自Merck公司，胰蛋白酶(trypsin，sequencing grade)购自Promega公司，peptidecalibration standard购自Bruker公司。

(3)一级质谱分析的主要参数如下：离子源加速电压1为25kV，加速电压2为21.9kV，N2激光波长为337nm，质谱信号单次扫描累加100次，收集的质核比范围为600-4000。谱图利用Flexanalysis 2.2和BioTools2.2软件来标注和提取肽段的质核比数据。肽段的质荷比数据通过Mascot软件(http://www.matrix-science.com)从人的NCBI蛋白质数据库中搜索

出其对应的蛋白质。搜索参数如下：

(4)对序列数据库中酶解的肽片断作蛋白质序列匹配搜索，所用的数据库为：MATRIXSCIENCE数据库，Database：NCBInr 20100429(10926906sequences；3720791775residues)，采用Mowse Score评分。

结果显示：

在MATRIX SCIENCE数据库中检索，采用Mowse Score评分，得分大于83分时，所鉴定物质肽片断与数据库中已知蛋白质肽片断相匹配的符合率高，有显著性差异(p＜0.05)(图1-13)。肽质量指纹质谱结果显示送检蛋白条带是αB-晶体蛋白(图1-14)。

实施例2.荧光金逆行示踪标记RGCs

材料：

一、主要器材

1.眼科显微手术器械                (苏州明仁医疗器械公司，中国)

2.中号无创血管夹                  (无锡医用器械厂，中国)

3.解剖手术显微镜                  (Olympus公司，日本)

4.荧光显微镜                      (Leica公司，德国)

5.图像分析仪                      (Leica公司，德国)

6.计时秒表                        (重庆仪表厂，中国)

7.大鼠立体定位仪                  (NARISHIGE公司，日本)

8.精密电子天平JA1003              (上海精科天平，中国)

9.电热恒温干燥箱                  (重庆四达实验仪器有限公司，中国)

10.尖头10μl微量上样器            (上海高欣玻璃仪器厂，中国)

11.Minipore滤纸                   (密理博，美国)

12.GT22000NV视觉电生理检查系统    (重庆国特医疗仪器厂，中国)

二、主要试剂

还需要以下试剂：

1.Cy3标记山羊抗小鼠IgG二抗                (Beyotime公司，中国)

2.小鼠抗大鼠beta-III Tubulin单克隆抗体    (R&D公司，美国)

3.乌来糖                                  (Sigma公司，美国)

4.戊巴比妥钠                              (Sigma公司，美国)，

5.4％多聚甲醛溶液                         (重庆化学试剂厂，中国)

6.荧光金                                  (Biotium公司，美国)

7.一抗封闭液                              (Beyotime公司，中国)

8.抗荧光淬灭封片液                        (Beyotime公司，中国)

9.中性树胶封片液                          (上海瑞齐生物科技公司，中国)

10.重组人αB-晶体蛋白                     (1.72mg/ml)实施例1制备备用。

三、实验动物及分组

出生后约3个月的Long Evans成年大鼠44只(图2-1)，雌雄不限，体质量(250±20)g，由第三军医大学野战外科研究所实验动物中心提供，检证字SCXK(渝)20020003，标准号为清洁级，符合国家医用动物使用标准。27只大鼠随机分成正常组、重组人αB-晶体蛋白组(简称C组)、和生理盐水组(简称S组)，每组9只。

方法：

步骤(一)建立大鼠视神经钳夹伤模型

用戊巴比妥钠(3.0ml/kg)腹腔注射麻醉实验大鼠，麻醉满意后，将大鼠俯卧固定于手术台，在手术显微镜下，沿角膜缘剪开大鼠手术眼的上穹隆结膜约120°，并钝性分离结膜至巩膜，注意向后分离时避开涡状静脉，暴露球后视神经长约4mm，用无创中号血管夹钳(图2-2)夹球后2mm处视神经5s，并避免损伤眼动脉。术后用载玻片轻压角膜，手术显微镜下观察眼底，眼底无缺血大鼠纳入实验，术后分层缝合。术毕实验大鼠术眼涂托百士眼膏，后送西南医院动物中心饲养，饲养条件各组间相同。

步骤(二)大鼠尾静脉给药

在大鼠视双眼神经钳夹伤后即刻进行尾静脉注射(图2-3)，将大鼠固定在尾静脉注射固定器上，拉直尾巴，绷紧，用酒精棉球擦拭尾巴，使血管扩张；用左手的食指，中指，无名指及大拇指将大鼠尾巴固定，右手握住1ml注射器前面0.1ml处。看针尖前面斜面进入1/2-3/4后上挑针头，进针，见回血后缓慢注射，约15秒注射完，后针头留置10秒后，迅速拔出针头，并用棉球按压尾部皮肤注射点1分钟，后用酒精棉球再次局部消毒。

各组注入剂量均为50ug/100g。

后每两天给予各组大鼠一次尾静脉注射，共注射10次。

步骤(三)荧光金逆行示踪标记RGCs

在视神经钳夹伤术后2周和4周，分别随机取重组人αB-晶体蛋白组、生理盐水组大鼠3只和正常大鼠3只，戊巴比妥钠腹腔注射(3.0ml/kg)，麻醉满意后，将实验大鼠固定在立体定位仪上，剪除头颅顶部毛发备皮，并局部消毒后，沿正中线切开头颅顶部头皮约1.5cm，用开睑器撑开头皮，小心剥离骨膜，并彻底止血，充分暴露矢状缝及顶间缝之间颅骨。根据GeorgePaxinos编写的《The Rat Brainin Stereotaxic Coordinates》中大鼠脑立体定位图谱，Bregma点后移6.8mm±0.2mm，旁开1.6mm±0.2mm确定双侧上丘定位点，Bregma点后移4.6mm±0.2mm，旁开4.0mm±0.2mm确定外侧膝状体定位点(图2-4)。在相应颅骨表面投射点用钻头钻直径约为1mm的孔，用10μL微量注射器，在避光条件下吸取2％荧光金(FG)，注射深度上丘4.0mm±0.2mm，外侧膝状体5.6mm±0.2mm，将2.5ul FG慢慢注入各孔内，留针5min，缓慢出针，术毕分层缝合切口筋膜和皮肤。

观察结果：

1、正常组大鼠视网膜荧光金逆行标记的RGCs，在视网膜各象限均匀分布，视乳头周围区域分布较周边部密集，且大血管走行区域无RGCs。荧光金标记的RGCs细胞胞体直径较大，形态呈三角形或圆形，荧光颗粒主要积聚在胞浆荧光均匀明亮，细胞体边界清楚，部分细胞突起明显可见，无荧光金染料渗漏到细胞外(图2-7)。

2、视神经钳夹伤术后2周，C组和S组视网膜各象限分布的荧光金逆行标记的RGCs均明显减少，且各象限分布不均匀。C组部分被荧光金标记的RGCs胞体形态规则，胞浆内积聚的荧光金颗粒较正常RGCs少，胞体荧光均匀但色稍暗，细胞体边界尚清楚，小部分细胞突起明显可见，荧光金染料无明显渗漏到细胞外。S组荧光金逆行标记的形态完整的RGCs较前两者少，并可观察到小的荧光金颗粒聚集点，少见正常的细胞形态(图2-8a、b)。

3、视神经钳夹伤术后4周，各组视网膜分布的荧光金逆行标记的RGCs数目较伤后2周更为减少，且各象限分布不均匀。C组仍可观察到小部分RGCs胞浆内积聚的荧光金颗粒足够显色细胞形态和突起规则，细胞边界清楚的RGCs，但大部分RGCs胞浆内积聚的荧光金颗粒不能完整充盈细胞胞体，细胞轮廓不能显示，仅观察到点状的荧光金颗粒聚集体。S组视网膜仅看到点状的荧光金颗粒聚集体(图2-9a、b)。

实施例2.全视网膜铺片荧光金标记和免疫荧光染色RGCs计数试验

步骤1.全视网膜铺片

将实施例1的各组大鼠，于荧光金逆行示踪术后7天，进行大鼠视网膜取材和固定。取材前用速眠新肌肉注射麻醉实验大鼠，麻醉成功后用0.9％生理盐水(200～250ml)灌注，尽量冲洗血液后，再将大鼠用4％多聚甲醛灌注固定，用眼科显微剪360度剪开结膜，并于大鼠眼球背侧用10-0黑色尼龙线做标记，取出眼球，置于4％多聚甲醛中后固定15min，祛除眼前节，于0.01M PBS中分离视网膜后，在缝线标记处做一三角形切口，标记为上方视网膜，在视网膜周边做4处放射状切口，将视网膜平伏的铺在Minipore滤纸上，后将视网膜置于4％多聚甲醛中后固定1h。

步骤2.全视网膜铺片免疫组化染色

将固定好的视网膜铺片，行视网膜节细胞特异抗体β-III-tubulin免疫组化染色，具体实验方法参照蔡文琴编写的《现代实用细胞与分子生物学实验技术》中免疫组化染色方法进行。β-III-tubulin单克隆抗体免疫组织化学法染色，并以PBS代替一抗设立阴性对照。

具体操作步骤：

(1)将固定好的视网膜铺片，用0.01M的PBS漂洗3次，每次15min；

(2)一抗封闭液，封闭12小时，4℃，注意避光；

(3)0.01M的PBS漂洗3次，每次15min；

(4)加入一抗β-III-tubulin(1∶500)和0.2％Triton-100，4℃孵育，过夜；

(5)0.01M的PBS漂洗3次，每次15min；

(6)加入二抗山羊抗小鼠Cy3，4℃孵育，过夜；

(7)0.01M的PBS漂洗3次，每次15min；

(8)抗荧光淬灭封片液封片，照相。

步骤3.全视网膜铺片荧光金标记和免疫荧光染色RGCs计数

用荧光显微镜观察，每张视网膜铺片的上、下、鼻和颞侧距离视乳头1/6、3/6、5/6半径处各拍摄1张，每张视网膜铺片共拍摄12张(200×)的荧光照片。对每个视野中，标记的RGCs进行计数，求平均值。分别统计损伤后2周和4周，视网膜神经节细胞层荧光金和β-III-tubulin标记的剩余RGCs数目，(图2-5)。

步骤4.统计学分析

实验结果以x±s表示，应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，两组以上均数比较采用单因素方差分析或多样本比较的秩和检验，两组间均数比较采用独立样本t检验。检验结果以P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异非常显著。

试验结果：

一、荧光金逆行标记RGCs的计数

1、正常视网膜荧光金逆行标记的RGCs数目为(2171.42±159.74)个/mm2。

视神经钳夹伤后各实验组荧光金逆行标记的RGCs随着视神经损伤后时间的延长明显减少，C组和S组在损伤后2周的荧光金逆行标记的RGCs数目分别为(338.04±49.33)个/mm2和(221.75±40.87)个/mm2，与正常视网膜相比有轴浆运输功能的RGCs分别剩余15.57％和10.18％。C组与S组有非常显著差异(p＜0.01)。

视神经损伤后4周，各组视网膜荧光金逆行标记的RGCs数目进一步减少，与正常视网膜相比有轴浆运输功能的RGCs分别剩余3.64％和1.33％。C组的荧光金逆行标记的RGCs的数目显著高于S组(p＜0.01)。

二、视神经钳夹伤后β-III-tubulin免疫荧光染色RGCs观察

(一)β-III-tubulin免疫荧光染色RGCs形态观察

1、正常组大鼠视网膜β-III-tubulin免疫荧光染色的RGCs，在视网膜各象限均匀分布，视乳头周围区域分布较周边部密集，大血管走行区域无RGCs。β-III-tubulin免疫荧光染色的RGCs胞体大小均等，形态呈圆形或三角形，荧光主要结合在胞浆和轴突内，细胞体边界清楚，部分细胞突起明显可见。并可观察到从视乳头放射状向周边网膜分布的视神经纤维束(图2-11)。

2、视神经钳夹伤术后2周，C组和S组视网膜各象限分布的β-III-tubulin免疫荧光染色的RGCs均明显减少，且各象限分布不均匀。C组大部分免疫荧光染色的RGCs形态规则，胞浆荧光染色可见，但色稍暗，细胞体边界尚清楚，小部分细胞突起明显可见。S组β-III-tubulin免疫荧光染色的的形态完整的RGCs较前两者少，并可观察到部分RGCs的轴突，且视神经纤维束较C组细，形态较疏松。(图2-12a、b)。

3、视神经钳夹伤术后4周，各组视网膜分布的β-III-tubulin免疫荧光染色的RGCs数目较伤后2周更为减少，且各象限分布不均匀。C组组仍可观察到小部分RGCs细胞边界清楚，形态和突起规则，但大部分RGCs胞浆显影不清，仅观察到细胞核的形态。S组β-III-tubulin免疫荧光染色的的形态完整的RGCs较前两者也较少，仅小部分可观察到RGCs形态，大部分RGCs不能显色，视神经纤维束较C组，可看到部分纤维断裂或消失。(图2-13a、b)。

(二)β-III-tubulin免疫荧光染色RGCs的计数

1、正常视网膜β-III-tubulin免疫荧光染色的RGCs数目为(2156.43±259.38)个/mm2。

视神经钳夹伤后各实验组荧光金逆行标记的β-III-tubulin免疫荧光染色的RGCs随着视神经损伤后时间的延长明显减少，C组和S组在损伤后2周的β-III-tubulin免疫荧光染色的RGC密度分别为(122.95±29.37)个/mm2和(84.73±9.34)个/mm2，与正常视网膜相比RGCs分别剩余5.71％和3.90％。

C组和S组在损伤后4周的β-III-tubulin免疫荧光染色的RGCs密度分别为(106.82±7.18)个/mm2和(75.17±9.17)个/mm2，与正常视网膜相比RGCs分别剩余4.92％和3.48％。

C组在视神经损伤后2周和4周β-III-tubulin免疫荧光染色的RGCs的密度高于S组，且C组与S组相比有差异非常显著(p＜0.01)。

本发明研究结果表明视神经损伤后2和4周大鼠尾静脉注射重组人αB-晶体蛋白组的RGCs荧光金逆行标记和免疫组化染色均显示明显较对照Trx和生理盐水组高。说明重组人αB-晶体蛋白在视神经损伤后对RCGs有明显的保护作用，能够明显提高RGCs的存活率，α-晶状体蛋白可以通过拮抗髓鞘抑制物阻碍视神经再生的作用，促进RGCs突起的生长和受损的视神经轴突再生。

Claims (9)

1.人αB-晶体蛋白在制备保护视网膜神经节细胞的药物中的应用。

2.保护视网膜神经节细胞的药物，其特征在于：其有效成分为分离纯化的重组人αB-晶体蛋白，所述重组人αB-晶体蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的药物，剂型为注射剂。

4.根据权利要求3所述的药物，所述注射剂所用的溶剂，pH 7.5，配方为：20mM Tris-HCl、50mM氯化钠、1mMEDTA、无菌水。

5.根据权利要求3所述的药物，所述重组人αB-晶体蛋白是人工构建的包含有如Seq IDNo.2所示的核苷酸序列的重组表达载体在体外表达，然后经分离纯化而得的重组蛋白。

6.根据权利要求5所述的药物，所述体外表达指：将重组表达载体pET28a-αB-crystallin转染到BL21细胞中，诱导阳性BL21细胞表达重组人αB-晶体蛋白。

7.权利要求1～7任一所述的药物的制备方法：将分离纯化的重组人αB-晶体蛋白溶于不影响αB-晶体蛋白活性且适用于人体注射的溶剂中。

8.根据权利要求7所述的制备方法，所述重组人αB-晶体蛋白是人工构建的包含有如Seq IDNo.2所示的核苷酸序列的重组表达载体在体外表达，然后经分离纯化而得的重组蛋白。

9.根据权利要求8所述的制备方法，所述体外表达指：将所述重组表达载体pET28a-αB-crystallin转染到BL21细胞中，诱导阳性BL21细胞表达重组人αB-晶体蛋白。

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