CN102206602A

CN102206602A - 一种具有抗粮谷类饲料及粮食中污染霉菌的放线菌

Info

Publication number: CN102206602A
Application number: CN2011100940085A
Authority: CN
Inventors: 王昌禄; 刘春静; 李风娟; 陈勉华; 王玉荣; 张灵敏; 王文杰; 蒋伯瑛; 周庆礼
Original assignee: TIANJIN FOOD PROCESSING ENGINEERING CENTER
Current assignee: TIANJIN FOOD PROCESSING ENGINEERING CENTER
Priority date: 2011-04-15
Filing date: 2011-04-15
Publication date: 2011-10-05
Anticipated expiration: 2031-04-15
Also published as: CN102206602B

Abstract

本发明涉及一种具有抗粮谷类饲料及粮食中污染霉菌的放线菌，其特征在于：菌种命名为TD-1，分类命名：链霉菌(Streptomyces sp.)，其保藏编号：CGMCC No.4666，保藏日期：2011年03月15日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京。本发明首次分离并筛选出一种抗粮谷类饲料及粮食中污染霉菌生长的自养放线菌TD-1，该菌株对多种污染粮谷类饲料及粮食的霉菌具有明显的抑制作用，如对黄曲霉、桔青霉、茄腐镰刀菌、赭曲霉、米曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、尖孢镰刀菌及纯绿青霉等都具有明显的拮抗作用，能够有效延长粮谷类饲料及粮食的保存期与保存品质，为开发粮谷类饲料及粮食中霉菌生物抑制剂奠定基础。

Description

一种具有抗粮谷类饲料及粮食中污染霉菌的放线菌

技术领域

本发明涉及土壤放线菌对粮谷类饲料及粮食中污染霉菌的防治，尤其是一种具有抗粮谷类饲料及粮食中污染霉菌的放线菌。

背景技术

随着我国饲料工业的迅猛发展，霉菌对粮谷类饲料行业及粮食造成的损失已逐渐引起人们的重视。根据联合国粮农组织估算，目前世界上有25％左右的谷物被霉菌毒素污染，每年所造成的经济损失高达数千亿美元。我国平均每年损失的饲料占总产量的20％，其中一半以上是由于霉变所致，在气候温湿的南方地区尤为严重。目前，已知对饲料产生污染的霉菌有30余种，产生的霉菌毒素大约有200余种，霉菌污染给饲料工业带来了巨大的危害，因此，需要开发新型、高效、无毒、天然的饲料用防霉剂。

放线菌作为一种资源丰富的微生物类群，其产生的抗生素及其它次生代谢产物在农作物病虫害生物防治方面具有重要作用，是一类具有巨大使用价值和经济价值的微生物，在植物病虫害生物防治中具有广阔的开发应用前景。

近十年来，从微生物中发现的新活性物质902个，其中放线菌产生的有668个，占74％。利用放线菌产生的活性物质进行植物病原菌病害的生物防治，具有周期短、易于研究、便于生产、无毒无害等优点。放线菌作为最早用于生物防治的微生物，有很强的分解纤维素、石蜡、琼脂、角蛋白和橡胶等复杂有机物的能力，在自然界物质循环和提高土壤肥力等方面有着重要的作用。在放线菌研究领域，拮抗放线菌的研究占有重要地位。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗粮谷类饲料及粮食中污染霉菌的放线菌，该菌株能够对多种污染粮谷类饲料及粮食的霉菌产生明显的抑制作用，为粮谷类饲料及粮食中霉菌生物抑制剂的开发奠定基础。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种具有抗粮谷类饲料及粮食中污染霉菌的放线菌，其特征在于：菌种命名为TD-1，分类命名：链霉菌(Streptomyces sp.)，其保藏编号：CGMCC No.4666，保藏日期：2011年03月15日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

而且，所述放线菌TD-1对黄曲霉、桔青霉、茄腐镰刀菌、赭曲霉、米曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、尖孢镰刀菌及纯绿青霉具有拮抗作用。

本发明的优点和积极效果如下：

1.本发明首次分离并筛选出一种抗粮谷类饲料及粮食中污染霉菌生长的自养放线菌TD-1，该菌株能够对多种污染粮谷类饲料及粮食的霉菌产生明显的抑制作用，如对黄曲霉、桔青霉、茄腐镰刀菌、赭曲霉、米曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、尖孢镰刀菌及纯绿青霉等都具有明显的拮抗作用，能够有效延长粮谷类饲料保存期限与保存品质，为粮谷类饲料及粮食中霉菌生物抑制剂的开发奠定基础。

2.本发明得到的放线菌TD-1在绝大多数培养基上均能生长，在不加有机碳源的基础培养基、高氏一号培养基，不加有机氮源的高氏一号培养基上均能生长，为菌种的广泛利用奠定了基础。

附图说明：

图1-1与图1-2为本发明的放线菌TD-1在高氏一号琼脂培养基上的培养特征照片；

图2-1至图2-4为本发明的放线菌TD-1在不加有机碳源的基础培养基、高氏一号培养基，不加有机氮源的高氏一号培养基上生长的照片，其中图2-1为不加有机碳源的基础培养基；图2-2为高氏一号培养基；图2-3为不加有机碳源的高氏一号；图2-4为不加有机氮源的高氏一号培养基；

图3-1至图3-8为本发明的放线菌TD-1对粮谷类饲料中污染霉菌拮抗作用的照片，其中图3-1为赭曲霉；图3-2为黑曲霉；图3-3为构巢曲霉；图3-4为米曲霉；图3-5为茄腐镰刀菌；图3-6为黄曲霉；图3-7为纯绿青霉；图3-8为串珠镰刀菌。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

一种具有抗粮谷类饲料及粮食中污染霉菌的放线菌TD-1，分类命名：链霉菌(Streptomycessp.)，其保藏编号：CGMCC No.4666，保藏日期：2011年03月15日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，本放线菌TD-1在绝大多数培养基上均能生长，在高氏一号琼脂培养基上生长时，菌落圆形，质地干燥，粉状，有褶皱，中央隆起。气生菌丝由粉红色至橘红色，基丝橘红色，发育好，菌丝交织紧密，有大量分枝并呈放射状，孢子丝柔曲形，形成孢子链，孢子呈椭圆形。革兰氏染色阳性，液化明胶，牛奶先凝固，胨化可疑，纤维素中能生长，但不利用，产生过氧化氢酶，类黑色素产生可疑，不能水解淀粉，还原硝酸盐。在不加有机碳源的基础培养基、高氏一号培养基，不加有机氮源的高氏一号培养基上均能生长。本放线菌TD-1对黄曲霉(Aspergillus flavus)、桔青霉(Penicillum citrinum)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)及纯绿青霉(Penicilliumverrucosum)具有明显的拮抗作用。

一、分离培养方法

1.分离本发明所述的放线菌是从饲料厂储粮仓处采集的土样中，首先用高氏一号培养基：20.0g可溶性淀粉，0.5g NaCl，0.01g FeSO₄·7H₂O，0.5g MgSO₄·7H₂O，1g KNO₃，0.5gK₂HPO₄，200g琼脂，1000mL蒸馏水，调节pH 7.2-7.4进行富集培养，采用平板稀释涂布法，分离得到11株放线菌。

2.分离步骤

取分离培养基(可溶性淀粉，20.0g；NaCl，0.5g；FeSO₄·7H₂O，0.01g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；KNO₃，1g；K₂HPO₄，0.5g；琼脂，200g；蒸馏水，1000mL；调节pH 7.2-7.4，121℃，30min灭菌)20mL加入50μg/mL重铬酸钾，把土壤样品富集培养液以十倍的级差，用无菌水进行稀释，取稀释10²、10³、10⁴、10⁵倍的悬浮液。将熔化好的PDA培养基倒入已灭菌的培养皿内，待凝固后，用移液枪吸取选定稀释浓度的稀释液滴0.05mL，滴在固体培养基表面，用无菌玻璃刮子涂匀，然后，将培养皿倒置于28℃培养箱中培养3-5d，长出菌落，纯化3次，确认为纯菌株后保藏。菌种采用冻干安瓿管保藏、甘油管保藏和液氮保藏等保藏方式。

3.培养条件

培养基：高氏一号合成培养基：可溶性淀粉，20.0g；NaCl，0.5g；FeSO4·7H₂O，0.01g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；KNO₃，1g；K₂HPO₄，0.5g；琼脂，200g；蒸馏水，1000.0mL；调节pH 7.2-7.4，121℃，30min灭菌。

最适生长温度：28-35℃。

二、筛选方法

1.筛选

采用对峙培养法，以串珠镰刀菌作为指示菌，对分离到的11株放线菌进行抑菌活性筛选。

2.筛选步骤

(1)指示菌菌饼的制备

将串珠镰刀菌转接活化，28℃培养箱中培养3d后制成菌悬液，涂布在已制备好的PDA平板上，28℃培养3d，用直径12mm打孔器打出菌饼备用。

(2)放线菌菌悬液的制备

将11株放线菌转接活化，28℃培养箱中培养5d，加入无菌水制成菌悬液备用。

(3)对峙培养

将15mL PDA培养基倒入无菌平皿中，泠凝后，在平板上以原点为中心划十字线，用移液枪吸取40μL不同放线菌菌悬液，滴在原点处，28℃培养3d，在二条直线的两端距中心相同距离接种已培养好的串珠镰刀菌菌饼，但不能与放线菌相连，28℃培养4d，根据抑菌带宽度筛选出抑菌效果好的菌株进行研究。

利用此法获得了一株具有较强抗串珠镰刀菌活性的菌株，标记为TD-1，此处是以串珠镰刀菌作为指示菌，证明是抑制串珠镰刀菌的，下面有实验证明TD-1菌株能够抑制粮谷类饲料常见霉菌的其他菌种。

三、理化性质

1.根据菌落形态、显微特征、培养特性、生理生化特征等几方面对放线菌TD-1进行初步鉴定(阎逊初，放线菌的分离与鉴定[M]，北京，科学出版社，1992)，结果如表1至表5所示。

表1 放线菌TD-1的形态学特征

表2 放线菌TD-1的培养特征

表3 放线菌TD-1的生理生化特征

备注：+为阳性；-为阴性；+-为可疑。

表4 放线菌TD-1的碳源利用情况

备注：-表示负反应，+-表示反应可疑，+、++、+++表示反应的强弱程度分别为弱、中强、很强。

2.放线菌TD-1对营养要求分析

平板培养：碳源利用基础培养基

(NH₄)₂SO₄，2.0g；NaH₂PO₄·7H₂O，0.5g；K₂HPO₄，0.5g；MgSO₄·7H₂O，0.2g；CaCl₂·2H₂O，0.1g；蒸馏水，1000.0mL；琼脂，15.0g；pH 6.5；121℃，30min灭菌。

表5 放线菌TD-1在三种培养基上的生长情况

结合以上结果，鉴定放线菌TD-1为自养链霉菌的一个变种。

四、放线菌TD-1对粮谷类饲料及粮食中污染霉菌的抑制性分析

将放线菌TD-1接种在PDA培养基中(PDA培养基：称取去皮马铃薯200.0g，切成小块，加入1000.0mL水煮沸30min，用双层纱布滤成清液。加水至1000.0mL，加入20.0g葡萄糖完全溶解，pH自然)，培养3-5d，分别在其周围放置已制备好的不同霉菌的菌饼，对峙生长，观察抑菌圈大小，如图3所示。

从图3-1至图3-8中可以看出，TD-1菌株对粮谷类饲料及粮食中常见污染霉菌均有抑制作用，抑菌能力强、抑菌谱广，其中，图3-1为赭曲霉，图3-2为黑曲霉，图3-3为构巢曲霉，图3-4为米曲霉，图3-5为茄腐镰刀菌，图3-6为黄曲霉，图3-7为纯绿青霉，图3-8为串珠镰刀菌。

Claims

1.一种具有抗粮谷类饲料及粮食中污染霉菌的放线菌，其特征在于：菌种命名为TD-1，分类命名：链霉菌Streptomyces sp.，其保藏编号：CGMCC No.4666，保藏日期：2011年03月15日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.根据权利要求1所述的具有抗粮谷类饲料及粮食中污染霉菌的放线菌，其特征在于：所述放线菌TD-1对黄曲霉、桔青霉、茄腐镰刀菌、赭曲霉、米曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、尖孢镰刀菌及纯绿青霉具有拮抗作用。