CN102203275A - 药物发现方法和平台 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于识别纠正与健康状况或健康状况的倾向相关的表型的试剂的方法。本发明还涉及用于识别诊断性细胞表型、在受试者中确定健康状况的风险的方法、在人类受试者中降低药物毒性的风险的方法和用于识别导致人类疾病的候选基因的方法。本发明还公开了诱导的人多能干细胞系。

Description

药物发现方法和平台

背景技术

制药工业已经消耗了巨大的技术和财政资源来研发新型治疗剂。然而，先导化合物的失败率(大于90％)仍然持续地保持在高水平。通常在临床前模型(例如近交动物模型或少量细胞系)中满足预期的先导药物化合物在向人类临床试验患者群施用时为毒性的或无效的。在大多数目前的药物研发尝试中的主要不足是：它们没有在人类患者群的极度遗传多样性环境中评估候选药物的有效性和毒性。换而言之，在目前的药物研发范例中，药物的有效性和毒性未在人群中存在的许多(如果不是大多数)相关基因型/表型组合中进行测试。事实上，即使在相对小的人类临床试验群体中获得了试验的成功，但一旦将这些药物施用给更广的人类患者群后也可能产生预料不到的副作用。

发明内容

本发明涉及用于识别纠正与健康状况或健康状况的倾向相关的表型的试剂的方法，包括：将来自诱导的人多能干细胞系的细胞或从诱导的人多能干细胞系分化的细胞的第一群与候选试剂相接触；将来自诱导的人多能干细胞系的细胞或从诱导的人多能干细胞系分化的细胞的第二群与对照试剂相接触；其中在两个群中的细胞包含至少一个与健康状况或健康状况的倾向相关的内源等位基因；分析两个群，且如果在处理后第一群比第二群更接近于正常表型，则确认候选试剂为纠正该表型。该状况可选自健康状况，例如神经变性疾病、神经障碍、情结障碍、心血管疾病、代谢障碍、呼吸道疾病、药物敏感性状况、眼疾病、免疫疾病或血液疾病。所述细胞可从诱导的干细胞分化为神经干细胞、神经元、心肌细胞、肝干细胞或肝细胞。所描述的表型可为细胞凋亡、细胞内钙水平、钙流、蛋白激酶活性、酶活性、细胞形态、受体活化、蛋白质运输、细胞内蛋白质聚集、细胞器组成、运动性、细胞间通讯、蛋白表达或基因表达。

本发明还涉及用于识别诊断性细胞表型的方法，包括：将来自受试者的一组细胞与来自不具有健康状况的受试者的一组细胞相对比，其中两组细胞均为诱导的多能干细胞或为从诱导的多能干细胞分化的细胞，且其中在计算机上进行该对比。所述细胞可从诱导的干细胞分化为神经干细胞、神经元、心肌细胞、肝干细胞或肝细胞。

本发明还涉及用于在受试者中确定健康状况的风险的方法，包括：将在来自受试者的第一组细胞中确定的至少一种表型与在来自不具有健康状况的受试者的第二组细胞中确定的该至少一种表型和在来自具有健康状况的受试者的第三组细胞中确定的该至少一种表型相对比；如果在第一组细胞中确定的该至少一种表型与在第二组细胞中确定的该至少一种表型相比更类似于在第三组细胞中确定的该至少一种表型，则表明所述受试者处于该健康状况的高风险中，其中所述第一、第二和第三组细胞为诱导的多能干细胞或为从诱导的多能干细胞分化的细胞，和其中在计算机上进行该对比。

本发明还涉及用于在人类受试者中降低药物毒性的风险的方法，包括：将从受试者产生的诱导的多能干细胞系分化的一种或多种细胞与一剂药理学试剂相接触，对接触的一种或多种分化的细胞进行毒性分析，且如果和仅当在接触的细胞中毒性分析为阴性，向该受试者指定或施用该药理学试剂。从诱导的多能干细胞系分化的细胞可为肝细胞、心肌细胞或神经元。

本发明还涉及用于识别导致人类疾病的候选基因的方法，包括将来自多个健康个体的分化的细胞类型的培养人类细胞的全基因表达谱与来自患有所述人类疾病的多个个体的分化的细胞类型的培养人类细胞的全基因表达谱相对比，识别具有不同表达水平的一个或多个基因为导致所述人类疾病的候选基因，其中在计算机上进行该对比。

本发明还公开了从被诊断具有健康状况的受试者产生的或包含至少一个与健康状况或健康状况的倾向相关的内源等位基因的诱导的人多能干细胞系。本发明还公开了包含来自具有至少一个与神经变性疾病、神经障碍或情结障碍相关的内源等位基因的受试者或来自被诊断患有神经变性疾病、神经障碍或情结障碍的受试者的神经干细胞或神经元的分离的人类细胞群。本发明还公开了包含来自具有至少一个与心血管疾病相关的内源等位基因的受试者或来自被诊断患有心血管疾病的受试者的人心脏祖细胞或心肌细胞的分离的人类细胞群。本发明还公开了包含来自具有至少一个与药物敏感性状况相关的内源等位基因的受试者或来自被诊断具有药物敏感性状况的受试者的肝干细胞或肝细胞的分离的人类细胞群。

本发明还公开了一组遗传多样性的诱导的人多能干细胞系，包括从多个个体产生的诱导的人多能干细胞系，所述多个个体各携带在该多个个体中独特的至少一个多态性等位基因。

援引加入

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用方式结合在本文中，就好像各个出版物、专利和专利申请均具体和单独地通过引用方式结合在本文中。

附图简述

本发明的新特征通过所附权利要求书详细阐明。通过参照以下给出示例性的实施方式的具体描述和附图还会更好地理解本发明的特征和优势，该示例性的实施方式使用了本发明的原理，且附图包括：

图1为传统药物发现方案(左，其中在患者中测试化合物的有效性和安全性之前在异源系统(例如动物模型)中针对疾病靶点测试先导化合物)和新的药物发现方案(右，首先基于在来自患者的疾病相关的细胞类型中纠正疾病相关细胞表型的有效性识别先导化合物)的对比示意图。

图2为用于基于患者iPSC的疾病建模和药物发现的示例性的、非限定性的方案的概要。

图3为在来自患者iPSC系的遗传多样性同期组的细胞中，用于基于患者iPSC的先导候选药物的有效性和安全性的测试的示例性的、非限定性的方案的概要。

图4为用于基于患者iPSC识别药物有效性和毒性的预测性生物标志物的示例性的、非限定性的方案的概要。这样的生物标志物用于例如候选药物临床试验的患者分层中，还用于在特定患者或患者群中确定批准的治疗药物的最佳剂量和安全性，这有时候也被称为“个性化医疗”。

图5(上排)显示来自三名SMN1^-/-SMA患者和两名SMNl^-/+健康对照受试者的成纤维细胞的显微照片；(下排)显示由如上排所示的对应SMA病例和对照受试者成纤维细胞产生的iPSC集落的显微照片。

图6显示从图5所示的SMA病例和对照iPSC系获得的类胚体的显微照片。

图7显示在从SM10d iPSC分化的细胞中外胚层(TuJl)、中胚层(Desmin)和内胚层(AFP)谱系标志物的染色的免疫荧光显微照片。

具体实施方式

I.介绍

人类患者群体中和群体之间的遗传差异(例如多态性等位基因)很大程度上决定了个体对于疾病的倾向、疾病表现、疾病严重性和对治疗(例如对药物治疗)的响应的差异。用于人类疾病和药物发现的普遍的动物和细胞模型不能很好地表现待治疗的患者群中现存的基因型/表型谱。例如，在药物发现中通常使用的小鼠和大鼠种系为高度近交的，且因此仅代表了小鼠或大鼠中非常窄范围的可能的基因型/表型组合，更不用说人类。同样地，用于药物筛选的相对少数的人类细胞系可以反映它们来源的个体的基因型/表型范围，但不能反映遗传多样性的群体的基因型/表型范围。此外，大多数人类细胞系在产生或表型模拟受特定健康状况影响的特别分化的细胞类型(例如神经元、心肌细胞和肝细胞)的能力方面受到非常大的限制。此外，由于细胞系已被改变进行无限复制，因此细胞系不能代表受试者中的细胞群。重要的是，在许多情况下，疾病的动物模型或遗传改造细胞模型不能充分地重现在人类患者的细胞中实际出现的细胞疾病表型。因此，典型的临床前药物研发策略忽略了在人群中存在的且将会对候选药物化合物的治疗效果和毒性产生直接影响的许多基因型/表型。这些事实的实际结果是：如上所述，尽管先导化合物在动物模型和转化的细胞系模型的临床前试验中获得成功，但往往在人类临床试验中失败。理想地，药物筛选和药物靶点发现在重现人类患者群中存在的遗传和表型多样性以及在细胞水平的适当的疾病状态的生物模型中进行，最好在临床试验阶段前。这些药物发现的范例示意性地显示在图1中。在传统的药物发现模式(左)中，基于在动物模型中其对特定的药物靶点的作用和其有效性/缺乏毒性来选择用于临床试验的候选治疗剂。在替代的药物发现模式(右)中，如本文所述的来自患者iPSC系的疾病相关细胞是用于基于其在源自患者的细胞中改善疾病相关的细胞表型的能力识别先导化合物的起始点。

因此，本发明描述了来自所选择的个体(例如患者)的诱导的人多能干细胞系、这类细胞系的遗传多样性的组、来自这类细胞系的分化的细胞以及其用于疾病建模、药物发现、诊断和个性化治疗的方法。

II.定义

本文使用的“候选药物化合物”是指待测定其影响功能性终点的能力的任何测试化合物。这样的功能性终点的一些例子为配体与受体的结合、受体拮抗性、受体激动性、蛋白质-蛋白质相互作用、酶活性、转录响应等。

本文使用的“纠正”表型是指改变表型以使其更加接近正常表型。

本文使用的“iPSC供体”是指由其产生一种或多种诱导的干细胞系的受试者，例如人类患者。一般而言，iPSC系的基因组对应于其iPSC供体的基因组。

本文使用的“表型组分析(phenomic analysis)”是指由特定类型的细胞(例如心肌细胞)表现的表型(例如静息钙水平、基因表达谱、细胞凋亡指数、电生理学特性、对自由基的敏感性、化合物摄取和排出、激酶活性、第二信使通路响应)的分析。

本文使用的“表型组(phenome)”是指受试者和细胞类型特异性的表型的组。例如，尽管具有相同的基因组，但是来自同一个体的肝细胞和心肌细胞的表型组截然不同。

本文使用的“内源等位基因”是指细胞基因组原始的天然存在的等位基因，即不是通过重组方法引入的等位基因。

本文使用的“源自iPSC的细胞”是指通过iPSC的增殖以产生更多iPSC或通过iPSC分化为不同的细胞类型而从iPSC产生的细胞。源自iPSC的细胞包括不是从iPSC直接分化而是从中间细胞类型(例如神经胶质祖细胞、神经干细胞或心脏祖细胞)分化的细胞。

本文使用的“正常”表型是指落入健康个体中发现的表型范围内的或与健康状况无关(例如不预示健康状况)的表型(例如细胞凋亡率、静息钙水平、激酶活性、基因表达水平)。

III.用于药物筛选和药物靶点发现的诱导的干细胞系

A.概述

本发明提供了如下详述的诱导的人多能干细胞(iPSC)系、干细胞系的组及其在药物发现、诊断和治疗方法中使用的方法。本文公开的诱导的多能干细胞系的特征为长期自我更新、正常的染色体组型和分化为多种不同细胞类型(例如神经元、心肌细胞和肝细胞)的发育潜能。诱导的多能干细胞系可分化为所有三个胚层(即外胚层、中胚层和内胚层)的细胞谱系。

受试者(例如患者)和从该受试者产生的iPSC系之间存在重要的关联。首先，iPSC系的所有基因型和对应受试者的基因型是相同的。因此，在一者中揭示的基因型-表型相关性对于另一者也提供相应的信息，反之亦然。第二，在活体外源自iPSC系的分化的细胞(例如神经元)将会显示与对应受试者体内分化的细胞的表型非常相似(如果不是相同的话)的全套细胞表型(本文称为“表型组”)。这一点对于发展靶向于不能常规地从患者获得的细胞(例如神经元、心肌细胞、肝细胞或胰腺细胞)的治疗剂是特别有意义的。例如，当患者患有神经变性疾病(例如帕金森氏病)时，通常受该状况影响的多巴胺能神经元可以通过来自该受试者的iPSC系的分化非侵入性地获得，且然后可在多种分析中被筛选。因此，iPSC系提供了分化的细胞(例如不可获得的分化细胞)的可再生来源，其中可以检查与疾病、细胞类型和个体相关的病理学细胞表型并针对测试化合物进行筛选。用于疾病建模和药物发现的该方法的示例性、非限定性的实施方式示例性地示于图2中。iPSC系和源自iPSC的细胞(例如运动神经元)还可用于预测候选药物化合物在特定个体或个体组中的有效性和/或副作用，如图3示例性地所示。例如，可测试测试化合物在从诱导的多能干细胞的遗传多样性的组分化的肝细胞中的毒性。源自iPSC的肝细胞中的毒性测试可以揭示在目标患者群中测试化合物产生毒性的整体可能性，以及在该群内的特定患者中产生毒性的可能性。

事实上，iPSC系和源自iPSC的细胞(例如胰腺细胞)在表型由基因组确定或预定的意义上可作为揭示细胞表型的“细胞化身(avatar)”，所述表型为疾病、细胞类型和受试者特异性的。总的来说，患者的诱导干细胞系的组代表患者群中宽范围的基因型/表型组合。因此，它们可用于发现在相关目标群体的宽范围内有效和安全的治疗剂，或用于确定哪些个体可用特定的治疗剂有效和安全地治疗。

B.受试者样品的筛选和选择

本文描述的一些方法使用来自符合一个或多个预先确定的标准的受试者的诱导的干细胞系或诱导的干细胞系的组。在一些情况下，可以基于一个或多个这样的预先确定的标准选择受试者和来自这样的受试者的细胞样品以用于产生诱导的干细胞系和诱导的干细胞系的组。这些标准包括但不限于：受试者中健康状况(例如脊髓性肌萎缩、帕金森氏病或肌萎缩性脊髓侧索硬化)的存在与否、对于健康状况的一个或多个阳性诊断标准、表明健康状况的倾向或复发的家族病史、与健康状况相关的基因型的存在与否，或还未在诱导的干细胞系的组中表示的至少一个多态性等位基因的存在。

在一些情况下，诱导的干细胞系的组特别地从被诊断具有健康状况的患者和不具有该健康状况的患者产生。这样的健康状况包括但不限于：神经变性疾病；神经障碍，例如认知损害和情结障碍；听觉疾病，例如耳聋；骨质疏松症；心血管疾病；糖尿病；代谢障碍；呼吸道疾病；药物敏感性状况；眼疾病，例如黄斑变性；免疫疾病；血液疾病；肾脏疾病；增殖性障碍；遗传障碍、外伤性损伤、中风、器官衰竭或肢缺损。

神经变性疾病的例子包括但不限于：亚历山大病、阿尔珀病(Alper′s disease)、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、共济失调毛细血管扩张症、巴登氏病(Batten disease)、牛海绵样脑病、卡纳万病(Canavan disease)、科凯恩综合征、皮质基底节变性、克雅氏病、亨廷顿氏病、HIV相关痴呆症、肯尼迪氏病(Kennedy′s disease)、克腊比氏病(Krabbe′s disease)、路易体痴呆、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease)、多发性硬化、多系统萎缩症、发作性睡病、神经疏螺旋体病(neuroborreliosis)、帕金森氏病、佩-梅氏病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、皮克氏病、原发性侧索硬化症、朊病毒病、植烷酸贮积症、桑德霍夫病(Sandhoff’s disease)、谢耳德氏病(Schilder′s disease)、恶性贫血继发的脊髓亚急性混合变性、精神分裂症、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩、进行性核上性麻痹(Steele-Richardson-Olszewski disease)和脊髓痨。

神经障碍的例子包括中风、认知损害和情结障碍。

免疫疾病的例子包括但不限于：获得性免疫缺陷、白血病、淋巴瘤、超敏(过敏)、自身免疫性疾病和严重的联合免疫缺陷。

自身免疫性疾病的例子包括但不限于：急性播散性脑脊髓炎、阿狄森氏病、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、大疱性类天疱疮、乳糜泄、皮肌炎、1型糖尿病、古德帕斯丘综合征、格雷夫斯病、格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本氏病、特发性血小板减少性紫癜、红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、天疱疮、恶性贫血、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、类风湿性关节炎、干燥综合征、颞关节炎(也被称为“巨细胞关节炎”)、血管炎、韦格纳氏肉芽肿病。

心血管疾病的例子包括但不限于：动脉瘤、心绞痛、心律失常、动脉粥样硬化、心肌病、脑血管意外(中风)、脑血管疾病、先天性心脏病、充血性心力衰竭、心肌炎、冠状动脉瓣膜病(valve diseasecoronary)、扩张性动脉病(artery disease dilated)、心肌病、心脏舒张功能不全、心内膜炎、高血压(高血压症)、肥厚型心肌病、二尖瓣脱垂、心肌梗死(心脏病发作)以及静脉血栓栓塞。

代谢障碍的例子包括但不限于：酸性脂肪酶病、淀粉样变性、巴氏综合征(Barth Syndrome)、生物素酰胺酶缺乏症(biotinidasedeficiency)、肉毒碱棕榈酰转移酶缺乏症II型、脑桥中央髓鞘溶解症、肌肉的代谢性疾病包括肌肉萎缩症、法勃氏病(Farber′s Disease)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、神经节苷酯贮积症(gangliosidose)、三甲基胺尿症、莱-奈二氏综合征、脂质贮积病、代谢性肌病、甲基丙二酸尿症、线粒体肌病、粘多糖贮积症(mucopolysaccharidoses)、粘脂贮积病(mucolipidoses)、粘脂病、粘多糖症、多种辅酶A羧化酶缺乏症、非酮性高甘氨酸血症、庞贝氏症、丙酸血症、I型糖原贮积病、尿素循环障碍、高草酸尿症和草酸盐沉着症。

增殖性障碍的例子包括但不限于以下的一种或多种：癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞肿瘤、胚芽瘤(blastic tumor)、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、皮肤黑色素瘤、乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌。

疾病或障碍的其他例子可参见于2008年6月13日提交的WSGR案卷号36588-704.201，第一发明人为Kazuhiro Sakurada的美国申请No.12/157,967；于2008年6月13日提交的WSGR案卷号36588-707.101，第一发明人为Kazuhiro Sakurada的美国申请No.61/061,594和于2009年6月12日提交的WSGR案卷号36588-704.502，第一发明人为Kazuhiro Sakurada的美国申请；且在此通过引用方式将其结合在本文中。还可以预期的是，本发明的方法包括推广和销售用于治疗包括但不限于本文所述的疾病和障碍的产品和服务。

这样的受试者可在例如基因相关性研究、临床研究和医院中被识别，优选在已经做出健康状况的最终诊断后。优选地，在包括未受影响的对照个体的基因相关性研究中识别受试者。

在其他情况下，从被筛选是否存在与健康状况或健康状况的倾向相关的至少一个等位基因的受试者产生iPSC系。这样的等位基因表明，尽管未显示出健康状况的明显症状，但个体具有发生该健康状况的高风险。例如，BRCA1已被用于表明发生乳腺癌的高可能性。可在来自多种来源(例如血库、精子库、基因相关性研究、医院、临床试验或其他任何来源，只要可从基因分型的个体获得活细胞样品即可)的样品上进行受试者的基因分型。尽管不希望束缚于理论，据认为来自携带与健康状况相关的等位基因的个体的一种或多种该细胞表型将会显示出异常情况，其与基因型结合可用作比单独的基因型更可靠的健康状况的预后性指示。此外，与健康状况相关的特定异常细胞表型的识别可指示用于筛选该健康状况的预防剂和治疗剂的目标途径。

持续进行着识别人群中存在的多态性等位基因之间的相关性的尝试，例如单核苷酸多态性(SNP)以及常见健康状况的发生，例如神经变性疾病、精神障碍、代谢障碍和心血管疾病。可在人类基因组中发现各种不同类型的多态性等位基因，如表1所总结的。

许多研究已经识别出与健康状况或健康状况的倾向相关的等位基因。

与健康状况相关的等位基因的例子是本领域已知的。参见例如表2中列出的数据库。

表3提供了与健康状况相关的等位基因的一些例子和它们的相应研究。

任何rs-标识的SNP可在万维网上通过National Center forBiotechnology Information的SNP数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得；下拉菜单＝″SNP.″。

可以就基因中影响对治疗剂或一类治疗剂的响应的等位基因对受试者进行筛选。这样的等位基因的例子包括但不限于：药物代谢酶的等位基因，例如葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PDH)、丁基胆碱酯酶、N-乙酰转移酶、细胞色素P450同种型(例如，2B6、2D6、C19、2C9)、巯基嘌呤S-甲基转移酶、二氢嘧啶脱氢酶和1A1型尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶。细胞色素P450酶同种型的等位基因可在例如“www.cypalleles.ki.se/”的“Home Page of the Human CytochromeP450(CYP)Allele Nomenclature Committee”中提供的数据库中找到。一些等位基因存在于影响药物转运的基因中，包括例如赋予多药耐药性的转运子(MDR)、乳腺癌抗性蛋白(BRCP)、多药耐药性相关蛋白(MRP)和有机阴离子转运多肽(OATP1B1)。其他等位基因存在于编码药物靶点的基因中，包括但不限于：维生素K环氧化物还原酶、因子V、G蛋白偶联受体(GPCR)。其中值得注意的是，GPCR为最常见的药物靶点之一。GPCR中多态性等位基因的例子可在例如GPCR Natural Variants(″NaVa″)数据库中找到，其可在互联网上通过“nava.liacs.nl/”访问。GPCR NaVa数据库描述了人G蛋白偶联受体(GPCR)家族内的序列变体。其包括：罕见突变(频率＜1％)；多态性(频率＞1％)，包括单核苷酸多态性(SNP)；未估计等位基因频率的变体。

可通过本领域已知的多种方法中的任一方法在来自受试者的核酸样品中检测和评分目的多态性等位基因。例如，可通过对来自受试者的核酸样品进行基于核酸阵列的分析来检测多个等位基因，其中核酸阵列包含等位基因特异性的探针(例如SNP特异性探针)，该探针在高严格性杂交条件下选择性地与两个或更多个目的多态性等位基因(例如G蛋白偶联受体的等位基因)的核酸序列杂交且在两个或更多个目的多态性等位基因的核酸序列之间进行区分。

用于检测多态性的核酸阵列可为市售的核酸阵列。例如，

Genome-Wide SNP Array 6.0包括用于多于906,000个SNP的探针和用于检测拷贝数变异的多于946,000个探针。可选地，核酸阵列可订制以包括有限亚组的目的等位基因。用于分析预先确定的多态性和解释杂交模式的合适的探针阵列的设计详细描述在WO 95/11995；EP 717,113和WO 97/29212中。这样的阵列通常包括第一和第二组探针，其经设计而与多态性的不同等位基因形式互补。各组包含被划分为亚组的第一组探针，一个亚组对应于一个多态性。各亚组包括跨越多态性和邻近碱基的探针，且与多态性的一个等位基因形式互补。因此，在第一和第二探针组内，存在各多态性的对应探针亚组。如上所述，这些探针与目标样品的杂交模式可通过足迹法或聚类分析进行分析。例如，如果第一和第二探针组包括分别与探针跨越的多态性位点的第一和第二等位基因形式互补的探针亚组，则在阵列与对于第一等位基因形式为纯合的样品的杂交时，所有来自第一组的亚组中的探针显示出特异性的杂交，而来自跨越多态性的第二组的亚组中的探针仅显示错配杂交。错配杂交作为第二组中探针亚组的标准化探针强度的作图中探针强度的足迹(即目标/参考强度比)表示。反之，如果目标样品对于第二等位基因形式为纯合的，则在来自第一探针组的亚组中的探针的标准化杂交强度中观察到足迹。如果目标样品对于两种等位基因形式均为纯合的，则在来自两个探针组的亚组中的标准化探针强度中均观察到足迹，尽管在足迹内强度比率的抑制与纯合的等位基因中观察到的足迹中的相比不明显。对核酸阵列与核酸样品的杂交模式的分析表明哪些等位基因形式存在于阵列上呈现的一些或所有的SNP序列上。因此，个体或从个体产生的iPSC系可用代表目的等位基因变体(例如与健康状况相关的等位基因)的多态性谱表征。

在其他实施方式中，使用引物延伸反应或扩增反应来检测等位基因。例如，包含(或怀疑包含)目标核酸分子的核酸样品可与寡核苷酸引物接触，该引物在与聚合酶进一步接触后可以延伸达到和超过(如果想要的话)SNP的位置。此外，核酸样品可与包括第一引物和第二引物的扩增引物对接触，其选择性地与目标核酸分子的互补链杂交，且在聚合酶存在的情况下，允许扩增产物的产生。为方便起见，扩增引物对的引物称为“第一引物”和“第二引物”；但是，本文所指的“第一引物”或“第二引物”并不意图表示任何重要性、添加顺序等。还应进一步认识到，扩增引物对需要第一和第二引物包括通常被称为正向引物或反向引物的引物。

可以设计引物延伸或PCR扩增反应，从而可通过延伸和/或扩增产物的存在或大小来确定SNP位置上的特定核苷酸的存在，在这种情况下，可使用例如凝胶电泳法、毛细管凝胶电泳法或质谱法的方法来确定SNP；或可以测序产物以确定在SNP位置上的核苷酸。此外，可以通过例如进一步将样品与检测寡核苷酸(detectoroligonucleotide)接触，该检测寡核苷酸可选择性地与包含SNP位置的第一扩增产物的核苷酸序列杂交；和检测如上所述的检测寡核苷酸的选择性杂交来间接检测SNP。

用于基因分型的其他各种方法是本领域已知的，且可应用在本发明的方法中。例如，可以使用试剂进行PCR，然后在该终点读取板。可类似地使用分子信标、

或

试剂和方法(Stratagene；Intergen)。还可以使用ELISA形式，例如使用其中一个引物被生物素化而另一引物包含地高辛配基(digoxygenin)的设计，检测扩增产物。然后将扩增产物结合在抗生蛋白链菌素板上、清洗、与酶偶联的地高辛配基抗体反应，并用酶的发色、荧光或化学发光底物显色。或者，放射性方法可用于检测产生的扩增产物，例如通过将放射性标记的脱氧核苷三磷酸引入扩增反应，然后将扩增产物印迹到DEAE纸上用于检测。此外，如果一个引物是生物素化的，则抗生蛋白链菌素包被的闪烁亲近分析(scintillation proximityassay)板可用于测量PCR产物。检测的其他方法可使用化学发光标记例如镧系螯合剂(例如

分析(Pall公司)中使用的)、电化学发光标记例如三-二吡啶化钌(ORI-GEN)，或荧光标记例如使用荧光相关光谱。

市售的和可用于识别一个或多个SNP的核苷酸存在的分析系统为

分析系统(Orchid BioSciences公司；普林斯顿，N.J.)。一般而言，

方法为三步骤引物延伸反应。在第一步中，通过与捕获引物杂交从样品中分离目标核酸分子，其提供第一水平的特异性。在第二步中，捕获引物在目标SNP位点从终端核苷三磷酸延伸，其提供了第二水平的特异性。在第三步中，可使用各种已知的方式检测延伸的核苷三磷酸，包括例如通过直接荧光、间接荧光、间接比色测定、质谱法或荧光偏振。可以使用SNP

仪(OrchidBioSciences公司)以自动模式在384孔形式中方便地进行反应。

用于对本文所选择的SNP等位基因进行基因分型的各种不同方法易于适于高通量分析中。例如，可使用便宜的机械化热循环仪进行特定数目循环的扩增反应如PCR，然后产生的扩增产物可在反应的终点被确定。此外，可以多重形式进行该方法，例如通过使用差异标记的寡核苷酸探针进行，或者进行产生不同大小的连接产物寡核苷酸连接分析或产生不同大小的扩增产物的扩增反应。在另一实例中，使用高通量质谱法来检测目标核酸样品中的SNP等位基因。用于SNP基因分型的质谱方法描述在例如美国专利No.7,132,519、6,994,998中和美国专利申请No.20060275789中。

当使用基于杂交的方法时，高严格性条件为使得完全匹配留在杂交复合物中而不完全匹配消失的那些条件。同理，低严格性条件为允许形成具有完全匹配和不完全匹配两者的杂交复合物的那些条件。高严格性条件是本领域已知的，参见例如Maniatis等人(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版；和Short Protocolsin Molecular Biology，编辑Ausubel等人。严格性条件为序列依赖性的，且会在不同的条件下不同。较长序列特别地在较高温度下杂交。核酸杂交的大量教导可在Tijssen(1993)，Techniques in Biochemistryand Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.″中找到。一般而言，严格性条件选择为比在限定的离子强度pH下特定序列的热熔点(Tm)低大约5-10℃。Tm是50％的与目标互补的探针在平衡状态下与目标序列杂交时的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)(由于目标序列过量，在Tm时，50％的探针在平衡状态下占据)。严格性条件为其中在pH 7.0至8.3下盐浓度小于约1.0M钠离子、通常约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃和对于长探针(例如大于50个核苷酸)温度为约60℃的条件。还可通过添加去稳定化试剂如甲酰胺来实现严格性条件。在另一实施方式中，使用较低严格性杂交条件；例如，可使用如本领域已知的中等或低严格性条件。参见例如Maniatis和Ausubel，同上，以及Tijssen，同上。

C.用于诱导多能干细胞系的方法

可从很多种哺乳动物细胞诱导iPSC系，例如人类体细胞如成纤维细胞、源自骨髓的单核细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞、外周血单核细胞、巨噬细胞、肝细胞、角质形成细胞、口腔角质形成细胞、毛囊真皮细胞、胃上皮细胞、肺上皮细胞、滑膜细胞、肾细胞、皮肤上皮细胞或成骨细胞。用于诱导多能和多潜能干细胞系的方法进一步公开在2008年6月13日提交，WSGR案卷号36588-704.201，第一发明人为Kazuhiro Sakurada的美国申请No.12/157,967；2008年6月13日提交，WSGR案卷号36588-707.101，第一发明人为Kazuhiro Sakurada的美国申请61/061,594和2008年6月13日提交，WSGR案卷号36588-702.101，第一发明人为Kazuhiro Sakurada的美国申请61/061,565，其全部通过引用方式全文结合在本文中。

待诱导的细胞可源自许多不同类型的组织，例如骨髓、皮肤(例如真皮、表皮)、肌肉、脂肪组织、外周血、包皮、骨骼肌或平滑肌。细胞还可源自新生儿组织，包括但不限于：脐带组织(例如脐带、脐带血、脐带血管)、羊膜、胎盘或其他各种不同的新生儿组织(例如骨髓液、肌肉、脂肪组织、外周血、皮肤、骨骼肌等)。

细胞可源自从自出生(包括剖腹产出生)到死亡的时期内的哺乳动物收集的新生儿或出生后的组织。例如，组织可来自如下的哺乳动物：＞10分钟龄、＞1小时龄、＞1天龄、＞1个月龄、＞2个月龄、＞6个月龄、＞1年龄、＞2年龄、＞5年龄、＞10年龄、＞15年龄、＞18年龄、＞25年龄、＞35年龄、＞45年龄、＞55年龄、＞65年龄、＜80年龄、＜70年龄、＜60年龄、＜50年龄、＜40年龄、＜30年龄、＜20年龄或＜10年龄。在一些实施例中，组织来自年龄为18、20、21、23、24、25、28、29、31、33、34、35、37、38、40、41、42、43、44、47、51、55、61、63、65、70、77或85岁的人体。

细胞可来自非胚胎组织，例如处于晚于胚胎阶段的发育阶段。在一些情况下，细胞可源自胎儿。在一些情况下，细胞不来自胎儿。在一些情况下，细胞来自胚胎。在一些情况下，细胞不来自胚胎。

可以从单细胞或细胞群获得细胞。该细胞群可为同质的或为异质的。细胞可为在人类细胞样品例如活组织检查或血液样品中发现的细胞群。在一些情况下，细胞为细胞系。在一些情况下，细胞为体细胞。在一些情况下，细胞源自与其他细胞融合的细胞。在一些情况下，细胞不是源自与其他细胞融合的细胞。在一些情况下，细胞不是源自与其他细胞人工融合的细胞。在一些情况下，细胞不是已经与胚胎干细胞融合的细胞或已经经过被称为体细胞核移植的过程的细胞。

细胞群可包括分化的和未分化的细胞两者。在一些情况下，细胞群主要包括分化的细胞。在一些情况下，细胞群主要包括未分化的细胞，例如未分化的干细胞。细胞群内的未分化细胞可被诱导成为多潜能的或多能的。在一些情况下，细胞群内分化的细胞被诱导成为多潜能的或多能的。

细胞群可包括未分化的细胞，例如间质干细胞(MSC)，参见例如Pittenger等人(1999)，Science 284(5411)：143-7；多能成体祖细胞(MAPC)，例如参见Jahagirdar等人(2005)，Stem Cell Rev.1(1)：53-9，和/或骨髓分离的成体多系可诱导(MIAMI)细胞(D′Ippolioto等人，(2004)，J.Cell Sci.117(Pt 14)：2971-81)。MSC为在发育期间由间充质产生的多潜能细胞。在一些情况下，未分化的干细胞(例如间质干细胞、MAPC和MIAMI细胞)为没有通过异染色质形成而发生表观遗传灭活修饰的干细胞，该异染色质形成是由于以下基因的至少4个、至少3个、至少2个、至少1个或一个也没有的DNA甲基化或组蛋白修饰：Nanog、Oct3/4、Sox2和Tert。当人类多能干细胞从人出生后组织中存在的未分化的干细胞诱导产生时，可出现这类基因例如Tert、Nanog、Oct3/4或Sox2的激活或表达。

获得人类体细胞的方法是熟知的，如在例如Schantz andNg(2004)，A Manual for Primary Human Cell Culture，World ScientificPublishing Co.，Pte，Ltd中所描述的。在一些情况下，该方法包括：通过例如活组织检查、血液抽取或者肺泡灌洗或其他肺部灌洗获得细胞样品。用于获得各种不同类型的人类体细胞的其他合适的方法包括但不限于以下示例性的方法：

骨髓

向供体给予全身麻醉并将其置于俯卧位。从髂骨后缘开始，将收集针直接插入皮肤中并通过髂骨表面到达骨髓，来自骨髓的液体被吸入注射器内。然后通过密度梯度离心从抽出物中制备单核细胞级份。然后收集的粗制单核细胞级份在用于本文所述的诱导多能性的方法之前进行培养。为方便起见，本文所述的诱导多能性的方法统称为“诱导”。

出生后皮肤

从例如膝后部或臀部收集含真皮的皮肤组织。然后在37℃下在含有1％抗生素/抗霉菌素的0.6％胰蛋白酶/DMEM(Dulbecco′sModified Eagle′s培养基)/F-12中培养皮肤组织30分钟，皮肤的内侧面朝向下。

在将皮肤组织翻转以用镊子轻轻刮擦内侧以后，使用剪刀将皮肤组织细细地切割为1mm²的片段，然后其在室温下以1200rpm离心10分钟。除去上清液，并向组织沉淀物中加入25ml的0.1％胰蛋白酶/DMEM/F-12/1％抗生素、抗霉菌素，并在37℃下用搅拌器以200-300rpm搅拌40分钟。在确认组织沉淀物完全消化后，加入3ml胎牛血清(FBS)(JRH制造)，并顺序用纱网(I型，PIP制造)、100μm尼龙滤网(FALCON制造)和40μm尼龙滤网(FALCON制造)过滤。在室温下以1200rpm离心得到的滤出液10分钟以除去上清液，之后加入DMEM/F-12/1％抗生素、抗霉菌素来洗涤沉淀物，然后在室温下1200rpm离心10分钟。如此获得的细胞级份然后在诱导之前进行培养。

出生后骨骼肌

在含结缔组织的肌肉(例如肱二头肌的外侧头或腿部的缝匠肌)的真皮被切开且肌肉组织被切除后，进行缝合。用剪刀或外科手术刀切碎获得的完整肌肉，然后悬浮在含0.06％IA型胶原酶和10％FBS的DMEM(高葡萄糖)中，并在37℃下培养2小时。

通过离心，从切碎的肌肉收集细胞，并悬浮在含10％FBS的DMEM(高葡萄糖)中。在将悬浮液通过孔径大小为40μm的微滤器和然后孔径大小为20μm的微滤器后，可根据下面6.中描述的方法培养所获得的细胞级份作为包含未分化的干细胞的粗纯化的细胞，并用于诱导本发明的人多能干细胞。

出生后脂肪组织

可通过本领域普通技术人员已知的各种方法分离在本发明中所使用的源自脂肪组织的细胞。例如，这样的方法描述在美国专利No.6,153,432中，其全部在此通过引用方式结合在本文中。优选的脂肪组织来源为网膜脂肪组织。在人体中，通常通过吸脂来分离脂肪细胞。

在一种分离源自脂肪细胞的细胞的方法中，在25-50℃、优选33-40℃和最优选37℃下，使用0.01％-0.5％、优选0.04％-0.2％和最优选约0.1％胶原酶，0.01％-0.5％、优选0.04％和最优选约0.2％胰蛋白酶和/或0.5ng/ml-10ng/ml分散酶或有效量的透明质酸酶或DNase(DNA消化酶)，和约0.01-约2.0mM、优选约0.1-约1.0mM、最优选0.53mM浓度的乙二胺四乙酸(EDTA)处理脂肪组织10分钟-3小时、优选30分钟-1小时和最优选45分钟。

细胞通过20微米-800微米、更优选40微米-400微米和最优选60微米的尼龙滤网或粗滤布滤网。然后直接地或使用Ficoll或Percoll或另一微粒梯度对培养液中的细胞进行差异离心。在4-50℃、优选20-40℃和最优选约25℃下，在100-3000xg、更优选200-1500xg、最优选500xg下离心细胞1分钟-1小时、更优选2-15分钟和最优选5分钟。

可根据本文描述的方法培养如此获得的源自脂肪组织的细胞级份作为包含未分化的干细胞的粗纯化的细胞，并用于诱导本发明的人多潜能或多能干细胞。

血液

收集约50ml-约500ml静脉血或脐带血，并通过例如Kanof等人(1993)，Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevack和W.Strober编辑)，ch.7.1.1.-7.1.5，John Wiley&Sons，New York)中描述的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)方法获得单核细胞级份。

在分离单核细胞级份以后，大约1x 10⁷-1x 10⁸个人类外周血单核细胞悬浮在包含10％胎牛血清、100μg/ml链霉素和100单位/ml青霉素的RPMI 1640培养基中，清洗两次以后，回收细胞。回收的细胞重新悬浮在RPMI 1640培养基中，并以约1x 10⁷个细胞/皿的密度接种在100mm塑料陪替氏培养皿上，并在8％CO₂的37℃培养箱中培养。10分钟后，除去残留在悬浮液中的细胞，并通过吸打(pipetting)收集粘附细胞。然后所得到的吸附单核细胞级份在本文所描述的诱导过程之前进行培养。在一些情况下，可根据本文所描述的方法培养如此获得的源自外周血和源自脐带血的粘附细胞级份作为包含未分化的干细胞的粗纯化的细胞，并用于诱导本发明的人多能干细胞。

诱导

在诱导过程中，在培养的细胞中进行某些多肽的强制表达，然后对作为多潜能和多能干细胞特征的多种形态和基因表达性质对iPSC进行筛选。满足这些筛选标准的诱导的细胞可随后进行亚克隆和扩增。在一些情况下，待诱导的细胞可在诱导程序之前培养一段时间。或者，待诱导的细胞可直接用于诱导过程而无预先培养期。在一些实施方式中，所使用的细胞培养基的类型在诱导过程之前、之中或之后是相同或非常相似的。在其他情况下，在不同的点使用不同的细胞培养基。例如，在诱导过程之前可直接使用一种类型的培养基，而在诱导过程中使用第二种类型的培养基。有时候，在诱导过程中使用第三种类型的培养基。

细胞可在补充特定血清的培养基中培养。在一些实施方式中，血清是胎牛血清(FBS)。血清还可以是小牛血清(fetal calf serum，FCS)。在一些情况下，血清可以是人类AB血清。还可以使用血清的混合物，例如FBS和人类AB、FBS和FCS或FCS和人类AB的混合物。

在诱导之前、之中或之后，可在低血清培养条件下进行细胞培养。“低血清培养条件’’是指使用包含的血清浓度为0％(v/v)(即不含血清)-约5％(v/v)，例如0％-2％、0％-2.5％、0％-3％、0％-4％、0％-5％、0.1％-2％、0.1％-5％、0.1％、0.5％、1％、1.2％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％或4％的细胞培养基。在一些实施方式中，血清浓度为约0％-约2％。在一些情况下，血清浓度为约2％。在一些情况下，血清浓度优选为2％或更低。在其他实施方式中，在“高血清条件”下培养细胞，即高于5％的血清-约20％的血清，例如6％、7％、8％、10％、12％、15％或20％。在诱导之前、之中和/或之后可进行高血清条件下的培养。

可以在其中培养细胞的一些代表性的培养基包括：MAPC、FBM、ES、MEF-条件化的(conditioned)ES(MC-ES)和mTeSR^TM(例如可从StemCell Technologies，Vancouver，加拿大获得)，参见Ludwig等人(2006)，Nat Biotechnol，24(2)：185-187。在其他情况下，还可使用用于人ES细胞的生长的可选的培养条件，例如描述在Skottman等人(2006)，Reproduction，132(5)：691-698中。在一些实施方式中，在向细胞引入诱导因子之前和/或之中，在MAPC、FBM、MC-ES或mTeSR^TM中培养细胞；且细胞随后在诱导过程中在MC-ES或mTeSR^TM培养基中培养。

MAPC(2％FBS)培养基可包含：60％Dulbecco′s Modified Eagle′s培养基-低葡萄糖、40％MCDB 201、胰岛素转铁蛋白硒补充剂(0.01mg/ml胰岛素；0.0055mg/ml转铁蛋白；0.005μg/ml硒化钠)、1X亚麻酸白蛋白(1mg/mL白蛋白；2摩尔亚麻酸/摩尔白蛋白)、1nM地塞米松、2％胎牛血清、1nM地塞米松、10-4M抗坏血酸和10μg/ml庆大霉素。

FBM(2％FBS)培养基可包含：MCDB202改良培养基、2％胎牛血清、5μg/ml胰岛素、50mg/ml庆大霉素和50ng/ml两性霉素B。

ES培养基可包含：40％Dulbecco′s Modified Eagle′s培养基(DMEM)40％F12培养基、2mM L-谷氨酰胺、1X非必需氨基酸(Sigma公司，St.Louis，MO)、20％Knockout Serum Replacement^TM(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)和10μg/ml庆大霉素。

MC-ES培养基可根据如下制备。在用丝裂霉素C处理的鼠胚成纤维细胞(MEF)上条件化ES培养基，收集，并通过0.45μM过滤器过滤，并补充约0.1mM β-巯基乙醇、约10ng/ml bFGF或FGF-2和任选的约10ng/ml活化素A。在一些情况下，使用照射的MEF代替丝裂霉素处理的MEF。

当使用低或高血清条件培养细胞时，可在培养基中包括一种或多种生长因子，例如成纤维细胞生长因子(FGF)-2；碱性FGF(bFGF)；血小板源生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)；胰岛素样生长因子(IGF)；或胰岛素。可用于补充细胞培养基的其他生长因子包括但不限于以下一种或多种：转化生长因子P-1(TGF P-1)、活化素A、Noggin、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子(NT)-1、NT-2或NT3。在一些情况下，一种或多种这类因子可用于在MC-ES培养基或其他细胞培养基中代替bFGF或FGF-2。

在一些情况下，本文所述的培养基(例如MAPC、FBM、MC-ES、mTeSR^TM)中生长因子的浓度为约2ng/ml-约20ng/ml，例如约2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、10ng/ml、12ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、17ng/ml或20ng/ml。在一些实施方式中，bFGF或FGF2的浓度为约2ng/ml-约5ng/ml；约5ng/ml-约8ng/ml；约9ng/ml-约11ng/ml；约11ng/ml-约15ng/ml；或约15ng/ml-约20ng/ml。

生长因子可单独使用或组合使用。例如，可将FGF-2单独加入培养基中；在另一实施例中，可将PDGF和EGF两者加入培养基中。

在一些实施例中，在细胞中基因或多肽的强制表达启动(例如在紧接着逆转录病毒感染期)后，“iPSC”’维持在如本文所述的MC-ES培养基中。

在一些实施方式中，细胞在存在rho或rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂的情况下维持以降低细胞凋亡。在一些情况下，将Rho相关激酶的抑制剂加入培养基中。例如，加入Y-27632(Calbiochem；水溶生的)或Fasudil(HA 1077：Calbiochem)-Rho相关激酶(Rho相关的卷曲式含卷曲蛋白激酶)抑制剂-可用于培养本发明的人多能干细胞。在一些情况下，Y-27632或Fasudil的浓度为约5μM-约20μM，例如约5μM、10μM、15μM或20μM。

在进行本文所述的诱导方法以前，细胞可培养约1-约12天，例如2天、3天、4.5天、5天、6.5天、7天、8天、9天、10天或约1天-约12天之间的任何其他天数。

在一些情况下，在37℃、5％CO₂培养器中在完全ES培养基中培养iPSC，约每1-2天更换培养基。在一些实施方式中，在基于形态特征识别和选择包含“iPSC”的克隆之前，培养和观察诱导的iPSC约14天-约40天，例如15、16、17、18、19、20、23、24、27、28、29、30、31、33、34、35、36、37、38天或约14天-约40天之间的任何其他时间长度。用于识别iPSC克隆的形态特征包括但不限于：具有高细胞核-细胞质比率的小的细胞尺寸；在亲代细胞之间(例如成纤维细胞之间)的空间内形成小的单层集落。

可以以约1x 10³个细胞/cm²-约1x 10⁴个细胞/cm²的细胞密度，例如2x 10³个细胞/cm²、3.5x 10³个细胞/cm²、6x 10³个细胞/cm²、7x 10³个细胞/cm²、9x 10³个细胞/cm²或约1x 10³个细胞/cm²-约1x10⁴个细胞/cm²之间的任何其他细胞密度接种细胞。

可将细胞直接接种和培养在组织培养级的塑料上。或者，将细胞接种和培养在涂覆的基质上，例如涂覆有纤连蛋白、明胶、matrigel^TM、胶原蛋白或层粘连蛋白的基质上。合适的细胞培养容器包括例如35mm、60mm、100mm和150mm的细胞培养皿、6孔细胞培养板和其他等同大小的细胞培养容器。在一些情况下，使用饲养层细胞培养细胞。例如，细胞可在MEF层或MEF覆盖层上培养。

具有低浓度血清的培养基可特别用于富集未分化的干细胞。在低血清条件下培养的未分化的细胞可以具有或不具有MSC、MAPC和/或MIAMI细胞共有的某些特征。表型的不同可能部分地由于获得MSC、MAPC和MIAMI细胞所使用的培养方法。例如，当在含高浓度血清(5％或更高)的培养基中培养组织(例如骨髓、脂肪、肌肉或皮肤等)时，通常通过分离粘附在塑料培养皿上的非造血细胞(例如间质细胞)来获得MSC。但是，即使在这些培养条件下，可以维持非常少量的未分化的细胞，特别是如果将细胞某些培养条件传代(例如，低传代数或低密度培养)。

在一些实施方式中，为了培养和生长人出生后组织中存在的从本发明的未分化的干细胞诱导的人多能干细胞，优选细胞在MEF覆盖的塑料培养皿或matrigel涂覆的塑料培养盘上在本文所述的包含添加剂的培养基中每5-7天进行传代培养。在一些情况下，可以低密度培养细胞，这可通过以约1∶6-1∶3分割细胞或通过以10³个细胞/cm²-3x 10⁴个细胞/cm²接种细胞实现。

细胞从供体(例如人)分离出来后通常立即发生原代培养。可对原代细胞进行二级传代培养、三级传代培养、四级传代培养或多于四级传代培养。“二级”传代培养指原代培养细胞传代培养一次，“三级”传代培养是指原代培养物传代培养两次，“四级”传代培养是指原代细胞传代培养三次，等等。本文描述的培养技术通常可包括原代培养和四级传代培养之间阶段的培养，但也可以使用其他培养阶段。优选地，细胞在原代培养到二级传代培养之间进行培养。

可以多种方式诱导细胞成为多能性的。在一些实施方式中，用于在一种或多种细胞中诱导多能性的方法包括强制一组诱导因子(IF)的表达。在一些情况下，该组IF包括以下一种或多种：Oct3/4多肽、Sox2多肽、Klf4多肽或c-Myc多肽。在一些情况下，该组不包括c-Myc多肽。例如，该组IF可包括：Oct3/4多肽、Sox2多肽和Klf4多肽，但不包括c-Myc多肽。在一些情况下，该组IF不包括可增加细胞转化风险的多肽。

在一些情况下，该组可包括c-Myc多肽。在某些情况下，c-Myc多肽为c-Myc的组成型活性变异体。在一些情况下，该组包括能够具有可诱导活性的c-Myc多肽，例如c-Myc-ER多肽，参见例如Littlewood等人(1995)Nucleic Acid Res.23(10)：1686-90。

在其他情况下，该组IF可包括：Oct3/4多肽、Sox2多肽和Klf4多肽，但不包括TERT多肽、SV40大T抗原多肽、HPV 16E6多肽、HPV 16E7多肽或Bmil多肽。在一些情况下，该组IF不包括TERT多肽。在一些情况下，该组IF不包括SV40大T抗原。在其他情况下，该组IF不包括HPV 16E6多肽或HPV 16E7多肽。

在一些情况下，该组IF包括三种IF，其中该三种IF中的两种为Oct3/4多肽和Sox2多肽。在其他情况下，该组IF包括两种IF，其中该两种多肽为c-Myc多肽和Sox2多肽。在一些情况下，该组诱导因子限制于Oct 3/4、Sox2和Klf4多肽。在其他情况下，该组诱导因子可限制于以下四种IF的组：Oct3/4多肽、Sox2多肽、Klf4多肽和c-Myc多肽。

IF组可以包括Oct 3/4、Sox2和Klf4多肽之外的IF。这样的另外的IF包括但不限于Nanog、TERT、LIN28、CYP26A1、GDF3、FoxD3、Zfp42、Dnmt3b、Ecat1和Tc11多肽。在一些情况下，该组另外的IF不包括c-Myc多肽。在一些情况下，该组另外的IF不包括可增加细胞转化风险的多肽。

IF的强制表达可维持至少约7天-至少约40天的时间，例如8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、25天、30天、33天或37天。

在人类细胞群的细胞中诱导多能性的效率为待诱导的细胞总数的至少约0.001％-至少约0.01％，例如0.002％、0.0034％、0.004％、0.005％、0.0065％、0.007％、0.008％或0.0085％。

D.HDAC抑制剂

可通过结合组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂处理和IF组的强制表达来实现细胞的诱导。待诱导的细胞可以为在人出生后组织中存在的未分化的干细胞。在其他情况下，待诱导的细胞可为分化的细胞或者分化的或未分化的细胞的混合物。

HDAC可与特定组的IF(例如Oct3/4、Sox2和Klf4)的强制表达结合。例如，在HDAC抑制剂处理与Oct3/4、Sox2和Klf4的强制表达或Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的强制表达结合后，人类体细胞被诱导成为多能性的。在一些情况下，可以通过将Oct3/4、Sox2和Klf4的三个基因或Oct3/4、Sox2和Klf4的三个基因加上c-Myc基因或HDAC抑制剂引入在人出生后组织中存在的未分化的干细胞(其中Tert、Nanog、Oct3/4和Sox2的各基因未发生表观遗传灭活)中诱导人多能干细胞。在再其他的情况下，通过将Oct3/4、Sox2和Klf4的三个基因或Oct3/4、Sox2和Klf4的三个基因加上c-Myc基因或组蛋白脱乙酰基酶抑制剂引入未分化的干细胞(在该未分化的干细胞通过原代培养或二级传代培养或者以低密度在包含低浓度血清的培养基中传代培养的分培养进行扩增后)诱导人多能干细胞。

可用一种或多种HDAC处理细胞约2小时-约5天，例如3小时、6小时、12小时、14小时、18小时、1天、2天、3天或4天。HDAC抑制剂的处理在细胞中开始IF的强制表达之前开始。在一些情况下，HDAC抑制剂处理在细胞中IF强制表达期间或之后开始。在其他情况下，HDAC抑制剂处理在强制表达之前开始，且在强制表达期间维持。

HDAC抑制剂的合适浓度为约0.001nM-约10mM，取决于待使用的特定HDAC抑制剂，但所选择的浓度不会显著降低处理的细胞中的细胞存活率。HDAC浓度可为0.01nM-1000nM。在一些实施方式中，HDAC浓度为约0.01nM-约1000nM，例如约0.05nM、0.1nM、0.5nM、0.75nM、1.0nM、1.5nM、10nM、20nM、40nM、50nM、100nM、200nM、300nM、500nM、600nM、700nM、800nM或约0.01nM-约1000nM之间的其他浓度。细胞可暴露1-5天或1-3天。例如，细胞暴露1天、2天、3天、4天或5天。

HDAC抑制剂的多个种类可用于诱导实验中。在优选的实施方式中，使用HDAC抑制剂MS-275。合适的HDAC抑制剂的例子包括但不限于以下的任何物质：

A.曲古抑菌素(trichostatin)A及其类似物，例如曲古抑菌素A(TSA)和曲古抑菌素C(Koghe等人1998，Biochem.Pharmacol.56：1359-1364)。

B.肽，例如oxamflatin[(2E)-5-[3-[(苯磺酰)氨基苯基]-戊-2-烯-4-inohydroxamic acid(Kim等人，Oncogene 18：2461-2470(1999))；Trapoxin A(环-(L-苯丙氨酰基-L-苯丙氨酰基-D-哌可啉基-L-2-氨基-8-氧代-9，10-环氧-癸酰基)(Kijima等人，J.Biol.Chem.268：22429-22435(1993))；FR901228，缩酚肽(Nakajima等人，Ex.Cell RES.241：126-133(1998))；FR225497，环四肽(H.Mori等人，PCT国际专利公布WO 00/08048(2000年2月17日))；apicidin，环四肽[环-(N-O-甲基-L-色氨酰基-L-异亮氨酰基-D-哌可啉基-L-2-氨基-8-氧代癸酰基)](Darkin-Rattray等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：13143-13147(1996))；apicidin Ia、apicidin Ib、apicidin Ic、apicidin IIa和apicidin IIb(P.Dulski等人，PCT国际专利公开WO 97/11366)；HC-毒素，环四肽(Bosch等人，Plant Cell 7：1941-1950(1995))；WF27082，环四肽(PCT国际专利公布WO 98/48825)和chlamydocin(Bosch等人，同上)。

C.基于异羟肟酸的杂化极性化合物(HPC)，例如：水杨基异羟肟酸(SBHA)(Andrews等人，International J.Parasitology  30：761-8(2000))；辛二酰基酰替苯胺异羟肟酸(SAHA)(Richon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：3003-7(1998))；壬二酸双异羟肟酸(ABHA)(Andrews等人，同上)；壬二酸-1-羟肟酸-9-酰替苯胺(azelaic-1-hydroxamate-9-anilide)(AAHA)(Qiu等人，Mol.Bi ol.Cell 11：2069-83(2000))；M-羧基肉桂酸双羟肟酰胺(M-carboxy cinnamic acidbishydroxamide)(CBHA)(Ricon等人，同上)；6-(3-氯苯基酰脲)己酸异羟肟酸，3-Cl-UCHA)(Richon等人，同上)；MW2796(Andrews等人，同上)；和MW2996(Andrews等人，同上)。

D.短链脂肪酸(SCFA)化合物，例如：丁酸钠(Cousens等人，J.Biol.Chem.254：1716-23(1979))；异戊酸(McBain等人，Biochem.Pharm.53：1357-68(1997))；丙戊酸；戊酸盐(McBain等人，同上)；4-苯基丁酸(4-PBA)(Lea和Tulsyan，Anticancer RESearch  15：879-3(1995))；苯基丁酸(PB)(Wang等人，Cancer RESearch 59：2766-99(1999))；丙酸酯(propionate)(McBain等人，同上)；丁酰胺(Lea和Tulsyan，同上)；异丁酰胺(Lea和Tulsyan，同上)；乙酸苯酯(Lea和Tulsyan，同上)；3-溴代丙酸盐(Lea和Tulsyan，同上)；三丁精(Guan等人，Cancer RESearch 60：749-55(2000))；丁酸精氨酸；异丁基酰胺；和丙戊酸盐。

E.苯甲酰胺衍生物，例如：MS-275[N-(2-氨基苯基)-4-[N-(吡啶-3-基-甲氧羰基)氨甲基]苯甲酰胺](Saito等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：4592-7(1999))；和MS-275的3′-氨基衍生物(Saito等人，同上)；和CI-994。

可以按照例如以下进行组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的处理。HDAC抑制剂的浓度可取决于特定抑制剂，但优选为0.001nM-约10mM，更优选为约0.01nM-约1000nM。组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的有效量或剂量被定义为不显著降低细胞(特别是未分化的干细胞)的存活率的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的量。细胞暴露1-5天或1-3天。暴露时间可短于1天。在具体实施方式中，细胞培养约1-5天，然后将其暴露于有效量的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。但是，可在培养开始时加入组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。在这样的时间范围内，携带基因的载体(例如包含编码三个基因(Oct3/4、Sox2和Klf4)的核酸的载体)通过已知方法被引入到培养的细胞中。

E.IF表达载体

IF的强制表达可包括：向细胞群引入一种或多种编码Oct 3/4、Sox2和Klf4多肽的哺乳动物表达载体。IF可作为外源基因被引入到细胞中。在一些情况下，外源基因被整合到宿主细胞及其后代的基因组中。在其他情况下，外源基因在宿主细胞及其后代中保持在游离基因状态中。外源基因是从外部来源引入细胞内的基因。本文所用的基因为包含编码目的多肽(例如IF)的开放阅读框的核酸。基因优选包括可操作连接至开放阅读开放阅读框的启动子。在一些情况下，基因的天然形式已经存在于细胞内，但另外的“外源基因”被加入到细胞中以诱导多肽表达。

一种或多种哺乳动物表达载体可被引入总细胞群的多于20％的细胞中，例如25％、30％、35％、40％、44％、50％、57％、62％、70％、74％、75％、80％、90％或超过20％的其他百分比的细胞。单个哺乳动物表达载体可包含两种或多种被提及的IF。在其他情况下，使用一种或多种编码Oct 3/4、Sox2、Klf4和c-Myc多肽的表达载体。在一些实施方式中，待表达的各IF被编码在单独的哺乳动物表达载体上。

在一些情况下，IF在框内与转运蛋白的氨基酸序列遗传融合，例如如在美国专利No.6,521,455、6,251,398和6,017,735中所描述的VP22多肽的氨基酸序列。该VP22序列允许将来自已用VP22融合多肽表达载体转染的细胞的VP22融合多肽进行细胞间转运到达未转染或转导的邻近细胞。参见例如Lemken等人(2007)，Mol Ther，15(2)：310-319。因此，在本文所述的诱导方法中使用IF-VP22融合多肽可显著提高转染的哺乳动物表达载体的功能效率。

合适的哺乳动物表达载体的例子包括但不限于：重组病毒、核酸载体例如质粒、人工细菌染色体、人工酵母染色体、人工人类染色体、cDNA、cRNA和PCR产物表达盒。用于驱动IF表达的合适启动子的例子包括：逆转录病毒LTR元件；组成型启动子例如CMV、HSV 1-TK、SV40、EF-1α、β肌动蛋白；PGK和诱导型启动子，例如包含PGK-操作子元件的那些。在一些情况下，一种或多种母乳动物表达载体除了编码IF以外还编码有助于识别或选择已经转染或感染的细胞的标志物基因。标志物基因的例子包括但不限于：荧光蛋白基因，例如EGFP、DS-Red、YFP和CFP的基因；赋予对选择试剂的抗性的蛋白质，例如neoR基因和杀稻瘟菌素抗性基因。

1.重组病毒

IF的强制表达可通过向一个或多个细胞中引入携带编码IF的DNA或RNA的重组病毒而实现。此外，重组病毒可携带编码多于一种IF的DNA或RNA。这包括单个病毒内包含的单一IF或多种IF的多个拷贝。为方便起见，在本文中有时通过其编码的IF来命名病毒。例如，编码Oct3/4多肽的病毒可描述为“Oct3/4病毒”。在某些情况下，病毒一次可编码IF的多于一个拷贝或可编码多于一种IF，例如两种IF。

可将重组病毒的不同组合和组引入细胞内。重组病毒的组可包括在本文所述的任意IF组中包括的组合。重组病毒的组可包括至少：Oct3/4病毒、Sox2病毒和Klf4病毒。重组病毒的组可限制于以下四种重组病毒的组：Oct3/4病毒、Sox2病毒、Klf4病毒和c-Myc病毒。在一些情况下，重组病毒的组被限制为至少Oct3/4病毒、Sox2病毒、Klf4病毒和c-Myc病毒的组。在一些情况下，重组病毒的组被限制为Oct 3/4、Sox2和Klf4病毒。重组病毒的组可以被限制为至少Oct3/4病毒、Sox2病毒和Klf4病毒的组。在一些情况下，重组病毒的组包括三种重组病毒，其中该三种重组病毒中的两种为Oct3/4病毒和Sox2病毒。在再其他的情况下，重组病毒的组可限制为Sox2病毒和c-Myc病毒。

在一些情况下，重组病毒的组不包括编码可增加细胞转化风险的多肽的重组病毒，例如c-Myc多肽。例如，重组病毒的组可包括：Oct3/4病毒、Sox2病毒和Klf4病毒，但不包括c-Myc病毒。

在其他情况下，重组病毒的组包括c-Myc病毒。由c-Myc病毒编码的c-Myc多肽可为野生型c-Myc或c-Myc的组成型活性变异体。在一些情况下，该组包括编码能够具有可诱导活性的c-Myc多肽(例如c-Myc-ER多肽)的病毒，参见例如Littlewood等人(1995)NucleicAcid Res.23(10)：1686-90。

重组病毒的组可包括：Oct3/4病毒、Sox2病毒和Klf4病毒，但不包括TERT病毒、SV40大T抗原病毒、HPV 16E6病毒、HPV 16E7病毒或Bmil病毒。有时，重组病毒的组不包括TERT病毒。在一些情况下，重组病毒的组不包括SV40病毒。在其他情况下，重组病毒的组不包括HPV16E6病毒或HPV 16E7病毒。

重组病毒的组还可包括除了Oct 3/4、Sox2和Klf4病毒以外的病毒。这样的另外的重组病毒包括但不限于：Nanog、TERT、CYP26A1、GDF3、FoxD3、Zfp42、Dnmt3b、Ecat1和Tc11病毒。在一些情况下，重组病毒的组包括本文所述的任何IF变异体。

单个病毒可按时间顺序或同时加入到细胞中。在一些情况下，至少一种病毒(例如Oct3/4病毒、Sox2病毒、Klf4病毒或c-Myc病毒)在与一种或多种其他病毒加入的时间不同的时间被加入到细胞中。在一些实施例中，Oct3/4病毒、Sox2病毒和K1F4病毒被同时或时间上非常接近地加入到细胞中，c-Myc病毒在与加入其他病毒的时间不同的时间被加入。

至少两种重组病毒可同时或时间上非常接近地被加入到细胞中。在一些实施例中，Oct3/4病毒和Sox2病毒同时或时间上非常接近地被加入到细胞中，而Klf4病毒或c-Myc病毒在不同的时间加入。在一些实施例中，Oct3/4病毒和Sox2病毒；Oct3/4病毒和Klf4病毒；Oct3/4病毒和c-Myc病毒；Sox2病毒和Klf4病毒；Sox2病毒和c-Myc病毒或Klf4和c-Myc病毒被同时或时间上非常接近地加入。

在一些情况下，至少三种病毒例如Oct3/4病毒、Sox2病毒和Klf4病毒同时或时间上非常接近地被加入到细胞中。在其它情况下，至少四种病毒例如Oct3/4病毒、Sox2病毒、Klf4病毒和c-Myc病毒被同时或时间上非常接近地加入到细胞中。

有时候，病毒感染的有效性可通过用同一病毒重复处理来提高。在一些情况下，在至少两个、至少三个或至少四个独立的时间向细胞加入一种或多种Oct3/4病毒、Sox2病毒、Klf4病毒或c-Myc病毒。

重组病毒的例子包括但不限于：逆转录病毒(包括慢病毒)；腺病毒和腺相关病毒。重组逆转录病毒通常为莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)，但也可以使用其他重组逆转录病毒，例如禽白血病病毒、牛白血病病毒、鼠白血病病毒(MLV)、貂细胞灶诱导病毒、鼠肉瘤病毒、网状内皮组织增生病毒、长臂猿(Gibbon Abe)白血病病毒、MasonPfizer猴病毒或Rous肉瘤病毒，参见例如美国专利No.6,333,195。

在其他情况下，重组逆转录病毒为慢病毒(例如人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)、猿免疫缺陷病毒(SIV)或猫免疫缺陷病毒(FIV))，参见例如Johnston等人(1999)，Journal of Virology 73(6)″4991-5000(FIV)；Nègre D等人(2002)Current Topics in Microbiology and Immunology261：53-74(SIV)；.Naldini等人(1996)Science.272：263-267(HIV)。

重组逆转录病毒可包含病毒多肽(例如逆转录病毒env)以帮助进入目标细胞。这样的病毒多肽是本领域公知的，参见例如美国专利No.5,449,614。病毒多肽可以为帮助源自多个物种的细胞(包括原始宿主物种以外的细胞)的双嗜性病毒多肽(例如双嗜性env)。参见，例如前处。病毒多肽可以为帮助进入原始宿主物种以外的细胞的异嗜性(xenotropic)病毒多肽。参见，例如前处。病毒多肽可以为帮助进入原始宿主物种的细胞的亲嗜性(ecotropic)病毒多肽。参见，例如前处。

能够帮助逆转录病毒进入细胞的病毒多肽的例子包括但不限于：MMLV双嗜性env、MMLV亲嗜性env、MMLV异嗜性env、疱疹性口炎病毒-g蛋白(VSV-g)、HIV-1env、长臂猿白血病病毒(GALV)env、RD114、FeLV-C、FeLV-B、MLV 10A1env基因及其变体，包括嵌合体。参见例如Yee等人(1994)，Methods Cell Biol.PtA：99-112(VSV-G)；美国专利No.5,449,614。在一些情况下，病毒多肽经遗传修饰以促进表达或增强与受体的结合。

一般而言，通过将病毒DNA或RNA构建体引入生产者细胞(producer cell)来产生重组病毒。在一些情况下，生产者细胞不表达外源基因。在其他情况下，生产者细胞为包含一种或多种外源基因(例如编码一种或多种gag、pol或env多肽和/或一种或多种逆转录病毒gag、pol或env多肽的基因)的“包装细胞(packaging cell)”。逆转录病毒包装细胞可包含编码病毒多肽(例如帮助进入目标细胞的VSV-g)的基因。在一些情况下，包装细胞包含编码一种或多种慢病毒蛋白(例如gag、pol、env、vpr、vpu、vpx、vif、tat、rev或nef)的基因。在一些情况下，包装细胞包含编码腺病毒蛋白(如E1A或E1B或其他腺病毒蛋白)的基因。例如，包装细胞提供的蛋白质可为逆转录病毒源的蛋白质如gag、pol和env，慢病毒源的蛋白质如gag、pol、env、vpr、vpu、vpx、vif、tat、rev和nef及腺病毒源的蛋白质如E 1A和E1B。在许多实施例中，包装细胞提供来自不同于病毒载体来自的病毒的病毒的蛋白质。

包装细胞系包括但不限于任何容易转染的细胞系。包装细胞系可基于293T细胞、NIH3T3、COS或HeLa细胞系。作为包装细胞，可以使用能够提供至少一种编码病毒包装所需的蛋白质的基因缺陷的重组病毒载体质粒的缺乏蛋白质(lacking protein)的任何细胞。包装细胞系的例子包括但不限于Platinum-E(Plat-E)、Platinum-A(Plat-A)、BOSC 23(ATCC CRL 11554)和Bing(ATCC CRL 11270)，参见例如Morita等人(2000)Gene Therapy 7：1063-1066；Onishi等人(1996)Experimental Hematology 24：324-329；美国专利No.6,995,009。市售的包装细胞系也是有用的，例如Ampho-Pak 293细胞系、Eco-Pak2-293细胞系、RetroPack PT67细胞系和Retro-X Universal PackagingSystem(所有均可从Clontech获得)。

逆转录病毒构建体可源自多种逆转录病毒，例如MMLV、HIV-1、SIV、FIV或其他本文所述的逆转录病毒。逆转录病毒构建体可编码特定病毒的多于一个循环的复制所需的所有病毒多肽。在一些情况下，通过加入其他因子或其他病毒多肽来提高病毒进入的效率。在其他情况下，由逆转录病毒构建体编码的病毒多肽不支持多于一个循环的复制，例如美国专利No.6,872,528。在这样的情况下，加入其他因子或其他病毒多肽可有助于病毒的进入。在示例性的实施方式中，重组逆转录病毒为包含VSV-g多肽但不包含HIV-1env多肽的HIV-1病毒。

逆转录病毒构建体可包含：启动子、多克隆位点和/或抗性基因。启动子的例子包括但不限于：CMV、SV40、EF1α、β肌动蛋白、逆转录病毒LTR启动子和诱导型启动子。逆转录病毒构建体还可包含包装信号(例如，来自MFG载体的包装信号；psi包装信号)。本领域已知的逆转录病毒构建体的例子包括但不限于pMX、pBabeX或其衍生体。参见例如Onishi等人(1996)Experimental Hematology24：324-329。在一些情况下，逆转录病毒构建体是自失活的慢病毒载体(SIN载体)，参见例如Miyoshi等人，(1998)J Virol.72(10)：8150-8157。在一些情况下，逆转录病毒构建体为LL-CG、LS-CG、CL-CG、CS-CG、CLG或MFG。Miyoshi等人，(1998)J Virol.72(10)：8150-8157；Onishi等人(1996)Experimental Hematology 24：324-329；Riviere等人(1995)PNAS 92：6733-6737。病毒载体质粒(或构建体)包括：pMXs、pMXs-IB、pMXs-puro、pMXs-neo(pMXs-IB为携带杀稻瘟菌素抗性基因而不是pMXs-puro的嘌呤霉素抗性基因的载体)[Experimental Hematology，2003，31(11)：1007-14]、MFG[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92，6733-6737(1995)]、pBabePuro[Nucleic AcidsResearch 18，3587-3596(1990)]、LL-CG、CL-CG、CS-CG、CLG[Journalof Virology 72：8150-8157(1998)]等作为逆转录病毒系统，和pAdexl[Nucleic Acids Res.23：3816-3821(1995)]等作为腺病毒系统。在示例性的实施方式中，逆转录病毒构建体包含杀稻瘟菌素(例如pMXs-IB)、嘌呤霉素(例如pMXs-puro、pBabePuro)或新霉素(例如pMXs-neo)。参见例如Morgenstern等人(1990)Nucleic Acids Research18：3587-3596。

逆转录病毒构建体可编码一种或多种IF。在示例性的实施方式中，产生或获得编码Oct3/4、Sox2、Klf4或c-Myc多肽或其变异体的pMX载体。例如，将Oct3/4插入pMXs-puro以产生pMX-Oct3/4；将Sox2插入pMXs-neo以产生pMX-Sox2；将Klf4插入pMXs-IB以产生pMX-Klf4；和将c-Myc插入pMXs-IB以产生pMX-c-Myc。

从包装细胞产生重组病毒的方法及其用途是众所周知的，参见例如美国专利No.5,834,256、6,910,434、5,591,624、5,817,491、7070994和6,995,009，其全部在此通过引用方式结合在本文中。许多方法从将病毒构建体引入包装细胞系中开始。可通过本领域已知的任何方法引入病毒构建体，包括但不限于：磷酸钙法[特开(日本未经审查的专利公布)No.2-227075]、电穿孔法、显微注射、Fugene转染等和本文描述的任何方法。

在一个实施例中，通过Fugene HD(Roche)转染将pMX-Oct3/4、pMX-Sox2、pMX-Klf4或pMX-c-Myc引入PlatE细胞中。可用补充有FGM-2Single Quots(Lonza)的包含FBM(Lonza)的新鲜培养基替换细胞培养基。在一些实施方式中，引入病毒构建体后约12-约60小时替换培养基，例如在向生产者细胞引入病毒构建体后约12-约18小时；约18-约24小时；约24-约30小时；约30-约36小时；约36-约42小时；约42-约48小时；约48-约54小时；或约54-约60小时。可在向生产者细胞引入病毒构建体后约24-约48小时替换培养基。可以在加入新鲜培养基后约4-约24小时回收上清液，例如约4小时。在一些情况下，可以在加入新鲜培养基后约每隔4小时回收上清液。可将回收的上清液通过0.45μM过滤器(Millipore)。在一些情况下，回收的上清液包含源自pMX-Oct3/4、pMX-Sox2、pMX-Klf4或pMX-c-Myc的一种或多种的逆转录病毒。

腺病毒转导可用于强制IF组的表达。用于产生腺病毒的方法及其用途是公知的，如描述在例如Straus，The Adenovirus，PlenumPress(NY 1984)，451496；Rosenfeld等人，Science，252：431-434(1991)；美国专利No.6,203,975、5,707,618和5,637,456中。在其他情况下，使用腺病毒相关的病毒转导来强制IF组的表达。用于制备腺病毒相关病毒的方法及其用途是公知的，如描述在例如美国专利No.6,660,514和6,146,874中。

在示例性的实施方式中，获得和产生腺病毒构建体，其中腺病毒构建体(例如Adeno-X)包含编码Oct3/4、Sox2、Klf4或c-Myc的DNA。可通过本领域已知的任何方法(例如Lipofectamine 2000(Invitrogen)或Fugene HD(Roche))向HEK 293细胞中引入腺病毒构建体。在一些情况下，该方法进一步包括：(1)当细胞表现出细胞病变效应(CPE)(该效应出现在转染后约10-约20天，例如约11、13、14、15、18或20天)时，收集细胞；(2)对细胞进行约2-约5天的冻-融循环，例如约3天；(3)收集所得到的含病毒的液体；(4)使用腺病毒纯化试剂盒(Clontech)纯化病毒和(5)在-80℃下贮存病毒。在一些情况下，如本文所述，使用Adeno-X快速滴度测定试剂盒(Clontech)确定腺病毒原液的滴度或噬菌斑形成单位(PFU)。

可用天然靶向不同细胞类型或来自不同宿主的细胞的重组逆转录病毒来感染细胞。为了促进感染效率，可首先将外源受体引入人类细胞中。例如，可将外源小鼠受体添加到人类细胞(例如出生后皮肤成纤维细胞)以有助于莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)的进入。外源受体可以通过促进病毒进入改善感染效率，特别是如果受体识别病毒多肽，例如MMLV env或HIV env。外源受体的例子包括但不限于由本领域已知的特定逆转录病毒或慢病毒识别的任何受体。例如，使用鼠受体-mCATl，GenBank登录号NM 007513蛋白质，来帮助人类目标细胞的MMLV感染。在另一实施例中，使用CXCR4或CCR5受体来帮助目标细胞的HIV-1感染。

可通过文本描述的方法引入外源受体。引入外源受体的方法包括但不限于：磷酸钙转染、Lipofectamine转染、Fugene转染、显微注射或电穿孔。在示例性的实施方式中，使用病毒(例如重组腺病毒)或逆转录病毒(包括慢病毒)将外源受体引入目标细胞。在进一步的示例性实施方式中，使用重组腺病毒将MCATl引入人类细胞，然后使用重组逆转录病毒(例如MMLV)将IF基因(例如Oct 3/4、Sox2、Klf4或c-Myc)引入细胞。

在一些情况下，制备或获得包含编码mCATl蛋白质的DNA的腺病毒(例如使用pADEX-mCATl构建体产生的腺病毒)的溶液。该腺病毒溶液可包含汉克平衡盐溶液(Hanks′balanced salt solution)。在示例性的实施方式中，通过以下方式实现细胞的感染：(1)将p-ADEX-mCATl腺病毒溶液与细胞(例如人类非胚胎成纤维细胞)相接触，其感染复数(m.o.i.)为约1∶5-约1∶50，例如约1∶5、约1∶7、约1∶10、约1∶15、约1∶20、约1∶25、约1∶30、约1∶35、约1∶40、约1∶45或约1∶50；(2)在室温下将细胞与腺病毒溶液一直孵育约15分钟-约2小时，例如约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约1.25小时、约1.5小时、约1.75小时或约2小时；和(3)在培养基中培养体细胞群约24小时-约60小时，例如约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约54小时或约60小时。

可以使用各种方法感染细胞。在一些情况下，通过以下方式感染细胞：(1)组合pMX-Oct3/4逆转录病毒、pMX-Sox2逆转录病毒、pMX-Klf4或pMX-c-Myc中的一种或多种、两种或多种、三种或多种或所有四种以获得逆转录病毒溶液；(2)用约2ug/ml-约15ug/ml聚凝胺(Polybrene)，例如约2ug/ml、约3ug/ml、约5ug/ml、约7ug/ml、约10ug/ml、约12ug/ml或约15ug/ml聚凝胺补充该逆转录病毒溶液；(3)将逆转录病毒溶液与体细胞相接触，其m.o.i为约1∶100-约1∶500，例如约1∶100、约1∶150、约1∶200、约1∶250、约1∶300、约1∶350、约1∶400、约1∶450或约1∶500的m.o.i；(4)允许步骤(3)的接触在37℃持续约2小时-约24小时，例如约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或约24小时；(5)紧接着步骤(4)的接触，将培养基更换成如本文描述的MC-ES培养基；和(6)每1-2天使用新鲜的培养基更换MC-ES培养基。在一些情况下，通过本文描述的步骤(1)-(6)对体细胞进行感染，再加上在将细胞与逆转录病毒溶液相接触之前预培养体细胞一定时间(例如48小时)的步骤。当体细胞表达通过病毒转导、转染或其他方法引入的外源受体时，该预培养可能是必需的。因此，在一些实施方式中，如果使用腺病毒或慢病毒将外源受体(例如mCATl)引入体细胞，这样的细胞可能需要培养至少约30小时-至少约60小时的一段时间，例如约30、约35、约40、约48、约52、约55或约60小时。

可以通过本领域已知的任意方法来实现细胞的感染，例如Palsson，B.等人，WO95/10619.1995年4月20日；Morling，F.J.等人(1995).Gene Therapy.2：504-508；Gopp等人(2006)Methods Enzymol.420：64-81。例如，可以通过离心感染(spin-infection)或“离心接种(spinoculation)”方法进行感染，该方法包括在紧接着向细胞加入病毒之后的时间内对细胞进行离心。在一些情况下，可以在感染之前通过例如超速离心来浓缩病毒。在一些情况下，可以使用其他技术来帮助或促进逆转录病毒进入到目标细胞中。例如，可将逆转录病毒与脂质体或免疫脂质体接触以帮助或引导进入特定的细胞类型中。参见例如Tan等人(2007)Mol Med.13(3-4)：216-226。

可以使用本文描述的感染细胞的方法来感染表达外源受体(例如MCATl或本文描述的其他外源受体)的细胞。取决于外源受体是如何被引入的，可能需要改变感染之前的预培养时间。在一些情况下，使用不表达外源受体的细胞。一些重组逆转录病毒(例如VSV-G假型重组逆转录病毒)可能不需要外源受体的帮助以有效地进入细胞。在一些实施例中，根据本文描述的方法将VSV-G假型重组逆转录病毒引入细胞中，除了细胞预培养的时间可能改变以外。

2.核酸载体

可以使用核酸载体转染(例如瞬时转染)方法将IF引入人类细胞中。用于制备转染级的核酸表达载体的方法是公知的。参见例如Sambrook  和Russell(2001)，″Molecular Cloning：A LaboratoryManual，″第3版，(CSHL Press)。高效转染的有效方法的例子包括如描述在例如Trompeter(2003)，J Immunol Methods，274(1-2)：245-256和国际专利申请公布WO2002086134、WO200200871和WO2002086129的“核转染(nucleofection)”、使用基于脂质的转染试剂(例如

6和HD(Roche)、DOTAP和lipofectamine^TM LTX)结合PLUS^TM(Invitrogen，Carlsbad，CA)，Dreamfect^TM(OZ Biosciences，Marseille，France)、GeneJuice^TM(Novagen，Madison，WI)、聚乙烯亚胺(参见例如Lungwitz等人(2005)，Eur J Pharm Biopharm，60(2)：247-266)和Gene Jammer^TM(Stratagene，La Jolla，CA)的转染，以及使用如描述在例如美国专利申请No.11/195,066中的纳米微粒转染试剂的转染。

3.蛋白质转导

诱导方法可使用蛋白质转导以将至少一种IF直接引入到细胞中。在一些情况下，蛋白质转导方法包括将细胞与包含载体试剂和至少一种含有上述IF之一的氨基酸序列的纯化多肽的组合物相接触。合适的载体试剂及其使用方法的例子包括但不限于：市售试剂例如在美国专利No.6,841,535中描述的Chariot^TM(Active Motif公司，Carlsbad，CA)；

(Gene Therapy Systems公司，San Diego，CA)、GenomeONE(Cosmo Bio有限公司，Tokyo，Japan)和ProteoJuice^TM(Novagen，Madison，WI)，或如描述在例如美国专利申请No.138,593中的纳米微粒蛋白质转导试剂。

蛋白质转导方法可包括将细胞与至少一种包含蛋白质转导结构域(PTD)序列融合的上述TA之一的氨基酸序列的的纯化多肽(IF-PTD融合多肽)相接触。PTD结构域可融合到IF序列的氨基末端；或者，PTD结构域可融合到IF序列的羧基末端。在一些情况下，IF-PTD融合多肽作为变性多肽加入到细胞中，当其复性时可能有助于将其转运到细胞中。PTB融合蛋白的产生及其使用方法是本领域已知的，如描述在例如美国专利No 5,674,980、5,652,122和6,881,825中。还可以参见Becker-Hapak等人(2003)，Curr Protocols in Cell Biol，John Wiley&Sons公司。示例性的PTD结构域氨基酸序列包括但不限于以下任意序列：YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：1)；RKKRRQRR(SEQ ID NO：2)；YARAAARQARA(SEQ ID NO：3)；THRLPRRRRRR(SEQ ID NO：4)和GGRRARRRRRR(SEQ ID NO：5)。

在一些情况下，在不同时间依顺序向细胞加入单个纯化的IF多肽。在其他实施方式中，向细胞加入至少三种纯化IF多肽(但不是纯化的c-Myc多肽)的组，例如Oct3/4多肽、Sox2多肽和Klf4多肽。在一些实施方式中，向细胞加入四种纯化的IF多肽的组，例如纯化的Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc多肽。在一些实施方式中，向细胞加入作为一种组合物(即包含IF多肽混合物的组合物)的纯化IF多肽。在一些实施方式中，细胞在存在纯化的IF多肽的情况下孵育约30分钟-约24小时，例如1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时或约30分钟-约24小时之间的任何其他时间。在一些实施方式中，细胞的蛋白质转导以约每天-约每4天的频率重复，例如每1.5天、每2天、每3天或约每天-约每4天之间的任何其他频率。

还可通过使用不含核酸的含IF的蛋白质转导纳米微粒(PTN)来实现IF的强制表达。用于产生或使用PTN的方法的具体内容可参见例如Link等人(2006)，Nuc AcidsRes，34(2)：e16。

在一些情况下，本文描述的方法以任意组合使用蛋白质转导和表达载体转导/转染，以强制如本文所述的IF组的表达。在一些实施方式中，使用逆转录病毒载体来强制细胞中Oct 3/4、Sox2和Klf4多肽的表达，且通过如本文所述的蛋白质转导将纯化的c-Myc纯化多肽引入细胞中。除了纯化的IF多肽外，可以使用HDAC抑制剂处理。在一些情况下，将至少三种纯化IF多肽(但不是纯化的c-Myc)的组(例如Oct3/4多肽、Sox2多肽和Klf4多肽)加入也进行HDAC抑制剂处理的细胞。

F.亚克隆诱导的细胞集落

可通过本领域已知的任意方法亚克隆细胞集落。在一些情况下，在基于形态特征识别和选择包含“iPSC”的克隆之前，培养和观察iPSC约14天-约40天，例如15、16、17、18、19、20、23、24、27、28、29、30、31、33、34、35、36、37、38天或约14天-约40天之间的任何其他时间。用于识别iPSC克隆的形态特征包括但不限于：具有高的核-细胞质比率的小细胞大小；在亲代细胞之间(例如在成纤维细胞之间)的空间形成小的单层集落。

在使用生理缓冲液(例如汉克平衡盐溶液)洗涤细胞培养物后，显示目标形态特征的集落由其底部涂有硅脂的克隆环环绕。然后将大约100μl(或50μl-150μl)的“用于灵长类ES细胞的脱落培养基(Detachment Medium For Primate ES Cells)”(ReproCELL制造，东京，日本)加入克隆环中，并在37℃下培养约20分钟以形成细胞悬浮液。然后将在包含脱落集落的环中的细胞悬浮液加入约2ml的MC ES培养基(或本文描述的其他培养基)中，并在MEF涂覆的24孔培养板的一个孔中或其他具有等同表面积的细胞培养容器中接种。在5％CO₂、37℃的细胞培养器中培养源自该集落的细胞大约14小时后，更换培养基。随后，大约每两天更换培养基直到约8天后进行二级传代培养时。

在一些实施方式中，在第一次传代培养中，除去培养基，用汉克平衡盐溶液洗涤细胞，然后向细胞中加入用于灵长类ES细胞的脱落培养基(ReproCell，东京，日本)，并在37℃下培养10分钟。培养之后，向得到的细胞悬浮液中加入MC-ES培养基(2ml)以终止脱落培养基的活性。然后将细胞悬浮液转移入离心管中，在4℃下以200x g离心5分钟。除去上清液，在MC ES培养基中重新悬浮细胞沉淀，并将重新悬浮的细胞接种在MEF涂覆的24孔培养板的四个孔中，培养约7天直到准备二级传代培养。

在通过如上所述的方法制备的二级传代培养中，将细胞接种在用20μg/cm浓度的基质胶涂覆的60mm细胞培养盘上。大约8天后(开始IF的强制表达大约5周后)，准备三级传代培养，其中将细胞接种在两个基质胶涂覆的60mm细胞培养盘上，一个培养盘随后用于基因表达分析，而另一个用于如下所述的继续传代。一个传代培养物被用于如本文所述的基因表达分析，而另一个根据需要进行传代以维持源自iPSC克隆的细胞系。

G.传代和维持诱导的细胞

亚克隆以后，可以大约每5-7天传代培养iPSC。在一些情况下，使用汉克平衡盐溶液洗涤细胞，和加入分散酶或用于灵长类ES细胞的脱落培养基并在37℃下培养5-10分钟。当大约多于一半的集落脱落时，加入MC-ES培养基以终止脱落培养基的酶活性，并将得到的细胞/集落悬浮液转移到离心管中。允许悬浮液中的集落沉降到管的底部，小心除去上清液，然后加入MC-ES培养基以重新悬浮集落。在检查过集落的大小以后，通过缓慢地上下吸打将任何非常大的集落打散成较小尺寸。将适当大小的集落接种在基质胶涂覆的塑料培养盘上，其在传代培养之前具有大约3-6倍的基础面积。

可用于培养本发明的从人体出生后组织中存在的未分化的干细胞诱导的人类多能干细胞的培养基的例子包括但不限于：ES培养基、适于培养人类ES细胞的培养基如MEF条件化的ES培养基(MC-ES)或本文描述的其他培养基，例如mTeSR^TM。在一些实施例中，如本文所述，细胞在ROCK抑制剂存在的情况下维持。

IV.诱导的细胞的分析

可以分析由基于形态特征最初识别的那些细胞集落传代培养的细胞集落与多能干细胞相关的多种性质中的任意一种，包括但不限于：碱性磷酸酶活性的表达、ES细胞标志物基因的表达、蛋白标志物的表达、与亲代细胞相关的Oct3/4和Nanog启动子的低甲基化、长期自我更新、正常双倍体染色体组型和形成包含外胚层、中胚层和内胚层组织的畸胎瘤的能力。

用于检测细胞中(例如在固定的细胞或活细胞中)的碱性磷酸酶活性的多种分析方法和试剂是本领域已知的。在示例性的实施方式中，在室温下使用10％福尔马林中性缓冲液固定待分析的集落大约5分钟，例如2-5分钟，然后使用PBS清洗。然后加入碱性磷酸酶的显色底物，由Pierce(Rockford，IL)生产的一步型BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸对甲苯胺盐)和NBT(氯化硝基四氮唑兰)，并在室温下反应20-30分钟。将具有碱性磷酸酶活性的细胞染为蓝-紫色。

然后可以分析用于测试碱性磷酸酶活性的假定iPSC细胞集落的一系列人类胚胎干细胞标志物(ESCM)基因的表达，包括但不限于Nanog、TDGF1、Dnmt3b、Zfp42、FoxD3、GDF3、CYP26A1、TERT、Oct3/4、Sox2、Sall4和HPRT。参见例如Assou等人(2007)，Stem Cells，25：961-973。许多用于基因表达分析的方法是本领域已知的。参见例如Lorkowski等人(2003)，Analysing Gene Expression，A Handbook ofMethods：Possibilities and Pitfalls，Wiley-VCH。合适的基于核酸的基因表达分析的例子包括但不限于：定量RT-PCR(qRT-PCR)、微阵列杂交、斑点印迹、RNA印迹、RNAse保护和SAGE。

在一些实施方式中，通过qRT-PCR确定假定的iPS细胞集落中ESCM基因mRNA表达水平的程度。收获假定的iPS细胞集落，并使用“用于甲醛或多聚甲醛固定的、石蜡包埋的(FFPE)组织的Recoverall总核酸分离试剂盒(Recoverall total nucleic acid isolationkit for formaldehyde-or paraformaldehyde-fixed，paraffin-embedded(FFPE)tissue)”(由Ambion制造，Austin，TX)提取总RNA。在一些情况下，用于RNA提取的集落为固定的集落，例如已测试其碱性磷酸酶活性的集落。集落可直接用于RNA提取，即不需要预先固定。在示例性的实施方式中，从提取的RNA合成cDNA之后，使用

PreAmp mastermix(由Applied Biosystems制造，Foster City，CA)进行目标基因的扩增。使用ABI Prism 7900HT进行实时定量PCR，并使用以下用于检测上述ESCM基因的mRNA的PCR引物组(来自Applied Biosystems)：Nanog，Hs02387400_g1、Dnmt3b，Hs00171876_m1、FoxD3，Hs00255287s_1、Zfp42、Hs01938187_s1、TDGF1，Hs02339499_g1、TERT，Hs00162669_m1、GDF3，Hs00220998_m1、CYP26A1，Hs00175627_m1、GAPDH，Hs99999905_m1)。

可以通过免疫细胞化学方法来分析假定的iPS细胞集落的蛋白标志物的表达，包括但不限于：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、CD9、CD24、Thy-1和Nanog。大量免疫细胞化学分析方法(例如荧光免疫细胞化学分析)是已知的，如描述在例如Harlow等人(1988)，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY，353-355，并且还可参见TheHandbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR，(2004)中。

在示例性的实施方式中，在假定的iPS细胞集落中一种或多种上述蛋白标志物的表达根据以下方式进行分析。使用10％甲醛固定培养的细胞10分钟，并在室温下用0.1％明胶/PBS封闭约1小时。细胞在4℃下与抗SSEA-3(MC-631；Chemicon)、SSEA-4(MC813-70；Chemicon)、TRA-1-60(ab16288；abcam)、TRA-1-81(ab16289；abcam)、CD9(M-L13；R&D systems)、CD24(ALB9；abcam)、Thy1(5E10；BDBioscience)或Nanog(MAB 1997；R&D Systems)的初级抗体一起孵育过夜。对于Nanog染色而言，细胞在封闭之前使用0.1％TritonX-100/PBS渗透。使用PBS洗涤细胞集落三次，然后在室温下与AlexaFluor 488偶联的二级抗体(Molecular Probes)和Hoechst 33258(Nacalai)一起孵育1小时。在进一步洗涤之后，使用荧光显微镜(例如Axiovert 200M显微镜(Carl Zeiss))检测荧光。

可在活细胞中分析iPSC集落中胚胎干细胞(ESC)标志物基因的表达，其提高了识别进行根据本文描述的诱导方法后的iPSC集落的效率。可用于识别诱导的干细胞集落的ESC标志物基因的例子包括例如Oct3/4、Nanog、Klf4、Lin28、Sox2、c-Myc或TERT。在一些实施方式中，在活细胞中检测一种或多种这些基因的mRNA。在其他实施方式中，检测两种或多种ESC标志物基因的mRNA。在一个方法中，细胞与同其杂交的并指示一种或多种干细胞标志物基因存在的一种或多种分子信标探针接触。分子信标(MB)为形成茎环结构的单链寡核苷酸杂交探针。环包含与目标序列互补的探针序列，而茎是通过位于探针序列每一侧上的互补臂序列的退火而形成的。荧光团与一个臂的末端共价连接，而猝灭剂与另一臂的末端共价连接。当在溶液中游离时，MB不会发荧光。但是，当它们与目标序列杂交时，它们会发生使其能够明显地发出荧光的构象改变。取决于目标探针序列的GC含量，探针序列的长度可为约15-约30个核苷酸。一般而言，目标探针序列的GC含量应该为约40-约60％。侧翼茎序列可为约5-约7个核苷酸，其GC含量为约75-约100百分比。MB的设计以及使用它们来检测活细胞中的mRNA的表达是本领域已知的，如描述在例如Rhee等人(2008)，Nuc Acid Res，36(5)：e30中。可用于确定MB双链体和MB/目标双链体的解链温度的算法是本领域已知的。参见例如描述在Zucker(2003)，Nuc Acids Res 31(13)：3406-3415中的″Mfold″算法，其可从网络服务器：frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/dna-forml.cgi公开获得。还可以参见以下地址的Hyther服务器：ozone3.chem.wayne.edu/。在这些算法中使用的典型参数为：信标和目标核酸的浓度为200nM，折叠温度为37℃，离子条件为10mMKCl和5mM MgCl₂。在开始诱导以后，待评估的iPSC集落可接触约14天-约50天，例如诱导后14天-21天、14天-28天、20天-45天、25天-40天、30天-35天、30天-50天。优选地，细胞与能够可靠地检测信号所允许的尽量低浓度的MB接触尽量短的时间。在一些实施方式中，MB的浓度为约0.1μM-约5μM(对于各MB而言)，例如0.1μM-0.5μM、0.2μM-1μM、0.5μM-2μM或3μM-5μM。与MB一起孵育的时间为约5分钟-约2小时，例如15分钟-30分钟、20分钟-1小时、30分钟-1.5小时、45分钟-2小时，或约5分钟-2小时之间的任何其他时间。在一些情况下，在不使用转染试剂的情况下将MB引入细胞中。在其他情况下，使用优化用于寡核苷酸转染的转染试剂，例如

oligo转染试剂盒或本领域已知的任何其他转染试剂。在其他情况下，使用链球菌溶血素-O瞬时地渗透细胞以使得MB进入细胞中。该方法描述在例如Rhee等人，同上，和Santangelo等人(2004)，Nuc Acids Res，32(6)：e57中。

在一些情况下，将MB加入粘附细胞培养中，且如上所述从基质中摘取发现一种或多种ESC标志物基因的表达为阳性的细胞集落。在其他情况下，向悬浮液中的iPSC加入MB，且通过FACS或任何其他基于荧光的分选方法来选择ESC阳性细胞。可选地，向粘附iPSC加入MB，其随后在FACS选择之前分散。使用FACS选择iPSC对于高通量产生iPSC系和iPSC系的组是特别有用的。

A.甲基化分析

在一些实施方式中，iPSC的特征为相对于它们的亲代细胞而言，Oct3/4和Nanog的基因组启动子的甲基化降低。待分析的合适的Oct3/4启动子区域包括但不限于：包含保守区域1(CR1)的Oct3/4近端启动子和包含CR4的Oct3/4启动子远端增强子。待分析的合适的Nanog启动子区域包括但不限于：包含Oct3/4和Sox2结合位点的Nanog近端启动子。参见例如Rodda等人(2005)，J Biol Chem，280：24731-24737和Yang等人(2005)，J Cell Biochem，96：821-830。用于基因组DNA的定量分析的许多方法是已知的，如描述在例如Brena等人(2006)，J Mol Med，84(5)：365-377中。在示例性的实施方式中，从假定的iPSC和用于对比的细胞分离的基因组DNA被分离，并用重亚硫酸盐处理。然后使用包含T7启动子序列的引物对重亚硫酸盐处理的基因组DNA进行PCR扩增。然后，使用T7聚合酶产生RNA转录本，然后再用RNAse A处理以产生甲基化特异性的切割产物。通过切割产物的MALDI-TOF质谱来评估单个CpG位点的甲基化。该方法的具体描述提供在例如，Ehich等人(2005)，Proc Natl AcadSci USA，102：15785-15790中。

B.自我更新分析

干细胞的一个特性是它们连续增殖而不发生衰老的能力。因此，在体外评估iPSC连续传代的能力。在一些情况下，在体外测定iPSC传代至少约30-至少约100次的能力，例如约33、35、40、45、51、56、60、68、75、80、90、93、100代或至少约30-至少约1oo代之间的任意其他代数。

在另一评价中，分析iPSC从亲代细胞中IF的强制表达开始增殖约30天-约500天的时间的能力，例如从亲代细胞中IF的强制表达开始40天、50天、60天、70天、80天、100天、150天、180天、200天、250天、300天、400天、450天或约30天-约500天之间的任意其他时间。在一些实施方式中，iPSC的长期自我更新在细胞在限定的培养基(例如mTeSRl培养基)中和在不存在饲养层细胞的情况下传代时(例如如本文所述的mTeSRl培养基)测定。在其他实施方式中，细胞在如本文所述的MC-ES培养基中传代。

C.染色体组型分析

作为另一可能的分析，评估iPSC的二倍性和正常的、稳定的染色体组型，例如当细胞已经在体外传代至少一年以后稳定。许多染色体组型分析方法是本领域已知的。在一些实施方式中，染色体组型分析方法是如描述在例如Bayani等人(2004)，Curr Protoc Cell Biol，Chapter 22：Unit 22.5中的多色FISH法。在其他实施方式中，染色体组型分析包括如描述在例如Vermeesch等人(2007)，Eur J Hum Genet，15(11)：1105-1114中的分子染色体组型分析。在示例性的实施方式中，使用0.02μg/ml的colecemid预处理iPSC约2-约3小时，使用约0.06-约0.075M KC l孵育约20分钟，然后再使用卡诺依氏固定液(Carnoy′s fixative)进行固定。然后，对于多色FISH分析，使用多色FISH探针杂交细胞，例如来自Cambio，Ltd(Cambridge，UK)的

Human Multicolour FISH(M-FISH)试剂盒中的那些多色FISH探针。

D.畸胎瘤分析

通常认为，当注射到免疫受损动物中时，多能干细胞具有形成包含外胚层、中胚层和内胚层组织的畸胎瘤的能力。诱导的细胞或诱导的多能干细胞(iPS)或ES细胞样多能干细胞可以指具有体外长期自我更新能力和分化为三个胚层的多能性的细胞，且当移植到测试动物(例如小鼠)中时所述多能干细胞可形成畸胎瘤。

可在免疫受损动物模型中的畸胎瘤形成分析中评估iPSC的多能型。免疫受损动物可为施用免疫抑制剂(例如环孢菌素或FK-506)的啮齿动物。例如，免疫受损动物模型可为SCID小鼠。可向7-8周龄的免疫受损动物的睾丸髓质中注射约0.5x 10⁶-约2.0x 10⁶的iPSC/小鼠，例如0.6x10⁶、0.8x 10⁶、1.0x 10⁶、1.2x 10⁶、1.5x 10⁶、1.7x 10⁶或约0.5x 10⁶-约2.0x 10⁶iPSC/小鼠之间的其他数目的iPSC。约6-约8周后，在使用PBS、再用10％的缓冲福尔马林灌注动物后，切除畸胎瘤。然后对切除的畸胎瘤进行免疫组织学分析。区分人类畸胎瘤组织和宿主(例如啮齿动物)组织的一种方法包括对人类特异性的核标志物HuNu进行免疫染色。免疫组织学分析包括：确定外胚层(例如神经外胚层)、中胚层和内胚层组织的存在。外胚层组织的蛋白标志物包括但不限于：巢蛋白、GFAP和整联蛋白β1。中胚层组织的蛋白标志物包括但不限于：胶原蛋白II、Brachyury和骨钙素(osteocalcin)。内胚层组织的蛋白标志物包括但不限于：甲胎蛋白(αFP)和HNF3β。

E.全基因表达

在一些实施方式中，在假定的iPS细胞集落中进行全基因表达分析。这种全基因表达分析可包括将假定的iPS细胞集落的基因表达谱与一种或多种细胞类型的基因表达谱进行对比，所述细胞类型包括但不限于：(i)亲代细胞，即由其诱导假定的iPS细胞集落的一种或多种细胞；(ii)人类ES细胞系；或(iii)已建立的iPS细胞系。如本领域已知，人类ES细胞系的基因表达数据可通过公开来源获得，例如万维网上的NCBI″Gene Expression Omnibus″数据库。参见例如Barrett等人(2007)，Nuc Acids Res，D760-D765。因此，在一些实施方式中，假定的iPS集落的基因表达谱与ES细胞系的基因表达谱的对比需要比较从假定的IPS细胞集落实验获得的数据和通过公开数据库可获得的基因表达数据。可公开获得其基因表达数据的人类ES细胞系的例子包括但不限于：hE14(GEO数据组登录号GSM 151739和GSM151741)、Sheff4(GEO登录号GSM194307、GSM194308和GSM193409)、h_ES 01(GEO登录号GSM194390)、h_ES H9(GEO登录号GSM 194392)和h_ES BG03(GEO登录号GSM 194391)。

有可能通过核酸微阵列杂交分析方法对从一种或多种iPS细胞系分离的总RNA进行分析来实现全基因表达。用于全基因表达分析的合适的微阵列平台的例子包括但不限于：Human Genome U133plus 2.0微阵列(Affymetrix)和Whole Human Genome Oligo微阵列(Agilent)。许多用于对比基因表达谱的分析方法是已知的，如描述在例如Suarez-Farinas等人(2007)，Methods Mol Biol，377：139-152，Hardin等人(2007)，BMC Bioinformatics，8：220，Troyanskaya等人(2002)，Bioinformatics，18(11)：1454-1461和Knudsen(2002)，ABiologist′s Guide to Analysis of DNA Microarray Data，John Wiley&Sons中。在一些实施方式中，将来自通过本文描述的方法产生的细胞的基因表达数据与从其他细胞类型(包括但不限于人类ES细胞系、亲代细胞和多潜能干细胞系)获得的基因表达数据相对比。合适的统计学分析度量和方法包括但不限于：皮尔逊相关(PearsonCorrelation)、欧氏距离(Euclidean Distance)、分级群聚(HierarchicalClustering)(参见例如Eisen等人(1998)，Proc Natl Acad Sci USA，95(25)：14863-14868)和自组织特征映射(Self Organizing Maps)(参见例如Tamayo等人(1999)，Proc Natl Acad Sci USA，96(6)：2907-2912)。

F.用于分化诱导的干细胞系的方法

iPSC系可分化为不同谱系的细胞类型。分化的细胞的例子包括来自外胚层(例如神经元和成纤维细胞)、中胚层(例如心肌细胞)或内胚层(例如胰腺细胞)谱系的任何分化的细胞。分化的细胞可为胰腺β细胞、神经干细胞、神经元(例如多巴胺能神经元)、少突细胞、少突细胞祖细胞、肝细胞、肝干细胞、星形细胞、肌细胞、造血细胞或心肌细胞中的一种或多种。

源自iPSC的分化细胞可为终末分化的细胞，或者它们可能能够产生特定谱系的细胞。例如，iPSC可分化为多种多潜能细胞类型，例如神经干细胞、心脏干细胞或肝干细胞。然后干细胞可进一步分化为新的细胞类型，例如神经干细胞可分化为神经元；心脏干细胞可分化为心肌细胞；和肝干细胞可分化为肝细胞。用于分化iPSC的方法还公开在2008年6月13日提交的美国申请No.12/157,967，WSGR案卷号36588-704.201，第一发明人为Kazuhiro Sakurada；2008年6月13日提交的美国申请No.61/061,594，WSGR案卷号36588-707.101，第一发明人为Kazuhiro Sakurada；和2008年6月13日提交的美国申请No.61/061,565，WSGR案卷号36588-702.101，第一发明人为Kazuhiro Sakurada，其全部通过引用方式结合在本文中。

存在许多将iPSC分化为更加特化的细胞类型的方法。分化iPSC的方法可与用于分化其他干细胞(特别是ES细胞、MSC、MAPC、MIAMI、造血干细胞(HSC))的那些方法相似。在一些情况下，分化在活体外发生；在一些情况下，分化在体内发生。

从ES细胞产生神经干细胞的任何已知方法可用于从iPSC产生神经干细胞，参见例如Reubinoff等人(2001)Nat Biotechnol.19(12)：1134-40。例如，可通过在noggin或其他骨形态形成蛋白质拮抗剂的存在下培养作为浮动聚集体的iPSC来产生神经干细胞，参见例如Itsykson等人(2005)Mol Cell Neurosci.30(1)：24-36。在另一实施例中，可通过培养悬浮液中的iPSC以在生长因子(例如FGF-2)的存在下形成聚集体而产生神经干细胞，Zhang等人(2001)，Nat.Biotech.(19)1129-1133。在一些情况下，在不含血清的含FGF-2的培养基中培养聚集体。在另一实施例中，在不含血清的含FGF-2的培养基存在下，iPSC与小鼠基质细胞系(例如PA6)共培养。在再另一实施例中，可直接将iPSC转移到不含血清的含FGF-2的培养基中以直接诱导分化。

源自iPSC的神经干细胞可分化为神经元、少突细胞或星形细胞。多巴胺能神经元在帕金森氏病中起到重要作用，因此是特别令人感兴趣的。为了促进分化为多巴胺能神经元，可在不含血清的条件下将iPSC与PA6小鼠基质细胞共培养，参见例如Kawasaki等人(2000)Neuron 28(1)：31-40。其他方法也进行了描述，参见例如Pomp等人(2005)，Stem Cells 23(7)：923-30；美国专利No.6,395,546。

还可以从iPSC产生少突细胞。例如，可通过将iPSC或神经干细胞与基质细胞共培养来产生少突细胞，例如Lee等人(2000)NatureBiotechnol18：675-679。在另一实施例中，可通过在融合蛋白质(其中白细胞介素(IL)-6受体或其衍生物与IL-6细胞因子或其衍生物相连)存在下培养iPSC或神经干细胞来产生少突细胞。

还可从iPSC产生星形细胞。可通过在具有bFGF和EGF的神经源性培养基存在下培养iPSC或神经干细胞来产生星形细胞，参见例如Brustle等人(1999)Science 285：754-756。

可通过本领域已知的方法将诱导的细胞分化为胰腺β细胞，例如Lumelsky等人(2001)Science 292：1389-1394；Assady等人，(2001)Diabetes 50：1691-1697；D′Amour等人(2006)Nat Biotechnol：1392-1401；D′Amour等人(2005)Nat Biotechnol 23：1534-1541。该方法可包括在补充有活化素A的无血清培养基中培养iPSC，然后在补充有全反式视黄酸的无血清培养基的存在下进行培养，再然后在补充有bFGF和烟酰胺的无血清培养基的存在下进行培养，例如Jiang等人(2007)Cell Res 4：333-444。在其他实施例中，该方法包括在无血清培养基、活化素A和Wnt蛋白质存在下培养iPSC约0.5-约6天，例如约0.5、1、2、3、4、5、6天；然后在约0.1％-约2％(例如0.2％)的FBS和活化素A的存在下培养约1-约4天，例如约1、2、3、4天；然后在2％FBS、FGF-10及KAAD-环杷明(cyclopamine)(酮式-N-氨基乙基氨基己酰基二氢肉桂酰基环杷明)和视黄酸的存在下培养约1-约5天，例如1、2、3、4或5天；然后用1％B27、γ分泌酶抑制剂和extendin-4培养约1-约4天，例如约1、2、3或4天；和最后在1％B27、extendin-4、IGF-1和HGF的存在下培养约1-约4天，例如1、2、3或4天。

肝细胞或肝干细胞可从iPSC分化。例如，在丁酸钠的存在下培养iPSC可产生肝细胞，参见例如Rambhatla等人(2003)CellTransplant 12：1-11。在另一实施例中，可通过在活化素A的存在下在不含血清的培养基中培养iPSC，然后在成纤维细胞生长因子-4和骨形态形成蛋白-2中培养细胞来产生肝细胞，例如Cai等人(2007)Hepatology 45(5)：1229-39。在示例性的实施方式中，可通过在活化素A的存在下培养iPSC约2-约6天，例如约2、约3、约4、约5或约6天，然后在肝细胞生长因子(HGF)的存在下培养iPSC约5天-约10天，例如约5、约6、约7、约8、约9或约10天，将iPSC分化为肝细胞或肝干细胞。

该方法还可以包括将iPSC分化为心肌细胞。在示例性的实施方式中，该方法包括在使得形成类胚体之前在noggin的存在下培养iPSC约2-约6天，例如约2、约3、约4、约5或约6天，并培养类胚体约1周-约4周，例如约1、约2、约3或约4周。

在其他实施例中，可通过可能在LIF的存在下培养iPSC来产生心肌细胞，或通过对它们进行本领域的其他方法以从ES细胞产生心肌细胞，例如Bader等人(2000)Circ Res 86：787-794，Kehat等人(2001)J Clin Invest 108：407-414；Mummery 等人(2003)Circulation107：2733-2740。

从iPSC产生其他细胞类型的方法的例子包括：(1)在视黄酸、白血病抑制因子(LIF)、甲状腺激素(T3)和胰岛素的存在下培养iPSC以产生脂肪细胞，例如Dani等人(1997)J.Cell Sci110：1279-1285；(2)在BMP-2或BMP-4的存在下培养iPSC以产生软骨细胞，例如Kramer等人(2000)Mech Dev 92：193-205；(3)在产生平滑肌的条件下培养iPSC，例如Yamashita等人(2000)Nature 408：92-96；(4)在β-巯基乙醇的存在下培养iPSC以产生角质形成细胞，例如Bagutti等人(1996)Dev Biol 179：184-196；Green等人(2003)Proc Natl Acad Sci USA100：15625-15630；(5)在白细胞介素-3(IL-3)和巨噬细胞集落刺激因子的存在下培养iPSC以产生巨噬细胞，例如Lieschke和Dunn(1995)Exp Hemat 23：328-334；(6)在IL-3和干细胞因子的存在下培养iPSC以产生肥大细胞，例如Tsai等人(2000)Proc Natl Acad Sci USA97：9186-9190；(7)在地塞米松和基质细胞层、干细胞因子(steel factor)的存在下培养iPSC以产生黑色素细胞，例如Yamane等人(1999)DevDyn 216：450-458；(8)在地塞米松、视黄酸、抗坏血酸、β-甘油磷酸的存在下共培养iPSC和胎鼠成骨细胞以产生成骨细胞，例如Buttery等人(2001)Tissue Eng 7：89-99；(9)在骨源因子的存在下培养iPSC以产生成骨细胞，例如Sottile等人(2003)Cloning Stem Cells 5：149-155；(10)在iPSC中共表达胰岛素样生长因子-2并在二甲亚砜的存在下培养细胞以产生骨骼肌细胞，例如Prelle等人(2000)Biochem BiophysRes Commun 277：631-638；(11)对iPSC施用用于产生白细胞的条件，例如Rathjen等人(1998)Reprod Fertil Dev 10：31-47；或(12)在BMP4以及SCF、FLT3、IL-3、IL-6和GCSF中的一种或多种存在下培养iPSC以产生造血祖细胞，例如Chadwick等人(2003)Blood102：906-915。

在一些情况下，可以纯化或分离分化细胞的亚群。在一些情况下，将对希望的细胞类型特异性的一种或多种单克隆抗体与细胞群一起孵育，并分离结合细胞的那些。在其他情况下，希望的细胞亚群表达在细胞类型特异性的启动子控制下的报告基因。

在具体实施方式中，以细胞类型特异性的方式表达潮霉素B磷酸转移酶-EGFP融合蛋白。纯化的方法包括分选细胞以选择绿色荧光细胞并根据需要重复分选过程，以获得富含以细胞类型依赖性的方式表达构建体(例如潮霉素B磷酸转移酶-EGFP)的细胞的细胞群。还可以通过负向选择具有单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦(HSVtk/GCV)自杀基因系统的增殖细胞，或通过正向选择表达双顺反子报告基因的细胞来选择理想的细胞亚群，例如Anderson等人(2007)Mol Ther.(11)：2027-2036。

G.诱导的干细胞系的组

在一些情况下，本文描述的方法利用iPSC系的组或从iPSC系分化的细胞的组。iPSC系的组包括多个iPSC系，例如满足特定选择标准的iPSC系。本文还提供了如本文所述的从iPSC系分化的细胞的组。这样的分化细胞的组包括但不限于：神经干细胞、神经元、视网膜细胞、神经胶质祖细胞、神经胶质细胞、心脏祖细胞、心肌细胞、胰腺祖细胞、胰腺β细胞、肝干细胞、肝细胞或肺祖细胞的组。在一些情况下，在产生将构成该组的iPSC系之前确定将iPSC系包括在iPSC系的组中的选择标准。在其他情况下，选择标准应用于预先产生的iPSC系，例如iPSC系的库。选择标准包括但不限于：在iPSC供体中是否存在特定的健康状况、在iPSC供体中的阳性药物响应、在iPSC供体中的阴性、阳性或不良药物响应、在iPSC系中或从iPSC系分化的细胞中是否存在特定的表型，以及在细胞系或它们的相应供体中是否存在一种或多种多态性等位基因。

在一些实施方式中，当选择标准包括是否存在一种或多种多态性等位基因时，该组包括遗传多样性的人类iPSC系，其中各iPSC系携带至少一个在该组包括的iPSC中独特的多态性等位基因，例如在iPSC系的组中独特的5-10、20-50、50-200、200-500、500-1000、1000-5000、5000-20000或20000-50000个多态性等位基因。该多态性等位基因可以包括例如SNP等位基因、启动子等位基因或编码蛋白的等位基因。可以使用多种已知基因分型分析中的任一种，通过基因分型来筛选和评分多态性等位基因。在一些情况下，基因分型分析为多重基因分型分析，例如核酸微阵列分析平台，如“SNP芯片”。在一些情况下，一种或多种多态性等位基因是预先选择的。在一些实施方式中，一种或多种预先选择的等位基因为与健康状况或健康状况的倾向相关的多态性等位基因。与健康状况或健康状况的倾向相关的多态性等位基因的例子包括但不限于与神经变性疾病、神经障碍、眼疾病、情结障碍、呼吸道疾病、心血管疾病、免疫疾病、血液疾病、代谢障碍或药物敏感性状况相关的多态性等位基因。与健康状况相关的多态性等位基因的一些例子提供在以上表3中。多态性等位基因可包括编码的蛋白质中的多态性等位基因，或影响编码的蛋白质表达的调控序列。在一些情况下，编码的蛋白质为药物靶点。药物靶点蛋白质的例子包括但不限于GPCR、离子通道、激酶、酶和转录因子。

在其他实施方式中，一种或多种多态性等位基因是基于在基因组中存在高度的周围连锁不平衡(surrounding linkage disequilibrium)而预先选择的，这已被认为是很可能影响许多常见健康状况的基因组基因座的标志。用于识别具有高周围连锁不平衡的SNP和靠近该SNP的基因的方法描述在例如Wang等人(2006)，Proc Natl Acad SciUSA，103(1)：135-140中。

在一些情况下，iPSC系的组包括从被诊断为患有一种或多种健康状况的受试者产生的iPSC系。该一种或多种健康状况可为所有iPSC供体共有的一种或多种健康状况，或它们可为在iPSC供体之间不同的健康状况。

在某些情况下，iPSC系的组包括从被诊断为具有健康状况且携带与健康状况相关的多态性等位基因(例如与被诊断的健康状况相关的多态性等位基因)的受试者产生的iPSC系。

iPSC系的组可以包括来自至少约10个个体-至少约50,000个个体的iPSC系，例如10-50、20-100、50-250、100-1000、250-2000、500-5000、1000-10,000、2500-20,000、10,000-30,000、20,000-40,000或30,000-50,000个个体。

iPSC系的组可包括来自两个民族的iPSC系，例如3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30或50个民族。民族的例子包括但不限于：欧洲人、日本人、中国人和尼日利亚约鲁巴人，且民族列举在表4中。

V.使用诱导的干细胞系和诱导的干细胞系的组的方法

A.概述

本文描述的iPSC系和iPSC系的组可用于多种与药物发现和开发相关的方法中。通常，候选药物化合物在评估在患者群中表达的仅单个或非常少的药物靶点序列变异体的生化分析(例如受体结合分析)中进行评价。因此，这样的分析提供了很少的关于候选药物化合物可能在表达与最初筛选的药物目标等位基因不同的药物目标等位基因的患者中效力如何的信息。关于同一问题，候选药物化合物通常在一种或少量被工程化以表达药物靶点的特定等位基因的细胞系中进行功能性细胞筛选，同样不仅忽视了人类患者群相对于药物靶点本身而且相对于各种不同下游信号转导蛋白质(在细胞对药物的响应终点起作用的蛋白质)的遗传多样性。同样地，候选药物化合物的副作用(例如肝毒性)通常在近交动物模型中评价，这很可能不能针对人类患者群的不同部分提供相应的信息。与此相反，在如本文所述的遗传多样性的iPSC系的组中进行药物筛选解决了在流行的药物筛选模型中缺乏遗传多样性的问题。

如本文所述的遗传多样性的iPSC系(例如人类iPSC系)的组或如本文所述的从遗传多样性的iPSC系的组分化的细胞可用于识别作用于目标药物靶点的化合物。在一些实施方式中，iPSC细胞系的组包括足够数目的iPSC系，从而该组中表现出药物靶点(例如GPCR、离子通道或激酶)的至少两个，例如至少3、5、10、20、50、100或200个多态性等位基因。在一些实施方式中，iPSC系的组源自被诊断为具有健康状况或被识别为具有健康状况的倾向的受试者。在其他实施方式中，iPSC系的组包括各具有至少一个与健康状况或健康状况的倾向相关的多态性等位基因的iPSC系。

许多健康状况的药物靶点是已知的。这类药物靶点可以包括但不限于：受体、GPCR、生长因子受体、神经递质受体、离子通道、酶、蛋白激酶、蛋白酶、细胞骨架蛋白和转录因子。可以通过本领域已知的多种分析方法来测定测试化合物对药物靶点的作用。这样的分析包括基于细胞的分析，包括但不限于用于确定第二信使水平(例如细胞内钙、cAMP、cGMP、花生四烯酸和肌醇磷酸)、通道电流、细胞凋亡、增殖、形态改变、粘附改变的分析。基于细胞的分析的例子包括但不限于描述在美国专利No.7,319,009、7,288,368和7,238,213中的那些分析方法。基于细胞的分析还可以包括在测试化合物的在或不存在的情况下确定细胞中一种或多种蛋白质(例如蛋白激酶、受体和转录因子)的细胞定位。还可以通过本领域已知的任何基因表达描述(profiling)方法来筛选测试化合物改变基因表达谱的能力。在一些情况下，还可以遗传修饰待筛选的细胞以表达可以表明信号途径的激活的一种或多种报告蛋白质。例如，可以通过本领域已知的多种方法来检测被引入细胞中的融合蛋白质之间的蛋白-蛋白相互作用，例如通过荧光共振能量转移(FRET)或酶片段互补。

在一些情况下，疾病的散发性形式的机理基础是遗传决定的细胞类型特异性的表型和后生因素(例如氧化应激)的组合。换言之，来自具有疾病(例如帕金森氏病)的散发性形式的患者的源自iPSC的分化细胞可携带对病理性或前病理性细胞表型(例如细胞凋亡)的遗传倾向，但该表型可能仅在重演了与该散发性疾病或在疾病的临床表现(线粒体功能障碍、氧化应激或亚硝基化应激)之前的细胞表型相关的环境/后生因素的适当“应激原(stressor)”存在下在体外表现出来。因此，在一些情况下，由应激原诱导疾病相关的细胞表型。应激原的例子包括但不限于：细胞氧化应激、亚硝基化应激、蛋白酶体抑制、线粒体电子传递的抑制、翻译抑制、降低的钙缓冲、高克分子渗透压浓度、热激、重金属(例如Zn、Mn、F e、Cd、Al或Pb)、蛋白错折叠。诱导、增加或来自氧化应激的试剂的例子包括但不限于：H₂O₂、抗坏血酸/FeSO₄、4-羟基壬烯醛、谷氨酸盐、红藻氨酸盐、NMDA、多巴胺、冈田酸、Aβ^1-42和异氰酸酯。蛋白酶体抑制剂包括但不限于：乳胞素、福美锌、MG132和苄氧羰基-L-异亮氨酰基-γ-叔丁基-谷氨酰基-L-丙氨酰基-L-亮氨酸缩醛(PSI)。线粒体应激原包括但不限于：鱼藤酮、3-硝基丙酸(NPA)、1-甲基-4-苯基吡啶鎓(MPP⁺)、抗霉素、百草枯、丙咪腙(methylglycoxal)和氰化物。亚硝基化应激原包括但不限于(+/-)-S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺、硝普钠和过氧化亚硝酸盐。

在一些情况下，通过表达或过表达外源野生型或突变基因和/或蛋白质来提供应激原。这样的基因的例子包括：α-突触核蛋白(α-synuclein)、β淀粉样蛋白、Aβ^1-42、Parkin、Pink1、富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)、超氧化物歧化酶(SOD)。

iPSC系或iPSC系的组中的候选药物化合物的分析可以包括确定剂量-响应。在一些实施方式中，iPSC系的剂量响应或从该iPSC系分化的一种或多种细胞类型的剂量响应表明了在相应的iPSC供体中化合物的可能效力。在一些实施方式中，iPSC系的组中对测试化合物显示出可接受的剂量-响应的iPSC系部分表明在关注的目标患者群中可接受的剂量-响应关系的预期可能性。在一些情况下，候选药物的基于细胞的分析包括：将从iPSC系的组或源自iPSC的细胞中获得的响应与一种或多种用作候选药物化合物的效果的阳性或阴性对照的参照iPSC系或细胞相对比。参照iPSC系或细胞可来自健康的iPSC供体、被诊断为具有健康状况的iPSC供体或携带与健康状况相关的多态性等位基因的iPSC供体。在其他实施方式中，在iPSC系或iPSC系的组中候选药物化合物的分析可以包括确定有效浓度、最大耐受剂量和最小有效浓度。另外的方法和分析公开在于2008年6月13日提交的、WSGR案卷号36588-707.101、第一发明人Kazuhiro Sakurada的美国申请No.61/061,594中，其通过引用结合在本文中。

在一些情况下，可在从iPSC分化的细胞上进行药物筛选。这样的分化细胞的例子描述在本文中(例如肝细胞、神经干细胞、神经元、胰腺β细胞、心肌细胞、肝干细胞、少突细胞)。药物可以靶向于治疗特定的疾病或状况，例如在本文中描述的疾病或状况。例如，iPSC可分化为多巴胺能神经元，其可用于筛选用于帕金森氏病的药物。在其他情况下，从iPSC分化的神经元或神经干细胞可用于筛选用于治疗阿尔茨海默氏病、多发性硬化症或其他神经障碍的药物。在一些情况下，iPSC可直接移植到免疫受损的动物(例如SCID小鼠)中，然后该动物用于建立模拟人类或其他动物的生理状态的体外或体内分析系统。该体外或体内分析系统可用于筛选药物(例如用于帕金森氏病的药物)，或作为识别生物学机制的手段。

当与健康状况或该健康状况的倾向相关的异常细胞表型(例如异常细胞形态、基因表达或信号传导)是已知的，但药物靶点还没有被识别出来时，测试化合物的筛选也可以在源自iPSC的细胞中进行。这样的分析可包括将来自一个或多个iPSC供体的源自iPSC的细胞的测试群与测试化合物相接触，并将来自同一个或多个iPSC供体的源自iPSC的细胞的阴性对照群与阴性对照化合物相接触。然后在测试和阴性对照群中与关注的健康状况相关的分析的细胞表型可与正常细胞表型相对比。当在测试群中的分析细胞表型被确定为与阴性对照群表现的该表型相比更接近正常细胞表型时，该候选药物化合物被确定为使该表型正常化。可在来自不具有健康状况或健康状况的倾向的iPSC供体的源自iPSC的细胞中建立相对于特定健康状况或健康状况的倾向的正常细胞表型。

可以以类似于临床试验的方式在源自iPSC的细胞的组上测试被识别为先导化合物的测试化合物。在一些情况下，在来自具有相同健康状况的患者的源自iPSC的细胞的组中确定先导化合物相对阴性对照化合物(例如安慰剂化合物)的效力。优选地，这样的源自iPSC的细胞的组来自遗传多样性的受试者。例如，这样的患者可携带至少一个在将包括在该组中的源自iPSC的细胞内独特的多态性等位基因，例如在iPSC系的组内独特的5-10、20-50、50-200、200-500、500-1000、1000-5000、5000-20000或20000-50000个多态性等位基因。用于定量群的遗传多样性的多种方法是本领域已知的，例如分子差异分析(AMOVA)和广义分子差异分析(GAMOVA)。参见例如Excoffier等人(1992)，Genetics，131：479-491；Nievergelt等人(2008)，PLOS Genetics，3(4)：e51。本领域已知的各种不同临床实验设计可用于对比先导化合物相对阴性对照化合物的效果。参见例如Chow等人(2004)″Design and Analysis of Clinical Trials：Concepts andMethodologies，″John Wiley&Sons，Inc.，Hoboken，NJ。

可以基于任何细胞响应终点来确定源自iPSC的细胞中的先导化合物的效果，例如在本文描述的任何基于细胞的分析或基因表达谱分析中所获得的响应。

在一些情况下，在源自iPSC的细胞的组上测试先导化合物的潜在副作用。源自iPSC的细胞可包括肝细胞、心肌细胞、神经元的任何细胞类型。

候选药物化合物可为选择的单个小分子(例如来自先前的药物筛选的先导化合物)，或在一些情况下，待筛选的候选药物化合物来自组合文库，即通过组合多种化学“构件(building block)”由化学合成或生物合成产生的不同化合物的集合。例如，通过以对于给定化合物长度(即多肽化合物中氨基酸的数目)的每种可能的方式组合一系列被称为氨基酸的化学构件来形成线性组合化学文库，例如多肽文库。可以通过化学构件的这种组合混合来合成数百万的化合物。事实上，从理论上来说，100个可互换的化学构件的系统的组合混合会合成1亿个四聚体化合物或100亿个五聚体化合物。参见例如Gallop等人(1994)，J.Med.Chem 37(9)，1233。组合化学文库的准备和筛选是本领域已知的。组合化学文库包括但不限于：diversomer如乙内酰脲类、苯二氮类和二肽类，如描述在例如Hobbs等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90，6909中；小化合物文库的类似有机合成，如描述在Chen等人(1994)，J.Amer.Chem.Soc，116：2661中；寡聚氨基甲酸酯(Oligocarbamate)，如描述在Cho等人(1993)，Science 261，1303中；肽基膦酸酯类(peptidyl phosphonate)，如描述在Campbell等人(1994)，J.Org.Chem.，59：658中；和包含例如噻唑酮类和metathiazanone类(美国专利No.5,549,974)、吡咯烷类(美国专利No.5,525,735和5,519,134)、苯二氮

类(美国专利No.5,288,514)的小有机分子文库。

多种组合文库可从例如ComGenex(普林斯顿，NJ)、Asinex(莫斯科，俄罗斯)、Tripos，Inc.(St.Louis，MO)、ChemStar，Ltd.(莫斯科，俄罗斯)、3D Pharmaceuticals(Exton，PA)和Martek Biosciences(哥伦比亚，MD)购得。

B.个体化的药物治疗和失败的药物“救援”

从受试者(例如人类受试者)产生的iPSC细胞系和源自iPSC的细胞可用于确定特定药物对该受试者具有充分的效力的可能性，以及如果有效的话，确定用于该受试者的适当的剂量范围。该过程示意性地显示于图3中。来自受试者的源自iPSC的细胞(例如分化的源自iPSC的细胞)可在体外接触待测试的药物，然后如本文所述测定它们对于药物的表型响应。可将源自iPSC的细胞的响应与从来自一个或多个药物已显示为有效的个体的源自iPSC的细胞获得的参照响应和/或与来自药物被发现无效的受试者的源自iPSC的细胞的参照响应相对比。在一些情况下，待测试的受试者为具有健康状况或健康状况的倾向的受试者。例如，当受试者具有健康状况且多种药物可用于治疗该健康状况时，可在来自该个体的源自iPSC的细胞中评估该多种药物的效力和副作用。优选地，用于测试药物的效力的源自iPSC的细胞包括表达至少一个药物靶点(例如神经递质受体)的细胞。在其他情况下，受试者不具有健康状况。在一个实施方式中，用于各种不同健康状况的药物优先在来自健康受试者的源自iPSC的细胞中测试以建立对于该受试者的药物-表型谱(pharmaco-phenomic profile)。接下来，可以根据需要使用药物-表型谱来选择用于治疗特定受试者的最优药物和药物剂量。

C.疾病途径和靶标发现

对于许多疾病，特别是主要具有散发形式(例如帕金森氏病)的疾病而言，先于病状和最终造成病状的基础细胞表型是未知的。事实上，对于进行性变性状况而言，很可能是在症状最初表现出来很早之前就存在致病性或预兆性的细胞表型。但是，对于许多类型的疾病而言，相关细胞(例如神经元、心肌细胞和胰腺细胞)并不能直接进行分析。因此，取决于受特定疾病影响的细胞类型，不可能来自患者的活细胞与正常受试者的活细胞进行对比以识别引起疾病或倾向导致疾病的疾病相关细胞表型。对于患者的源自iPSC的细胞和正常受试者的源自iPSC的细胞之间的可再现细胞表型差异的识别使得能够发展识别候选治疗剂的筛选分析方法。候选治疗剂为使疾病相关细胞表型正常化的那些试剂，即在源自患者的细胞中改变相关细胞表型以使其更加接近于在相同条件下源自正常受试者的细胞中的相应细胞表型。或者，治疗剂可以改变源自患者的iPSC的细胞表型，从而保护它们免受应激原的影响，如本文所述。

代表患者的源自iPSC的细胞中相对于正常受试者的源自iPSC的细胞中的各种不同细胞表型(例如线粒体ROS产生、表达谱、蛋白质聚集)的数据集构成了多维空间内的矢量，其可用于通过多变量和单变量统计方法和机械学习技术进行分析。因此，可以识别区分患者相对于正常受试者的细胞表型，例如通过单变量统计学方法，例如t-检验、ANOVA、回归以及它们的非参数模拟。在一些实施方式中，使用各种不同的统计学标准进一步过滤细胞表型数据，例如显著性的p值(1型误差)、效应大小等。通过生物途径分析进一步仔细检查在疾病与正常状态之间显著不同的细胞表型组。在许多情况下，进行途径富集分析(pathway enrichment analysis)以进一步缩小最能提供疾病信息的细胞表型组。可以使用多种统计学过程(例如超几何统计、Kolmogorov-Smirnoff检验等)进行途径富集分析。

在一些情况下，发现在患者与正常受试者之间显著不同的细胞表型(即疾病相关细胞表型)需要通过正交分析来验证。在其他情况下，通过在来自相同类型的细胞表型分析的独立数据集上进行验证/交叉验证分析来确认被识别的疾病相关细胞表型。在一些实施方式中，通过首先测定和分析仅一部分可获得的患者iPSC系和正常iPSC系，然后再在剩余的iPSC系中验证疾病相关细胞表型，来确定疾病相关的细胞表型。在其他实施方式中，当不能使用独立的iPSC系组进行疾病相关细胞表型的发现和验证时，转而使用其他统计学方法，例如k折交叉验证技术。在一些情况下，然后使用一种或多种验证的细胞表型来评估测试剂将一种或多种反映疾病状况的细胞表型转化为反映正常状况的细胞表型的能力。

当研究中的疾病为具有潜在晚发性(例如60岁或更老)的进行性状况时，选择“正常”对照受试者不是很容易的，因为通常不能预先知道谁将会发生进行性变性疾病。换言之，在特定年龄/时间点(例如当为获得iPSC衍生而进行活组织检查时)明显正常的受试者可能最终发生寻找相关的细胞表型的疾病。因此，源自这样的受试者的细胞将不会是有效的“正常”对照。因此，在一些实施方式中，不是选择年龄匹配的正常对照受试者，而是选择“老年健康(wellderly)”受试者用于获得正常对照iPSC。如本文所使用的，“老年健康”受试者是指至少80岁且不患有任何严重慢性疾病的任何受试者。选择老年健康受试者作为正常对照受试者使得在统计学上这样的个体将不太可能发生变性状况。因此，源自这类个体的iPSC不容易显示出与正在分析的疾病相关或为其预兆的细胞表型，且因此为了对比源自患者的iPSC和源自iPSC的细胞的目的提供了更为可靠的“正常对照”表型。在其他实施方式中，选择尽管不患有研究的变性疾病但可能患有其他不相关的变性疾病的老年个体用于产生对照iPSC。在其他情况下，没有待分析的疾病的年龄匹配的受试者被用于产生正常对照受试者iPSC。

在一些情况下，一旦候选治疗剂已在少量患者iPSC系以及源自其的细胞中被识别为能够有效地使细胞表型正常化，则在源自患者iPSC的细胞的较大组中测试其效力以确定候选治疗剂的效力和毒性方面的潜在差异。在一些情况下，在来自至少约20-约500个患者的iPSC或源自iPSC的细胞中测试效力，例如至少约25、30、40、50、60、70、100、200、250、300、400或至少约20-约500个患者之间的另一数目的患者。在一些实施方式中，识别了与对候选治疗剂的响应或对候选治疗剂缺乏响应相关的生物标志物，并用于将患者群分层为例如“高响应者”(HR)和“低响应者”(LR)，如图4所示。在一些情况下，使用生物标志物来识别用于候选治疗剂的临床试验的合适患者。在其他情况下，使用生物标志物来预测治疗试剂对于特定患者的反应或潜在毒性。在一些情况下，生物标志物包括基因组生物标志物(例如SNP、CNV或其他遗传多态性)。在其他情况下，生物标志物包括表达谱指纹(signature)(例如mRNA表达谱)。生物标志物可包括蛋白表达谱或甚至单个蛋白表达水平。在一些情况下，当生物标志物为表达谱生物标志物时，可从患者样品(例如血液、尿液、痰、头发、皮肤或从患者直接采集的其他生物样品)直接确定这些。在其他实施方式中，表达谱生物标志物对候选治疗剂或治疗剂在其中进行测试的患者iPSC或源自iPSC的细胞是特异性的。

因此，在一些实施方式中，iPSC源自患者和对照受试者，且iPSC分化为疾病相关的细胞类型，从而允许在源自患者的细胞中的细胞表型与源自正常受试者的细胞进行对比。例如，对比的细胞表型可包括线粒体表型，例如ATP合成、ATP/ADP比率、线粒体电位、钙缓冲、活性氧物质的产生、线粒体融合和裂变、线粒体形态和线粒体运动。在其他情况下，对比的细胞表型为特定细胞类型在应激原的存在下发生细胞凋亡的分数和速率。在一些实施方式中，细胞表型为蛋白质聚集(例如路易体(lewy body)的形成)。在其他实施方式中，在源自患者的细胞和源自正常受试者的细胞之间对比基因表达(例如微RNA表达)。

在一些情况下，构建了整合与各患者和对照iPSC系相关的多元数据流的关系数据库。这些数据包括但不限于一种或多种以下数据：患者病史和家族病史、患者医疗数据(例如血压、肝酶水平)、患者药物副作用、患者药物反应、部分或完全基因组序列、具有已知的疾病相关等位基因的所有基因的序列、全面的SNAP基因型(例如具有已知的疾病相关性的所有SNP的基因型)、基因拷贝数差异(CNV)多态性、处于静息和处于不同刺激形式(例如应激原的存在)下的iPSC和从iPSC分化的细胞(例如多巴胺能神经元、皮质神经元、运动神经元、胰腺细胞、肝细胞、心肌细胞和血管上皮细胞)的表达谱、用于最初的途径发现和用于药物筛选的所有细胞表型分析数据，包括例如在测试化合物和具有已知药理学性质的化合物(例如胆碱酯酶抑制剂、受体配体、激酶抑制剂等)存在或不存在的情况下的细胞表型数据。在一些实施方式中，使用者可以基于任何使用者限定范围的标准集来查询该数据库。例如，使用者可能希望了解与其源自iPSC的多巴胺能神经元对候选治疗剂响应或不响应的患者相关的多态性。在另一实施例中，使用者可能希望了解区分对应激原显示严重的细胞凋亡响应与显示中等细胞凋亡响应的运动神经元的共同基因表达谱，等。这些数据库对于挖掘和建立特定疾病状态和它们对候选治疗剂的响应的强预言性特征是非常有用的。

实施例

实施例1.来自患有脊髓性肌萎缩的患者的iPSC系的产生

脊髓性肌萎缩(SMA)是以运动神经元的变性为特征的神经肌肉疾病，该疾病是儿童瘫痪和死亡的最主要原因之一。该疾病显示出影响婴儿到成人的广泛严重性，并基于发作的年龄和症状的严重程度分为I-IV型：I型“婴儿型”，在0-6个月龄发作且一般是致命的；II型“中间型”，在7-15个月龄发作，不能站立或行走，但具有维持坐姿的部分能力；III型“青少年型”，在19个月-17岁的年龄发作，具有行走的部分能力，尽管可能是暂时的；IV型“成人型”，具有一些肌肉力，但其遗传学基础是未知的。

SMA的分子基础与运动神经元存活(Survival Motor Neuron，SMN)基因关联。包含SMN(运动神经元存活)基因的染色体5的区域具有大的重复。包含几个基因的大的序列出现两次，即在各相邻片段中出现一次。基因的两个拷贝(被称为SMN1和SMN2)仅具有几个碱基对的差异。SMN2基因包含出现在内含子6与外显子7的剪接点处出现的突变，造成大约90％的SMN2前mRNA转录物被剪接为不含外显子7的形式。该较短mRNA转录物编码快速降解的截短的SMN蛋白质。来自SMN2的大约10％的前mRNA转录物被剪切成编码全功能性SMN蛋白的全长转录物。尽管出于未知原因，运动神经元的存活看起来受到特别的影响，但该剪接缺陷出现在多种细胞类型中。

SMA由两个染色体的SMN1基因的缺失造成，且其严重程度(在SMA1-SMA3之间)性主要取决于SMN2^E7转录物的水平是否可以补偿包含外显子7的SMN1转录物的低水平或缺失。造成SMN1缺失的突变为两种类型。其中SMN1的两个拷贝失去的缺失突变。另一类型的突变为其中SMN1基因的两个拷贝都具有造成与SMN2基因相同的剪接模式的点突变的转换突变。作为研发用于识别可增加包含外显子7的SMN2(SMN2^E7)转录物水平的分子的体外分析的最初步骤，我们从由三个SMN1^-/-SMA患者和两个健康SMN1^-/+受试者建立的Coriell成纤维细胞系产生了几种iPSC系。

通过使用四种用于表达人类OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC的MoMLV VSV-G-假型病毒(各以约10的MOI)转导SMN1^-/-和SMN1^-/+成纤维细胞培养来开始iPSC的诱导。病毒转导五天后，将成纤维细胞从人类成纤维细胞培养基转换到人类ES细胞支持培养基中，且基于形态标准每日监测假定的iPSC集落的出现。

在大约三周后挑取原始的假定SMA-iPSC集落，并在ROCK抑制剂Y-27632(10μM，Calbiochem)的存在下克隆增殖，以获得SMN1^-/-iPSC系SM4p、SM7t和SM8c，和SMN1^-/+iPSC系SM9a和SM10d，如图5所示。如通过免疫细胞化学方法确定的，各iPSC表达多能性相关标志物，Nanog、Oct4、SSEA3、SSEA4、TRA1-60和TRA1-81(数据未显示)。Q-PCR分析显示这些iPSC系表达内源性Oct4、Sox2和Klf4，但不表达由病毒转导引入的外源性Oct4、Sox2和Klf4。此外，Q-PCR分析还表明在所有iPSC系中Nanog、SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81、DNMT3B、FOXD3、LIN28、ZNF206、LEFT2、TDGF1和TDGF2的表达(数据未显示)。重要的是，所有的SMA iPSC系能够形成如图6所示的类胚体(EB)，这表明这些系具有如iPSC所预期的良好的分化潜能。事实上，SM8c系在体外分化为外胚层、中胚层和内胚层谱系的能力通过外胚层标志物TuJ1、中胚层标志物Desmin和内胚层标志物AFP的免疫染色得到确认，如图7所示。此外，通过对Islet和Neuro-N的双重免疫标记显示，SM8c iPSC系分化为成熟的运动神经元(数据未显示)。

基于这些结果，我们得出结论，iPSC可从SMA患者产生并分化为运动神经元，如实施例2所描述的筛选分析所要求的。

实施例2.识别在患有脊髓性肌萎缩的患者的运动神经元中改善分 子和细胞疾病表型的分析

我们试图识别增加源自患有SMA的患者的运动神经元中的SMN2^E7转录物的水平的分子。原则上，可通过促进SMN2的转录、降低SMN2mRNA的降解或增加剪接成SMN2^E7mRNA的SMN2前mRNA的分数来提高SMN2^E7转录物的水平。通过首先如实施例1中所述从I型、II型和III型SMA患者产生iPS细胞系的组，然后将iPSC分化为运动神经元来获得SMA患者特异性的运动神经元。在运动神经元分化之前，建立SMA患者SMN2小基因报告iPSC系以便于读取运动神经元中SMN2^E7转录物的水平。

在获得父母知情同意之后，从约30个I型、30个II型和30个III型SMA患者(所有患者均具有SMA1^-/-基因型)以及具有SMA 1^-/+的10个年龄匹配的健康对照受试者获得直径和厚度为2-4mm的标准皮肤穿孔切片。对于待产生的各SMA-iPSC系，收集以下相应的患者信息且注释在iPSC系数据库中：疾病严重性分级(即I、II或III型)、疾病发作的年龄、患者病史、家族病史包括ALS的发病率、SMN蛋白的血液水平、SMN1和SMN2基因型、MUNE运动单位数目测定(Motor Unit Number Estimation)、Hammersmith SMA运动功能评分量表(Hammersmith SMA Functional Motor Scale ranking)、呼吸试验评估(仅对大于5岁的儿童)、症状进展评估(例如运动试验的结果是如何随时间变化的)、肌肉质量指数、迄今治疗干预的描述和治疗响应。还可以根据需求将其他数据加入到各记录中，包括例如在各种不同实验条件下(例如候选治疗化合物存在或不存在的情况下)的SMN蛋白质水平和SMN2^E7转录物水平、信息性SNP基因型、基因组序列和组织/细胞类型特异性表达特征。

活组织检查样品在4℃下，在包含KO-DMEM和补充有10％胎牛血清(FBS)、Earl′s盐、核苷、β-巯基乙醇(BME)、非必需氨基酸、谷氨酰胺和青霉素/链霉素的“活组织检查培养基”中保存长达5-7天。将活组织样品切成4-5块，然后将切块转移到60mm的培养皿中。然后将切块“夹置”在酸洗盖玻片下，并在活组织检查培养基中培养5天。接下来，将夹置的活组织检查外植体培养在包含KO-DMEM、Earl′s盐、10％FBS、谷氨酰胺、青霉素/链霉素的人类成纤维细胞(″hFib″)培养基中，且每3-4天更换培养基直到盖玻片汇合。如实施例1所述，从由各活组织样品获得的成纤维细胞产生SMAiPSC。

产生了SMN2剪接小基因报告构建体，其包含外显子6、7和8，并使用主要根据如Zhang等人(2001)，Gene Ther.，8：1532-1538和Wilson等人，Stem Cells and Development，16：1027-1041中的描述产生的SMN2启动子。SMN2报告构建体将包含DD-AmCyan1荧光蛋白报告体，以使在化合物筛选报告基因分析中的信噪比最大。DD-AmCyan1蛋白质包含条件性地破坏该蛋白质稳定性的降解(″DD″)结构域，从而在测试化合物筛选分析之前维持报告蛋白质的“背景”水平非常低。但是，在加入可选择性地结合DD结构域的细胞可渗透的“Shield1”配体(Invitrogen)后，报告蛋白质被稳定且可以因此发生累积。因此，通过几乎专门地测量在开始筛选分析之后(即在加入Shield1配体和测试化合物之后)所产生的报告蛋白质使得在测试化合物的存在或不存在下DD-AmCyan1报告体水平的潜在差异最大化。另外的报告构建体包括AmCyan1或荧光素酶作为报告体。其他构建体包括CMV启动子以驱动SMN2小基因的表达。然后将SMN2报告构建体稳定地转染到I型、II型和III型SMA-iPSC和健康对照(SMN1^WT/WT)iPSC中以分别产生不同疾病严重性背景的SMN2-报告体SMA-iPSC系和SMN2报告体对照iPSC系。最初在源自I型SMA报告体iPSC的运动神经元中进行测试化合物增加适当剪接的SMN2转录物水平的能力的初步筛选。

在第0天，胰蛋白酶处理SMN2报告SMA-iPSC的汇合10cm培养板，然后在包含KO DMEM(Invitrogen，目录#10829-018)、敲除血清替代品(Knockout Serum Replacement)(Invitrogen，目录#A1099202)、血浆蛋白(Plasmanate)(Talecris)、Glutamax(Invitrogen，目录#35050079)、非必需氨基酸(Invitrogen，目录#11140050)的类胚体(EB)培养基中进行清洗/重新悬浮。在清洗和重新悬浮之后，将细胞接种在超低粘附(ULF)6孔培养板上，并在接下来的4-5天内生长为EB。在第5天，清洗EB，温和地重新悬浮在EB培养基中，并重新接种在新的ULA 6孔培养板上，在且第8或第9天重复清洗/重新接种过程。在第11天，收集EB并重新悬浮在补充有1μM视黄酸(RA)和100nM Purmorphamine(PM)的N2基础培养基(DMEM/F12、Glutamax(Invitrogen，目录#10565)、N-2补充剂(Invitrogen，目录#17502-048)、D-葡萄糖(Sigma，目录#G8769)、抗坏血酸(Sigma，目录#A4403-100mG))中。在第14天，将EB转移到N2基础培养基+1μM RA+1μM Purmorphamine中，并重新接种在ULA 6孔培养板上(3ml EB悬浮液/孔)。

根据需要每3-5天更换补充有RA(1μM)/PM(1μM)的EB培养基，直到大致第28天。然后，通过稀释的木瓜蛋白酶处理和温和的研磨来解离EB，然后重新接种在新的ULF 6孔培养板上，接着在45分钟的时间内每10分钟温和地研磨。在解离后，收集得到的细胞悬浮液并转移到包含运动神经元成熟培养基(DMEM/F12、Glutamax、N-2补充剂(Invitrogen，目录#17502-048)、B-27补充剂(Invitrogen，目录#17504-044)、D-葡萄糖、抗坏血酸(Sigma，目录#A4403-100mG)、2ng/mL的各GDNF(R&D，目录#212-GD)、BDNF(R&D，目录#248-BD)和CNTF(R&D，目录#257-NT/CF)的50ml锥形管中。然后细胞悬浮液通过1000RPM离心5分钟成团，然后重新悬浮在运动神经元成熟培养基中，细胞浓度约为1.6x 10⁶个细胞/ml。然后将细胞悬浮液的等分样品(50μl)接种在光学级96孔板的层粘连蛋白涂覆的孔中。从第31天开始，根据培养基消耗的速度，每隔一天或每天更换一半的培养基。在开始SMN2-报告体分析之前，在运动神经元分化培养基中维持分化的培养物另外四周，以允许运动神经元群扩展和成熟。

在筛选分析开始时，在96孔板的所有孔中，在最终浓度为1μM的Shield 1的存在下孵育成熟的运动神经元(MMN)培养物。测试孔在最终浓度为50μM的来自NIH临床收集库(Clinical CollectionLibrary)(从BioFocus DPI获得)的测试化合物存在下孵育。阴性对照孔不添加测试化合物，或者与一些测试化合物溶液中存在的等浓度的载体化合物(例如DMSO)一起进行孵育。阳性对照孔在钒酸钠(50μM)的存在下孵育，其预先已显示显著地增加SMN2^E7转录物的水平(Zhang等人(2001)，Gene Therapy，8，1532-1538)。孵育24小时后，固定培养物，并进行Islet 1/2(成熟运动神经元)和Olig2(运动神经元祖细胞)的免疫荧光检测，且对Islet 1/2⁺和Olig2⁺细胞中的DD-AmCyan 1荧光水平成像和定量。在二次分析中对增加SMN2报告体水平的化合物(“候选治疗”化合物)的增加SMN2^E7转录物水平的能力和在大约两周的时间内促进SMA运动神经原存活的能力进行筛选。然后在源自另外的I型SMA SMN2-报告体iPSC系和源自II型和III型iPSC系的运动神经元上测试候选治疗化合物，以验证候选治疗化合物对来自SMA患者群中存在的不同遗传背景的运动神经元的作用。

可以预期，识别增加源自患者的运动神经元的SMN2^E7转录物净水平的化合物可能比在相对不受或较少受SMN1缺失影响的细胞类型(例如成纤维细胞)或异源细胞系中的类似分析更适合用于识别SMA的候选治疗药物。

实施例3.从具有特发性帕金森氏病和与帕金森氏病相关的基因中 的限定突变的患者产生iPSC系iPSC

帕金森氏病(PD)是老年最常见的神经变性疾病之一，影响超过65岁的人群的1-2％。临床症状包括：静息震颤、运动徐缓和僵硬。我们希望产生PD患者iPSC模型，以识别能够减缓、停止或逆转PD进展的候选治疗剂。

从得自10个没有已知的PD家族史的健康对照受试者、10个患有散发性PD的患者(患者各具有编码α-突触核蛋白(PARK1)、parkin(PARK2)、PINK1(PARK6)或LRRK2(PARK8)基因中的突变，各突变总共10个患者)的皮肤活组织样品产生iPSC系。如实施例1所述产生iPSC。然后，通过分化各患者iPSC系和对照受试者iPSC来产生多巴胺能神经元。通过酪氨酸羟化酶阳性的免疫细胞化学染色和分析分化细胞合成和释放多巴胺的能力确定多巴胺能表型。根据按照Perrier等人(2004)，Proc Natl Acad Sci USA101，12543-12548的方法分化iPSC获得多巴胺能神经元。在验证从以上各iPSC系分化的神经元的多巴胺能表型以后，在一组细胞表型分析中测试源自患者iPSC的多巴胺能神经元的培养物，并与对照受试者多巴胺能神经元相对比。这些细胞表型分析是：对于α-突触核蛋白聚集、多巴胺能神经元细胞凋亡(TUNEL，半胱天冬酶(caspase)激活)和坏死(CytoTox-Glo)、氧化应激指标(谷胱甘肽水平、ROS和4-HNE)和线粒体功能障碍(ATP含量、膜电位、形态和钙缓冲)的分析。可以预期，散发型PD和由上述突变引起的PD将会在这些分析中的至少部分中显示出非常类似的多巴胺能细胞表型。一旦这一点确定，一种或多种PD相关的细胞表型用作筛选可逆转或改善这些细胞表型的候选治疗剂的基础。此外，可以预期，因为PD细胞表型在来自人类PD患者的疾病相关细胞(多巴胺能神经元)中被识别，它们的预测价值和开发治疗剂的可靠性将会比基于异源分析模型的那些更加有利。

尽管本文已经显示和描述了本发明的优选实施方式，本领域普通技术人员很清楚，这些实施方式仅是示例性的。在不偏离本发明的情况下，多种变型、改变和替换是本领域普通技术人员很容易想到的。应该明白，可以使用本文所述的本发明的实施方式的不同替代方式。应该理解，以下权利要求限定了本发明的范围，因而在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物也包括在本发明的范围内。

Claims (114)

1.一种用于识别纠正与健康状况或健康状况的倾向相关的表型的试剂的方法，包括：

(i)将来自诱导的人多能干细胞系的细胞或从诱导的人多能干细胞系分化的细胞的第一群与候选试剂相接触；

(ii)将来自诱导的人多能干细胞系的细胞或从诱导的人多能干细胞系分化的细胞的第二群与阴性对照试剂相接触；

(iii)在所述接触步骤后分析所述第一群和所述第二群的表型；和

(iv)如果在所述接触步骤后所述第一群的分析表型比在所述接触步骤后所述第二群的表型更接近正常表型，则确认所述候选试剂纠正所述表型；

其中诱导的人多能干细胞的所述第一和第二群中的细胞：

(a)包含至少一个与所述健康状况或所述健康状况的倾向相关的内源等位基因；或

(b)是由具有所述健康状况或所述健康状况的倾向的受试者产生的。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述健康状况为神经变性疾病、神经障碍、情结障碍、心血管疾病、代谢障碍、呼吸道疾病、药物敏感性状况、眼疾病、免疫疾病或血液疾病。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞的第一和第二群为从诱导的人多能干细胞系分化的细胞。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述分化的细胞为神经干细胞、神经元、心肌细胞、肝干细胞或肝细胞。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述表型为细胞凋亡、细胞内钙水平、钙流、蛋白激酶活性、酶活性、细胞形态、受体活化、蛋白质运输、细胞内蛋白质聚集、细胞器组成、运动性、细胞间通讯、蛋白表达或基因表达。

6.如权利要求1所述的方法，进一步包括将所述诱导的人多能干细胞系基因组中存在的多个多态性等位基因与产生所述诱导的多能干细胞系的该人以外的人的基因组中存在的多个多态性等位基因相对比。

7.如权利要求1所述的方法，还包括就多个多态性对所述诱导的人多能干细胞系进行基因分型。

8.如权利要求1所述的方法，还包括将所述诱导的人多能干细胞系的基因组序列或其部分与产生所述诱导的多能干细胞系的该人以外的人的基因组序列或其部分相对比。

9.如权利要求1所述的方法，还包括测序所述诱导的人多能干细胞系的基因组。

10.一种用于识别诊断性细胞表型的方法，包括将在来自具有健康状况的受试者的第一组细胞中确定的至少一种表型与在来自没有该健康状况的受试者的第二组细胞中确定的该至少一种表型相对比，和如果在所述第一组细胞中确定的所述至少一种表型不同于在所述第二组细胞中确定的所述至少一种表型，则表明所述至少一种表型为诊断性表型，其中所述第一和第二组细胞为诱导的多能干细胞或为从诱导的多能干细胞分化的细胞，和其中所述对比在计算机上进行。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述第一和第二组细胞为从诱导的多能干细胞分化的细胞。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述分化的细胞包括神经元、心肌细胞或肝细胞。

13.如权利要求10所述的方法，还包括确定所述第一或第二组细胞中的该至少一种表型。

14.如权利要求10所述的方法，其中所述至少一种表型包括基因表达谱。

15.一种用于在受试者中确定健康状况的风险的方法，包括：

(i)将在来自该受试者的第一组细胞中确定的至少一种表型与在来自没有该健康状况的受试者的第二组细胞中确定的该至少一种表型及在来自具有该健康状况的受试者的第三组细胞中确定的该至少一种表型相对比；和

(ii)如果在所述第一组细胞中确定的所述至少一种表型与在所述第二组细胞中确定的所述至少一种表型相比更类似于在所述第三组细胞中确定的所述至少一种表型，则表明所述受试者处于所述健康状况的高风险中，其中所述第一、第二和第三组细胞为诱导的多能干细胞或为从诱导的多能干细胞分化的细胞，和其中所述对比在计算机上进行。

16.一种用于在人类受试者中降低药物毒性的风险的方法，包括：

(i)将从所述受试者产生的诱导的多能干细胞系分化的一种或多种细胞与一剂药理学试剂相接触；

(ii)对所述接触的一种或多种分化的细胞进行毒性分析；和

(iii)如果且仅当在所述接触的细胞中毒性分析为阴性，则向所述受试者指定或施用所述药理学试剂。

17.如权利要求15所述的方法，其中从所述诱导的多能干细胞系分化的所述一种或多种细胞包括一种或多种肝细胞、心肌细胞或神经元。

18.如权利要求15所述的方法，其中从所述诱导的多能干细胞系分化的所述一种或多种细胞包括一种或多种肝细胞。

19.如权利要求15所述的方法，其中所述分析步骤包括测定细胞凋亡、细胞内钙水平、钙流、蛋白激酶活性、酶活性、细胞形态、蛋白质运输、细胞内蛋白质聚集、细胞器组成、运动性、离子通道电流、细胞间通讯、蛋白表达、基因表达、线粒体跨膜电势、细胞色素C氧化酶易位、P450酶同种型活性或P450酶同种型表达水平。

20.如权利要求15所述的方法，还包括将所述诱导的人多能干细胞系的基因组中存在的多个多态性等位基因与产生所述诱导的多能干细胞系的该人以外的人的基因组中存在的多个多态性等位基因相对比。

21.如权利要求15所述的方法，还包括就多个多态性对所述诱导的人多能干细胞系进行基因分型。

22.如权利要求15所述的方法，还包括将所述诱导的人多能干细胞系的基因组序列或其部分与产生所述诱导的多能干细胞系的该人以外的人的基因组序列或其部分相对比。

23.如权利要求1所述的方法，还包括测序所述诱导的人多能干细胞系的基因组。

24.一种用于识别导致人类疾病的候选基因的方法，包括将

(i)来自多个健康个体的分化的细胞类型的培养的人类细胞的全基因表达谱与

(ii)来自患有所述人类疾病的多个个体的分化的细胞类型的培养的人类细胞的全基因表达谱

相对比；和

识别在(i)和(ii)中具有不同表达水平的一个或多个基因作为导致所述人类疾病的候选基因，其中所述对比在计算机上进行。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述分化的细胞类型包括神经元细胞类型、神经胶质细胞类型、心脏细胞类型、肝细胞类型、肺细胞类型或胰腺细胞类型。

26.如权利要求24所述的方法，还包括确定(i)或(ii)。

27.如权利要求24所述的方法，其中所述健康状况为神经变性疾病、神经障碍、眼疾病、情结障碍、呼吸道疾病、心血管疾病、免疫疾病、血液疾病、代谢障碍或药物敏感性状况。

28.如权利要求24所述的方法，还包括改变所述一个或多个识别的候选基因在如下细胞中的表达水平：

(i)从诱导的人多能干细胞系分化的细胞，其包含与健康状况或健康状况的倾向相关的至少一个内源等位基因；或

(ii)从诱导的人多能干细胞系分化的细胞，其中所述诱导的人多能干细胞系是从被诊断为具有健康状况的受试者产生的。

29.如权利要求24所述的方法，其中所述多个健康个体包括至少100个个体，和所述具有所述健康状况的多个个体包括至少100个个体。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述多个健康个体包括至少500个个体，和所述具有所述健康状况的多个个体包括至少500个个体。

31.如权利要求29所述的方法，其中所述多个健康个体和所述具有所述健康状况的多个个体具有类似的人口构成。

32.从被诊断具有健康状况的受试者产生的诱导的人多能干细胞系。

33.如权利要求32所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述健康状况为神经变性疾病、神经障碍、眼疾病、情结障碍、呼吸道疾病、心血管疾病、免疫疾病、血液疾病、代谢障碍或药物敏感性状况。

34.如权利要求33所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述健康状况为神经变性疾病、神经障碍或情结障碍。

35.从权利要求34所述的诱导的人多能干细胞分化的神经干细胞或神经元。

36.如权利要求33所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述健康状况为心血管疾病。

37.从权利要求36所述的诱导的人多能干细胞分化的心脏祖细胞或心肌细胞。

38.如权利要求33所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述健康状况为代谢障碍。

39.如权利要求33所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述健康状况为药物敏感性状况。

40.如权利要求39所述的诱导的人多能干细胞系，其中与所述健康状况或健康状况的倾向相关的所述内源等位基因为细胞色素P450同种型等位基因。

41.从权利要求39所述的诱导的人多能干细胞分化的肝干细胞或肝细胞。

42.通过权利要求32所述的人多能干细胞分化产生的分化的细胞。

43.如权利要求42所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为神经干细胞或神经元。

44.如权利要求42所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为神经胶质祖细胞或神经胶质细胞。

45.如权利要求42所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为心脏祖细胞或心肌细胞。

46.如权利要求42所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为胰腺β细胞或胰腺祖细胞。

47.如权利要求42所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为肝干细胞或肝细胞。

48.如权利要求42所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为肺祖细胞或肺细胞。

49.包含权利要求42所述的分化的细胞的非人嵌合体哺乳动物。

50.通过权利要求32所述的人多能干细胞分化产生的分化的细胞。

51.一种诱导的人多能干细胞系，包含与健康状况或健康状况的倾向相关的至少一种内源等位基因。

52.如权利要求51所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述与健康状况相关的至少一种内源等位基因包括单核苷酸多态性等位基因、启动子等位基因或编码蛋白质的等位基因。

53.如权利要求51所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述健康状况为神经变性疾病、神经障碍、眼疾病、情结障碍、呼吸道疾病、心血管疾病、免疫疾病、血液疾病、代谢障碍或药物敏感性状况。

54.如权利要求53所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述健康状况为神经变性疾病、神经障碍或情结障碍。

55.从权利要求54所述的诱导的人多能干细胞系分化的神经干细胞或神经元。

56.如权利要求53所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述健康状况为心血管疾病。

57.从权利要求56所述的诱导的人多能干细胞分化的心脏祖细胞或心肌细胞。

58.如权利要求53所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述健康状况为代谢障碍。

59.如权利要求58所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述健康状况为药物敏感性状况。

60.如权利要求59所述的诱导的人多能干细胞系，其中与所述健康状况或健康状况的倾向相关的所述内源等位基因为细胞色素P450同种型等位基因。

61.从权利要求59所述的诱导的人多能干细胞分化的肝干细胞或肝细胞。

62.通过权利要求51所述的人多能干细胞分化产生的分化的细胞。

63.如权利要求62所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为神经干细胞或神经元。

64.如权利要求62所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为神经胶质祖细胞或神经胶质细胞。

65.如权利要求62所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为心脏祖细胞或心肌细胞。

66.如权利要求62所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为胰腺β细胞或胰腺祖细胞。

67.如权利要求62所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为肝干细胞或肝细胞。

68.如权利要求62所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为肺祖细胞或肺细胞。

69.包含权利要求62所述的分化的细胞的非人嵌合体哺乳动物。

70.如权利要求51所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述诱导的人多能干细胞系为雄性的。

71.如权利要求51所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述诱导的人多能干细胞系为雌性的。

72.包含来自具有与神经变性疾病、神经障碍或情结障碍相关的至少一种内源等位基因的受试者或来自被诊断为患有神经变性疾病、神经障碍或情结障碍的受试者的神经干细胞或神经元的分离的人类细胞群。

73.用于产生权利要求72所述的分离的人类细胞群的方法，包括从所述人类受试者产生诱导的多能干细胞系。

74.如权利要求73所述的方法，还包括就是否存在所述的至少一种内源等位基因对所述人类受试者进行基因分型。

75.如权利要求73所述的方法，还包括将所述诱导的多能干细胞系分化为包含神经元的细胞群。

76.如权利要求72所述的方法，其中所述人类受试者具有所述的至少一种内源等位基因。

77.如权利要求72所述的方法，其中所述人类受试者被诊断为患有所述神经变性疾病、神经障碍或情结障碍。

78.包含权利要求72所述的分离的人类细胞群的非人嵌合体哺乳动物。

79.包含来自具有与心血管疾病相关的至少一种内源等位基因的受试者或来自被诊断为患有心血管疾病的受试者的人心脏祖细胞或心肌细胞的分离的人类细胞群。

80.用于产生权利要求79所述的分离的人类细胞群的方法，包括从所述人类受试者产生诱导的多能干细胞系。

81.如权利要求80所述的方法，还包括就是否存在所述的至少一种内源等位基因对所述人类受试者进行基因分型。

82.如权利要求80所述的方法，还包括将所述诱导的多能干细胞系分化为包含心脏祖细胞或心肌细胞的细胞群。

83.如权利要求79所述的方法，其中所述人类受试者具有所述的至少一种内源等位基因。

84.如权利要求79所述的方法，其中所述人类受试者被诊断为患有所述心血管疾病。

85.包含权利要求79所述的分离的人类细胞群的非人嵌合体哺乳动物。

86.包含来自具有与药物敏感性状况相关的至少一种内源等位基因的受试者或来自被诊断为具有药物敏感性状况的受试者的肝干细胞或肝细胞的分离的人类细胞群。

87.用于产生权利要求86所述的分离的人类细胞群的方法，包括从所述人类受试者产生诱导的多能干细胞系。

88.如权利要求87所述的方法，还包括就是否存在所述的至少一种内源等位基因对所述人类受试者进行基因分型。

89.如权利要求87所述的方法，还包括将所述诱导的多能干细胞系分化为包含肝干细胞或肝细胞的细胞群。

90.如权利要求86所述的分离的人肝干细胞或肝细胞，其中与药物敏感性状况相关的所述内源等位基因为细胞色素P450同种型等位基因。

91.包含权利要求86所述的肝干细胞或肝细胞群的非人嵌合体哺乳动物。

92.如权利要求86所述的方法，其中所述人类受试者具有所述的至少一种内源等位基因。

93.如权利要求86所述的方法，其中所述人类受试者被诊断为具有所述药物敏感性状况。

94.一组遗传多样性的诱导的人多能干细胞系，包含从多个个体产生的诱导的人多能干细胞系，其中所述多个个体各携带在所述多个个体中独特的至少一个多态性等位基因。

95.如权利要求94所述的组，其中所述至少一个多态性等位基因包括至少50个多态性等位基因。

96.如权利要求95所述的组，其中所述至少50个多态性等位基因包括至少500个多态性等位基因。

97.如权利要求94所述的组，其包含从至少50个个体产生的诱导的人多能干细胞系。

98.如权利要求94所述的组，其包含从至少250个个体产生的诱导的人多能干细胞系。

99.如权利要求94所述的组，其包含从至少1000个个体产生的诱导的人多能干细胞系。

100.如权利要求94所述的组，其中所述多个个体包括至少两个民族的个体。

101.如权利要求94所述的组，其中所述至少一种多态性包括与健康状况或健康状况的倾向相关的多态性。

102.如权利要求100所述的组，其中所述健康状况为神经变性疾病、神经障碍、眼疾病、情结障碍、呼吸道疾病、心血管疾病、免疫疾病、血液疾病、代谢障碍或药物敏感性状况。

103.如权利要求94所述的组，其中所述至少一种多态性包括与至少三种健康状况相关的多态性、与健康状况的倾向相关的多态性或其任意组合。

104.如权利要求103所述的组，其中所述至少三种健康状况选自神经变性疾病、神经障碍、情结障碍、心血管疾病、代谢障碍、药物敏感性状况、眼疾病、呼吸道疾病、免疫疾病或血液疾病。

105.如权利要求94所述的组，其中所述至少一个多态性等位基因包括单核苷酸多态性等位基因、启动子等位基因或编码蛋白质的等位基因。

106.如权利要求94所述的组，其中所述多个个体具有一种或多种健康状况。

107.如权利要求106所述的组，其中所述一种或多种健康状况包括神经变性疾病、神经障碍、情结障碍、心血管疾病、代谢障碍、药物敏感性状况、眼疾病、呼吸道疾病、免疫疾病或血液疾病。

108.如权利要求106所述的组，其中所述多个个体具有至少一种共同的健康状况。

109.如权利要求108所述的组，其中所述至少一种共同的健康状况包括神经变性疾病、神经障碍、情结障碍、心血管疾病、代谢障碍、药物敏感性状况、眼疾病、呼吸道疾病、免疫疾病或血液疾病。

110.包含从权利要求94所述的诱导的人多能干细胞的组分化的细胞的一组分化的人类细胞。

111.如权利要求110所述的分化的人类细胞的组，其中所述分化的人类细胞为神经干细胞、神经元、神经胶质祖细胞、神经胶质细胞、心脏祖细胞、心肌细胞、胰腺祖细胞、胰腺β细胞、肝干细胞、肝细胞或肺祖细胞。

112.如权利要求110所述的分化的人类细胞的组，其中所述分化的人类细胞为神经干细胞或神经元。

113.如权利要求110所述的分化的人类细胞的组，其中所述分化的人类细胞为心脏祖细胞或心肌细胞。

114.如权利要求110所述的分化的人类细胞的组，其中所述分化的人类细胞为肝干细胞或肝细胞。

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