CN107603951A

CN107603951A - 一种用于在体诱导成熟神经元分裂的新型生长/神经营养因子组合物及其用途

Info

Publication number: CN107603951A
Application number: CN201610547844.7A
Authority: CN
Inventors: 刘少君; 刘若虚; 林世德; 马洁; 景书谦
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Priority date: 2016-07-12
Filing date: 2016-07-12
Publication date: 2018-01-19
Anticipated expiration: 2036-07-12
Also published as: CN107603951B

Abstract

本发明涉及用于诱导成熟神经元分裂的组合物及其用途。具体地，本发明涉及用于诱导成熟神经元分裂的组合物，其包含：表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)和三碘甲状腺素(tri‑iodothyronine，T3)。

Description

一种用于在体诱导成熟神经元分裂的新型生长/神经营养因子组合物及其用途

技术领域

本发明涉及用于在体诱导皮层固有成熟神经元分裂的新型生长/神经营养因子组合物及其用途。具体地，本发明涉及用于诱导成熟神经元分裂的组合物，其包含：表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和三碘甲状腺素(tri-iodothyronine，T3)。

背景技术

数十年以来，学术界就成年动物脑中大脑皮层中是否存在神经发生或者大脑皮层中的成熟神经元是否能够被诱导分裂，一直存在着广泛的争论。之前有报道称，在成年啮齿类动物^1,2和猕猴^3,4的大脑皮层中存在低水平的神经发生，但是其他的研究却报道称没有检测到这一神经发生^5,6。在例如凋亡、卒中或者外伤的损伤刺激之下，室管膜下区(subventricular zone，SVZ)中的神经干细胞可以被激活并且分化成为神经前体细胞，神经前体细胞随后迁移到损伤刺激部位邻近区域并最终在原位分化成为成熟神经元^7,8。

而对于成年哺乳动物大脑皮层中的固有成熟神经元，学术界一般认为其不具有分裂能力^9-11。

而对于神经退行性疾病、卒中、脑外伤而言，成熟神经元不具有分裂能力这一性质是这些疾病治疗中的巨大障碍。此外，脑衰老以及衰老相关的神经退行性病变也与神经元的损失有关。尽管脑中存在一定水平的神经发生，但是其水平过低不足以补偿神经元的损失，另一方面，尽管神经前体细胞在某些情况下可以迁移并在特定部位分化成为神经元，但是其难以被利用来预防衰老和治疗神经退行性疾病⁷，也不足以逆转上述状况。神经退行性疾病治疗的关键在于固有的成熟神经元的自发地或者被诱导地自我更新或分裂¹⁵。

因此，学术界一直渴望开发出一种技术来实现大脑皮层固有成熟神经元的诱导分裂。这种技术将会为以下疾病的治疗提供希望：神经退行性疾病以及来自起因于卒中或外伤的脑和脊髓损伤。

发明内容

本发明提供了一种用于诱导大脑皮层固有成熟神经元分裂的生长因子/神经营养因子组合物。

特别地，本发明提供了用于诱导成熟神经元大量分裂的组合物，其包含：表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)和三碘甲状腺素(tri-iodothyronine，T3)。

在某些实施方案中，本发明的组合物还包含另外的生长因子和/或神经营养因子。

在某些实施方案中，在本发明的组合物中EGF、bFGF、HGF、IGF、NGF、BDNF的终浓度为1-400微克/ml，T3的终浓度为1-1000微克/ml。

在某些实施方案中，在本发明的组合物中EGF、bFGF、HGF、IGF、NGF、BDNF的终浓度为10微克/ml，T3的终浓度为50微克/ml。

在某些实施方案中，本发明的组合物还包含纤维蛋白基质和/或纤溶酶原混合物。

在某些实施方案中，所述成熟神经元是大脑皮层固有成熟神经元。

在另一个方面，本发明提供了表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)和三碘甲状腺素(tri-iodothyronine，T3)在制备用于诱导成熟神经元分裂的药物中的用途。

在另一个方面，本发明提供了表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)和三碘甲状腺素(tri-iodothyronine，T3)组合在制备用于治疗神经退行性疾病、帕金森病、多发性硬化症的治疗、ALS、阿尔茨海默病、糖尿病神经病变、卒中或脑外伤的药物中的用途。

在另一个方面，本发明的组合物可用于以下用途：例如周围神经的再生、脊髓中的轴突再生、促进某些细胞的分化、靶神经元细胞存活的增加、脑血流量的增加、脊髓损伤的治疗、神经退行性疾病的治疗、中风或脑缺血症的治疗、亨廷顿氏病的治疗、帕金森氏病的治疗、多发性硬化症的治疗、ALS的治疗、阿尔茨海默氏的治疗、糖尿病神经病变的治疗。

在一个具体实施方案中，将生长因子/神经营养因子组合(cocktail)与三碘甲状腺素(tri-iodothyronine，T3)的组合物(在本文中，也称之为cocktail)注射到成年大鼠的初级运动M1大脑皮层，2-4天以后观察到被MAP2⁺/NeuN⁺或者MAP2⁺/Hu⁺所标记的大量局部神经元可以被诱导分裂，NeuN和Hu在诱导分裂的神经元中显著下调，这些诱导分裂的神经元不表达双皮质素(doublecortin，DCX)，该标志物仅在迁移的神经前体细胞中表达^7,13,14。通过逆行神经示踪和延迟诱导神经分裂相结合的方法，本发明人不仅仅鉴定到投射到脊髓的诱导分裂的神经元，还确认这些诱导分裂的神经元来源于固有的(原位的)成熟神经元，而不是从别处迁移来或者由神经前体细胞形成的神经元。

此外，本发明人通过5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)染色研究了诱导分裂神经元的存活，在将诱导分裂组合物注射到M1大脑皮层后36小时期间，腹膜内注射BrdU共3次，然后观察BrdU⁺/NeuN⁺神经元数量，在4周、8周时都检测到大脑皮层显微注射部位周围有大量的BrdU⁺/NeuN⁺神经元，而且4周和8周之间没有显著差异。

本发明人出人意料地发现三碘甲状腺素(tri-iodothyronine，T3)可降低Necdin表达，导致E2F1输入核的增加，进而活化成熟神经元，最终使得神经元重新进入细胞周期。并且还出人意料地发现使用低浓度的BDNF和NGF使得MAPK信号通路活化，从而减轻高浓度T3所导致的神经元凋亡。使用这一方法，本发明人成功地诱导了固有的成熟神经元在成年动物脑大脑皮层III-V层的原位分裂。

一般来说，通过3H-胸腺嘧啶([3H]TdR)和BrdU标记来显示神经发生，其能够在细胞周期的S期DNA合成过程中掺入到DNA中¹⁶。但是，一些DNA合成可能与有丝分裂无关，例如基因修复或者凋亡过程中，所以上述标记物显示的是DNA合成^10,15,16，有可能无法准确表征细胞分裂的状态。此外，这两种标志物之间也缺乏一致性，即便在同一个动物中结果也常常不一致^9,17-19。所以，为了排除这些影响，从而准确地确证神经元分裂的发生，本发明人使用了Hoechst 33258来标记DNA，通过带标记染色体的形态和排列(arrangement)来确定分裂中神经元的有丝分裂阶段(参见图1)。

此外，为了避免内源神经前体细胞的活化和迁移，从而确定分裂神经元的来源，本发明人尽可能地降低损伤，例如使用玻璃微针(OD约80微米)，减少注射的量，并且延长显微注射时间(长达10分钟)，等等。微透析仅进行24-36小时，之后立即处死动物。为了避免分裂中细胞的细胞核与另一细胞的核周质在照片中重叠所导致的错误结论^9,20，本发明人使用了激光扫描共聚焦显微镜进行分层扫描，并且在单张照片或3D照片中展示细胞核与核周质的关系。

更优选地，为了诱导更多的神经元分裂，除了T3和BDNF、NGF之外，本发明人将另外的生长因子/神经营养因子添加到本发明的组合物中，例如根据大脑神经元表达，构建了本研究使用的鸡尾酒组合²⁵。

附图说明

下面通过对本发明的详细描述以及附图来清楚地说明本发明前面叙述的方面以及其他方面。为了举例说明本发明，在附图中的实施方案是目前优选的，然而，可以理解，本发明并不限于所公开的特定实施方案。

图1显示了在成年大鼠大脑皮层中诱导神经元分裂。通过微透析或显微注射诱导神经元分裂之后，用Map2(红色)和NeuN(绿色)对脑冰冻切片进行免疫荧光标记，用Hoechst33258(蓝色)对DNA进行染色。使用激光扫描共聚焦显微镜获取照片，0.2微米/步长。为了避免结构重叠，在a-d图和f-q图中使用单步照片。根据染色体的特征性排布，分裂神经元被鉴定为不同的有丝分裂阶段，包括前期(a-d图)、中期(f-m图)和后期(n-q图)。Map2清楚地显示出神经元的核周质，NeuN仅在核周质的绿色轮廓(a、f、j和n图)或者树突(j-m图中的箭头)显示，表明在细胞分裂过程中其表达可能下调。在a-d图中分裂神经元的定位显示于e图中方框所示位置，位于大脑皮层的III层。多层照片r图(0.2微米/步x15步)显示了在大脑皮层局部区域的四个MAP2⁺分裂神经元，其处于前期(箭头)和中期(星号)，展示了所诱导分裂神经元的数量。s图是高度放大的分裂神经元照片，对应于r图中的方框。II、III、IV和V是大脑皮层的不同层。比例尺为6.5微米(在a-d、f-m和r图中)、3微米(s图)、13微米(n-q图)和80微米(e图)。

图2显示了投射到脊髓的第V板层的诱导分裂神经元。通过注射TRDA(红色荧光示踪剂)到C5段皮层脊髓束来逆行示踪成年大鼠。1、2、4和8周之后，将本发明的生长因子/神经营养因子组合+T3的本发明组合物注射到主要运动皮层(primary motor cortex)(M1)，使动物再存活2或4天。用Hoechst和抗MAP2抗体(成熟神经元标志物)对冰冻切片进行染色。低倍照片(a-d图，单步照片)和高倍照片(e-h图)分布显示了两个脊髓投射MAP2⁺分裂神经元，其中显示红色TRDA颗粒(b和f图)以及Hoechst标记的染色体(c和g图)，合并在MAP2⁺核周质(d和h图，箭头)。比例尺为35微米(a-d图)、6.5微米(e-h图)。

图3显示诱导的分裂神经元不表达DCX且低表达Hu蛋白。其中显示本发明的生长因子/神经营养因子组合+T3显微注射到成年大鼠大脑皮层M1区诱导了分裂的神经元。使用Hoechst 33258(蓝色)和抗MAP2抗体(红色)和DCX(绿色)(a-h、r图)或者MAP2(红色)和Hu(绿色)(i-p、q图)对脑切片染色。所有照片使用激光扫描共聚焦显微镜获取，0.2微米/步长。数据以单层照片显示，除非另有特别指明。

两个MAP2⁺分裂神经元(a-d图中的前期和e-h图中的前中期)不表达DCX(a和e图)。在诱导分裂神经元中，Hu阳性标记微弱地显示为神经元核周质的绿色细胞轮廓(i-l图，前期)或者胞质中绿色荧光颗粒(m-p图，前中期)。合并的照片(q图)显示了大脑皮层局部区域中四个MAP2⁺/Hu^-分裂神经元(蓝色)，展现了诱导的分裂神经元数量。在合并的照片中，其他未分裂的神经元表达Hu蛋白，这表明Hu表达在诱导分裂神经元中减弱或消失。合并的照片显示Hoechst染色的染色体与MAP2⁺核周质的共定位(d、h、i和p图)，图a-d显示了3D重建照片(r图，0.2微米/步x10步)。

比例尺分别为10微米(a-d图)、7.1微米(e-h图)、4.5微米(i-l图)、5微米(m-p图)、8.5微米(q图)和2.8微米(r图)。

图4显示了大脑皮层中诱导分裂神经元的命运。所有BrdU⁺/NeuN⁺神经元分布在大脑皮层的III-V层在注射针周围圆柱体直径1.5mm的区域。观察到四种类型的神经元：多极神经元(a-c图)、双极神经元(e-h)、锥体细胞(i-l图)和大神经元(m-s图)。

单步照片显示BrdU⁺(红色)/NeuN⁺(绿色)多极神经元(a-c图)，8周存活组。其特征为两个尖端树突和强阳性NeuN⁺轴突。位于IV层。c图(重叠图)。d图显示3D投射，其中BrdU(红色)和NeuN(绿色)标记在所有三个维度都是一致的。激光扫描共聚焦显微镜，0.2微米/步长，比例尺：3微米。

从4周存活组动物中获得BrdU⁺(红色)/NeuN⁺(绿色)双极神经元(e-g图，单步照片)。其特征为神经元突起的强阳性NeuN染色，以及细胞质的弱标记(e图)。红色：BrdU⁺细胞核(f图)、G：合并照片。H：双极神经元的共聚焦成像3D投射。沿x轴(左)和y轴(上)显示BrdU和NeuN的共定位。比例尺：4微米。

单步照片显示8周存活组中的小的锥体样神经元。该BrdU⁺锥体神经元定位于IV层，显示出大的强NeuN⁺尖端树突以及相对弱的NeuN⁺细胞质。合并照片(k图)显示其精确的重叠。l图：此锥体神经元的共聚焦3D重建。比例尺：2.5微米。

一系列单步照片(m-r图)显示8周存活组中的大神经元，其在细胞质具有强绿色荧光，在细胞核显示红色BrdU标记。s图是共聚焦3D重建照片。比例尺：4微米。

图5显示了所诱导的分裂神经元(箭头)在大脑皮层中的分布。分裂神经元均匀分布在大脑皮层中，而在注射区和SVZ之间的移行区域中没有观察到分裂神经元。MAP2：红色，NeuN：绿色。比例尺为80微米。

图6显示了典型的定位于IV层(e图)的分裂前期(a-d图)MAP2⁺神经元，其未被TRDA示踪所标记(b图)。a-d图显示的分裂神经元位于V层(e图，空心箭头所示)。而V层的TRDA^-MAP2⁺神经元(e图，实心箭头所示)不分裂。II、III、IV和V表示大脑皮层的不同层。比例尺为11微米(a-d图)和80微米(e图)。

图7显示将本发明的生长因子/神经营养因子组合+T3显微注射到成年大鼠大脑皮层之后，DCX阳性标记局限在室管膜下区(subventricular zone，SVZ)，而在注射部位与SVZ区的移行区域，没有DCX阳性细胞的积累(a-d图)。e-h图为高倍照片；Lv：侧脑室。比例尺为240微米(a-d图)和57微米(e-h图)。

具体实施方式

材料与方法

生长因子/神经营养因子

本发明的生长因子/神经营养因子组合包含：EGF(Sigma E4127Lot:SLBJ4118V)、bFGF(Invitrogen PMG0033,Lot 489821E)、HGF(Millipore Cat:375228-5UG,Lot:D00165582)、IGF(Millipore GF306Lot:2576396)、NGF(提取自小鼠颌下腺，惠赠自Prof.Shao N)、BDNF(惠赠自Dr.Jing)。本发明中所使用的T3：T3(Calbiochem 64245)。生长因子/神经营养因子的终浓度为10微克/ml，T3的终浓度为50微克/ml。

动物

成年SD大鼠在12小时光/暗周期下饲养，在06:00给予光照。室温维持在24摄氏度，30-50％相对湿度。该研究获得了实验动物使用和管理委员会的批准。

微透析

将麻醉大鼠以立体定位方式固定，使用空心钻(CMA)在前囟两侧的后0.24mm以及侧面2mm钻孔，使用牙科粘合剂在皮层下0.5mm固定引导套管(MAB 13.8.1C)。将微透析探针(MAB 13.8.1)插入引导套管，以5微升/分钟的速率，使用MAB 20输送含有或不含T3(50微克/ml)的灌注液。灌注液为生理盐水、Neurobasal培养液(Thermo Fisher12349015)和B27培养液(Invitrogen，B27 12587-010)的混合物，其中含有BDNF(终浓度2微克/ml)、NGF(终浓度2微克/ml)，或者N3培养液(含有另外的组合(cocktail)和1％吐温80用于神经元培养的培养液)。对于直接观察神经元分裂的实验，在灌注48小时后处理动物，对于BrdU掺入实验，在灌注开始后12小时将BrdU(Sigma B5002)腹膜内注射到动物，以12小时间隔再重复两次。灌注48小时后将动物送回笼舍，维持4或8周。

显微注射

使用苯巴比妥(60mg/kg)深度麻醉成年大鼠，然后以立体方式固定(RWD LifeSci)。用空心钻(CMA)在前囟两侧的后0.24mm以及侧面2mm钻孔，在显微镜下，使用自动步进注射装置(Njanoject II.Drummond Scientific C.)将1.5微升包含或不包含纤维蛋白(fibrin)基质(12.5IU/ml纤维蛋白原和12.5IU/ml纤溶酶原，Sigma F6755和T5772)的本发明组合物注射到大脑皮层。在实验的第二、四天处死动物。对于BrdU标记实验，一天两次腹膜内注射120mg/kg的BrdU给动物，从脑注射之后36小时开始，一共3次。使动物存活1、2、4和8周。

逆行示踪

将0.2微升10％TRDA(Molecular Probes INC,cat No.,D3328,lot No.:1540675)水溶液注射到C5段两侧皮层脊髓束中。饲养动物4周和8周，在上面注射的相同坐标点显微注射1.5微升的本发明组合物，然后在显微注射的第2天处死动物。

免疫荧光染色

麻醉大鼠，先用生理盐水经升主动脉灌注，然后用冰冷的4％甲醛溶液灌注。将脑和脊髓后固定两个小时，在4摄氏度20％蔗糖磷酸盐溶液中浸泡过夜。使用冷冻切片机将大脑皮层和C3-6的脊髓切片，20微米厚。切片保存于含有4％驴血清、0.3％BSA和0.3％trion的PBS中室温孵育2小时，然后用双重或者单一的小鼠抗MAP2(abcam ab11267,1:500)、NeuN(abcam Lot:GR138829-25,ab104224,1:500)、Nestin(Millipore lot:LV1797294MAB 353,1:200)、HuC/D(Invitrogen,Cat no A21271,2微克/ml)、GFAP(MilliporeMAB 34021:500)、BrdU(abcam lot:GR255088-1,Ab8152,1:200)一抗，或者抗MAP2(abcam Lot:GR133239-2,ab32454 1:500)、DCX(abcam Lot:GR229621-1,ab187231:500)、NeuN(abcam Lot:GR249899-5,ab177487,1:500)、GFAP(Dako REF:Z0334Lot:00066091,1:500)兔抗体或者山羊抗双皮质素多克隆IgG(C-18)(Santa Cruz Lot#J2015,sc-8066 1:1000)孵育24小时。在PBS中清洗切片10分钟x3次，然后在下述荧光素缀合的抗体中再孵育两小时：抗兔IgG(Abcam Lot:GR192145-1和abcam Lot:GR172157-1)、抗小鼠IgG(Abcam Lot:GR147771-1；Lot:GR126425-1和Lot:GR248986-1)或者抗山羊IgG(abcam Lot：GR246227-2)。二抗的选择基于一抗的类型。在PBS中清洗三遍，用Hoechst 33258(Sigma-Aldrich,Lot NO,B28838)染10分钟，然后用F4680FluoromountAqueous封片介质(Sigma,Lot SLBQ2436V)封片以防止荧光淬灭。

显微镜和软件

使用两种类型的共聚焦激光扫描显微镜：Perkin Elmer Instruments，UltraVZEW Vox和Nikon Diaphot光学显微镜和TIE-A1,Nikon。使用Volocity分析软件(6.0.1,license sever，41710233)和NIS-Elements4.40软件(Nikon)来编码照片和3D图片。

定量

使用改进的分段法对测试切片和对照切片中的诱导分裂神经元数量进行定量³⁰。观察的皮层区域限定于注射针2mm直径的圆柱体，高度限于大脑皮层的I-IV层。使用t检验和非配对t检验对数量进行检验。p<0.05视为具有显著性差异。

定义

本文中所使用的术语“活化形式”或者“衍生形式”(两者可互换地使用)为在被偶联物的特定位置引入一个活性基团或改造使其具有一个活性官能团，使其便于与水溶性物偶联的化合物。

本文使用的术语例如“包含”、“含”、“含有”和“包括”不意在限制。此外，除非另有说明，“或”、“或者”意指“和/或”。

另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。而且如果提到一个特定的数值，至少会包括该数值，除非文章清楚的表明了其另有所指。

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。

除非另有说明，任何关于本方法和产品一种实施方案公开的组分、元素、属性或者步骤可以应用于任何其他在此公开的方法和产品。

本公开引用的的每项专利、专利申请、出版物或者本文件中的描述以参考的方式整体并入文本中。

本发明在下面的实施例中进一步的定义。应了解这些实施例仅仅以举例的方式来说明，并不旨在限制本发明的范围。从上面的讨论以及这些例子中，本领域技术人员可以确定本发明的本质特征，而且在不脱离其本质和范围的情况下，能够对本发明做出各方面的改变和修改来使之适应各种各样的用法和条件。

实施例

实施例1：在成年大鼠大脑皮层中诱导分裂神经元

本发明人将包含(n＝3)或不包含(n＝3)纤维蛋白(fibrin)基质(12.5IU/ml纤维蛋白原和12.5IU/ml纤溶酶原，Sigma F6755和T5772)的本发明组合物(生长因子/神经营养因子组合+T3)分别注射到成年大鼠的大脑皮层。其中，所述生长因子/神经营养因子组合由以下组成：EGF(Sigma E4127Lot:SLBJ4118V)、bFGF(Invitrogen PMG0033,Lot 489821E)、HGF(Millipore Cat:375228-5UG,Lot:D00165582)、IGF(Millipore GF306Lot:2576396)、NGF(提取自小鼠颌下腺，惠赠自Prof.Shao N)和BDNF。两组所观察到的分裂神经元数量没有差异。因此，选择生长因子/神经营养因子组合+T3用于后续实验。

本发明人观察到，通过微透析或显微注射生长因子/神经营养因子组合+T3能够诱导大量的分裂神经元，其被MAP2和NeuN所标记(图1的a-s以及图5)。

通过微透析神经营养因子组合+T3或者微透析T3，诱导出大量分裂的神经元，其中在大脑皮层III-V层中MAP2⁺/NeuN⁺分裂神经元的相应数量为485.00±114.486/mm³(n＝6)、388±132.774/mm³(n＝6)和123.00±71.778/mm3(n＝6)。组间的差异具有非常高的统计学显著性(P＝0.025,p＝0.000和p＝0.000，t检验)。

通过显微注射，用生长因子/神经营养因子组合+T3(N＝3组)注射到M1大脑皮层，2天后分裂神经元的数量为388.40±132.757/mm³(n＝6)，4天后为485±114.486/mm³(n＝6)。组间差异也具有显著性，在生理盐水对照组(N＝3)中未观察到MAP2⁺/NeuN⁺分裂神经元。

为了确定所诱导分裂神经元的来源，首先，本发明人通过减少注射体积、使用玻璃微吸管、延长注射时间等来避免神经前体细胞的活化。其次，使用双皮质素(DCX)进行染色，来确定神经前体细胞是否迁移到目标区域，文献认为DCX只在迁移中的神经前体细胞中表达。结果显示，DCX阳性细胞只在SVZ区中存在，而在注射区域和SVZ区之间的过渡区域没有发现任何DCX阳性细胞的积聚(参见图6)，表明并未激活内源神经前体细胞。

此外，在本实施例中，扫描了超过50个大脑皮层切片，均未发现表达DCX的MAP2⁺分裂神经元(参见图2的a-h)，表明诱导分裂的神经元并非来源于神经细胞前体的迁移和分化。

再者，本发明人还使用了Hu蛋白，其在所有神经元中表达^26,27,28，但是不在神经胶质细胞²⁷和分裂的前体细胞²⁹中表达。近来，Hu C/D蛋白已用作成熟神经元的生物标志物^12,27,29。如图2所示，在诱导的分裂神经元核周质显示出弱的Hu阳性绿色轮廓(i-l，前期)或者细胞质中显示绿色荧光颗粒(m-p，前中期)，表明在诱导的分裂神经元中Hu表达被减弱或消除。类似的改变也发生在NeuN表达中，在诱导的分裂MAP2⁺神经元中观察到核周质(图1的a、f、j和n)或者树突(图1中j和n，箭头)的绿色轮廓。这一现象可能是由于有丝分裂过程中神经元所经历的某种类型的幼稚化(primitivization)所导致的。

实施例2：脊髓投射

为了鉴定大脑皮层V层中的诱导分裂神经元是否投射到脊髓，本发明人提前将3kDa的德克萨斯红-葡聚糖胺(Texas red-dextran amine,TRDA)注射到C5段两侧皮层脊髓束中。注射TRDA后第一周，观察到在C3段脊髓束的密集的TRDA示踪的神经纤维。但是，随着存活时间的延长，荧光密度逐渐变低，在逆行示踪后14天就观察不到了。这表明，在注射部位，再生的纤维(如果有的话)并不吸收TRDA。

然后，将本发明的组合物注射到已接受TRDA注射4或8周的大鼠大脑皮层的M1区，接着再将动物维持2天，然后用Hoechst和抗MAP2抗体标记脑和脊髓切片。如MAP2⁺核周质中红色TRDA颗粒所示，逆行示踪神经元全部位于大脑皮层的V层，因此表明，它们是之前就存在于初级运动皮层的固有神经元。根据标记染色体的形态所示，它们之中的一部分处于有丝分裂的不同时期(图3，a-h)。作为特异性的对照，许多处于III和IV层的MAP2⁺分裂神经元没有被TRDA所标记(如图7)，一些V层的逆行示踪神经元尚未被诱导分裂(如图7)。延迟诱导神经元分裂与TRDA示踪相结合证明了至少投射到脊髓的诱导分裂神经元是运动皮层固有的神经元。

结合诱导分裂神经元的细胞来源，可以得出，本发明所诱导的神经元来源于大脑皮层的固有神经元，而非神经前体细胞。

实施例3：诱导分裂神经元的命运

为了检测有丝分裂后神经元的存活，本发明人将生长因子/神经营养因子组合+T3注射到大脑皮层M1，同时腹腔内注射BrdU，在36小时内施用3次，以避免引发内源神经前体细胞。继续饲养动物4周或8周。结果显示，所有BrdU⁺/NeuN⁺神经元分布在大脑皮层内注射针周围圆柱区域的2mm直径内。相比于诱导后立即处死的动物，在BrdU⁺神经元中NeuN的表达显著恢复(参见图4)。从形态来看，BrdU⁺/NeuN⁺神经元可以被分为四种类型：多极神经元(图4的a-d)、双极神经元(图4的e-h)、锥体细胞(图4的i-l)和大神经元(图4的m-s)。

在4周组中，BrdU⁺/NeuN⁺神经元的数量为169±468/mm³，少于实验后立即处死的动物。在4周组(参见b)与8周组(约174.353/mm³，参见a、c和d)之间，BrdU⁺/NeuN⁺神经元的数量差异没有统计学显著性，这表明在这期间，经过诱导分裂神经元的凋亡已终止。

以上描述地仅是优选实施方案，其只作为示例而不限制实施本发明所必需特征的组合。所提供的标题并不意指限制本发明的多种实施方案。

本申请中提及的所有公开物和专利通过引用方式并入本文。不脱离本发明的范围和精神，本发明的所描述的方法和组合物的多种修饰和变体对于本领域技术人员是显而易见的。虽然通过具体的优选实施方式描述了本发明，但是应该理解所要求保护的本发明不应该被不适当地局限于这些具体实施方式。事实上，那些对于相关领域技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所描述的模式的多种变体意在包括在随附的权利要求的范围内。

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Claims

1.用于诱导成熟神经元分裂的组合物，其包含：表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)和三碘甲状腺素(tri-iodothyronine，T3)。

2.根据权利要求1的组合物，其还包含另外的生长因子和/或神经营养因子。

3.根据权利要求1的组合物，其中EGF、bFGF、HGF、IGF、NGF、BDNF的终浓度为1-400微克/ml，T3的终浓度为1-1000微克/ml。

4.根据权利要求1的组合物，其中EGF、bFGF、HGF、IGF、NGF、BDNF的终浓度为10微克/ml，T3的终浓度为50微克/ml。

5.根据权利要求1的组合物，其还包含纤维蛋白基质和/或纤溶酶原。

6.根据权利要求1的组合物，其中成熟神经元是固有成熟神经元。

7.表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)和三碘甲状腺素(tri-iodothyronine，T3)在制备用于诱导成熟神经元分裂的药物中的用途。

8.表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)和三碘甲状腺素(tri-iodothyronine，T3)在制备用于治疗神经退行性疾病、帕金森病、多发性硬化症的治疗、ALS、阿尔茨海默病、糖尿病神经病变、卒中或脑外伤的药物中的用途。