CN102203129B - 用于体外诊断中风的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于体外诊断个体的中风和短暂性脑缺血发作(TIA)的方法，其包括下列步骤：(a)测量个体的生物样品中proBNP(1-108)或包含RAPRSP序列(SEQ ID NO：1)的proBNP(1-108)的片段的水平；(b)将测量的水平与临界值比较；(c)从而确定所述个体中是否发生中风或TIA。
Description
发明领域
本发明涉及用于体外诊断中风(stroke)的方法和试剂盒。
发明背景
中风，也称为脑血管意外(CVA)，是导致每年诊断为中风的估计700,000名患者的死亡率和发病率的原因之一。目前中风在美国位列引起死亡的第三大原因。
术语″中风″包括两种非常不同的临床背景，对其进行区分非常重要。因此，缺血性中风通常由血管堵塞引起，并且最好是在症状开始的三个小时内通过凝块溶解剂(例如t-PA)进行治疗。与此相反，出血性中风由脑内出血引起的，禁止通过抗凝剂对其进行治疗(已证明这样的治疗是致死性的)。
短暂性脑缺血发作(Transient ischemic attack，TIA，经常俗称为″小中风″)由脑部特定区域的供血变化引起，导致短暂的神经机能障碍(根据定义，其持续小于24小时)；如果症状继续持续，则将其分类为中风(参见例如Transient Ischemic Attacks：Stroke(CVA)：MerckManual Home Edition)。经诊断具有TIA的患者有时被告知具有发展中风的风险。如果供血受损的时间持续几分钟以上，那么脑部该区域的神经细胞死亡并且引起永久性神经缺损。患TIA的群体的三分之一随后具有复发的TIA并且由于永久性神经细胞损失，三分之一患有中风(Transient ischemic attack Mount Sinai Hospital，New York)。因此，由于这些患者具有增加的发展中风的风险，鉴定TIA是有益的。
在存在指示中风的症状(例如突然麻痹或失明、意识错乱、严重头痛、语言不清和偏瘫)的患者中，中风的诊断，以及缺血性和出血性中风之间的细分目前基本上依靠计算机体层摄影(CT)。然而CT不能完全满足需要，因为其在急性中风的诊断中评估的灵敏度小于26％(Chalela等人(2007)Lancet 369：293-298)，这与缺血性中风的检测中很差的性能(灵敏度小于33％)有关(Reynolds等人(2003)Clin.Chem.49：1733-1739)。磁共振成象(MRI)已显示在急性中风(灵敏度84％，Chalela等人(2007)Lancet 369：293-298)，特别是缺血性中风的诊断中优于CT。然而，MRI扫描仪是昂贵的设备并且在急救室中并不总是可获得的。
因此，对于诊断中风和TIA，仍然需要可选的或补充的方法(特别是针对CT的可选的或补充的方法)。
在这方面，已表明生物化学标志物可用作检测中风的辅助手段，特别是在缺血性中风的早期检测中。
S-100b(星形胶质细胞活化的标志物)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)是得到最好表征的此类标志物(Jauch等人(2006)Stroke 37：2508-2513)。心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)还被认为是有前景的标志物(Lescuyer等人(2005)Mol.Diagn.9：1-7)。然而，似乎由这些标志物分别提供的区分能力的临床价值不足。
因此，已提出将组合数个标志物(例如S-100b、B型神经营养生长因子(BNGF)、von Willebrand因子(vWF)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1))的组用于诊断缺血性中风(Reynolds等人(2003)Clin.Chem.49：1733-1739)。实际上，已显示该组对症状发作6小时内的缺血性中风样品提供93％的特异性和92％的灵敏度。然而，在发作3小时内，灵敏度只有87％，这可能是由于标志物的个体灵敏度/特异性太低。
因此，仍然需要提供良好的个体灵敏度/特异性比率的可选的标志物，以用于单标志物测试或用于改进多标志物的组(通过增加灵敏度/特异性或通过允许降低组中标志物(其水平必须被测量)的数目)。
proBNP(1-108)，108个氨基酸的前体蛋白在体内被切割以产生(i)脑钠肽(也称为BNP(32)或简称BNP)，其由proBNP(1-108)的32个C-末端的氨基酸组成和(ii)NT-proBNP(1-76)，其由proBNP(1-108)的76个N-末端的氨基酸组成(Giuliani等人(2006)Clinical Chemistry 52：1054-61)。在生物学上，BNP是血压调节剂，其主要由左心室响应体积扩张和压力过载而释放。已显示proBNP(1-108)在患有严重心力衰竭的患者中循环(Hammerer Lercher等人(2008)Clinical Chemistry 54：5)。
发明简述
本发明基于发明人的出乎意料的发现：单独的proBNP(1-108)在中风检测中具有高的区分能力(例如95％的灵敏度和95％的特异性，如在血浆样品中测量的)。
因此，本发明涉及用于体外诊断个体的中风和短暂性脑缺血发作(TIA)的方法，其包括下列步骤：
(a)测量个体的生物样品中proBNP(1-108)或包含RAPRSP序列(SEQID NO：1)的proBNP(1-108)的片段的水平；
(b)将测量的水平与临界值(cut-off value)相比较；
(c)从而确定个体中是否已经发生中风或TIA。
在上述方法的一个实施方案中，本发明更特别地涉及一种方法，其包括下列步骤：
(a′)测量个体的生物样品中proBNP(1-108)或包含RAPRSP序列(SEQ ID NO：1)的proBNP(1-108)的片段的水平；
(b′)测量个体的生物样品中至少一个另外的中风标志物的水平；
(c′)将proBNP(1-108)的水平或proBNP(1-108)的片段的水平和至少一个另外的中风标志物的水平与一个或数个临界值进行比较；
(d′)从而确定个体中是否已经发生中风或TIA。
在本发明的另一个实施方案中，上述方法进一步包括测量至少一个心血管疾病的标志物的水平。
本发明还涉及用于诊断中风的试剂盒，其包含：
-至少一个适用于检测proBNP(1-108)，或包含RAPRSP序列(SEQ IDNO：1)的proBNP(1-108)的片段的抗体；和
-至少一个包含proBNP(1-108)，或包含RAPRSP序列(SEQ ID NO：1)的proBNP(1-108)的片段的校准物(calibrator)，优选其浓度为1至1000pg/ml。
本发明还涉及proBNP(1-108)或包含RAPRSP序列(SEQ ID NO：1)的proBNP(1-108)的片段用于体外诊断中风或TIA的用途。
附图简述
图1表示中风和对照群体中H-FABP浓度的分布(纵轴，ng/ml)。
图2表示中风和对照群体中proBNP(1-108)浓度的分布(纵轴，pg/ml)。
图3表示中风、TIA和对照群体中proBNP(1-108)浓度的分布(纵轴，pg/ml)。
图4表示中风和对照群体中proBNP(1-108)浓度的分布(纵轴，pg/ml)。
图5表示中风和对照群体中S-100b浓度的分布(纵轴，ng/ml)。
图6表示中风和对照群体中NSE浓度的分布(纵轴，ng/ml)。
发明详述
如本文预期的，″诊断″或确定″诊断″指确定个体中是否已经发生中风。
如本文预期的，″中风″指所有的脑血管意外。特别地，术语″中风″包括急性和慢性中风及缺血性和出血性中风。
缺血性中风的特征在于脑血管的部分或全部阻塞，其可以导致由这些血管供血的脑组织的梗死和坏死。在短暂性脑缺血发作(TIA)中，阻塞自发地终止，引起持续不超过24小时的机能障碍。
出血性中风的特征在于通常由脑血管破裂引起的脑内出血。
优选地，根据本发明的中风选自缺血性中风和出血性中风。更优选地，如本文预期的，中风是急性缺血性中风。
有利地，本发明的方法提供早期中风诊断。对于缺血性中风而言，早期中风诊断特别重要，因为据估计，在中风症状开始3小时内治疗阻塞的血管，将防止大多数不可逆的脑损伤。因此，优选上述步骤(a)在个体中指示中风的至少一个症状开始后6小时内，更优选3小时内，和最优选2小时内进行。
指示中风的症状对本领域技术人员来说是公知的和显著的，包括突然麻痹或失明、意识错乱、严重头痛、语言不清和偏瘫。
所述个体优选是人。
″proBNP(1-108)″指BNP(32)和NT-proBNP(1-76)的前体。如本文预期的，″proBNP(1-108)″包括所有其天然变体。例如，proBNP(1-108)由SEQ ID NO：4表示。
在体内，proBNP(1-108)经常是部分截短的，特别地，例如通过循环的蛋白酶使其缺失N-末端侧或任选地C-末端侧的一个或多个氨基酸，从而形成所谓的″proBNP(1-108)片段″。此类proBNP(1-108)片段的一个实例，通过二肽酶切割而产生的proBNP(3-108)片段由Lam等人(2007)J.Am.Coll.Cardiol.49：1193-1202描述。据信，不仅proBNP(1-108)具有诊断价值，而且其各种天然片段也具有诊断价值。因此，本发明不仅可依赖于测量proBNP(1-108)的水平，还可依赖于测量proBNP(1-108)的片段的水平。
表述″proBNP(1-108)″和″proBNP(1-108)的片段″还包括已经经历至少一种翻译后修饰(例如磷酸化、糖基化等)的任何多肽。例如Schellenberger等人(2006)Arch.Biochem.Biophys.51：160-6已经表明，proBNP(1-108)是完全或部分O-糖基化的糖蛋白。
如本文预期的，proBNP(1-108)的片段包含RAPRSP序列(SEQ ID NO：1)。该RAPRSP序列具有被体内切割以产生NT-proBNP(1-76)和BNP(32)的proBNP(1-108)的位点。因而，RAPRSP是proBNP(1-108)特有的，并且在BNP(32)和NT-proBNP(1-76)中没有发现，因此根据本发明的proBNP(1-108)的片段的定义，排除BNP(32)和NT-proBNP(1-76)。
进一步优选，根据本发明的proBNP(1-108)的片段包含FGRKMDR序列(SEQ ID NO：2)。该序列包含在proBNP(1-108)的BNP(32)部分中。更优选，proBNP(1-108)的片段包含BNP(32)的完整序列(SEQ ID NO：3)。
表述“另外的中风标志物”指除了上述proBNP(1-108)或proBNP(1-108)的片段以外的任何生物化学标志物，其水平指示中风或TIA，如上定义的。
表述″心血管疾病的标志物″指可用于检测或诊断心血管疾病的任何标志物。此类标志物是本领域技术人员公知的。优选地，心血管疾病的标志物选自C反应蛋白(CRP)和心肌肌钙蛋白I(cTnI)。测量心血管疾病的标志物的水平在本发明的方法中可以是有利的，因为其允许排除心血管疾病作为proBNP(1-108)的水平变化的原因。
优选地，使用免疫测定测量或确定proBNP(1-108)、proBNP(1-108)的片段、至少一种另外的中风标志物、或至少一种心血管疾病的标志物的水平。
如本文预期的，″免疫测定″指任何这样的方法，其中使用至少一种与其特异性结合的化合物(或配体)确定proBNP(1-108)、proBNP(1-108)的片段、至少一种另外的中风标志物、或至少一种心血管疾病的标志物的水平。与其特异性结合的化合物(或配体)可以是任何类型，但是优选其为抗体、适体(aptamer)或通过噬菌体展示获得的肽。免疫测定方法是本领域技术人员公知的，并且可以根据本领域技术人员公知的各种形式(例如以固相或均相，以一个或两个步骤，通过夹心法或通过竞争法)进行。
优选地，可以使用在两个配体之间(一个是捕获配体和另一个是检测配体)的固相夹心法。这类免疫测定对本领域对技术人员来说是尤其公知的。例如，Seferian等人(2007)Clin.Chem.53：866-873的文章给出了用于分析BNP(32)和proBNP(1-108)的夹心免疫测定(或在2个位点上的免疫测定)的实例，其每次使用一对抗体(固定在固相中的抗体和检测用的标记的抗体)。
通过检测方法，特别是″检测配体″来显示生物样品中抗原的存在。通过识别与捕获配体识别的位点不同的表位位点，标记的检测配体能够与捕获的抗原结合。
术语″标记的″指直接标记和间接标记(例如通过其他配体，直接标记它们自己，或使用标记的″亲和对″试剂，例如但不限于标记的抗生物素蛋白-生物素对等)。
在夹心法的情况下，优选选择捕获配体以便其特异性识别患者的天然抗原上的表位，并且优选选择检测配体以便其特异性识别患者的天然抗原上的另一个表位。
优选地，将捕获配体固定在固相上。作为固相的非限定性实例，可以使用微板，特别是聚苯乙烯微板(例如Nunc，Denmark出售的微板)。还可以使用固体颗粒或珠粒，顺磁珠(例如由Dynal，Merck-Eurolab(France)(商标Es taporTM)和Polymer Laboratories生产的那些)，或甚至聚苯乙烯或聚丙烯试管，玻璃、塑料或硅芯片等。
ELISA测定，放射免疫测定或任何其他的检测方法可以用来显示形成的抗原-抗体复合物的存在。因此，配体特别是抗体的不同类型的标记是可行的(放射性标记、酶标记、荧光标记等)。
也可以通过基于质量累积的方法(例如表面等离子共振(SPR))，通过压电检测，通过质谱法或任何其他方法(其在没有第二标记配体的情况下允许研究配体-抗原型相互作用)进行检测。
术语″特异性的″，当它涉及配体的识别或配体与靶的结合时，指所述配体与所述靶相互作用，而基本上不与另一个靶(其在结构上与所述靶不相似)相互作用。
如本文预期的，“抗体”指属于任何物种例如人、小鼠、大鼠、兔、山羊或骆驼的抗体。抗体还可以是嵌合抗体，即包含来源于不同物种的部分的抗体。优选的嵌合抗体是所谓的“人源化的”抗体，其中恒定部分(CH和CL)是人来源的而可变部分(VH和VL)是其他物种，例如小鼠来源的。可以通过本领域技术人员已知的任何方法，例如通过动物免疫，或通过重组法或合成法来产生本发明的抗体。而且根据本发明的“抗体”还包括包含所述抗体的至少一个互补位的抗体片段，例如Fab、F(ab′)2、scFv片段和骆驼单链抗体。本发明的抗体可以是多克隆抗体，特别是单特异性多克隆抗体，或单克隆抗体。
“适体”是本领域技术人员公知的。适体是能够特异性结合靶(特别是蛋白质靶)的核苷酸(特别是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)或肽性质的化合物。特别地，Ellington等人(1990)Nature 346：818-22和Bock等人(1992)Nature 355：564-6描述了核苷酸性质的适体和其产生。Hoppe-Seyler等人(2000)J.Mol Med.78：426-30描述了肽性质的适体和其产生。
″噬菌体展示″表示用于选择在噬菌体的衣壳上表达且由插入衣壳编码基因中的核酸序列编码的多肽配体的技术。该方法是本领域技术人员公知的，并且特别地由Scott & Smith(1990)Science 249：386-390和Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222：581-597描述。优选地，可通过噬菌体展示获得的多肽是scFv型多肽(单链可变片段)。特别地，Winter等人(1994)Annu.Rev.Immunol.12：433-455描述了该技术。
优选地，上述免疫测定包含靶向表位的抗体，所述表位包含RAPRSP序列(SEQ ID NO：1)。更优选地，所述抗体由按照布达佩斯条约于2005年4月29日保藏在CNCM(国立微生物保藏中心，Institut Pasteur，25，rue du Docteur Roux，75 724 Paris Cedex 15，France)的保藏号为I-3073的杂交瘤分泌。所述抗体特别地在国际公开案WO2004/014952中进行了描述。该抗体是有利的，因为其允许特异性检测根据本发明的proBNP(1-108)和proBNP(1-108)的所有片段(除了BNP(32)、NT-proBNP(1-76)和它们各自的片段外)，从而确保获得proBNP(1-108)和它的多种片段的完全诊断益处。
还优选，免疫测定包含靶向包含FGRKMDR序列的表位的抗体。更优选地，所述抗体由按照布达佩斯条约由Bio-Rad(3boulevard RaymondPoincaré，92430Marnes la Coquette，France)于2007年4月13日保藏在CNCM(国立微生物保藏中心，Institut Pasteur，25，rue duDocteur Roux，75 724 Paris Cedex 15，France)的保藏号为I-3746的杂交瘤分泌。所述抗体特别地在国际申请PCT/EP2008/060188中进行了描述。
有利地，将靶向包含RAPRSP序列(SEQ ID NO：1)的表位的抗体和靶向包含FGRKMDR序列的表位的抗体组合到相同的免疫测定中，从而允许特异性检测根据本发明的proBNP(1-108)或proBNP(1-108)的片段。
优选地，当涉及proBNP(1-108)或proBNP(1-108)的片段时，上述临界值为至少获自显然健康的个体群体的生物样品中根据本发明的proBNP(1-108)或proBNP(1-108)的片段的平均水平。更优选地，上述临界值为至少相应于获自显然健康的个体群体的根据本发明的proBNP(1-108)或proBNP(1-108)的片段的水平的第75百分位数、第95百分位数或第99百分位数的值。最优选，该临界值为至少0、1、2、3、5、10、50或100pg/ml。当临界值为至少0pg/ml时，其指本发明的方法的上述步骤a)和b)，或a′)和c′)简单地包括确定个体的生物样品中是否存在上述proBNP(1-108)或proBNP(1-108)的片段。
类似地，当涉及至少另外的中风标志物时，上述临界值优选为至少获自显然健康的个体群体的生物样品中所述至少一个另外的中风标志物的平均水平。
确定根据本发明的临界值完全在本领域技术人员的能力范围内。特别地，优选小心测量相同性质的生物样品中proBNP(1-108)、根据本发明的proBNP(1-108)的片段、或至少一个另外的中风标志物的水平。如本文预期的，″显然健康的个体群体″指优选地不存在上述指示中风的症状的个体。
将proBNP(1-108)或proBNP(1-108)的片段的水平和至少一个另外的中风标志物的水平与一个或几个临界值相比较，这表示一方面proBNP(1-108)或proBNP(1-108)的片段的水平，以及另一方面至少一个另外的中风标志物的水平，可以各自与各自的临界值相比较，或它们可以与单个临界值相比较。
优选，在测量proBNP(1-108)或proBNP(1-108)的片段的水平的相同生物样品中，测量至少另外的中风标志物的水平或至少一个心血管疾病的标志物的水平。
如本文预期的，表述″生物样品″包括取得的样品和已经经历各种处理(特别地使样品适用于本发明的工艺和方法)的样品。根据本发明的生物样品可以为任何类型，然而优选所述生物样品选自血液样品、血清样品、血浆样品、脑脊液样品、尿液样品和唾液样品。
实施例
实施例1
1.方法
a.样品
在获自中风开始后小于3小时的个体的70个血清样品(15个出血性中风样品(HM)和55个缺血性中风样品(IM))和来自显然健康的个体的148个对照血清样品中测定proBNP(1-108)和H-FABP的水平。
b.生物标志物的测量
使用BioPlexTM 2200proBNP(1-108)分析(Bio-Rad)来测定proBNP(1-108)的水平。
BioPlexTM 2200将多种磁珠和流式细胞术组合以在完全自动化随机存取平台上提供多种分析物的检测。用2种荧光团(分类染料，CL1和CL2)染色磁性颗粒(8μm直径，羧基修饰的表面)，所述荧光团发射不同波长并且在635nm处显著地吸收。报告荧光团β-藻红蛋白(PE)因为其高摩尔消光系数、量子产率、对光漂白的抗性、无自淬灭和稳定性而被选择。检测器同时测量三个波长的光：2个分类染料和报告染料。
BioPlexTM 2200proBNP(1-108)测定是两步法夹心荧光免疫测定。在第一步中，BioPlexTM 2200系统将50μL患者样品，包被有由保藏在CNCM的保藏号为I-3073的杂交瘤分泌的抗proBNP(1-108)单克隆抗体的磁性染色的珠粒和测定缓冲液组合到反应容器中。然后，在温育11分钟和冲洗循环后，添加与藻红蛋白(PE)缀合的由保藏在CNCM、保藏号为I-3746的杂交瘤分泌的抗人BNP单克隆抗体，并且温育2分钟。在除去过量的缀合物后，使珠粒混合物通过检测器，所述检测器通过PE荧光识别染色的珠粒和珠粒上捕获的抗原的量。在用一组6个不同的校准物校准后，用pg/mL表示3种质量对照的水平和患者样品结果。
还用各个样品测试两种质量对照珠粒以提高整个系统的完整性。
使用来自Hycult biotechnology的人H-FABP ELISA试剂盒，按照制造商的说明书，测定H-FABP的水平。
c.统计分析
用箱线图表示根据患者状况的生物标志物的分布，其是通过五个数值(最小观测值，下四分位数(Q1)，中位数(Q2)，上四分位数(Q3)和最大观测值)图形化地描述数据组的方便的方法。
数据已经用Box-Cox法标准化以遵循高斯分布并且能够进行统计分析(Box，G.E.P.和Cox，D.R.(1964)An analysis of transformations.JRSS B 26，211-246)。
用下列统计检验进行对照和中风样品之间的差异分析：Wilcoxon秩和检验(Wilcoxon，F.(1945)Individual comparisons by rankingmethods.Biometrics，1，80-83)，其是非参数的(不需要假设统计分布并且其可以是学生氏t检验的备选检验)；以及Welch′s检验，其是意欲用于可能具有不等方差的两个样品的学生氏t检验的改进。所述分析还包括通过Benjamini/Hochber方法(Benjamini和Y.Hochberg(1995)Controlling the False Discovery Rate：a practical andpowerful approach to multiple testing.J.R.Statist.Soc.B.Vol.57：289-300)校准(校正)这些检验方案。
标志物的诊断性能由两个指标表征：灵敏度(检测患病群体的能力)和特异性(检测对照群体的能力)。诊断试验的结果可以进一步通过测定ROC(接收者操作特征)分析的曲线下的面积(AUC)来表征。ROC曲线是对多种浓度的检验的灵敏度(Se)和特异性(Sp)之间的倒数关系的图形显示(M.H.Zweig和G.Campbell(1993)″Receiver-operatingcharacteristic(ROC)plots：a fundamental evaluation tool inclinical medicine″.Clinical chemistry 39(8)：561-57)。
2.结果
a)由箱线图表示的生物标志物的分布
图1和2分别表示中风和对照群体中H-FABP和proBNP(1-108)的浓度的分布。
表1：对照和中风群体中H-FABP和proBNP(1-108)的水平：
ProBNP(1-108)标志物在中风样品中显示比对照样品中更高的浓度水平。然而，测量的H-FABP浓度在中风患者样品和对照样品之间没有显示显著差异。
b)差异分析
测定中风样品和对照样品之间H-FABP和proBNP(1-108)的水平的差异的统计显著性：
表2：从对照和中风群体测定的H-FABP和proBNP(1-108)标志物的浓度之间的差异分析
| 标志物 | pWILCOXbrut | pWILCOXadj | pWELCHbrut | pWELCHadj |
| H-FABP | 0.0131 | 0.016375 | 0.0006 | 0.001 |
| proBNP | 0.0001 | 0.000167 | 0.0001 | 0.00025 |
在中风样品和对照样品之间，两种标志物(proBNP(1-108)和H-FABP)的浓度的差异是统计学显著的，然而proBNP(1-108)表现出特别有趣的特征：具有非常低的p值(10-4)(表2)。
c)ROC曲线分析
基于临床状况的接收操作特征(ROC)分析以及如表3中概括的，proBNP(1-108)的曲线下的面积成功地将诊断为中风的患者与健康受试者区分开，灵敏度为90％，特异性为85％。而且，该区分能力对于缺血性和出血性中风患者都非常高，各自的AUC分别为0.936和0.935。
表3：当与对照受试者比较时，中风患者的proBNP(1-108)的接收操作特征分析数据
如以下的表4所示，H-FABP标志物对中风诊断具有低的判别能力，灵敏度为57％，特异性为54.7％。
表4：当与对照受试者比较时，中风患者的H-FABP的接收操作特征分析数据
实施例2
1.方法
a.样品
在获自中风开始后小于3小时的个体的23个血清样品(5个出血性中风样品(HM)和18个缺血性中风样品(IM))，获自已临床诊断为TIA的个体的7个血清样品和来自显然健康的个体的94个对照血清样品中测定proBNP(1-108)的水平。
b.标志物水平的测定
如实施例1中所述，测定proBNP(1-108)的水平。
c.统计分析
如实施例1中所述，用箱线图表示proBNP(1-108)的水平的分布，并进行ROC分析。
2.结果
a)通过箱线图表示的生物标志物的分布
图3表示中风、TIA和对照群体中proBNP(1-108)的浓度的分布。
表5：对照、TIA和中风群体中proBNP(1-108)的分布值
ProBNP(1-108)标志物在中风或TIA患者样品中显示比对照样品中更高的浓度水平。
b)ROC曲线分析
基于临床状况的接收操作特征(ROC)分析以及如表6中概括的，proBNP(1-108)的曲线下的面积成功地将诊断为中风的患者与健康受试者区分开，灵敏度为91％，特异性为84％。
表6：当与对照患者比较时，中风患者的proBNP(1-108)的接收操作特征分析数据
因此，实施例1中所证明的proBNP(1-108)诊断中风患者的能力在这些新的病理和健康群体中得到确认。
实施例3
进一步在相同群体中比较proBNP(1-108)的区分能力与现有技术的两个参考中风标志物(S-100b和NSE)的区分能力。
1.方法
a.样品
在获自中风开始后小于3小时的个体的41个血浆样品和来自显然健康的个体的51个对照血浆样品中测定标志物的水平。
b.标志物水平的测定
如实施例1中所述，测定proBNP(1-108)的水平。
用来自Nanogen的Nexus DXTM Neuron Specific Enolase(NSE)Test试剂盒，按照制造商的说明书，测定NSE的水平。
用来自Nanogen的Nexus DXTM S-100ELISA Test试剂盒，按照制造商的说明书，测定S-100b的水平。
c.统计分析
如实施例1中所述，进行统计分析。
2.结果
a)通过箱线图表示的生物标志物的分布
图4、5和6分别表示中风和对照群体中proBNP(1-108)、S-100b和NSE的浓度的分布。
表7：对照和中风群体中proBNP(1-108)、S100和NSE的分布值
ProBNP(1-108)和NSE标志物在中风样品中显示比对照样品中更高的浓度水平。用proBNP(1-108)标志物观察到两个群体之间的最好的区分。然而，测量的S-100浓度在中风患者样品和对照样品之间没有显示显著差异。
b)差异分析
测定中风样品和对照样品之间proBNP(1-108)、NSE和S-100的水平的差异的统计显著性：
表8：从对照和中风群体测定的NSE、S-100和proBNP(1-108)标志物的浓度之间的差异分析
| 标志物 | pWILCOXbrut | pWILCOXadj | pWELCHbrut | pWELCHadj |
| NSE | 0.0001 | 0.0003 | 0.0001 | 0.0003 |
| S-100 | 0.0023 | 0.0037 | 0.0064 | 0.0102 |
| proBNP | 0.0001 | 0.0003 | 0.0001 | 0.0003 |
NSE和proBNP(1-108)是统计学显著的，具有极低的p值(p＜0.001)。
c)ROC曲线分析
基于临床状况的接收操作特征(ROC)分析以及如表9中概括的，proBNP(1-108)的曲线下的面积成功地将诊断为中风的患者与健康受试者区分开，灵敏度为95％，特异性为95％和AUC为0.974。
表9：当与对照受试者比较时，中风患者的proBNP(1-108)、NSE和S100的接收操作特征分析数据
| 对照对中风 | 样品大小 | 临界值 | Se | Sp | AUC | IC 95％ |
| proBNP(1-108) | (55)对(41) | 3.26 | 95％ | 95％ | 0.974 | 0.904-0.993 |
| NSE | (55)对(41) | 1.682 | 85％ | 73％ | 0.857 | 0.770-0.915 |
| S-100b | (55)对(41) | -6.644 | 39％ | 89％ | 0.636 | 0.504-0.751 |
可见，与由NSE和S-100b提供的区分能力相比，proBNP(1-108)具有更高的区分能力来将中风患者和对照受试者区分开。
实施例4
用如实施例1所述的BioPlexTM 2200proBNP(1-108)测定，在患有缺血性中风的患者中进一步评估proBNP(1-108)的诊断能力。
a)样品
-检验来自在中风开始3小时内进入急诊室的患有缺血性中风的患者的32个柠檬酸化的血浆样品。由National Institutes of HealthStroke Scale(NIHSS)评估中风的严重程度。
-检验来自显然健康的献血者的42个柠檬酸化的血浆样品，所述献血者与来自中风群体的患者在性别和年龄上匹配。
在-80℃储存所有柠檬酸化的血浆样品。在分析前，解冻样品并且在4℃以3000g离心15分钟。
b)结果
对照和缺血性中风群体的proBNP(1-108)的值的分布示于表10中。与对照组相比，缺血性中风组中的proBNP(1-108)的水平显著更高(Mann-Whi tney，p＜0.0001)。因此，该结果证实，proBNP(1-108)对于缺血性中风的早期诊断是有用的血浆生物标志物。
表10：缺血性中风和对照的柠檬酸化的血浆样品中proBNP(1-108)的浓度(最小值，第一四分位数，中位数，第三四分位数和最大值)
Claims (17)
1.适用于检测proBNP(1-108)，或包含RAPRSP序列(SEQ ID NO:1)的proBNP(1-108)的片段的水平的配体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于通过下列步骤来体外诊断个体的中风和短暂性脑缺血发作(TIA)：
(a)测量个体的生物样品中proBNP(1-108)或包含RAPRSP序列(SEQID NO:1)的proBNP(1-108)的片段的水平；
(b)将测量的水平与临界值相比较；
(c)从而确定所述个体中是否发生中风或TIA。
2.根据权利要求1的用途，其中所述proBNP(1-108)的片段进一步包含FGRKMDR序列(SEQ ID NO:2)。
3.根据权利要求1的用途，其中所述proBNP(1-108)的片段包含BNP(32)的序列SEQ ID NO:3。
4.根据权利要求1至3任一项的用途，其中所述中风选自缺血性中风和出血性中风。
5.根据权利要求1至3任一项的用途，其中在个体的至少一个指示中风的症状开始后6小时内进行步骤(a)。
6.根据权利要求1的用途，其中用免疫测定来测定proBNP(1-108)或proBNP(1-108)的片段的水平。
7.根据权利要求6的用途，其中所述免疫测定包含靶向表位的抗体，所述表位包含RAPRSP序列(SEQ ID NO:1)。
8.根据权利要求7的用途，其中所述抗体由按照布达佩斯条约于2005年4月29日保藏在CNCM，保藏号为I-3073的杂交瘤分泌。
9.根据权利要求6至8任一项的用途，其中所述免疫测定包含靶向表位的抗体，所述表位包含FGRKMDR序列(SEQ ID NO:2)。
10.根据权利要求9的用途，其中所述抗体由按照布达佩斯条约于2007年4月13日保藏在CNCM，保藏号为I-3746的杂交瘤分泌。
11.根据权利要求1至3任一项的用途，其中所述临界值为至少1pg/ml。
12.适用于检测proBNP(1-108)，或包含RAPRSP序列(SEQ ID NO:1)的proBNP(1-108)的片段的水平的配体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于通过下列步骤来体外诊断个体的中风和短暂性脑缺血发作(TIA)：
(a′)测量所述个体的生物样品中proBNP(1-108)或包含RAPRSP序列(SEQ ID NO:1)的proBNP(1-108)的片段的水平；
(b′)测量所述个体的生物样品中至少一个另外的中风标志物的水平；
(c′)将proBNP(1-108)或proBNP(1-108)的片段的水平和所述至少一个另外的中风标志物的水平与一个或几个临界值相比较；
(d′)从而确定所述个体中是否发生中风或TIA。
13.根据权利要求12的用途，其中在与其中测量proBNP(1-108)或proBNP(1-108)的片段的水平的生物样品相同的生物样品中测量至少另外的中风标志物的水平。
14.根据权利要求1-3任一项的用途，其中所述生物样品选自血液样品、血清样品、血浆样品、脑脊液样品、尿液样品和唾液样品。
15.根据权利要求1-3任一项的用途，其中，中风和TIA的体外诊断还包括测量至少一个心血管疾病的标志物的水平。
16.根据权利要求15的用途，其中所述至少一个心血管疾病的标志物选自CRP和cTnI。
17.根据权利要求12或13的用途，其中所述生物样品选自血液样品、血清样品、血浆样品、脑脊液样品、尿液样品和唾液样品。
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