CN107076758B - 作为心力衰竭预后标志物的脑啡肽酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于确定患有心力衰竭疾病的患者的预后的体外方法，所述方法包括确定患者的测试样品中可溶性脑啡肽酶(NEP)的水平的步骤。

Description

作为心力衰竭预后标志物的脑啡肽酶
本发明在临床预后领域。特别是，本发明涉及在患有心力衰竭(HF)的患者中的不良事件(例如心血管死亡率(mortality))的预后。
背景技术
心力衰竭(HF)(也被称为充血性HF(CHF))是当心脏结构或功能的问题损害其提供足够的血流以满足身体需要的能力时发生的心脏状况。它可引起各种各样的症状，特别是在休息或运动和/或疲劳期间的呼吸短促(SOB)、流体滞留的体征(例如肺充血或踝肿胀)、和休息时心脏结构或功能异常的客观证据。然而，一些患者可以完全无症状，且无症状的心脏结构或功能异常被认为是有症状心力衰竭的前兆，并且与高死亡率相关。
心力衰竭是一种常见疾病：大于2％的美国人口，或近500万人受到影响，30％～40％的患者在接受诊断后1年内死于心力衰竭。
由于缺乏普遍认可的定义和在确定诊断中的挑战，特别是在早期阶段，心力衰竭经常是未被诊断出的。通过适当的治疗，可以在大多数患者中控制心力衰竭，但是它是潜在的危及生命的病症，且进行性疾病与10％的总体年死亡率相关。此外，它是大于65岁人群住院的主要原因。因此，心脏衰竭的管理耗费了欧洲国家总医疗支出的1％～2％。
慢性HF是具有通常稳定治疗的症状的发展数月和数年的长期病症。这种病症与经历适应性反应的心脏相关，然而，这种病症在长期中可以是有害的，并导致恶化的状况。急性HF(AHF)是用于描述加重的或失代偿的心力衰竭的术语，涉及其中患者可以被表征为具有导致需要紧急治疗或住院的心力衰竭体征和症状的变化的发作。AHF在数小时或数天内快速发展，并且可以立即危及生命，因为心脏没有时间进行代偿性适应。慢性HF也可能失代偿，其最常见是由并发疾病(例如肺炎)、心肌梗死、心律失常、不受控制的高血压、或患者未能维持流体限制(fluid restriction)、饮食或药物所导致。
在患者呈现时预测不良事件的可能性是重要的，因为风险的早期识别是开始有助于预防不良事件发展的措施的先决条件。在此方面，已经进行了若干尝试以找到可以提供准确的预后信息的标志物。
临床上，几种生物标志物作为HF预后的预测受到了极大的关注，其中利尿钠肽是使用最广泛的，但是诸如ST2和高灵敏度肌钙蛋白T等其他标志物也显示出有前途的结果，其作为利尿钠肽的补充方式。当测量生物标志物的水平时，临床医生了解可能削弱或破坏测试准确性的混杂因素也是非常重要的。这种情况的典型例子是身体质量指数或受损的肾功能如何影响利尿钠肽在HF中的血液浓度。
因此，尽管做出了努力，仍然需要另外的预后标志物，其可以在HF疾病的控制中提供有用的信息。
发明内容
本发明的发明人已经发现患有HF的患者的样品中的循环可溶性脑啡肽酶(以下也被称为“NEP”)的水平。特别是，已经广泛检测到慢性HF患者的血清中可溶性NEP的循环水平。此外，如下所示，已经发现NEP与心血管结果的正相关。
NEP，如下面详细解释的，是具有大的胞外催化结构域、单个跨膜区和短(27个氨基酸)胞质N末端结构域的膜结合酶。已经公开该酶在现有技术中在几种类型的癌症或肾脏疾病中作为诊断或预后标志物。
令人惊奇地是，本发明的发明人发现该酶可用作HF的预后标志物。
另一方面，一些先前的报告已经鉴定了NEP在生物流体中的存在。然而，没有循环可溶性NEP作为HF患者的病理生物学替代的证据。
因此，第一方面，本发明提供了用于确定患有心力衰竭疾病的患者的预后的体外方法，所述方法包括确定患者的测试样品中可溶性脑啡肽酶(NEP)的水平的步骤。
如下面详细解释的，1069名大的现实生活连续组群的患者被跟踪平均4.1年，具有335个复合终点事件，并且发现NEP是CV死亡率和发病率的良好病理生物学替代，甚至在包括12个预后有意义的变量(包括NT-proBNP)的非常全面的多变量的模型中进行调整，NT-proBNP是在HF预后中更广泛使用的生物标志物之一。如表2所示，其总结了多变量分析的结果，由NEP提供的预后信息是显著的(因为p值低于0.05)，并且在这样的分析期间其独立于考虑到的其他参数。本领域技术人员知道，当进行多变量分析时，首先看起来似乎足以用于疾病的诊断或预后的生物标志物最终被忽视，因为它们受到其他生物标志物或考虑其他参数的统计学上的负干扰(例如年龄或性别，等等)。作为另一个多变量统计分析的以下表3，说明当其他预后性HF标志物，ST2和高灵敏度肌钙蛋白T，包括在分析中时，可溶性NEP提供的预后信息不受影响，其与失去其统计学意义的NTproBNP相反。
因此，从表2和3的数据可以得出结论，可溶性NEP提供独立于测定中考虑的参数和其他生物标志物的预后信息。因此，下面提供的数据支持NEP作为患有HF患者的预后工具的巨大价值。
第二方面，本发明提供可溶性NEP作为HF的预后标志物的用途。
第三方面，本发明提供了用于检测分离样品中可溶性NEP存在的手段在本发明第一方面所限定的方法中用于心力衰竭疾病预后的用途。
第四方面，本发明提供了一种决定或推荐是否启动基于NEP抑制剂的医疗方案的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在体外确定患者的测试样品中可溶性NEP的量；和(b)将步骤(a)中获得的水平与参考值进行比较，其中，如果在步骤(a)中检测到的可溶性NEP的量高于参考值时，则表明患者将受益于基于NEP抑制剂的医疗方案。
确定测试样品中的可溶性NEP水平，本领域技术人员可另外建立哪种是可推荐的最适合的治疗，因为样品中检测到的水平可反映综合症的延伸(即严重性)。在测试样品中确定的可溶性NEP的水平越高，对HF患者施用NEP抑制剂可以越有益。
此外，一旦其决定开始医疗方案，因为受试者患有HF综合症(遵循本发明的第二方面中所限定的方法)，可以监测该方案的有效性：可溶性NEP减少或恢复可溶性NEP的正常水平可以表明HF患者对该医疗方案有利地反应，因此，所述方案是有效的；如果可溶性NEP的水平没有显著变化或者其增加，这可以表明医疗方案不是有效的。
附图说明
图1表示年龄调整的Cox回归曲线。A-无事件存活曲线，针对CV死亡或HF住院的主要复合终点。B-存活曲线，针对CV死亡。NEP的中值＝0.642ng/mL。黑线＝脑啡肽酶<中值；灰线＝脑啡肽酶≥中值。
具体实施方式
如上所述，本发明提供了确定患有HF的患者的预后的方法。
“预后”是指对患有心力衰竭的患者的不良事件(例如死亡率)的预测。其可以包括对所述患者的恢复机会或死亡机会的估计。“不良事件”被定义为心力衰竭的恶化或失代偿、以及死亡率。“死亡率”被定义为心血管死亡(可归因于例如心肌缺血和梗死、心力衰竭、心脏停搏或脑血管意外)和非心血管死亡率(包括所有其他死亡原因，例如感染、恶性肿瘤)。因此，在一个实施方式中，“不良预后”选自由下述组成的组：心力衰竭的恶化或失代偿，和心血管死亡率。在另一个实施方式中，不良预后是死亡率的风险。
HF，也被称为CHF，是当心脏的结构或功能的问题损害其提供足够的血流以满足身体需要的能力时发生的心脏病症。
在一个实施方式中，患者患有慢性HF。
“慢性HF”是通常具有稳定治疗的症状的长期病症(数月/数年)，其与经历对诱因(precipitating cause)的适应性反应(例如扩张、肥大)的心脏相关。然而，这些适应性反应在长期中可以是有害的，并导致恶化的状况。患有慢性HF患者可分为稳定、恶化和失代偿的慢性HF患者。慢性HF患者中的失代偿最常见的是由并发疾病(例如肺炎)、心肌梗死、心律失常、不受控制的高血压、或患者未能维持流体限制、饮食或药物引起。恶化或失代偿的慢性HF，可表征为具有HF体征和症状的变化，导致需要紧急治疗或治疗调整和住院治疗的需要。
导致心力衰竭住院的常见因素例如是急性心肌缺血、医疗方案的不符合(钠和/或流体限制)、未校正的高血压、房颤和其他心律失常、肺栓塞或并发感染。
脑啡肽酶(NEP)是具有大的胞外催化结构域、单个跨膜区和短(27个氨基酸)胞质N末端结构域的膜结合酶。其序列在Uniprot数据库(版本180，2014年7月9日最后修改)中可得，具有参考代码P08473。该酶催化包括利尿钠肽在内的许多血管舒张肽的降解，并且还有助于血管紧张素II的分解。
在本发明的方法中检测的NEP的可溶形式是不与膜结合的NEP的形式。在一个实施方式中，可溶性NEP形式与参考代码P08473的野生型的不同之处在于，其缺少跨膜和细胞内结构域，并且对应于序列SEQ ID NO:1。
本文使用的术语“患者”是指正在接受医疗护理或者由于疾病应该接受医疗护理的活的人类或非人类生物体。其包括接受病理体征调查的没有确定疾病的人。因此，本文所述的方法和测定适用于人类和兽医疾病。
在本发明第一方面的一个实施方式中，当可溶性NEP的水平高于参考值时，其表明不良预后。
由于可以从下面所示的结果推导出，遭受不良事件的风险随着NEP水平的增加而成比例地增加。对于NEP对数变换的一个标准差，遭受不良事件的风险增加约18％。
在第一方面的方法中提及的术语“参考值”应被理解为分子标志物可溶性NEP的预定值，其源自样品或样品组中的所述分子标志物的水平。样品取自已经/还未显示任何不良结果的受试者或受试者组。本领域技术人员使用公知常识能够选择更适于获得参考值的受试者或受试者组。
在一个实施方式中，从患有HF的患者群体中确定参考值。在这种情况下，如果发现当与参考值相比时可溶性NEP水平增加，则会表明患者恶化。并且，根据所述数据，临床医生能够采取适当的决定来治疗患者并使他保持存活。
在另一个实施方式中，当患有HF的患者正在由临床医生进行常规监测时，“参考值”可以对应于在监测患者开始时或在最后的健康检查中确定的可溶性NEP水平。或者作为另一种选择，如上所述，可以从还未显示出任何不良结果的患有HF的患者群体中确定参考值。以这种方式，如果发现可溶性NEP的水平增加，则表明患者正在恶化，并且可能发生不良结果。该信息将允许临床医生优化患者的治疗。
从所选择的受试者的组中获得参考值的方法是本领域现有技术中众所周知的。
例如，在下面的实施例中，参考值0.642ng/mL对应于从在动态设置中的HF患者群体中确定的可溶性NEP水平的中值。可以确定可溶性NEP水平高于所述参考值的HF患者，其不良事件的风险增加37％。
在本发明的一个实施方式中，样品选自由血液、血清、血浆、尿液、脑脊液、和细胞上清液组成的组。在另一个实施方式中，样品是血液、血浆或血清。在另一个实施方式中，样品是血清。
在本发明第一方面方法的另一个实施方式中，确定可溶性NEP的浓度。
在一个实施方式中，可溶性NEP的水平通过免疫测定技术确定。
“免疫测定”是通过使用抗体、免疫球蛋白、或它们的片段测量溶液中大分子的存在或浓度的生物化学测试。免疫测定具有许多不同的形式和变化。免疫测定可以是在测定的不同点加入试剂及洗去或分离的多个步骤中进行。多步测定通常被称为分离免疫测定或异质免疫测定。一些免疫测定可以简单地通过混合试剂和样品并进行物理测量来进行。这样的测定被称为均质免疫测定或较不频繁的非分离免疫测定。在免疫测定中经常使用校准液。校准液是已知含有所讨论的分析物的溶液，该分析物的浓度通常是已知的。对实际样品的测定响应与由校准物产生的测定响应的比较使得可以根据样品中分析物的存在或浓度来解释信号强度。
有利的是，确定蛋白质的浓度，而测定样品中NEP的总量，而不管其是否具有活性，从而获得关于体液中循环的真实可溶性NEP水平的更准确的信息，因此具有对疾病的适当预后的优势。
有利的是，免疫测定克服了酶法所显示的一些缺陷，诸如由于底物的易感性以及酶的催化位点可以在疾病的不同阶段期间改变的事实。
通常可以将免疫测定分为：竞争性均质免疫测定；竞争性异质免疫测定；单位点非竞争性免疫测定；和双位点非竞争性免疫测定。
在一个实施方式中，免疫测定是竞争性均质免疫测定。在另一个实施方式中，免疫测定是ELISA。
市场上有几种可用于确定可溶性NEP浓度的ELISA试剂盒，例如由R&D Systems、Raybiotech或Aviscera Bioscience等销售的试剂盒。
在一个实施方式中，当进行ELISA分析时，样品在温育前稀释1/10至1/2。在另一个实施方式中，样品在温育前稀释至1/4。
在另一个实施方式中，当进行ELISA时，在选自25℃～37℃的温度范围的恒定温度下，在1000rpm混合下进行温育步骤。在另一个实施方式中，温育步骤的恒定温度为30℃。
在另一个实施方式中，当进行ELISA时，孵育步骤进行120小时～180小时。在另一个实施方式中，温育步骤为150分钟。
在另一个实施方式中，进行ELISA检测：(a)在温育前稀释1/4的血清样品；并在30℃，1000rpm下将混合物温育150分钟。在这种条件下，本发明的发明人发现实现了灵敏度的改善。
第三方面，本发明提供了用于进行本发明的第一方面的方法中的任一种的手段的用途。
在本发明中，术语“具有与可溶性NEP结合的能力的抗体或其片段”应理解为能够结合由可溶性NEP限定的抗原的任何免疫球蛋白或其片段。其包括单克隆和多克隆抗体。术语“其片段”包括具有适合结合NEP表位的大小和构象的抗体的任何部分。适合的片段包括F(ab)、F(ab')和Fv。“表位”是被免疫系统(B细胞、T细胞或抗体)识别抗原的部分。
在本领域现有技术中存在制备和表征抗体的众所周知的手段。产生多克隆抗体的方法在本领域中是众所周知的。简单来说，通过用免疫原性组合物免疫动物并从该免疫动物中收集血清来制备多克隆抗体。多种动物物种可用于产生抗血清。通常用于产生抗血清的动物可以是兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或羊。
另一方面，单克隆抗体(MAbs)可以使用众所周知的技术容易地制备。制备单克隆抗体的程序通常与沿制备多克隆抗体相同的路线开始。如上所述向动物注射抗原。抗原可与佐剂混合，诸如弗氏完全或不完全佐剂。大约每两周重复用相同抗原的疫苗接种。免疫后，选择具有抗体产生潜力的体细胞，具体而言，B淋巴细胞(B细胞)，以用于MAb产生的方案。这些细胞可以从活检的脾脏、淋巴结或扁桃体或从外周血样品中获得。然后将来自免疫动物产生抗体的B淋巴细胞与来自永生性骨髓瘤细胞系的细胞进行融合，所述永生性骨髓瘤细胞通常来自与免疫动物相同的物种。在融合方法中足以用于产生杂交瘤的骨髓瘤细胞系优选不产生抗体的细胞，但其具有高融合效率和酶缺陷，从而使得它们不能在仅支持期望的融合细胞(杂交瘤)生长的某些培养基中生长。
在一个实施方式中，使用多克隆抗体检测可溶性NEP，例如由USCN Life SciencesInc；LifeSpan Biosciences或RayBiotech等提供的抗体。
在一个实施方式中，所述手段是与可溶性NEP特异性结合的抗体或其片段。
在另一个实施方式中，所述手段形成试剂盒的一部分。
试剂盒可以另外包含用于使相互作用可视化(浸渍条，化学发光试剂，比浊试剂等)的其他手段(添加剂，溶剂)。在实施例中公开了用于使抗原-抗体相互作用可视化的适合的添加剂、溶剂和试剂。
本发明的体外方法提供了预后信息。在一个实施方式中，可以在适合的数据载体中收集预后信息。适合的数据载体的实例为纸、CD、USB、PC中的计算机档案、或具有相同信息的声音注册。
最后，第四方面，本发明提供了一种决定或推荐是否对患有HF的患者启动基于NEP抑制剂的医疗方案的方法。
在本发明第四方面的一个实施方式中，受试者是患有HF的患者。
在本发明第四方面的另一个实施方式中，受试者是患有HF的患者，并且当与参考值相比时，较高水平的可溶性NEP指示不良预后。
NEP抑制剂的说明性非限制性实例为AHU-377、LCZ696的组分；Omapatrilat；RB-101；和UK-414.495。
在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”和该词语的变体不旨在排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。此外，词语“包括”涵盖“由...组成”的情况。在阅读说明书后，本发明的另外的目的、优点和特征对于本领域技术人员来说将变得显而易见，或者可以通过本发明的实践来知道。提供以下实施例和附图作为说明，并且它们不旨在限制本发明。与附图相关的并且放置在权利要求中的括号中的参考标记仅用于试图增加权利要求的可理解性，并且不应被解释为限制权利要求的范围。此外，本发明涵盖本文所述的特定和优选实施方式的所有可能的组合。
实施例
1.方法
研究人群
从2006年5月～2013年5月，在多学科HF诊所接受治疗的门诊患者被连续纳入研究中。如Bayes-Genis A.等(Bayes-Genis A.等.，2012)所述制备转诊纳入标准和血液样品的获得。总之，患者是通过心脏病学或内科部门转诊HF诊所的，较少程度是从急诊或其他医院部门转诊HF诊所的。主要转诊标准是根据欧洲心脏病学会指导的HF，不论病因，至少一次HF住院或左心室射血分数(LVEF)的减少。从存储在-80℃的无先前冻融循环的相同血液样品中分析NEP和NT-proBNP。所有样品在09:00am～12:00pm之间获得。
所有参与者提供书面知情同意书，当地伦理委员会批准了该研究。所有研究程序都符合1983年修订的1975年赫尔辛基宣言中概述的道德标准。
随访和结果
所有患者均按照预定的间隔进行随访，在失代偿的情况下需要额外的访问。定期访问时间表包括护士的最少每季度访问，医生的每两年访问，以及老年科医生、精神科医生和康复医生的选择性访问。没有参加定期访问的患者通过电话联系。
主要结果是心血管(CV)死亡或HF住院治疗的复合。也对CV和全因死亡(all-causedeath)也作为次要结果进行了探索。如果死亡是由以下原因引起的，则认为其是CV死亡：心力衰竭(在没有其他原因的情况下，失代偿性心力衰竭或治疗抗性心力衰竭)；猝死(没有证据表明心力衰竭恶化或任何其他死亡原因的之前稳定的患者的见证或未见证的意外死亡)；急性心肌梗死(AMI)(与AMI时间直接相关，无论是由于机械、血液动力学或心律失常并发症)；中风(与最近出现的急性神经功能缺陷相关)；程序性(procedural)(诊断后或治疗后程序死亡)；和其他心血管原因(例如，动脉瘤破裂、外周局部缺血、或主动脉夹层)。从HF诊所记录、其他医院病房和从加泰罗尼亚电子历史记录中鉴定确定住院情况。从HF诊所记录、其他医院病房、急诊室、全科医生、和通过联系患者的亲属确定致命事件。此外，数据从加泰罗尼亚和西班牙卫生系统的数据库验证。
脑啡肽酶测定
使用修改的夹心免疫测定(HUMAN NEP/CD10ELISA试剂盒，AvisceraBiosciences，Santa Clara，USA，Ref.SK00724-01，Lot No.20111893)测量人NEP。为了改善方法的分析灵敏度并获得样品定量的下限，进行了几种修改：a)在温育前将血清等分试样在制造商提供的稀释缓冲液(DB09)中稀释1/4；b)将试剂盒转移到在30℃的恒定温度时以1000rpm混合的进行所有温育的自动化机器人平台(Basic Radim Immunoassay Operator2[BRIO 2]，Radim spa，Pomezia，Italy)；和c)将初始样品温育延长至150分钟，从而在校准曲线中获得更高的斜率和更好的测定灵敏度。修改后的方案显示分析测量范围为0.250ng/mL～16ng/mL。测定内和测定间的变异系数分别为3.7％和8.9％。
NT-proBNP测定
使用免疫-电-化学发光测定在Modular Analytics E 170(Roche Diagnostics)上从血清确定NT-proBNP水平。该测定与生物活性BNP具有<0.001％的交叉反应性，并且在此报告的成分研究中，该测定具有0.9％～5.5％的批间(inter-run)变异系数。
hs-cTnT测定
使用制造商的说明书在Modular Analytics E 170(Roche Diagnostics)上使用hs-cTnT测定通过电化学发光免疫测定从血清样品中测量肌钙蛋白水平。hs-cTnT测定具有3ng/L～10,000ng/L的分析范围。在13ng/L的第99百分位数值时，变异系数为9％。该测定的分析性能已经得到验证，并且符合用于诊断心肌坏死的任务组的推荐。
hs-ST2测定
根据制造商的说明书使用高灵敏度夹心单克隆免疫测定(PresageTM sST2测定，Critical Diagnostics，San Diego，CA，USA)从血清样品测量ST2。hs-ST2测定具有<2.5％的批内(within-run)系数和4％的总变异系数。
统计分析
分类变量以百分比表示。连续变量表示为根据正态或非正态分布的平均值±标准差或中值(Q1-Q3)。使用正常Q-Q图来评估正态分布。使用rho Spearman系数分析NEP水平和年龄之间的相关性、左心室射血分数(LVEF)、NT-proBNP和估计的肾小球滤过率(CKD-EPI)。使用Mann-Whitney U检验评估性别和病因组之间NEP浓度的差异。使用Spearman检验计算纽约心脏协会(NYHA)功能类组的NEP水平的统计学差异(趋势的P值)。进行经年龄调整的Cox回归分析，并对复合主要终点和CV死亡率相对于NEP中值的存活曲线作图。还使用Cox回归模型进行多变量存活分析。对NEP值进行对数转换，1SD用于危险比(HR)计算。在模型中引入以下变量：年龄、性别、HF的缺血性病因、LVEF、NYHA功能性类别、糖尿病的存在、血红蛋白(g/dL)、血清钠(mmol/L)、估计的肾小球滤过率、NT-proBNP、β-阻断剂治疗、血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)或血管紧张素II受体阻断剂(ARB)治疗、和NEP。使用SPSS15(SPSS Inc.，Chicago，IL)进行统计分析。双侧P<0.05被认为是显著的。
结果
循环可溶性NEP是在2006年5月～2013年5月连续参加的1069名HF患者中测量的。表1显示了满足PARADIGM-HF研究纳入标准(NYHA II-IV级，LVEF≤35％，NTproBNP≥600ng/L或NTproBNP≥400ng/L，如果前一年HF入院，除非禁忌或不耐受，用ACEI或ARB以及用β-阻断剂治疗；PARADIGM样组群，N＝480)的整个样品和亚组患者的基线特征。在4.1±2.4年的平均随访期期间，449名患者死亡，247名为CV原因，169名为非CV原因(37.6％)和33名为未知原因(7.3％)死亡。在已知的CV原因中，128名(51.8％)患者是由于难治性HF，53名(21.4％)患者发生猝死，23名(9.3％)患者发生急性心肌梗死。235名患者在随访期间住院接受HF住院治疗，335名患者符合CV死亡或HF住院的主要终点。5名患者失去随访和充分审查。
循环可溶性NEP
中值可溶性NEP水平为0.642ng/ml(Q1-Q3 0.385ng/mL～1.219ng/mL)。156名患者(14.6％)的NEP水平低于分析测量范围。NEP水平适度但与年龄显著相关(rho 0.16，p<0.001)；与此相反，NET和LVEF(rho 0.02，p＝0.35)、估计的肾小球滤过率(rho0.05，p＝0.1)、NTproBNP(rho＝-0.01，p＝0.68)、或NYHA功能性分类(趋势的p为0.72)之间无相关性。NEP水平没有性别差异(p＝0.28)，但在非缺血性患者中显著高于缺血性患者(分别为0.690ng/ml[0.450-1.401]vs.0.611ng/ml[0.328-1.046]；p＝0.002)。
NEP和结果
相对于中值的年龄调整的NEP值与CV死亡或HF住院的复合主要终点(HR 1.37[95％CI 1.11-1.69]，p＝0.003)、CV死亡(HR 1.60[95％CI 1.24-2.06]，p<0.001)和全因死亡(HR 1.27[95％CI 1.06-1.53]，p＝0.01)之间是显著相关的。图1示出了CV死亡复合终点相对于NEP中值的发散存活曲线。
作为连续变量，经年龄调整NEP也与CV死亡或HF住院的复合主要终点(HR1.17[95％CI 1.06-1.29]，p＝0.001)、和CV死亡(HR 1.19[95％CI 1.06-1.32]，p＝0.002)之间是显著相关的；在全因死亡中具有显著性的趋势(HR 1.09[95％CI 1.00-1.19]，p＝0.06)。在包括NT-proBNP在内的综合多变量分析中，可溶性NEP与复合主要终点(HR 1.18[95％CI1.07-1.31]，p＝0.001)和CV死亡率(HR 1.18[95％CI 1.05-1.32]，p＝0.006)仍然是显著相关的(表2)。
还检查了这种现实生活的HF系列中的PARADIGM样组群，循环NEP水平与综合多变量分析中的CV死亡或HF住院的复合主要终点(HR 1.23[95％CI 1.05-1.43]，p＝0.008)仍然是显著相关的。
总之，HF是一种临床疾病，其特征在于包括肾素-血管紧张素-醛固酮系统和利尿钠肽在内的多种神经激素途径的上调。在利尿钠肽轴内，NEP是关键的酶。本发明的发明人首次证明了在患有HF的患者的循环中发现高水平的NEP，并且NEP浓度是不良结果(CV死亡率和发病率)的指示。
此外，报道的数据表明已经存在于ARNi LCZ696中的NEP抑制对于将新型病理生理贡献物靶向HF而言是必要的，并且对于改善患者结果是至关重要的。
表1
*平均值±标准差；中值(Q1-Q3)；1030名患者中可得的NTproBNP。
ACEI，血管紧张素转换酶抑制剂；ARB，血管紧张素II受体阻断剂；eGFR，估计的肾小球滤过率(CKD-EPI)；Etoh，酒精性心肌病；HF，心力衰竭；LVEF，左心室射血分数；MRA：矿物皮质激素受体拮抗剂；NT-proBNP，N末端脑利尿钠肽的激素原；NYHA，纽约心脏协会。
表2复合主要终点和CV死亡的风险的多变量Cox回归分析
表3包括复合主要终点和CV死亡的风险的其他生物标志物(NT-proBNP、hs-cTnT和ST2)的多变量Cox回归分析
HR，95％CI和P值是在含该变量的最终步骤中获得的那些。复合主要终点被限定为心血管死亡或HF住院。*NT-proBNP、hs-cTnT和脑啡肽酶作为log(NT-proBNP)、log(hs-cTnT)和log(脑啡肽酶)/1SD；CI
置信区间：#由于自变量与因变量的二次关系，二次项也包括在该模型中；
HR，危险比；HF，心力衰竭；LVEF，左心室射血分数；NYHA，纽约心脏协会；eGFR，估计的肾小球滤过率(CKD-EPI)；ACEI，血管紧张素转换酶抑制剂；ARB，血管紧张素II受体阻断剂；NT-proBNP，N末端脑利尿钠肽的激素原；Hs-cTnT＝高灵敏度心肌肌钙蛋白；ST2＝可溶性ST2。
参考文献
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<212> PRT
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<400> 1
Asp Asp Gly Ile Cys Lys Ser Ser Asp Cys Ile Lys Ser Ala Ala Arg
1 5 10 15
Leu Ile Gln Asn Met Asp Ala Thr Thr Glu Pro Cys Thr Asp Phe Phe
20 25 30
Lys Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Leu Lys Arg Asn Val Ile Pro Glu Thr
35 40 45
Ser Ser Arg Tyr Gly Asn Phe Asp Ile Leu Arg Asp Glu Leu Glu Val
50 55 60
Val Leu Lys Asp Val Leu Gln Glu Pro Lys Thr Glu Asp Ile Val Ala
65 70 75 80
Val Gln Lys Ala Lys Ala Leu Tyr Arg Ser Cys Ile Asn Glu Ser Ala
85 90 95
Ile Asp Ser Arg Gly Gly Glu Pro Leu Leu Lys Leu Leu Pro Asp Ile
100 105 110
Tyr Gly Trp Pro Val Ala Thr Glu Asn Trp Glu Gln Lys Tyr Gly Ala
115 120 125
Ser Trp Thr Ala Glu Lys Ala Ile Ala Gln Leu Asn Ser Lys Tyr Gly
130 135 140
Lys Lys Val Leu Ile Asn Leu Phe Val Gly Thr Asp Asp Lys Asn Ser
145 150 155 160
Val Asn His Val Ile His Ile Asp Gln Pro Arg Leu Gly Leu Pro Ser
165 170 175
Arg Asp Tyr Tyr Glu Cys Thr Gly Ile Tyr Lys Glu Ala Cys Thr Ala
180 185 190
Tyr Val Asp Phe Met Ile Ser Val Ala Arg Leu Ile Arg Gln Glu Glu
195 200 205
Arg Leu Pro Ile Asp Glu Asn Gln Leu Ala Leu Glu Met Asn Lys Val
210 215 220
Met Glu Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Ala Thr Ala Lys Pro Glu Asp
225 230 235 240
Arg Asn Asp Pro Met Leu Leu Tyr Asn Lys Met Thr Leu Ala Gln Ile
245 250 255
Gln Asn Asn Phe Ser Leu Glu Ile Asn Gly Lys Pro Phe Ser Trp Leu
260 265 270
Asn Phe Thr Asn Glu Ile Met Ser Thr Val Asn Ile Ser Ile Thr Asn
275 280 285
Glu Glu Asp Val Val Val Tyr Ala Pro Glu Tyr Leu Thr Lys Leu Lys
290 295 300
Pro Ile Leu Thr Lys Tyr Ser Ala Arg Asp Leu Gln Asn Leu Met Ser
305 310 315 320
Trp Arg Phe Ile Met Asp Leu Val Ser Ser Leu Ser Arg Thr Tyr Lys
325 330 335
Glu Ser Arg Asn Ala Phe Arg Lys Ala Leu Tyr Gly Thr Thr Ser Glu
340 345 350
Thr Ala Thr Trp Arg Arg Cys Ala Asn Tyr Val Asn Gly Asn Met Glu
355 360 365
Asn Ala Val Gly Arg Leu Tyr Val Glu Ala Ala Phe Ala Gly Glu Ser
370 375 380
Lys His Val Val Glu Asp Leu Ile Ala Gln Ile Arg Glu Val Phe Ile
385 390 395 400
Gln Thr Leu Asp Asp Leu Thr Trp Met Asp Ala Glu Thr Lys Lys Arg
405 410 415
Ala Glu Glu Lys Ala Leu Ala Ile Lys Glu Arg Ile Gly Tyr Pro Asp
420 425 430
Asp Ile Val Ser Asn Asp Asn Lys Leu Asn Asn Glu Tyr Leu Glu Leu
435 440 445
Asn Tyr Lys Glu Asp Glu Tyr Phe Glu Asn Ile Ile Gln Asn Leu Lys
450 455 460
Phe Ser Gln Ser Lys Gln Leu Lys Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp Lys
465 470 475 480
Asp Glu Trp Ile Ser Gly Ala Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr Ser Ser
485 490 495
Gly Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro Pro Phe
500 505 510
Phe Ser Ala Gln Gln Ser Asn Ser Leu Asn Tyr Gly Gly Ile Gly Met
515 520 525
Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg Asn
530 535 540
Phe Asn Lys Asp Gly Asp Leu Val Asp Trp Trp Thr Gln Gln Ser Ala
545 550 555 560
Ser Asn Phe Lys Glu Gln Ser Gln Cys Met Val Tyr Gln Tyr Gly Asn
565 570 575
Phe Ser Trp Asp Leu Ala Gly Gly Gln His Leu Asn Gly Ile Asn Thr
580 585 590
Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu Gly Gln Ala Tyr Arg
595 600 605
Ala Tyr Gln Asn Tyr Ile Lys Lys Asn Gly Glu Glu Lys Leu Leu Pro
610 615 620
Gly Leu Asp Leu Asn His Lys Gln Leu Phe Phe Leu Asn Phe Ala Gln
625 630 635 640
Val Trp Cys Gly Thr Tyr Arg Pro Glu Tyr Ala Val Asn Ser Ile Lys
645 650 655
Thr Asp Val His Ser Pro Gly Asn Phe Arg Ile Ile Gly Thr Leu Gln
660 665 670
Asn Ser Ala Glu Phe Ser Glu Ala Phe His Cys Arg Lys Asn Ser Tyr
675 680 685
Met Asn Pro Glu Lys Lys Cys Arg Val Trp
690 695

Claims (11)

1.确定患者的测试样品中可溶性脑啡肽酶(NEP)的浓度的试剂在制备用于确定患有心力衰竭疾病(HF)的患者的预后的试剂盒中的用途，所述测试样品选自由血液、血清和血浆组成的组。
2.如权利要求1所述的用途，其中，当可溶性NEP的浓度高于参考值时，其表明不良预后。
3.如权利要求1所述的用途，其中，所述可溶性NEP的浓度通过免疫测定技术确定。
4.如权利要求3所述的用途，其中，所述免疫测定技术是夹心测定。
5.如权利要求4所述的用途，其中，所述夹心测定是ELISA。
6.如权利要求1所述的用途，其中，所述测试样品是血清或血浆。
7.如权利要求1或2所述的用途，其中，不良预后是选自由心力衰竭的恶化或失代偿、以及死亡率组成的组的心血管事件的风险。
8.如权利要求7所述的用途，其中，所述心血管事件的风险随着可溶性NEP的浓度成比例地增加。
9.如权利要求1所述的用途，其中，所述患者患有慢性HF。
10.用于检测分离样品中可溶性NEP浓度的手段在制备用于心力衰竭疾病的预后的试剂盒中的用途，其中，所述手段是与可溶性NEP特异性结合的抗体或其片段，所述分离样品选自由血液、血清和血浆组成的组。
11.如权利要求10所述的用途，其中，所述抗体或其片段形成试剂盒的一部分。
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