CN102202664A - 包含毒蕈碱性受体拮抗剂和β2肾上腺素受体激动剂的药物产品 - Google Patents

包含毒蕈碱性受体拮抗剂和β2肾上腺素受体激动剂的药物产品 Download PDF

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艾伦.J.纳丁
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Abstract

本发明提供药物产品、试剂盒或组合物，所述药物产品、试剂盒或组合物包含第一活性成分和第二活性成分，所述第一活性成分选自毒蕈碱性受体拮抗剂，及所述第二活性成分为β2肾上腺素受体激动剂，所述药物产品、试剂盒或组合物用在呼吸系统疾病例如慢性阻塞性肺病和哮喘的治疗中。

Description

包含毒蕈碱性受体拮抗剂和β2肾上腺素受体激动剂的药物产品
技术领域
本发明涉及药物活性物质的组合，其用于治疗呼吸系统疾病，特别是慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘。
背景技术
肺的本质功能要求一种脆弱的结构广泛暴露于包括污染物、微生物、变应原(allergen)和致癌物在内的环境中。起因于生活方式选择和遗传组成的相互作用的宿主因素影响了对这种暴露的响应。对肺的伤害或感染能够产生广泛的呼吸系统疾病。这些疾病中的多种具有巨大的公共卫生重要性。呼吸系统疾病包括急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、职业性肺病、肺癌、结核、纤维化、尘肺、肺炎、肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘。
最常见的呼吸系统疾病是哮喘。哮喘一般被定义为气道的炎性病症，其临床症状由间歇性气流阻塞引起。其临床特征为喘鸣、呼吸困难和咳嗽的发作。它是一种慢性衰竭性病症，其患病率和严重性似乎一直在增加。据估计在发达国家的人口中，15％的儿童和5％的成人患有哮喘。因此，治疗应该针对症状的控制，从而使正常的生活成为可能，同时为治疗根本性炎症提供基础。
COPD是表示一大类能够干扰正常呼吸的肺病的术语。目前的临床准则将COPD定义为以不完全可逆的气流受限为特征的病症。气流受限通常既是进行性的，又与肺对有害颗粒和气体的异常炎性响应有关。上述颗粒和气体的最重要贡献来源至少在西方世界是吸烟。COPD患者具有多种症状，包括咳嗽、呼吸短促和痰生成过多；上述症状源于大量细胞腔隙(包括嗜中性粒细胞、巨噬细胞和上皮细胞)的功能障碍。COPD涵盖的两种最重要的病症是慢性支气管炎和肺气肿。
慢性支气管炎是支气管的长期炎症，其导致粘液生成增加及其它变化。患者的症状为咳嗽和咳痰。慢性支气管炎可引起更频繁和更严重的呼吸系统感染、支气管变窄和堵塞、呼吸困难和能力丧失。
肺气肿是影响肺泡和/或最小支气管末梢的慢性肺病。肺丧失其弹性，因此肺的这些区域变得肿大。这些肿大的区域困住陈腐的气体，且不能有效地使陈腐的气体与新鲜的空气进行交换。这导致呼吸困难，且可能导致对血液的供氧不足。肺气肿患者的主要症状是呼吸短促。
用于治疗呼吸系统疾病的治疗剂包括β2肾上腺素受体激动剂。这些药物(也称为β2激动剂)也可用于如下缓解呼吸系统疾病的症状：使支气管平滑肌松弛、减少气道阻塞、减少肺充气过度和减少呼吸短促。作为每日给药一次的β2激动剂的正在进行评价化合物参见Expert Opin.Investig.Drugs 14(7)，775-783(2005)。
用于治疗呼吸系统疾病的另一类治疗剂为毒蕈碱性拮抗剂。毒蕈碱性受体是一个G蛋白偶联受体(GPCR)家族，其具有五种家族成员M1、M2、M3、M4和M5。在这五种毒蕈碱性亚型中，已知三种(M1、M2和M3)对人肺组织具有生理学作用。副交感神经是人气道中反射性支气管收缩的主要途径，且通过释放乙酰胆碱到毒蕈碱性受体上来调节气道张力。气道张力在患有呼吸系统病症例如哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)的患者中是增加的，因此已开发出毒蕈碱性受体拮抗剂以用于治疗气道疾病。毒蕈碱性受体拮抗剂(在临床实践中通常称为抗胆碱能药)作为针对COPD个体的一线治疗已得到广泛的接受，且其用途已在文献中深入报道(例如Lee等人，Current Opinion in Pharmacology 2001，1，223-229)。
尽管用β2肾上腺素受体激动剂或毒蕈碱性拮抗剂进行的治疗可得到重要的益处，但这些药物的效力通常远不能令人满意。此外，鉴于呼吸系统疾病例如哮喘和COPD的复杂性，单独的任意一种调节剂不可能令人满意地治疗所述疾病。因此，医学上迫切需要针对呼吸系统疾病例如COPD和哮喘的新疗法，特别是具有疾病改善潜力的疗法。
发明内容
本发明提供药物产品，其以组合方式包含第一活性成分和第二活性成分，所述第一活性成分为选自以下的毒蕈碱性拮抗剂：
(R)-1-[5-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-[1，3，4]噁二唑-2-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X；
(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X；
(R)-3-(3-氟-4-甲基-苯氧基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X；
(R)-3-(3-氟-苯基硫基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X；
(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X；
其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子；及
所述第二活性成分为β2肾上腺素受体激动剂。
如果本发明毒蕈碱性拮抗剂与β2肾上腺素受体激动剂联用，则可在呼吸系统疾病的治疗中观察到有益的治疗作用。当将所述两种活性物质同时给药(在单一的药物制剂中或经由分开的药物制剂)或经由分开的药物制剂依次或分开给药时，可观察到有益作用。
本发明药物产品可为例如以混合物形式包含第一活性成分和第二活性成分的药物组合物。可选择地，所述药物产品可为例如试剂盒，其包含第一活性成分的制剂和第二活性成分的制剂及任选的有关向有此需要的患者同时、依次或分开给药所述制剂的说明书。
本发明组合中的第一活性成分为选自以下的毒蕈碱性拮抗剂：
(R)-1-[5-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-[1，3，4]噁二唑-2-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X；
(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X；
(R)-3-(3-氟-4-甲基-苯氧基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X；
(R)-3-(3-氟-苯基硫基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X；
(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X；
其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子。
本发明毒蕈碱性拮抗剂选自共同未决的申请PCT/GB2008/000519(WO2008/099186)中描述的一类新化合物，所述化合物对M3受体表现出高效力。所述毒蕈碱性拮抗剂的名称为基于实施例中描述的结构由Beilstein Autonom 2000命名软件包(MDL Information Systems Inc.)生成的IUPAC名称，且立体化学根据Cahn-Ingold-Prelog系统来指定。例如，名称(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷由以下结构来生成：
Figure DEST_PATH_GDA0000076476350000011
本发明毒蕈碱性拮抗剂包括与季氮原子上的正电荷结合的阴离子X。阴离子X可为任意可药用一价或多价(例如二价)酸的阴离子。在本发明实施方案中，X可为无机酸的阴离子，例如氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根离子、硝酸根离子或磷酸根离子；或为合适有机酸的阴离子，例如甲苯磺酸根离子、乙二磺酸根离子(乙烷-1，2-二磺酸根离子)、羟乙磺酸根离子(2-羟基乙基磺酸根离子)、乳酸根离子、油酸根离子、马来 根 
Figure BDA0000054819380000043
((Z)-3-羧基-丙烯酸根离子)、琥珀酸根离子(3-羧基- 
Figure BDA0000054819380000044
根离子)、苹果酸根离子((S)-3-羧基-2-羟基-丙酸根离子)、对乙酰氨基苯甲酸根离子、乙酸根离子、马 
Figure BDA0000054819380000045
根离子、 
Figure BDA0000054819380000046
马酸根离子、枸橼酸根离子、草酸根离子、琥珀酸根离子、酒石酸根离子、甲磺酸根离子、对甲苯磺酸根离子、苯磺酸根离子、萘二磺酸根离子(萘-1，5-二磺酸根离子)(例如半萘二磺酸根离子)、2，5-二氯苯磺酸根离子、1-羟基萘-2-甲酸根离子(昔萘酸根离子)或1-羟基萘-2-磺酸根离子。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂呈溴化物盐形式。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂选自：
(R)-1-[5-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-[1，3，4]噁二唑-2-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷溴化物；
(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷氯化物；
(R)-3-(3-氟-4-甲基-苯氧基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷溴化物；
(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷2-羟基-乙磺酸盐；
(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧 基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷苯磺酸盐；
(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷氯化物；和
(R)-3-(3-氟-苯基硫基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷溴化物。
本发明组合中的第二活性成分为β2肾上腺素受体激动剂。本发明β2肾上腺素受体激动剂可为能够刺激β2受体并用作支气管扩张剂的任意化合物或物质。除非另有说明，在本说明书上下文中，所提及的任意β2肾上腺素受体激动剂包括可由所述β2肾上腺素受体激动剂及其任意对映异构体和混合物形成的具有活性的盐、溶剂化物或衍生物。β2肾上腺素受体激动剂的盐或衍生物的可能实例为酸加成盐和可药用酯(例如C1-C6烷基酯)，所述酸加成盐为例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、枸橼酸盐、酒石酸盐、1-羟基萘-2-甲酸盐和马来酸盐。所述β2激动剂也可呈溶剂化物例如水合物形式。
可用在该实施方案药物产品中的β2肾上腺素受体激动剂的实例包括间羟异丙肾上腺素(metaproterenol)、异丙去甲肾上腺素(isoproterenol)、异丙肾上腺素(isoprenaline)、柳丁氨醇(albuterol)、沙丁胺醇(salbutamol)(例如为硫酸盐)、福莫特罗(formoterol)(例如为富马酸盐)、沙美特罗(salmeterol)(例如为昔萘酸盐)、特布他林(terbutaline)、奥西那林(orciprenaline)、比托特罗(bitolterol)(例如为甲磺酸盐)、吡布特罗(pirbuterol)和茚达特罗(indacaterol)。该实施方案中的β2肾上腺素受体激动剂可为长效β2激动剂(即活性保持多于24小时的β2激动剂)，例如沙美特罗(例如为昔萘酸盐)、福莫特罗(例如为富马酸盐)、班布特罗(bambuterol)(例如为盐酸盐)、卡莫特罗(carmoterol)(TA2005)(在化学上被确定为[R-(R*，R*)]-8-羟基-5-[1-羟基-2-[[2-(4-甲氧基-苯基)-1-甲基乙基]-氨基]乙基]-2(1H)-喹诺酮一盐酸盐，Chemical Abstract Service登记号137888-11-0，并公开在美国专利4,579,854中)、茚达特罗(CAS号312753-06-3；QAB-149)、甲酰苯胺衍生物例如WO 2002/76933中公开的3-(4-{[6-({(2R)-2-[3-(甲酰基氨基)-4-羟基苯基]-2-羟基乙基}氨基)己基]氧基}-丁基)-苯磺酰胺、苯磺酰胺衍生物例如WO 2002/88167中公开的3-(4-{[6-({(2R)-2-羟基-2-[4-羟基-3-(羟基-甲基)苯基]乙基}氨基)-己基]氧基}丁基)苯磺酰胺、WO 2003/042164和WO 2005/025555中公开的芳基苯胺受 体激动剂、WO 2004/032921和US 2005/222144中公开的吲哚衍生物及化合物GSK 159797、GSK 159802、GSK 597901、GSK 642444和GSK 678007。
在本发明实施方案中，所述β2肾上腺素受体激动剂为福莫特罗。福莫特罗的化学名称为N-[2-羟基-5-[(1)-1-羟基-2-[[(1)-2-(4-甲氧基苯基)-1-甲基乙基]氨基]乙基]苯基]-甲酰胺。福莫特罗的制备参见例如WO 92/05147。在该实施方案的一个方面，所述β2肾上腺素受体激动剂为富马酸福莫特罗。应该理解的是，本发明可使用福莫特罗的所有光学异构体及其混合物(包括外消旋体)。因此，术语福莫特罗涵盖例如N-[2-羟基-5-[(1R)-1-羟基-2-[[(1R)-2-(4-甲氧基苯基)-1-甲基乙基]氨基]乙基]苯基]-甲酰胺、N-[2-羟基-5-[(1S)-1-羟基-2-[[(1S)-2-(4-甲氧基苯基)-1-甲基乙基]氨基]乙基]苯基]-甲酰胺和上述对映异构体的混合物(包括外消旋体)。
在本发明实施方案中，所述β2肾上腺素受体激动剂选自：
N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酰胺，
N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-3-[2-(3-氯苯基)乙氧基]丙酰胺，及
7-[(1R)-2-({2-[(3-{[2-(2-氯苯基)乙基]氨基}丙基)硫基]乙基}氨基)-1-羟基乙基]-4-羟基-1，3-苯并噻唑-2(3H)-酮，
或其可药用盐。该实施方案中的β2肾上腺素受体激动剂可根据本申请实验制备部分来制备。该实施方案中的β2肾上腺素受体激动剂的名称为由IUPAC NAME，ACD Labs(版本8)命名软件包生成的IUPAC名称。
在本发明另一个实施方案中，所述β2肾上腺素受体激动剂选自：
N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酰胺二氢溴酸盐，
N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-3-[2-(3-氯苯基)乙氧基]丙酰胺二氢溴酸盐，及
7-[(1R)-2-({2-[(3-{[2-(2-氯苯基)乙基]氨基}丙基)硫基]乙基}氨基)-1-羟基乙基]-4-羟基-1，3-苯并噻唑-2(3H)-酮二氢溴酸盐。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激 动剂为福莫特罗(例如为富马酸盐)。在该实施方案的一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷氯化物。在该实施方案的另一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷苯磺酸盐。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为福莫特罗(例如为富马酸盐)。在该实施方案的一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷氯化物。在该实施方案的另一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷2-羟基-乙磺酸盐。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[5-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-[1，3，4]噁二唑-2-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为福莫特罗(例如为富马酸盐)。在该实施方案的一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[5-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-[1，3，4]噁二唑-2-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷溴化物。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-3-(3-氟-苯基硫基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为福莫特罗(例如为富马酸盐)。在该实施方案的一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-3-(3-氟-苯基硫基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷溴化物。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-3-(3-氟-4-甲基-苯氧基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为福莫特罗(例如为富马酸盐)。在该实施方案的一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-3-(3-氟-4-甲基-苯氧基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷溴化物。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酰胺或其可药用盐(例如二氢溴酸盐)。在该实施方案的一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷氯化物。在该实施方案的另一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷苯磺酸盐。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酰胺或其可药用盐(例如二氢溴酸盐)。在该实施方案的一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为
(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷氯化物。在该实施方案的另一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷2-羟基-乙磺酸盐。在该实施方案的另一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷2-羟基-乙磺酸盐。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[5-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-[1，3，4]噁二唑-2-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酰胺或其可药用盐(例如二氢溴酸盐)。在该实施方案的一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[5-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-[1，3，4]噁二唑-2-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷溴化物。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-3-(3-氟-苯基硫 基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酰胺或其可药用盐(例如二氢溴酸盐)。在该实施方案的一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-3-(3-氟-苯基硫基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷溴化物。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-3-(3-氟-4-甲基-苯氧基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酰胺或其可药用盐(例如二氢溴酸盐)。在该实施方案的一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-3-(3-氟-4-甲基-苯氧基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷溴化物。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为7-[(1R)-2-({2-[(3-{[2-(2-氯苯基)乙基]氨基}丙基)硫基]乙基}氨基)-1-羟基乙基]-4-羟基-1，3-苯并噻唑-2(3H)-酮或其可药用盐(例如二氢溴酸盐)。在该实施方案的一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷氯化物。在该实施方案的另一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为
(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷苯磺酸盐。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为7-[(1R)-2-({2-[(3-{[2-(2-氯苯基)乙基]氨基}丙基)硫基]乙基}氨基)-1-羟基乙基]-4-羟基-1，3-苯并噻唑-2(3H)-酮或其可药用盐(例如二氢溴酸盐)。在该实施方案的一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基- 羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷氯化物。在该实施方案的另一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为
(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷2-羟基-乙磺酸盐。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[5-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-[1，3，4]噁二唑-2-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为7-[(1R)-2-({2-[(3-{[2-(2-氯苯基)乙基]氨基}丙基)硫基]乙基}氨基)-1-羟基乙基]-4-羟基-1，3-苯并噻唑-2(3H)-酮或其可药用盐(例如二氢溴酸盐)。在该实施方案的一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[5-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-[1，3，4]噁二唑-2-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷溴化物。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-3-(3-氟-苯基硫基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为7-[(1R)-2-({2-[(3-{[2-(2-氯苯基)乙基]氨基}丙基)硫基]乙基}氨基)-1-羟基乙基]-4-羟基-1，3-苯并噻唑-2(3H)-酮或其可药用盐(例如二氢溴酸盐)。在该实施方案的一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-3-(3-氟-苯基硫基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷溴化物。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-3-(3-氟-4-甲基-苯氧基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为7-[(1R)-2-({2-[(3-{[2-(2-氯苯基)乙基]氨基}丙基)硫基]乙基}氨基)-1-羟基乙基]-4-羟基-1，3-苯并噻唑-2(3H)-酮或其可药用盐(例如二氢溴酸盐)。在该实施方案的一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-3-(3-氟-4-甲基-苯氧基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷溴化物。
在本发明实施方案中，所述β2肾上腺素受体激动剂为N-环己基-N3-[2-(3-氟苯基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-β-丙氨酸酰胺
(N-Cyclohexyl-N3-[2-(3-fluorophenyl)ethyl]-N-(2-{[2-(4-hydroxy-2-oxo-2，3-dih ydro-1，3-benzothiazol-7-yl)ethyl]amino}ethyl)-β-alaninamide)或其可药用盐。该 实施方案中的β2肾上腺素受体激动剂可根据WO2008/075026 A1来制备。在该实施方案的另一个方面，所述β2肾上腺素受体激动剂为N-环己基-N3-[2-(3-氟苯基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-β-丙氨酸酰胺二-三氟乙酸盐。在该实施方案的另一个方面，所述β2肾上腺素受体激动剂为N-环己基-N3-[2-(3-氟苯基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-β-丙氨酸酰胺二氢溴酸盐。在该实施方案的另一个方面，所述β2肾上腺素受体激动剂为N-环己基-N3-[2-(3-氟苯基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-β-丙氨酸酰胺二-D-扁桃酸盐。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为N-环己基-N3-[2-(3-氟苯基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-β-丙氨酸酰胺或其可药用盐(例如二氢溴酸盐或二-D-扁桃酸盐)。在该实施方案的一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷氯化物。在该实施方案的另一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷苯磺酸盐。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为N-环己基-N3-[2-(3-氟苯基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-β-丙氨酸酰胺或其可药用盐(例如二氢溴酸盐或二-D-扁桃酸盐)。在该实施方案的一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷氯化物。在该实施方案的另一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷2-羟基-乙磺酸盐。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[5-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-[1，3，4]噁二唑-2-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2] 辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为N-环己基-N3-[2-(3-氟苯基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-β-丙氨酸酰胺或其可药用盐(例如二氢溴酸盐或二-D-扁桃酸盐)。在该实施方案的一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[5-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-[1，3，4]噁二唑-2-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷溴化物。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-3-(3-氟-苯基硫基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为N-环己基-N3-[2-(3-氟苯基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-β-丙氨酸酰胺或其可药用盐(例如二氢溴酸盐或二-D-扁桃酸盐)。在该实施方案的一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-3-(3-氟-苯基硫基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷溴化物。
在本发明实施方案中，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-3-(3-氟-4-甲基-苯氧基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为N-环己基-N3-[2-(3-氟苯基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-β-丙氨酸酰胺或其可药用盐(例如二氢溴酸盐或二-D-扁桃酸盐)。在该实施方案的一个方面，所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-3-(3-氟-4-甲基-苯氧基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷溴化物。
本发明组合可在呼吸系统疾病的治疗中提供有益的治疗作用。上述作用的可能实例包括改善以下参数中的一种或多种：减少炎性细胞向肺中的流入、轻度和重度恶化、FEV1(一秒内的用力呼气量)、肺活量(VC)、呼气流量峰值(PEF)、症状评分和生活质量。
可同时、依次或分开给药本发明毒蕈碱性拮抗剂(第一活性成分)和β2肾上腺素受体激动剂(第二活性成分)以治疗呼吸系统疾病。依次是指以任意顺序一种活性成分紧接另一种活性成分来给药所述活性成分。如果将它们分开给药，则它们仍可具有所期望的作用，但当以该方式进行给药时，它们的给药间隔通常小于4小时，更优选小于2小时，更优选小于30分钟，及最优 选小于10分钟。
本发明活性成分可如下给药：使用常规系统给药剂型进行口服和胃肠外(例如静脉内、皮下、肌内或关节内)给药，所述常规系统给药剂型为例如片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、水性或油性溶液剂或混悬剂、乳剂和无菌注射用水性或油性溶液剂或混悬剂。所述活性成分也可按溶液剂、混悬剂、气雾剂和干粉剂的形式来局部给药(给药至肺和/或气道)。这些剂型通常包含一种或多种可药用成分，所述可药用成分可选自例如辅料、载体、粘合剂、润滑剂、稀释剂、稳定剂、缓冲剂、乳化剂、粘度调解剂、表面活性剂、防腐剂、矫味剂和着色剂。本领域技术人员应该理解的是，给药所述活性成分的最合适方法取决于多种因素。
在本发明实施方案中，所述活性成分经由分开的药物制剂来给药。因此，在一个方面，本发明提供试剂盒，其包含第一活性成分(其为本发明毒蕈碱性拮抗剂)的制剂和第二活性成分的制剂(其为β2肾上腺素受体激动剂)及任选的有关向有此需要的患者同时、依次或分开给药所述制剂的说明书。
在另一个实施方案中，所述活性成分可经由单一的药物组合物来给药。因此，本发明还提供药物组合物，其以混合物形式包含第一活性成分(其为本发明毒蕈碱性拮抗剂)及第二活性成分(其为β2肾上腺素受体激动剂)。
本发明药物组合物可如下制备：对所述毒蕈碱性拮抗剂(第一活性成分)与β2肾上腺素受体激动剂(第二活性成分)及可药用辅料、稀释剂或载体进行混合。因此，本发明另一个方面提供制备药物组合物的方法，所述方法包括对本发明毒蕈碱性拮抗剂与β2肾上腺素受体激动剂及可药用辅料、稀释剂或载体进行混合。
应该理解的是，根据本发明来给药的每种活性成分的治疗剂量将基于所使用的具体活性成分、给药所述活性成分的模式和待治疗的病症或障碍而变化。
在本发明实施方案中，本发明毒蕈碱性拮抗剂经由吸入来给药。当经由吸入来给药时，本发明毒蕈碱性拮抗剂的剂量范围通常为0.1微克(μg)至5000μg、0.1至1000μg、0.1至500μg、0.1至100μg、0.1至50μg、0.1至5μg、5至5000μg、5至1000μg、5至500μg、5至100μg、5至50μg、5至10μg、10至5000μg、10至1000μg、10至500μg、10至100μg、10至50μg、20至5000μg、20至1000μg、20至500μg、20至100μg、20至50μg、50至5000μg、 50至1000μg、50至500μg、50至100μg、100至5000μg、100至1000μg或100至500μg。所述剂量通常以每天1-4次来给药，优选为每天一次或两次，且最优选为每天一次。
在本发明实施方案中，所述β2肾上腺素受体激动剂可优选通过吸入来给药。当经由吸入来给药时，所述β2肾上腺素受体激动剂的剂量范围通常为0.1至50μg、0.1至40μg、0.1至30μg、0.1至20μg、0.1至10μg、5至10μg、5至50μg、5至40μg、5至30μg、5至20μg、5至10μg、10至50μg、10至40μg、10至30μg或10至20μg。所述剂量通常以每天1-4次来给药，优选为每天一次或两次，且最优选为每天一次。
在一个实施方案中，本发明提供药物产品，其以组合方式包含第一活性成分(其为毒蕈碱性拮抗剂)及第二活性成分(其为β2肾上腺素受体激动剂)，其中将每种活性成分配制成用于吸入给药。
在一个实施方案中，可将活性成分的药物制剂同时给药。
在一个实施方案中，可将活性成分的不同药物制剂依次给药。
在一个实施方案中，可将活性成分的不同药物制剂分开给药。
本发明活性成分优选以溶液剂、混悬剂、气雾剂和干粉剂的形式经由吸入来给药(例如局部给药至肺和/或气道)。例如，可使用计量剂量吸入器装置来给药分散于合适的推进剂中及带有或不带有其它赋型剂的活性成分，所述其它赋型剂为例如乙醇、表面活性剂、润滑剂或稳定剂。合适的推进剂包括烃、氯氟碳和氢氟烷(例如七氟烷)推进剂或任意上述推进剂的混合物。优选的推进剂是P134a和P227，它们各自可单独使用或与其它推进剂和/或表面活性剂和/或其它赋型剂联用。雾化水性混悬剂或优选为雾化水性溶液剂也可按单剂量或多剂量的形式来使用，其中调节或不调节适当的pH和/或张度。
所述活性成分的干粉剂和加压HFA气雾剂可通过口服吸入或经鼻吸入来给药。就吸入而言，化合物优选为微细分散的。微细分散的化合物优选具有小于10μm的质量中位直径，且可在分散剂的辅助下混悬在推进剂混合物中，所述分散剂为例如C8-C20脂肪酸或其盐(例如油酸)、胆汁盐、磷脂、烷基糖、全氟化表面活性剂、聚乙氧基化表面活性剂或其它可药用分散剂。
一种可能性是对微细分散的本发明化合物与载体物质进行混合，所述载体物质为例如单糖、二糖、多糖、糖醇或其它多元醇。适当的载体为糖，例 如乳糖、葡萄糖、棉子糖、松三糖、乳糖醇、麦芽醇、海藻糖、蔗糖、甘露醇和淀粉。可选择地，微细分散的化合物可用另一种物质包衣。也可将粉末混合物分装到硬明胶胶囊中，其中每个胶囊含有所需剂量的活性化合物。
另一种可能性是将微细分散的粉末加工成小球，其在吸入过程中发生破裂。可将该球化的粉末装填到多剂量吸入器的药物贮库中，例如称为 
Figure BDA0000054819380000151
的那种吸入器，其中给药单元对所需剂量进行计量，然后所述剂量被患者吸入。用该系统将带有或不带有载体物质的活性成分给药于患者。
本发明组合可用于治疗或预防呼吸道疾病例如慢性阻塞性肺病(COPD)、所有类型的慢性支气管炎(包括与其相关的呼吸困难)、哮喘(变应性哮喘和非变应性哮喘及’喘鸣婴儿综合征’)、成人/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性呼吸系统阻塞、支气管高反应性、肺纤维化、肺气肿、变应性鼻炎、继发于其它药物治疗(特别是其它吸入药物治疗)的气道高反应性恶化或尘肺病(例如矾土肺、煤肺病、石棉肺、石末肺、驼鸟毛尘肺、肺铁末沉着病、硅肺病、烟草尘肺和棉尘肺)。
干粉吸入器可用于给药单独的活性成分或与可药用载体组合的活性成分，在后一种情况下为微细分散的粉末形式或有序的混合物形式。干粉吸入器可为单剂量或多剂量，且可使用干粉或含有干粉的胶囊。
计量剂量吸入器、喷雾器和干粉吸入器装置是公知的，且各种这样的装置是可得到的。
本发明还提供本发明药物产品、试剂盒或药物组合物，所述药物产品、试剂盒或药物组合物在治疗中同时、依次或分开使用。
本发明还提供本发明药物产品、试剂盒或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗呼吸系统疾病，特别是慢性阻塞性肺病或哮喘。
本发明还提供本发明药物产品、试剂盒或药物组合物，所述药物产品、试剂盒或药物组合物用于治疗呼吸系统疾病，特别是慢性阻塞性肺病或哮喘。
本发明还提供治疗呼吸系统疾病的方法，所述方法包括向有此需要的患者同时、依次或分开给药：
(a)一定剂量(治疗有效剂量)的第一活性成分，其为本发明毒蕈碱性拮抗剂；和
(b)一定剂量(治疗有效剂量)的第二活性成分，其为β2肾上腺素受体激动 剂。
在本说明书上下文中，除非有相反的具体说明，术语“治疗”也包括“预防”。术语“治疗的”和“治疗地”应该相应地解释。预防被认为与对以下患者进行的治疗特别有关，所述患者患有所述病症或障碍的先前发作或被认为面临所述病症或障碍的增加风险。面临形成具体病症或障碍风险的患者通常包括具有所述病症或障碍家族史的那些患者或已通过遗传学试验或筛选而被确定为特别易于形成所述病症或障碍的那些患者。
除非另有说明，术语“疾病”具有与术语“病症”和“障碍”相同的含义，且在说明书和权利要求书通篇中可互换使用。术语“药物”和“活性成分”是指包含在本发明组合中的化合物，例如毒蕈碱性拮抗剂或β2肾上腺素受体激动剂。
本发明药物产品、试剂盒或组合物可任选包含第三活性成分，所述第三活性成分为适用于治疗呼吸系统疾病的物质。本发明可涉及的第三活性成分的实例包括：
·磷酸二酯酶抑制剂，
·趋化因子受体功能调节剂，
·激酶功能抑制剂，
·蛋白酶抑制剂，
·甾类糖皮质激素受体激动剂，及
·非甾类糖皮质激素受体激动剂。
根据该实施方案可用作第三活性成分的磷酸二酯酶抑制剂的实例包括PDE4抑制剂例如同工型PDE4D抑制剂、PDE3抑制剂和PDE5抑制剂。实例包括以下化合物：
(Z)-3-(3，5-二氯-吡啶-4-基)-2-[4-(茚满-2-基氧基-5-甲氧基-吡啶-2-基]丙烯腈，
N-[9-氨基-4-氧代-1-苯基-3，4，6，7-四氢吡咯并[3，2，1-jk][1，4]苯并二氮杂 
Figure BDA0000054819380000161
-3(R)-基]吡啶-3-甲酰胺(CI-1044)，
3-(苄基氧基)-1-(4-氟苄基)-N-[3-(甲基磺酰基)苯基]-1H-吲哚-2-甲酰胺，
(1S-外型)-5-[3-(二环[2.2.1]庚-2-基氧基)-4-甲氧基苯基]四氢-嘧啶-2(1H)-酮(Atizoram)，
N-(3，5-二氯-吡啶-4-基)-2-[1-(4-氟苄基)-5-羟基-1H-吲哚-3-基]-2-氧代乙 酰胺(AWD-12-281)，
β-[3-(环戊基氧基)-4-甲氧基苯基]-1，3-二氢-1，3-二氧代-2H-异吲哚-2-丙酰胺(CDC-801)，
N-[9-甲基-4-氧代-1-苯基-3，4，6，7-四氢吡咯并[3，2，1-jk][1，4]苯并二氮杂 
Figure BDA0000054819380000171
-3(R)-基]吡啶-4-甲酰胺(CI-1018)，
顺式-[4-氰基-4-(3-环戊基氧基-4-甲氧基苯基)环己烷1-甲酸(Cilomilast)，
8-氨基-1，3-二(环丙基甲基)黄嘌呤(Cipamfylline)，
N-(2，5-二氯-吡啶-3-基)-8-甲氧基-喹啉-5-甲酰胺(D-4418)，
5-(3，5-二叔丁基-4-羟基亚苄基)-2-亚氨基噻唑烷-4-酮(Darbufelone)，
2-甲基-1-[2-(1-甲基乙基)吡唑并[1，5-a]吡啶-3-基]-1-丙酮(Ibudilast)，
甲磺酸2-(2，4-二氯苯基羰基)-3-脲基苯并呋喃-6-基酯(Lirimilast)，
(-)-(R)-5-(4-甲氧基-3-丙氧基苯基)-5-甲基噁唑烷-2-酮(Mesopram)，
(-)-顺式-9-乙氧基-8-甲氧基-2-甲基-1，2，3，4，4a，10b-六氢-6-(4-二异丙基氨基羰基苯基)-苯并[c][1，6]二氮杂萘(Pumafentrine)，
3-(环丙基甲氧基)-N-(3，5-二氯-吡啶-4-基)-4-(二氟甲氧基)苯甲酰胺(Roflumilast)，
Roflumilast的N-氧化物，
5，6-二乙氧基苯并[b]噻吩-2-甲酸(Tibenelast)，
2，3，6，7-四氢-2-(均三甲苯基亚氨基)-9，10-二甲氧基-3-甲基-4H-嘧啶并[6，1-a]异喹啉-4-酮(Trequinsin)，及
3-[[3-(环戊基氧基)-4-甲氧基苯基]-甲基]-N-乙基-8-(1-甲基乙基)-3H-嘌呤-6-胺(V-11294A)。
根据该实施方案可用作第三活性成分的趋化因子受体功能调节剂的实例包括CCR3受体拮抗剂、CCR4受体拮抗剂、CCR5受体拮抗剂和CCR8受体拮抗剂。
根据该实施方案可用作第三活性成分的激酶功能抑制剂的实例包括p38激酶抑制剂和IKK抑制剂。
根据该实施方案可用作第三活性成分的蛋白酶抑制剂的实例包括嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂或MMP12抑制剂。
根据该实施方案可用作第三活性成分的甾类糖皮质激素受体激动剂的实例包括布地奈德(budesonide)、氟替卡松(fluticasone)(例如为丙酸酯)、莫米 松(mometasone)(例如为糠酸酯)、倍氯米松(beclomethasone)(例如为17-丙酸酯或17，21-二丙酸酯)、环索奈德(ciclesonide)、氯替泼诺(loteprednol)(例如为依碳酸盐)、依替泼诺(etiprednol)(例如为二氯乙酸盐)、曲安西龙(triamcinolone)(例如为丙酮化物(acetonide))、氟尼缩松(flunisolide)、zoticasone、氟莫奈德(flumoxonide)、罗氟奈德(rofleponide)、布替可特(butixocort)(例如为丙酸酯)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、替泼尼旦(tipredane)、甾类酯例如6α，9α-二氟-17α-[(呋喃-2-基羰基)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-氟甲基酯、6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-17α-丙酰基氧基-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-(2-氧代-四氢呋喃-3(S)-基)酯和6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-17α-[(4-甲基-1，3-噻唑-5-羰基)氧基]-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-氟甲基酯、DE 4129535中披露的甾类酯、WO 2002/00679和WO 2005/041980中披露的甾类或甾类GSK 870086、GSK 685698和GSK 799943。
根据该实施方案可用作第三活性成分的非甾类糖皮质激素受体激动剂的实例包括WO2006/046916中披露的那些非甾类糖皮质激素受体激动剂。
附图说明
本发明通过以下非限制性实施例来说明。在实施例中涉及以下附图：
图1：毒蕈碱性拮抗剂(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷苯磺酸盐的X射线粉末衍射图(实施例2)。
图2：毒蕈碱性拮抗剂(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷氯化物的X射线粉末衍射图(实施例3)。
图3：毒蕈碱性拮抗剂(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷2-羟基-乙磺酸盐的X射线粉末衍射图(实施例4)。
图4：毒蕈碱性拮抗剂(R)-1-[5-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-[1，3，4]噁二唑-2-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷溴化物的X射线粉末衍射图(实施例5)。
图5：毒蕈碱性拮抗剂(R)-3-(3-氟-4-甲基-苯氧基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷溴化物的X射线粉末衍射图(实 施例7)。
图6：毒蕈碱性拮抗剂(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷2-羟基-乙磺酸盐的X射线粉末衍射图(实施例8)。
具体实施方式
毒蕈碱性拮抗剂的制备
本发明毒蕈碱性拮抗剂可如下制备。本申请所述那些盐的可代替盐可通过常规化学手段使用与所述那些盐类似的方法来制备。
制备毒蕈碱性拮抗剂的一般实验细节
除非另有说明，以下一般条件用于制备所述毒蕈碱性拮抗剂。
除非另有说明，所有反应在氮气气氛下进行。在以下条件下得到NMR光谱：在带有5mm反向检测三重共振探头的以400MHz运行的Varian Unity Inova 400光谱仪上或在带有5mm反向检测三重共振TXI探头的以400MHz运行的Bruker Avance DRX 400光谱仪上或在带有标准5mm双频探头的以300MHz运行的BrukerAvance DPX 300光谱仪上。位移以相对于四甲基甲硅烷的ppm给出。当产物通过柱色谱来纯化时，’快速硅胶’是指用于色谱的粒度为0.035至0.070mm(220至440目)的硅胶(例如Fluka硅胶60)且施加高达10p.si的氮气压力以加速柱洗脱，或使用半自动 
Figure BDA0000054819380000191
Companion纯化系统，或在减压下对 
Figure BDA0000054819380000192
Isolute Flash Si II柱进行手动洗脱，或使用 
Figure BDA0000054819380000193
SP1半自动系统。所有溶剂和商购试剂按原样使用。SCX色谱在 
Figure BDA0000054819380000194
Isolute SCX或SCX-2预装柱上进行。
所涉及的液相色谱质谱法(LCMS)如下所述：
方法1
带有C18反相柱(100×3.0mm Higgins Clipeus，5μm粒度)的Waters Micromass ZQ2000。用A：水+0.1％甲酸；B：乙腈+0.1％甲酸洗脱。梯度：
Figure BDA0000054819380000195
检测：MS、ELS、UV(100μl分流至带有在线UV检测器的MS)。MS电离方法：电喷雾(正离子)。
方法2
带有C18反相柱(30×4.6mm Phenomenex Luna，3μm粒度)的Waters Platform LC Quadrupole质谱仪。用A：水+0.1％甲酸；B：乙腈+0.1％甲酸洗脱。梯度：
Figure BDA0000054819380000202
检测：MS、ELS、UV(200μl分流至带有在线UV检测器的MS)。MS电离方法：电喷雾(正离子和负离子)。
实验部分中使用的缩写：AIBN＝2，2’-偶氮二(2-甲基丙腈)；DCM＝二氯甲烷；DMF＝二甲基甲酰胺；DMSO＝二甲基亚砜；IMS＝工业用含甲醇酒精；LCMS＝液相色谱-质谱；NBS＝N-溴琥珀酰亚胺；RT＝室温；Rt＝保留时间；TFA＝三氟乙酸；THF＝四氢呋喃；SCX＝强阳离子交换色谱。
对实施例2的结晶形式进行分析：
差示扫描量热法(DSC)测量在配备有Mettler Toledo TS0801RO样品机器人和自动样品传送带的Mettler Toledo DSC823e上进行。在40μl铝盘中准备样品，样品盖被机器人自动刺穿并在30至250℃以10℃/min进行分析。通常，1-3mg样品用于分析且所述分析在以50ml·min-1吹洗的干燥氮气下进行。仪器的能量和温度使用标准铟来校正。
热重分析法(TGA)分析使用配备有TS0801RO样品机器人和自动样品传送带的Mettler Toledo热重分析仪(TGA851e)来确定。每个盘盖在分析前被手动刺穿并在30至400℃以10℃/min进行分析。通常，1-3mg样品用于分析。样品在分析过程中用氮气保持吹洗(60ml·min-1)。对仪器的温度进行校正。
在Bruker AXS C2GADDS衍射仪上收集粉末X射线衍射(PXRD)数据，其中使用Cu Kα辐射(40kV，40mA)、自动XYZ坐标台、用于自动样品定位的激光视频显微镜和HiStar 2二维区域检测器。X射线光学器件由与0.3mm 针孔准直器相连的单一 
Figure BDA0000054819380000211
多层镜构成。束流发散度即X射线束在样品上的有效尺寸为约4mm。使用θ-θ连续扫描模式，其中样品-检测器距离产生范围为3.2°至42.7°的有效2θ。通常，将样品暴露于X射线束120秒。将样品准备成平铺试样，其中物质按原样使用而不经研磨。将约1-2mg样品轻压在载玻片上以得到平坦表面。
动态蒸气吸收(DVS)分析在表面测量系统(SMS)DVS-Intrinsic吸湿分析仪上进行。所述仪器通过SMS Analysis Suite软件(DVS-Intrinsic Control v1.0.0.30)来控制。使用Microsoft Excel 2007及DVS Standard Analysis Suite(v6.0.0.7)对数据进行分析。将样品温度保持在25℃且样品湿度如下得到：以200ml·min-1的总流速对氮气湿气流和氮气干气流进行混合。相对湿度使用位于样品附近的经校正的Rotronic探头(动态范围为1-100％相对湿度(RH))来测量。不断通过微量天平(准确度为±0.005mg)对作为％RH函数的样品重量变化进行监测。通常，在分析前进行PXRD。然后在环境条件下将20mg样品置于经称皮重的不锈钢网篮中。在40％RH和25℃(典型的室内条件)负载和卸载样品并历时2个周期使样品经受渐进性DVS方案，其中使用表1中示出的参数。由该数据计算DVS等温线且在分析后进行最终的PXRD以检查固态形式的变化。
表1.DVS实验的方法参数
  参数   设置
  吸收-周期1(％RH)   40-90
  解吸-周期1(％RH)   90-0
  吸收-周期2(％RH)   0-90
  解吸-周期2(％RH)   90-0
  吸收-周期3(％RH)   0-40
  步长(％RH)   10
  dmdt(％min-1)   0.002
  样品温度(℃)   25
对实施例3、4、5、7和8的结晶形式进行分析：
X射线粉末衍射(XRPD)：2θ-θ构造的PANalytical X’Pert仪器或θ-θ构造的PANalytical Cubix仪器，扫描范围为2°至40°2θ，100秒暴露/0.02°增量。X射线通过以45kV和40mA运行的铜长小焦点管来产生。铜X射线的波长为 
Figure BDA0000054819380000212
数据在零背景容器上收集，在所述容器上放置～2mg化合物。容器由单晶硅制成，所述单晶硅已沿非衍射平面进行切割，然后在光学平面抛光机上进行抛光。在该表面上入射的X射线被Bragg消光所抵消。
差示扫描量热法(DSC)热分析图使用带有铝盘和刺穿盖的TA Q1000差 示扫描量热仪来测量。样品重量为0.5至5mg。所述方法在氮气气流(50ml/min)下进行，且对25℃至300℃的温度进行研究，其中恒定的温度升高速率为10℃/分钟。
热重分析法(TGA)热分析图使用带有铂盘的TA Q500热重分析仪来测量。样品重量为1至5mg。所述方法在氮气气流(60ml/min)下进行，且对室温至300℃的温度进行研究，其中恒定的温度升高速率为10℃/分钟。
重量蒸气吸收(GVS)分布使用表面测量系统动态蒸气吸收DVS-1或DVS Advantage仪器来测量。将约1-5mg固体样品置于玻璃容器中，且在双周期步骤方法(40％相对湿度(RH)至90％RH至0％RH至90％RH至0％RH且步长为10％RH)中记录样品重量。
中间体1：(R)-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮杂-二环[2.2.2]辛烷
Figure BDA0000054819380000221
将(R)-1-氮杂-二环[2.2.2]辛烷-3-醇(1.25g)、CuI(93.1mg)、1，10-菲咯啉(176mg)、Cs2CO3(3.19g)和3-氟-碘-苯(1.11g)于甲苯(2.5mL)中的溶液在100℃加热20小时。将反应混合物冷却，用乙酸乙酯稀释并用硅藻土过滤。不溶物用乙酸乙酯洗涤数次。滤液用5％硫酸铜溶液和水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发。通过SCX来纯化，得到(R)-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮杂-二环[2.2.2]辛烷(490mg，45％)，其为棕色油状物。LCMS(方法2，保留时间2.09分钟)。MH+＝222。
中间体2-3通过与就中间体1所述类似的操作由(R)-1-氮杂-二环[2.2.2]辛烷-3-醇和合适的芳基碘来制备。中间体2-3的数据：
Figure BDA0000054819380000222
中间体4：(R)-3-(3-氟-苯基硫基)-1-氮杂-二环[2.2.2]辛烷
Figure BDA0000054819380000223
(R)-3-(3-氟-苯基硫基)-1-氮杂-二环[2.2.2]辛烷如下由3-氟苯硫酚制备：在室温将3-氟苯硫酚(5g)于DMF(5mL)中的溶液缓慢加到NaH(1.56g浓度为 60％的矿物油分散液)于DMF(40mL)中的混悬液中。30分钟后，将甲磺酸(S)-(1-氮杂-二环[2.2.2]辛-3-基)酯(5.3g)(J.Med.Chem.，1992，35，2392-2406)于DMF(5mL)中的溶液滴加到所述混合物中并将反应混合物在70℃加热过夜。将反应混合物在乙酸乙酯和1N NaOH溶液之间分配。分离各层，水相用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发。通过SCX色谱来纯化，得到(R)-3-(3-氟-苯基硫基)-1-氮杂-二环[2.2.2]辛烷(4.5g，73％)。中间体4的数据：1H NMR(300MHz，MeOD)：7.33(1H，td，J＝8.04，6.01Hz)，7.22-7.13(2H，m)，7.01-6.93(1H，m)，3.81-3.70(1H，m)，3.58-3.48(1H，m)，3.14-2.91(2H，m)，2.92-2.77(2H，m)，2.26-2.15(1H，m)，2.01-1.77(4H，m)，1.70-1.58(1H，m)。
中间体A：(R)-(5-氯甲基-异噁唑-3-基)-环己基-苯基-甲醇
标题化合物如下由(R)-环己基-羟基-苯基-乙酸得到：
步骤1：将1，1’-羰基二咪唑(25.0g，154mmol)加到搅拌的(R)-环己基-羟基-苯基-乙酸(30.0g，128mmol)于无水THF(600mL)中的混悬液中。在室温搅拌90分钟后，历时1小时滴加硼氢化钠(11.6g，307mmol)。然后将反应混合物在室温搅拌过夜。反应通过加入水(100mL)来淬灭，然后用DCM萃取。干燥(MgSO4)合并的有机相，过滤并真空蒸发，得到粗制固体。通过硅胶色谱来纯化(用0-5％甲醇/DCM洗脱)，得到(R)-1-环己基-1-苯基-乙烷-1，2-二醇(20.7g，73％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.41-7.33(4H，m)，7.28-7.24(1H，m)，3.99(1H，d)，3.83(1H，d)，2.68(1H，br s)，1.86-1.80(1H，m)，1.78-1.64(3H，m)，1.63-1.57(1H，m)，1.47-1.41(1H，m)，1.27-0.94(5H，m)。
步骤2：在氮气气氛下将草酰氯(15.5mL，201mmol)于无水DCM(900mL)中的溶液冷却至-78℃。滴加DMSO(28.5mL，401mmol)于DCM(25mL)中的溶液，然后将混合物在-78℃搅拌10分钟。历时1小时滴加(R)-1-环己基-1-苯基-乙烷-1，2-二醇(29.5g，134mmol)于DCM(250mL)中的溶液，得到稠厚浆液。使内部温度达到-45℃。滴加三乙胺(92.8mL，669mmol)，加完后，将混合物温热至室温。混合物用1N盐酸(500mL×2)、水(500mL)和盐水(500mL)洗涤，然后干燥(MgSO4)，过滤并蒸发，得到橙色油状物。将其溶解在IMS(320mL) 中并滴加到羟胺盐酸盐(14.0g，201mmol)和碳酸钠(21.3g，201mmol)于水(210mL)中的预制溶液中。将所得乳液在室温搅拌过夜，然后在DCM和水之间分配。有机层用水和盐水洗涤，然后干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发。通过硅胶色谱来纯化(用0-15％EtOA/环己烷洗脱)，得到(R)-环己基-羟基-苯基-乙醛肟(25.9g，83％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.76(1H，s)，7.44-7.41(2H，m)，7.37-7.33(2H，m)，7.27-7.23(1H，m)，7.22(1H，br s)，3.34(1H，s)，1.90-1.60(5H，m)，1.37-1.05(6H，m)。
步骤3：将(R)-环己基-羟基-苯基-乙醛肟(8g，34mmol)和2，6-二甲基吡啶(10mL，86mmol)于DCM(150mL)中的溶液在冰浴中冷却。滴加三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(15.6mL，86mmol)。将混合物在0℃搅拌10分钟，然后将其温热至室温且保持30分钟。通过加入水(50mL)将反应淬灭。通过相分离柱，由此分离有机相并真空蒸发。通过硅胶色谱来纯化(用10-20％EtOAc/环己烷洗脱)，得到经单TMS保护和经二TMS保护的化合物的混合物。将其溶解在甲醇中并在室温静置过夜，真空蒸发，得到(R)-环己基-苯基-三甲基甲硅烷基氧基-乙醛肟(10g，96％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.62(1H，s)，7.32-7.28(4H，m)，7.26-7.21(1H，m)，7.11(1H，s)，1.93-1.85(2H，m)，1.76-1.71(1H，m)，1.68-1.56(2H，m)，1.49-1.42(1H，m)，1.27-0.78(5H，m)，0.11(9H，m)。
步骤4：在无水DCM(400mL)中形成(R)-环己基-苯基-三甲基甲硅烷基氧基-乙醛肟(6g，19.6mmol)的溶液并冷却至-78℃。在减少光照的条件下滴加次氯酸叔丁酯(4.3g，39.3mmol)于DCM(10mL)中的溶液。在-78℃保持2小时后，滴加三乙胺(4.1mL，29.4mmol)于DCM(10mL)中的溶液。在-78℃再保持10分钟后，将混合物温热至0℃。此时加入炔丙基氯(14.4mL，196mmol)，将混合物温热至室温过夜。混合物用盐水(200mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发。通过硅胶色谱来纯化(用0-10％EtOAc/环己烷洗脱)，得到粗制5-氯甲基-3-((R)-环己基-苯基-三甲基甲硅烷基氧基-甲基)-异噁唑。将其重新溶解在THF(100mL)中，在冰浴中冷却并滴加四丁基氟化铵(19.6mL浓度为1M的THF溶液)。将该混合物在0℃搅拌30分钟，然后在乙酸乙酯和水之间分配。干燥(Na2SO4)有机相，过滤并真空蒸发。通过硅胶色谱来纯化(用0-20％EtOAc/环己烷洗脱)，得到标题化合物，其为白色固体(3.5g，58％)。1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ7.51(2H，m)，7.32(2H，m)，7.25-7.21(1H，m)，6.29(1H，s)，4.52(2H，s)，2.80(1H，s)，2.34-2.28(1H，m)，1.81-1.76(1H，m)，1.72-1.62(3H， m)，1.36-1.02(6H，m)。
中间体B：(R)-(5-溴甲基-[1，3，4]噁二唑-2-基)-环己基-苯基-甲醇
步骤1：(R)-环己基-羟基-苯基-乙酰肼
将(R)-环己基扁桃酸(2.34g)的溶液溶解在DCM(20mL)中，用1，1’-羰基二咪唑(1.95g)处理并在室温处理1小时。反应混合物用一水合肼(1.0mL)处理并再搅拌30分钟。反应混合物用DCM稀释，用1N NaOH溶液和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发，得到标题化合物，其为白色固体(2.0g，81％)。LCMS(方法2，2.73分钟)。MH+＝249。
步骤2：氯-乙酸N’-((R)-2-环己基-2-羟基-2-苯基-乙酰基)-酰肼
将前述化合物(1.0g)的溶液溶解在DCM(20mL)中并在0℃用二异丙基乙基胺(0.83mL)和氯乙酰氯(0.39mL)处理。温热至室温并搅拌10分钟后，反应混合物用DCM稀释，用水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发，得到所需化合物(1.1g，73％)，其为白色固体。LCMS(方法2，3.20分钟)。MH+＝325。
步骤3：(R)-(5-氯甲基-[1，3，4]噁二唑-2-基)-环己基-苯基-甲醇
将前述化合物(170mg)、对甲苯磺酰氯(96mg)和1，2，2，6，6-五甲基哌啶(175mg)于DCM(2mL)中的溶液在室温搅拌过夜。反应混合物用DCM稀释，用NaHCO3溶液(两次)和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发。通过柱色谱来纯化(硅胶，0-100％环己烷/乙酸乙酯)，得到标题化合物，其为白色固体(105mg，63％)。标题化合物的数据：LCMS(方法2，3.79分钟)。MH+＝307。
步骤4：将前述化合物(4.66g)和溴化锂(6.6g)于丙酮(200mL)中的溶液回流过夜。冷却反应混合物，真空蒸发并在水和乙酸乙酯之间分配。分离有机相，干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发。将所得固体重新溶解在丙酮(200mL)中，用溴化锂(6.6g)处理并加热回流过夜。冷却反应混合物，真空浓缩并在水和乙酸乙酯之间分配。分离有机相，干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发，得到标题化合物(4.65g，84％)。标题化合物的数据：LCMS(方法2，3.90分钟)。MH+＝353。1H NMRδ(ppm)(CHCl3-d)：7.60-7.53(2H，m)，7.41-7.25(3H，m)， 4.49(2H，s)，3.28(1H，s)，2.33(1H，s)，1.85-1.73(1H，m)，1.68(3H，s)，1.44-1.09(6H，m)。
中间体C：(5-溴甲基-异噁唑-3-基)-二苯基-甲醇
Figure BDA0000054819380000261
标题化合物如下由5-甲基异噁唑-3-甲酸甲酯得到：
步骤1.在-10℃和氮气气氛下将苯基溴化镁(浓度为3M的乙醚溶液；100mL)滴加到5-甲基异噁唑-3-甲酸甲酯(20.2g)于无水THF(300mL)中的溶液中。将反应混合物在-10℃搅拌5分钟，然后温热至室温并静置18小时。将反应混合物倒入冷的1M HCl(300mL)中并用乙醚萃取。合并的有机萃取物用NaHCO3、水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发，得到(5-甲基-异噁唑-3-基)-二苯基-甲醇(37.21g，98％)，其为蜡状固体。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.39-7.25(m，10H)，5.84(s，1H)，3.69(s，1H)，2.38(s，3H)。
步骤2.无水1，2-DCE(500mL)用氩气吹洗15分钟。在氮气气氛和搅拌下加入(5-甲基-异噁唑-3-基)-二苯基-甲醇(37.9g)，然后加入NBS(28.0g)和AIBN(4.7g)。将反应混合物在80℃搅拌1小时。向反应混合物中再加入NBS(28.0g)和AIBN(4.7g)并在80℃继续搅拌3小时。将反应混合物冷却至室温，倒入1M HCl(500mL)中并用乙醚萃取。合并的有机萃取物用NaHCO3、水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发。通过硅胶色谱来纯化(用10-100％环己烷/DCM洗脱)，得到标题化合物(26.0g，52％)，其为浅黄色固体，所述固体含有少量未变化的起始物质及二溴化和三溴化杂质。标题化合物的数据：1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.38-7.23(m，10H)，6.18(s，1H)，4.35(s，2H)，3.63(s，1H)。
标题化合物也可如下由2-氯-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯得到：
步骤A：(5-羟基甲基-异噁唑-3-基)-二苯基-甲醇
在室温历时4小时用注射泵将三乙胺(69mL)于乙醚(31mL)中溶液缓慢加到快速搅拌的炔丙醇(37.5mL)和2-氯-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(75g)于乙醚(500mL)中的溶液中。然后将反应混合物搅拌过夜，过滤，滤液用水洗涤(两次)。合并水相，用氯化钠饱和并用乙酸乙酯再次萃取(两次)。干燥(MgSO4)合并的有机相，过滤并真空蒸发，得到稠厚油状物(82g)，其主要为5-羟基 甲基-异噁唑-3-甲酸乙酯。将其溶解在THF(700mL)中，冷却至-10℃并用苯基氯化镁的溶液(750mL浓度为2.0M的THF溶液)处理，保持温度低于-2℃。将反应混合物温热至室温并搅拌1小时。将反应混合物小心倒入冰冷的浓盐酸(200mL)和冰(500mL)中，分离各层。水层用乙醚萃取。合并的有机层用盐水洗涤，干燥，过滤并真空蒸发。用乙醚研磨，得到(5-羟基甲基-异噁唑-3-基)-二苯基-甲醇(82.3g，59％(2步))，其为白色固体。1H NMR(300MHz，DMSO)：δ7.39-7.25(m，10H)，6.82(s，1H)，6.34(s，1H)，5.62(t，J＝6.0Hz，1H)，4.54(d，J＝6.0Hz，2H)。
步骤B：(5-溴甲基-异噁唑-3-基)-二苯基-甲醇
将前述化合物(40g)和四溴甲烷(70.8g)于DCM(350mL)中的溶液冷却至-15℃并用三苯基膦(48.5g)逐份处理，保持温度低于-8℃。将反应混合物温热至10℃，然后直接倒在硅胶垫上并用DCM(2500mL)洗脱。蒸发洗脱液并通过柱色谱来纯化(0-25％乙酸乙酯/环己烷)，得到标题化合物(43g，88％)，其为稠厚草色油状物。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.38-7.23(m，10H)，6.18(s，1H)，4.35(s，2H)，3.63(s，1H)。
实施例1：(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷氯化物
Figure BDA0000054819380000271
将(R)-(5-氯甲基-异噁唑-3-基)-环己基-苯基-甲醇(中间体A)(1.74g)和(R)-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮杂-二环[2.2.2]辛烷(中间体2)(1.26g)在乙腈(25mL)中混合并在50℃加热1小时。过滤收集所得白色固体，用乙酸乙酯和乙醚洗涤并真空干燥，得到标题化合物(2.9g)。将其溶解在沸腾的乙腈(125mL)中并在搅拌下缓慢冷却至室温。过滤收集所得晶体并真空干燥，得到标题化合物(2.4g，81％)。实施例1的数据：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.51-7.46(m，2H)，7.32(t，2H)，7.25-7.12(m，3H)，7.02-6.95(m，2H)，6.79(s，1H)，5.90(s，1H)，4.88(s，1H)，4.77(s，2H)，3.91(dd，1H)，3.54-3.34(m，5H)，2.39(s，1H)，2.24-2.09(m，2H)，2.06-1.97(m，1H)，1.94-1.80(m，2H)，1.68(d，1H)，1.58(d，3H)，1.28-1.13(m，3H)，1.10-0.98(m，3H)。LCMS(方法1，8.68分钟)。M+＝491。
实施例2：(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4- 氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷苯磺酸盐
Figure BDA0000054819380000281
将(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷氯化物(实施例1)(2.0g)的溶液溶解在DCM(20mL)中并与苯磺酸钠(3.4g)的水(20mL)溶液一起快速搅拌。分离有机层，并再次与苯磺酸钠(3.4g)的水(20mL)溶液一起快速搅拌。干燥(MgSO4)有机层，过滤并真空蒸发，得到标题化合物，其为白色泡沫。将其溶解在沸腾的丙-2-醇(48mL)中。过滤热的溶液，在搅拌下将滤液缓慢冷却至室温。2小时后，将混合物冷却至0℃，过滤收集晶体并真空干燥。得到标题化合物(2.1g)，收率为85％。1H NMRδ(ppm)(DMSO-d6)：7.62-7.58(2H，m)，7.52-7.47(2H，m)，7.35-7.26(5H，m)，7.26-7.13(3H，m)，7.02-6.95(2H，m)，6.80(1H，s)，5.89(1H，s)，4.88(1H，s)，4.75(2H，s)，3.91(1H，dd，J＝13.17，8.11Hz)，3.58-3.35(5H，m)，2.40(1H，s)，2.25-1.95(3H，m)，1.96-1.80(2H，m)，1.69(1H，d，J＝10.55Hz)，1.63-1.52(3H，m)，1.29-0.96(6H，m)。LCMS(方法1，8.73分钟)。M+＝491。
结晶物质的样品通过DSC、TGA、PXRD和DVS来分析。
熔点通过DSC(10℃/min)来确定，且发现具有尖锐的吸热事件，其中起始温度为178℃(±1℃)。熔化前的重量损失是可忽略的(通过TGA来确定)。PXRD分析显示样品为高度结晶的(参见图1)。在80％RH(±0.1％)进行的DVS分析产生0.2％(％w/w)的重量增加。
实施例3：(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷氯化物
Figure BDA0000054819380000282
将(R)-(5-氯甲基-异噁唑-3-基)-环己基-苯基-甲醇(中间体A)(3.00g)和(R)-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮杂-二环[2.2.2]辛烷(中间体1)(2.17g)在乙腈(60mL) 中混合并在50℃加热2小时。真空蒸发反应混合物并通过硅胶色谱来纯化(用1-15％甲醇/DCM洗脱)，得到标题化合物，其为白色泡沫。将其溶解在沸腾的乙腈(500mL)中并缓慢冷却至室温。过滤收集所得白色晶体并真空干燥，得到标题化合物(3.9g，75％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.49(dd，2H)，7.40-7.29(m，3H)，7.25-7.20(m，1H)，6.93-6.79(m，4H)，5.90(s，1H)，4.96(s，1H)，4.77(s，2H)，3.95(dd，1H)，3.49(d，4H)，2.43(s，1H)，2.26-2.10(m，2H)，2.07-1.98(m，1H)，1.95-1.82(m，2H)，1.69(d，1H)，1.59(s，4H)，1.28-1.14(m，3H)，1.10-0.98(m，3H)。LCMS(方法1，8.70分钟)。M+＝491。
结晶物质的样品通过DSC、XRPD和GVS来分析。
熔点通过DSC来确定，且发现具有宽的吸热事件(熔化)，其中始于约134℃(±2℃)。XRRD分析显示样品为结晶的(参见图2)。在80％RH进行的GVS分析在第一周期产生约5％的质量增加且在第二周期产生约6.5％的质量增加。
实施例4：(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷2-羟基-乙磺酸盐
将(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷氯化物(实施例3)(3.2g)于温的DCM(50mL)和甲醇(0.5mL)中的溶液快速搅拌并用羟乙磺酸铵(5g)的水(20mL)溶液处理。将反应混合物在室温搅拌1小时，然后冷却至0℃并搅拌0.5小时。过滤收集所得白色沉淀物，用水和乙醚洗涤，真空干燥。将沉淀物溶解在沸腾的乙腈(172mL)中。趁热过滤所得溶液，并在搅拌下缓慢冷却至室温。2小时后，过滤收集所得白色晶体并真空干燥，得到标题化合物(3.07g，82％)。1H NMRδ(ppm)(DMSO-d6)：7.47-7.42(2H，m)，7.35-7.25(3H，m)，7.21-7.13(1H，m)，6.81(4H，d，J＝43.75Hz)，5.84(1H，s)，4.92(1H，s)，4.70(2H，s)，4.40(1H，t，J＝5.72Hz)，3.90(1H，dd，J＝13.18，8.10Hz)，3.58(2H，td，J＝6.74，5.72Hz)，3.48-3.29(5H，m)，2.56(2H，t，J＝6.74Hz)，2.39(1H，s)，2.21-2.04(2H，m)，2.03-1.94(1H，m)，1.93-1.77(2H，m)，1.64(1H，d，J＝10.36Hz)，1.54(3H，d， J＝9.07Hz)，1.24-1.10(3H，m)，1.10-0.93(3H，m)。LCMS(方法1，8.72分钟)。M+＝491。
结晶物质的样品通过DSC、XRPD和GVS来分析。
熔点通过DSC来确定，且发现具有尖锐的熔化，其中始于约214℃(±2℃)。XRPD分析显示样品为结晶的(参见图3)。在80％RH进行的GVS分析没有产生任何质量增加。
实施例5：(R)-1-[5-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-[1，3，4]噁二唑-2-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷溴化物
Figure BDA0000054819380000301
将(R)-(5-溴甲基-[1，3，4]噁二唑-2-基)-环己基-苯基-甲醇(中间体B)(2.93g)和(R)-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮杂-二环[2.2.2]辛烷(中间体2)(1.8g)于乙腈(60mL)中的溶液在50℃加热过夜。真空蒸发反应混合物并用乙醚研磨，得到标题化合物(4.7g)，其用沸腾的乙酸乙酯重结晶。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.44-7.39(m，2H)，7.34-7.21(m，3H)，7.16-7.09(m，2H)，6.97-6.90(m，2H)，6.39(s，1H)，4.92(s，2H)，4.82(s，1H)，3.97-3.87(m，1H)，3.59-3.37(m，5H)，2.38(s，1H)，2.22(t，1H)，2.11(s，1H)，2.00(s，1H)，1.84(s，2H)，1.66(s，2H)，1.57(t，2H)，1.32(d，1H)，1.23-1.00(m，3H)，1.03-0.88(m，2H)。LCMS(方法1，8.29分钟)。M+＝492。
结晶物质的样品通过DSC、XRPD和GVS来分析。
熔点通过DSC来确定，且观察到双重吸热事件。推测熔化始于约169℃(±2℃)。XRPD分析显示样品为结晶的(参见图4)。在80％RH进行的GVS分析产生约0.8％的质量增加。
实施例6：(R)-3-(3-氟-苯基硫基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷溴化物
Figure BDA0000054819380000302
将(5-溴甲基-异噁唑-3-基)-二苯基-甲醇(中间体C)(1.1g纯度为约40％的 样品)和(R)-3-(3-氟-苯基硫基)-1-氮杂-二环[2.2.2]辛烷(中间体4)(218mg)于乙腈(10mL)中的溶液在室温搅拌1小时。过滤收集所得沉淀物并真空干燥。将其溶解在沸腾的乙腈(130mL)中，趁热过滤并在搅拌下缓慢冷却至室温。过滤收集所得晶体并真空干燥，得到标题化合物(312mg，51％)。1H NMRδ(ppm)(400MHz，CH3OH-d6)：7.40-7.22(13H，m)，7.09-7.03(1H，m)，6.83(1H，s)，4.71(2H，s)，4.07-3.98(2H，m)，3.69-3.38(5H，m)，2.50-2.39(1H，m)，2.29-2.25(1H，m)，2.24-2.14(1H，m)，2.18-1.93(2H，m)。LCMS(方法1，8.36分钟)。M+＝501.19。
实施例7：(R)-3-(3-氟-4-甲基-苯氧基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷溴化物
Figure BDA0000054819380000311
将(5-溴甲基-异噁唑-3-基)-二苯基-甲醇(中间体C)(4.7g纯度为约67％的样品)和(R)-3-(3-氟-4-甲基-苯氧基)-1-氮杂-二环[2.2.2]辛烷(中间体3)(2g)于乙腈(50mL)中的溶液在50℃加热1.5小时。冷却反应混合物，过滤收集固体，用乙酸乙酯和乙醚洗涤并真空干燥，得到标题化合物(4.36g，88％)。将其溶解在沸腾的丙-2-醇(760mL)中，趁热过滤，并在搅拌下缓慢冷却至室温。过滤收集所得晶体并真空干燥，得到标题化合物(3.72g)。1H NMRδ(ppm)(400MHz，CH3OH-d6)：7.39-7.26(10H，m)，7.16(1H，t，J＝8.63Hz)，6.84(1H，s)，6.75-6.66(2H，m)，4.93-4.87(1H，m)，4.79-4.70(2H，m)，4.03-3.95(1H，m)，3.67-3.48(5H，m)，2.56-2.52(1H，m)，2.40-2.31(1H，m)，2.20-2.11(4H，m)，2.10-1.93(2H，m)。LCMS(方法1，8.37分钟)。M+＝499.20。
结晶物质的样品通过DSC、XRPD和GVS来分析。
熔点通过DSC来确定，且发现具有尖锐的熔化，其中始于约242℃(±2℃)。XRPD分析显示样品为结晶的(参见图5)。在80％RH进行的GVS分析产生约0.1％的质量增加
实施例8：(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷2-羟基-乙磺酸盐
在配备有顶部搅拌器的5L烧瓶中向搅拌的(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷氯化物 1(155.83g)和DCM(2380mL)的混悬液中一次性加入MeOH(23.8mL)。搅拌几分钟后，形成溶液。历时5分钟向所述氯化物盐的搅拌溶液中加入羟乙磺酸铵盐(61.60g)的水(945mL)溶液。将所得两相混合物剧烈搅拌，数分钟后，加入一些(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷2-羟基-乙磺酸盐晶种。再搅拌35分钟后，再加入一些晶种。围绕烧瓶侧壁观察到痕量固体的形成。将其在室温再搅拌2.5小时，致密沉淀物开始形成。在显微镜下检查反应混合物的少量等分液，其显示出结晶物质。将搅拌的反应混合物在冰浴中冷却(内部温度为4℃且保持35分钟)。固体变为较大的颗粒。过滤收集固体并先后用冷水(总体积为3.1L且400-60mL/份)和乙醚(5×500mL)洗涤。将其风干，在40℃真空干燥过夜，然后再干燥6小时，得到产物，其为白色结晶固体(152.48g)。LC-MS(方法2)：Rt 8.91分钟，m/z 491[M]+。纯度＞99％。
然后在搅拌下将产物(152.48g)溶解在回流的IMS(2.8L)中，过滤热的溶液。将该溶液保持在热的状态下并在10L加热套反应器中搅拌，同时将剩余的物质(151.64g)溶解在回流的IMS(2.8L)中，然后趁热过滤。将上述两份溶液在10L加热套反应器中合并，搅拌并回流。少量物质已开始结晶出来，因此再加入IMS(350mL)直到形成溶液。将搅拌的溶液(搅拌速率为88-89rpm)逐渐冷却[历时约1小时从78℃(回流温度)至76.5℃(内部温度)，然后历时4.5小时从76.5℃(内部温度)至20℃(内部温度)，接着在20℃搅拌过夜]。在77℃、69℃和59℃向搅拌的溶液中加入晶种。固体物质已开始在反应器的底部结晶出来。随着混合物的进一步冷却，在接下来的几分钟内观察到更多的结晶。搅拌过夜后，过滤收集固体，用冷的IMS(～300mL)洗涤，风干(2.5小时)，然后在40℃真空干燥过夜，得到结晶的(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷2-羟基-乙磺酸盐(274.48g)。LC-MS(方法2)：Rt 8.84分钟，m/z 491[M]+。纯度＞99％。 1(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷氯化物的制备参见实施例3和WO 2008/099186。
结晶物质的样品通过XRPD、GVS和DSC来分析。通过DSC确定的熔点为213℃(起始温度)(±2℃)。在80％RH(±0.3％)进行的GVS分析产生0.15％的重量增加。XRPD光谱示于图6中。
毒蕈碱性拮抗剂的生物学活性
毒蕈碱性拮抗剂化合物的抑制作用通过毒蕈碱性受体放射性配体结合测定来确定。
在CHO-K1细胞中表达重组人M3受体。制备细胞膜且[3H]-N-甲基东莨菪碱([3H]-NMS)的结合及化合物的结合通过闪烁迫近测定(SPA)来评价。在环境温度和1％(v/v)DMSO存在下孵育时间为16小时。测定在白色96孔透明底NBS板(Corning)中进行。进行测定前，将含有M3受体的CHO细胞膜涂覆到SPA WGA(麦胚凝集素)珠子(GE Healthcare)上。在1μM阿托品存在下确定非特异性结合。
放射性在Microbeta闪烁计数器(PerkinElmer)上使用3H方案来测量，其中读取时间为2分钟/孔。化合物对[3H]-NMS结合的抑制通常使用范围为0.03nM至1μM的浓度来确定并表达为相对于就板而言的板特异性放射性配体结合的抑制百分比。将化合物对[3H]-NMS结合的浓度依赖性抑制表达为pIC50。
所测试的所有化合物在M3结合测定中表现出小于5nM的效力(作为Ki值)。具体地，在M3结合测定中，实施例1表现出0.80nM的Ki值，实施例3表现出0.66nM的Ki值，实施例5表现出0.70nM的Ki值，实施例6表现出0.15nM的Ki值，且实施例7表现出0.40nM的Ki值。
β 2 肾上腺素受体激动剂的制备
可用于本发明组合的以下β2肾上腺素受体激动剂可如下制备。
制备β 2 肾上腺素受体激动剂的一般实验细节
1H NMR光谱在Varian Inova 400MHz或Varian Mercury-VX 300MHz仪器上记录。氯仿-d(δH 7.27ppm)、二甲基亚砜-d6(δH 2.50ppm)、乙腈-d3(δH1.95ppm)或甲醇-d4(δH 3.31ppm)的中间峰用作内标。使用硅胶(0.040-0.063mm，Merck)进行柱色谱。除非另有说明，起始物质为商购的。所有溶剂和商购试剂为实验室级并按原样使用。
以下方法用于LC/MS分析：
仪器：Agilent 1100；柱：Waters Symmetry 2.1×30mm；质谱：APCI；流速：0.7ml/min；波长：254nm；溶剂A：水+0.1％TFA；溶剂B：乙腈+0.1％TFA；梯度：历时8分钟从15％B至95％B，在95％B保持1分钟。
分析性色谱在Symmetry C18柱(2.1×30mm，3.5μm粒度)上进行，其中乙腈/水/0.1％三氟乙酸用作流动相，梯度为历时8分钟从5％乙腈至95％乙腈， 流速为0.7ml/min。
实施例中使用的缩写或术语具有以下含义：
SCX：用磺酸吸附剂进行的固相萃取
HPLC：高效液相色谱
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
β2肾上腺素受体激动剂和用于制备它们的中间体在本申请中基于所给出的结构使用IUPAC NAME，ACD Labs(版本8)命名软件包来命名。
β 2 肾上腺素受体激动剂1(BA1)：制备1
N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酰胺二氢溴酸盐
Figure BDA0000054819380000341
a)3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酸叔丁酯
萘-1-乙醇(10g)用苄基三甲基氢氧化铵( 0.9mL浓度为40％的甲醇溶液)处理，将所得混合物真空搅拌30分钟。然后将混合物冷却至0℃，用丙烯酸叔丁酯(8.19g)处理。将所得混合物缓慢温热至室温并搅拌过夜。然后将粗制混合物吸附在氧化铝(30g)上并用乙醚(200mL)洗脱。浓缩有机物，得到粗品(16.6g)，所述粗品通过快速硅胶色谱来纯化(用1∶8乙醚∶己烷洗脱)，得到小标题化合物(12.83g)。1H NMR(CDCl3)δ8.05(dd，1H)，7.84(dd，1H)，7.72(dd，1H)，7.54-7.34(m，4H)，3.81-3.69(m，4H)，3.35(t，2H)，2.52-2.47(m，2H)，1.45(s，9H)。
b)3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酸
将3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酸叔丁酯(6.19g)吸收在二氯甲烷(30mL)中，用三氟乙酸(5mL)处理。将所得溶液在室温搅拌2小时，再加入1mL三氟乙酸并将溶液搅拌过夜。浓缩混合物，吸收在2M氢氧化钠溶液(30mL)中并用乙醚(2×20mL)洗涤。然后酸化水层(使用1M盐酸)并用乙醚(2×30mL)萃取。合并的有机物用盐水(20mL)洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并真空浓缩，得到小标题化合物(5.66g)，其为透明油状物。1H NMR(CDCl3)δ8.05(bs，1H)，7.85(bs，1H)，7.74(bs，1H)，7.50-7.38(m，4H)，3.84-3.75(bm，4H)，3.39(bs，2H)，2.65(bs，2H)。
c)N-(2-二乙基氨基乙基)-N-(2-羟基乙基)-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酰胺
将草酰氯(0.33g)滴加到3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酸(0.53g)于二氯甲烷(10mL)中的溶液中，加入二甲基甲酰胺(1滴)并在室温继续搅拌1小时。然后浓缩混合物，重新溶解在二氯甲烷(10mL)中，并滴加到2-(2-二乙基氨基乙基氨基)乙醇(0.35g)和二异丙基乙基胺(0.56g)于二氯甲烷(10mL)中的溶液中。将所得混合物在室温搅拌1小时，稀释(50mL二氯甲烷)，用水(2×20mL)和盐水(20mL)洗涤，用硫酸镁干燥并浓缩，得到粗制产物(0.91g)，其通过快速柱色谱来纯化(用5-7％甲醇/二氯甲烷洗脱)，得到0.63g小标题化合物。1H NMR(CDCl3)δ8.05(d，1H)，7.85(d，1H)，7.73(d，1H)，7.52-7.47(m，2H)，7.42-7.35(m，2H)，3.84-3.78(m，6H)，3.72-3.70(m，1/2H)，3.45-3.35(m，6H)，2.79-2.77(m，1+1/2H)，2.62-2.58(m，2H)，2.54-2.49(m，4H)，1.04-1.01(m，6H)。
d)N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酰胺
在-78℃将二甲基亚砜(0.097g)于二氯甲烷(1mL)中的溶液加到草酰氯(0.079g)于二氯甲烷(10mL)中的溶液中。将反应混合物搅拌15分钟，然后加入N-(2-二乙基氨基乙基)-N-(2-羟基乙基)-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酰胺(0.22g)于二氯甲烷(1mL+1mL洗涤)中的溶液，将反应混合物再搅拌15分钟。加入三乙胺(0.29g)，历时1小时将反应混合物温热至室温，随后稀释(30mL二氯甲烷)混合物，有机物用碳酸氢钠(20mL)和盐水(20mL)洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并真空浓缩，得到小标题化合物(0.21g)。
将粗制产物溶解在甲醇(10mL)中，将7-(2-氨基乙基)-4-羟基-1，3-苯并噻唑-2(3H)-酮盐酸盐(根据Organic Process Research & Development 2004，8(4)，628-642中描述的操作来制备；0.131g)与乙酸(0.1mL)和水(0.1mL)一起加到其中。在室温搅拌30分钟后，加入氰基硼氢化钠(0.020g)，将反应混合物搅拌过夜。加入氨(7N于甲醇中，1mL)并浓缩混合物。粗制残余物通过快速柱色谱来纯化(用1％氨+5％-7％甲醇/二氯甲烷洗脱)。粗制产物直接用于下一步骤。
e)N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酰胺二氢溴酸盐
Figure BDA0000054819380000361
将N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酰胺(0.052g)溶解在乙醇(1.5mL)中并用48％氢溴酸(21μl)处理。过滤收集白色固体二氢溴酸盐(0.058g)。MS：APCI(+ve)579(M+1)。1H NMRδ(DMSO)11.78-11.71(m，1H)，10.11-10.06(m，1H)，9.51-9.43(m，0.33H)，9.21-9.13(m，0.66H)，8.75-8.66(m，1H)，8.59-8.51(m，1H)，8.06(d，1H)，7.95-7.90(m，1H)，7.79(d，1H)，7.60-7.48(m，2H)，7.47-7.39(m，2H)，6.87(t，1H)，6.76(dd，1H)，3.78-3.53(m，10H)，3.25-3.09(m，10H)，2.91-2.80(m，2H)，2.73-2.61(m，2H)，1.26-1.15(m，6H)。NMR表明为旋转异构体的约2∶1混合物(在298K)。
β 2 肾上腺素受体激动剂1(BA1)：制备2
N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酰胺二氢溴酸盐
Figure BDA0000054819380000362
a)N’-(2，2-二甲氧基乙基)-N，N-二乙基-乙烷-1，2-二胺
Figure BDA0000054819380000363
N，N-二乙基-乙二胺(150g)于甲醇(500mL)中的溶液在10-15℃用乙二醛缩二甲醇(60wt％水溶液，225g)逐滴快速处理。加完后，将溶液温热至15℃，然后温热至22℃并在该温度静置16小时。反应混合物用5％钯/炭(Johnson-Matthey 38H型膏状物，15g)处理并在6巴压力下氢化直到反应完成(通过GC/MS来判断)。过滤除去催化剂并蒸干滤液(甲苯共沸，2.5L)，得到196.2g小标题化合物。1H NMR(CDCl3)：δ4.48(t，1H)，3.39(s，6H)，2.75(d，2H)，2.69(t，2H)，2.57-2.48(m，6H)，1.01(ts，6H)。
b)N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2，2-二甲氧基乙基)-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酰胺
Figure BDA0000054819380000371
历时45分钟将草酰氯(151mL)滴加到3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酸(389g)(实施例7步骤b))于二氯甲烷(2.1L)和DMF(0.5mL)中的溶液中。将反应混合物再搅拌16小时。然后浓缩混合物，重新溶解在DCM(1.7L)中并在0℃历时1.75小时滴加到N’-(2，2-二甲氧基乙基)-N，N-二乙基乙烷-1，2-二胺(325g)和异丙基二乙基胺(551mL)于DCM(1.7L)中的溶液中。将所得混合物在室温搅拌3小时，用饱和碳酸氢钠水溶液(5×1L)和水(1.5L)洗涤，用硫酸钠干燥，且浓缩，得到650g小标题化合物。m/e 431(M+H+，100％)。
c)N-[2-(二乙基氨基)乙基]-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]-N-(2-氧代乙基)丙酰胺
Figure BDA0000054819380000372
N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2，2-二甲氧基乙基)-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酰胺(93g)于DCM(270mL)中的溶液在0℃历时1.5小时用三氟乙酸(270mL)逐滴处理。加烷后，将反应混合物温热至室温并再搅拌1小时。浓缩反应混合物并将残余物倒入饱和碳酸氢钠水溶液(1800mL，小心进行)中。含水混合物用DCM(4×400mL)萃取，合并的萃取物用硫酸镁干燥并浓缩。残余物直接用于以下反应。
d)N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酰胺二氢溴酸盐
Figure BDA0000054819380000373
将7-(2-氨基-乙基)-4-羟基-3H-苯并噻唑-2-酮盐酸盐(53g)于无水NMP(216mL)中的混悬液加热至60℃并用NaOH(8.2g)于甲醇(102mL)中的溶液一次性处理。将亮橙色混悬液冷却至室温并历时20分钟用N-[2-(二乙基氨基)乙基]-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]-N-(2-氧代乙基)丙酰胺于二氯甲烷(475mL) 中的溶液逐滴处理。将反应混合物搅拌25分钟。然后历时20分钟逐份加入三乙酰氧基硼氢化钠(91.5g)，将混合物再搅拌50分钟。将反应混合物倒入水(1.8L)中，酸性溶液(pH 5)用叔丁基甲基醚(TBME)(3×500mL)洗涤。通过加入固体碳酸钾将水相碱化至pH 8并用二氯甲烷(3×750mL)萃取；合并的有机萃取物用硫酸镁干燥并浓缩，得到深色油状物。将其溶解在乙醇(200mL)中，加入48％氢溴酸水溶液(73mL)。将溶液陈化30分钟，然后蒸干。残余物用乙醇(560mL)研磨；过滤收集所得固体并在50℃真空干燥。将粘性固体混悬在沸腾的乙醇(100mL)中并趁热过滤。将所收集的固体在50℃真空干燥。该物质用乙醇/水(3∶1，500mL)重结晶。静置过夜后，过滤收集所得固体并用冰冷却的乙醇(75mL)洗涤。在50℃真空干燥24小时，得到57g标题化合物。
β 2 肾上腺素受体激动剂2(BA2)：
N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-3-[2-(3-氯苯基)乙氧基]丙酰胺二氢溴酸盐
Figure BDA0000054819380000381
a)3-[2-(3-氯苯基)乙氧基]丙酸叔丁酯
2-(3-氯苯基)乙醇(20g)用苄基三甲基氢氧化铵 
Figure BDA0000054819380000382
(2.67mL)处理，将所得混合物真空搅拌30分钟。然后将混合物冷却至0℃并用丙烯酸叔丁酯(17.40g)处理。将反应混合物温热至室温并搅拌16小时。将混合物过滤通过氧化铝(15g)(用乙醚(75mL)洗脱)。将所收集的滤液浓缩，得到小标题化合物(34.40g)，其为油状物。1H NMR(CDCl3)δ7.26-7.07(m，4H)，3.69-3.59(m，4H)，2.86-2.81(t，2H)，2.50-2.45(t，2H)，1.43(s，9H)
b)3-[2-(3-氯苯基)乙氧基]丙酸
将3-[2-(3-氯苯基)乙氧基]丙酸叔丁酯(实施例1a)，34.40g)溶解在二氯甲烷(150mL)中，用三氟乙酸(50mL)处理。将混合物在室温搅拌3小时，然后真空浓缩并与二氯甲烷(2×10mL)共沸。将残余物吸收在二氯甲烷(300mL)中，用饱和碳酸氢钠(200mL)萃取。碱性层用二氯甲烷(20mL)洗涤，然后用2M盐酸酸化。酸性层用二氯甲烷(2×200mL)萃取。合并有机层，用盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并浓缩，得到小标题化合物(24.50g)，其为油状物。m/e 227[M-H]。
c)N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2，2-二甲氧基乙基)-3-[2-(3-氯苯基)乙氧基]丙酰胺
Figure BDA0000054819380000391
历时45分钟将草酰氯(9.50mL)滴加到3-[2-(3-氯苯基)乙氧基]丙酸(22.50g)(实施例1b)于二氯甲烷(120ml)和DMF(0.5mL)中的溶液中。将反应混合物再搅拌16小时。然后浓缩混合物，重新溶解在DCM(1.7L)中并在0℃历时1.75小时滴加到N’-(2，2-二甲氧基乙基)-N，N-二乙基乙烷-1，2-二胺(20.20g)(实施例16a)和异丙基二乙基胺(34.43mL)于DCM(200mL)中的溶液中。将所得混合物在室温搅拌16小时，用饱和碳酸氢钠水溶液(3×1L)和水(1.5L)洗涤，用硫酸钠干燥，且浓缩，得到39.50g小标题化合物。m/e 415(M+H+，83％)。
d)N-[2-(二乙基氨基)乙基]-3-[2-(3-氯苯基)乙氧基]-N-(2-氧代乙基)丙酰胺
Figure BDA0000054819380000392
N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2，2-二甲氧基乙基)-3-[2-(3-氯苯基)乙氧基]丙酰胺(实施例1c)(20g)于DCM(500mL)中的溶液在0℃历时30分钟用三氟乙酸(50mL)逐滴处理。加烷后，将反应混合物温热至室温并再搅拌1小时。浓缩反应混合物并将残余物倒入饱和碳酸氢钠水溶液(1800mL，小心进行)中。含水混合物用DCM(3×400mL)萃取，合并的萃取物用硫酸镁干燥并浓缩。残余物直接用于以下反应。
e)N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-3-[2-(3-氯苯基)乙氧基]丙酰胺二氢溴酸盐
Figure BDA0000054819380000393
将7-(2-氨基-乙基)-4-羟基-3H-苯并噻唑-2-酮盐酸盐(11.77g)于无水NMP(50mL)中的混悬液加热至65℃并用NaOH(1.83g)于甲醇(23mL)中的溶液一次性处理。将亮橙色混悬液冷却至室温，并历时30分钟用N-[2-(二乙基氨基)乙基]-3-[2-(3-氯苯基)乙氧基]-N-(2-氧代乙基)丙酰胺(实施例1d)于二氯甲烷(50mL)中的溶液逐滴处理。将反应混合物搅拌30分钟。然后历时20分钟逐份加入三乙酰氧基硼氢化钠(20.33g)，将混合物再搅拌16小时。将反应混合物倒入水(1.8L)中，通过加入固体碳酸钾来碱化至pH 8并用二氯甲烷(2×500mL)萃取；合并的有机萃取物用硫酸镁干燥并浓缩，得到深色油状物。残余物通过硅胶色谱来纯化(10％(0.1％氨水/MeOH)/DCM作为洗脱剂)，得到小标题化合物，其为棕色油状物。收率(6.58g)。将其溶解在乙醇(150mL)中，加入48％氢溴酸水溶液(10mL)。将溶液陈化30分钟，然后蒸干。残余物用乙醇(100mL)研磨；过滤收集所得固体并在50℃真空干燥。该物质用乙醇/水(6∶1，500mL)重结晶；静置过夜后，过滤收集所得固体并用冰冷的乙醇(75mL)洗涤。在50℃真空干燥24小时，得到4.96g标题化合物。MS：APCI(+ve)：563(M+1)，99.3％纯度(T9505M)。1H NMR(DMSO，90℃)δ11.75-11.73(m，1H)，10.08-10.06(d，1H)，8.65(bs，1H)，7.33-7.19(m，4H)，6.89-6.84(t，1H)，6.77-6.74(m，1H)，3.68-3.58(m，8H)，3.17-3.16(m，10H)，2.86-2.80(m，4H)，2.67-2.62(m，2H)，1.23-1.19(t，6H)。元素分析CHNS：C：46.54％(46.39)；H：5.75％(5.70)；N：7.94％(7.73)；S：4.46％(4.42)。
β 2 肾上腺素受体激动剂3(BA3)：
7-[(1R)-2-({2-{[3-{[2-(2-氯苯基)乙基]氨基}丙基)硫基]乙基}氨基)-1-羟基乙基]-4-羟基-1，3-苯并噻唑-2(3H)-酮二氢溴酸盐
Figure BDA0000054819380000401
a)1-氯-2-[(E)-2-硝基乙烯基]苯
Figure BDA0000054819380000402
将2-氯苯甲醛(Aldrich)(10.0g)与硝基甲烷(26.05g)和乙酸铵(21.92g)在乙酸(200mL)中混合，将混合物加热回流40分钟。将混合物冷却至室温，真空除去大部分乙酸。将残余物溶解在二氯甲烷中并先后用水、碳酸钾溶液(×2) 和水洗涤。有机物用无水硫酸镁干燥，过滤并蒸发，得到所需物质，其为橙色油状物(12.83g)。1H NMRδ(CDCl3)8.41(d，1H)，7.62-7.57(m，2H)，7.52-7.48(m，1H)，7.43(dt，1H)，7.34(ddd，1H)。
b)2-(2-氯苯基)乙胺
Figure BDA0000054819380000411
氢化铝如下制备：在0-10℃和氮气气氛下将硫酸(8.40mL)于无水THF(60mL)中的溶液滴加到搅拌的浓度为1.0M的氢化锂铝于THF(314mL)中的溶液中。在5℃搅拌30分钟后，滴加1-氯-2-[(E)-2-硝基乙烯基]苯(12.83g)于无水THF(160mL)中的溶液，保持内部温度为0℃至10℃。加完后，将反应混合物加热回流5分钟。将混合物冷却至室温，然后冷却至0℃，小心滴加异丙醇(22mL)，保持温度低于20℃。小心滴加2M氢氧化钠(35mL)，保持温度低于20℃。将混合物在室温搅拌30分钟，然后过滤通过硅藻土层，所述硅藻土层随后用THF(×3)洗涤。蒸干滤液。使用硅胶柱色谱对残余物进行纯化(使用乙酸乙酯来加载物质，然后先后使用10％三乙胺/乙酸乙酯和10％三乙胺/45％乙醇∶45％乙酸乙酯作为洗脱剂)，得到所需物质(4.66g)。1H NMRδ(CDCl3)7.36(dd，1H)，7.25-7.13(m，3H)，2.98(dt，2H)，2.91-2.87(m，2H)。
c)[2-(2-氯苯基)乙基]氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0000054819380000412
在环境温度和氮气气氛下历时10分钟向搅拌的2-(2-氯苯基)乙胺(25.57g)和三乙胺(22.87mL)于无水THF(300mL)中的溶液中加入一缩二碳酸二叔丁酯(35.85g)于无水THF(50mL)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌3小时。真空除去溶剂，得到所需物质，其为黄色油状物(42.0g)。1H NMRδ(CDCL3)7.35(d，1H)，7.25-7.14(m，3H)，4.57(s，1H)，3.43-3.35(m，2H)，2.95(t，2H)，1.43(d，9H)。
d)烯丙基[2-(2-氯苯基)乙基]氨基甲酸叔丁酯
在35℃和氮气气氛下历时15分钟向氢化钠(60％于矿物油中)(7.23g)(其已用乙醚(×3)洗涤)于无水DMF(200mL)中的混悬液中加入[2-(2-氯苯基)乙基]氨基甲酸叔丁酯(42.0g)于无水DMF(50mL)中的溶液。加完后，将混合物在50℃搅拌90分钟。将混合物冷却至室温，然后缓慢加入烯丙基溴(15.63mL)，使用外部冷却将温度保持在25℃。将混合物在室温搅拌2小时，然后用水稀释并用乙酸乙酯(×3)萃取。合并有机物，用水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并蒸发。使用硅胶柱色谱对残余物进行纯化(用1％乙酸乙酯/异己烷进行加载，然后使用含有乙酸乙酯(0％、1％、2％和5％)的异己烷作为洗脱剂)，得到所需物质(27.0g)。得到数个混合馏分，因此将这些馏分合并，并如上所述使用硅胶柱色谱来再次纯化，又得到4g所需物质。将两批产物合并，共得到31.0g。1H NMRδ(CDCl3)7.36-7.31(m，1H)，7.21-7.12(m，3H)，5.83-5.68(m，1H)，5.17-5.05(m，2H)，3.86-3.66(m，2H)，3.41(t，2H)，3.03-2.90(m，2H)，1.43(s，9H)。HPLC：95.90％(220nm)[M+H-Boc]+＝196.1(计算值＝295.1339)(多模式+)。
e)[2-(2-氯苯基)乙基]{3-[(2-羟基乙基)硫基]丙基}氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0000054819380000422
将烯丙基[2-(2-氯苯基)乙基]氨基甲酸叔丁酯(31.0g)与2-巯基乙醇(7.37mL)和AIBN(1.15g)混合，在65℃搅拌45分钟。将混合物冷却并再加入巯基乙醇(1mL)和AIBN(200mg)。然后将混合物在65℃再加热30分钟。物质通过硅胶柱色谱来纯化(物质用20％乙酸乙酯/异己烷加载，然后用20％至50％乙酸乙酯/异己烷洗脱)，得到所需物质(31.94g)。1H NMRδ(CDCl3)7.38-7.32(m，1H)，7.22-7.13(m，3H)，3.75-3.68(m，2H)，3.41(t，2H)，3.32-3.14(m，2H)，3.03-2.91(m，2H)，2.72(t，2H)，2.54-2.36(m，2H)，1.85-1.71(m，2H)，1.42(s，9H)。HPLC：92.31％(220nm)[M+H-Boc]+＝274.1(计算值＝373.1478)(多模式+)。
f)[2-(2-氯苯基)乙基]{3-[(2-氧代乙基)硫基]丙基}氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0000054819380000431
将三氧化硫：吡啶复合物(30.52g)溶解在DMSO(200mL)中，在室温和氮气气氛下搅拌15分钟。加入DCM(100mL)，然后一次性加入[2-(2-氯苯基)乙基]{3-[(2-羟基乙基)硫基]丙基}氨基甲酸叔丁酯(23.9g)和许尼希碱(Hunigs base)(63.5mL)于DCM(160mL)中的溶液(放热)。将所得混合物在环境温度搅拌15分钟。反应混合物用乙酸乙酯稀释，先后用水、1N HCl和饱和碳酸氢钠溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。物质通过硅胶柱色谱来纯化(用20％乙酸乙酯/异己烷洗脱)，得到所需物质(12.43g)。1H NMRδ(CDCl3)9.46(t，1H)，7.36-7.32(m，1H)，7.21-7.13(m，3H)，3.40(t，2H)，3.29-3.13(m，4H)，3.02-2.90(m，2H)，2.45-2.34(m，2H)，1.82-1.69(m，2H)，1.49-1.36(m，9H)。
g)[2-(2-氯苯基)乙基]{3-[(2-{[(2R)-2-羟基-2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)硫基]丙基}氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0000054819380000432
将[2-(2-氯苯基)乙基]{3-[(2-氧代乙基)硫基]丙基}氨基甲酸叔丁酯(11.32g)溶解在甲醇(200mL)和乙酸(1.74mL)的混合物中。向溶液中加入7-[(1R)-2-氨基-1-羟基乙基]-4-羟基-1，3-苯并噻唑-2(3H)-酮盐酸盐(8.0g)，将混合物在室温和氮气气氛下搅拌1小时。加入氰基硼氢化钠(1.92g)并将混合物再搅拌2小时。真空除去溶剂，残余物用水稀释，用0.880氨水碱化，并用乙酸乙酯(×3)萃取(在萃取期间用硅藻土过滤)。合并有机物，用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到棕色残余物(15.5g)。物质使用硅胶柱色谱来纯化(使用含有MeOH(2％、5％、10％、20％和30％且所有都含有1％0.880氨水)的DCM作为洗脱剂)，得到所需物质(6.67g)(38％收率)。1HNMRδ(DMSO)7.43-7.38(m，1H)，7.30-7.21(m，3H)，6.86(d，1H)，6.69(d，1H)，4.56(dd，1H)，3.23-3.10(m，2H)，2.88(t，2H)，2.71-2.48(m，8H)，2.46-2.39(m，2H)，1.72-1.62(m，2H)，1.40-1.22(m，9H)。HPLC：97.46％(220nm)[M+H]+＝582.1(计算值＝582.1863)(多模式+)。
h)7-[(1R)-2-({2-[(3-{[2-(2-氯苯基)乙基]氨基}丙基)硫基]乙基}氨基)-1-羟基乙基]-4-羟基-1，3-苯并噻唑-2(3H)-酮二氢溴酸盐
在0℃向搅拌的来自g)的Boc化合物(5.93g)于DCM(20mL)中的混悬液中加入三氟乙酸(20mL)，将所得混合物在氮气下搅拌30分钟。混合物用甲苯稀释，除去溶剂，然后与甲苯(×2)共沸。将残余物溶解在乙腈中，用48％HBr水溶液酸化并真空浓缩(没有浓缩至干)。混合物再用乙腈稀释，过滤收集所沉淀的固体，用乙腈洗涤并真空干燥，得到6.35g。存在3.8％的杂质(来自e)的异构体)，因此将物质重新溶解在乙腈∶水的1∶1混合物中并使用制备性HPLC来纯化(Sunfire 30×80mm C8柱；NH4OAc缓冲剂；历时10分钟从5％乙腈至50％乙腈)。所得物质在干燥器中在10毫巴用KOH和H2SO4干燥过夜。将所得二乙酸盐溶解在水中并用0.880氨水碱化。形成白色胶状物，因此将水溶液滗出，真空干燥胶状物，得到游离碱(4.11g)。将其溶解在热的乙醇中，过滤溶液，然后冷却至室温。溶液用48％HBr水溶液酸化并静置以结晶。过滤收集白色固体，用乙醇洗涤并真空干燥，得到3.81g(批次1)。1H NMRδ(DMSO)11.67(s，1H)，10.15(s，1H)，8.70(s，4H)，7.50-7.30(m，4H)，6.94(d，1H)，6.78(d，1H)，6.45(s，1H)，4.96-4.90(m，1H)，3.22-3.02(m，10H)，2.86-2.76(m，2H)，2.66(t，2H)，1.91(五重峰，2H)。HPLC：99.63％(220nm)[M+H]+＝482(计算值＝482.1339)(MultiMode+)。元素分析：
Figure BDA0000054819380000442
蒸干母液，然后用乙腈研磨。过滤收集固体，得到719mg(批次2)(共4.53g)。1H NMRδ(DMSO)11.67(s，1H)，10.15(s，1H)，8.80-8.60(m，4H)，7.50-7.29(m，4H)，6.94(d，1H)，6.78(d，1H)，6.45(s，1H)，4.96-4.89(m，1H)，3.22-3.00(m，10H)，2.85-2.76(m，2H)，2.66(t，2H)，1.90(五重峰，2H)。HPLC：99.20％(220nm)[M+H]+＝482(计算值＝482.1339)(MultiMode+)。
元素分析：
Figure BDA0000054819380000451
β 2 肾上腺素受体激动剂的生物学活性
由肾上腺素能β 2 介导的cAMP生成
细胞制备
在培养箱(37℃和5％CO2)中使H292细胞在225cm2烧瓶中在包含10％(v/v)FBS(胎牛血清)和2mM L-谷氨酰胺的RPMI培养基中生长。
实验方法
通过用AccutaseTM细胞脱附溶液处理15分钟将附着的H292细胞从组织培养烧瓶中取出。将烧瓶在加湿培养箱(37℃和5％CO2)中孵育15分钟。将脱附的细胞以0.05×106个细胞/mL重新混悬在RPMI培养基(包含10％(v/v)FBS和2mM L-谷氨酰胺)中。将5000个细胞/100μl加到用组织培养基处理的96孔板中的每个孔中，在加湿培养箱(37℃和5％CO2)中将细胞孵育过夜。将培养基取出，细胞用100μl测定缓冲液洗涤两次，用50μl测定缓冲液(包含10mM HEPES(pH 7.4)和5mM葡萄糖的HBSS溶液)置换。将细胞在室温静置20分钟，然后加入25μl咯利普兰(在包含2.4％(v/v)二甲基亚砜的测定缓冲液中制成且浓度为1.2mM)。将细胞与咯利普兰一起孵育10分钟，然后加入化合物A，将细胞在室温孵育60分钟。咯利普兰在测定中的最终浓度为300μM，载体的最终浓度为1.6％(v/v)二甲基亚砜。反应如下停止：除去上清液，用100μl测定缓冲液洗涤一次，用50μl细胞溶解缓冲液置换。将细胞单层在-80℃冷冻30分钟(或过夜)。
Alpha Screen TM  cAMP检测
cAMP(环膦腺苷)在细胞溶解物中的浓度使用AlphaScreenTM方法学来确定。，将冷冻的细胞板在板振荡器上解冻20分钟，然后将10μl细胞溶解物转移至96孔白色板中。将40μl与生物素化cAMP一起预孵育的混合性AlphaScreenTM检测珠子加到每个孔中，将板在室温避光孵育10小时。AlphaScreenTM信号使用EnVision分光光度计(Perkin-Elmer Inc.)按照制造商推荐的设置来测量。cAMP浓度通过参考在相同实验中使用标准cAMP浓度 所确定的校正曲线来确定。构建化合物A的浓度响应曲线，将数据拟合成四参数逻辑方程以确定pEC50和内在活性。在每次实验中将内在活性表达成相对于就福莫特罗所确定的最大活性的分数。结果示于表1中。
选择性测定
肾上腺素能α1D
膜制备
膜由表达重组人α1D受体的人胚肾293(HEK293)细胞来制备。将这些膜稀释在测定缓冲液(50mM HEPES，1mM EDTA，0.1％明胶，pH 7.4)中，使膜的最终浓度在最大和最小特异性结合之间提供合适的窗口。
实验方法
测定在U形底96孔聚丙烯板中进行。将10μl[3H]-哌唑嗪(0.3nM最终浓度)和10μl化合物A(10×最终浓度)加到每个试验孔中。对于每块测定板，针对在10μl媒介物(10％(v/v)DMSO在测定缓冲液中)(用于定义最大结合)存在下的[3H]-哌唑嗪结合或针对在10μl BMY7378(10μM最终浓度)(用于定义非特异性结合(NSB))存在下的[3H]-哌唑嗪结合，一式八份进行实验。然后加入膜，使最终体积为100μl。将板在室温孵育2小时，然后使用96孔板Tomtec细胞收集器过滤到经PEI涂覆的GF/B滤板(在测定缓冲液中预浸泡1小时)上。在4℃用250μl洗涤缓冲液(50mM HEPES，1mM EDTA，pH 7.4)洗涤五次以除去未结合的放射性。将板干燥，然后使用Packard板密封剂将板由下部密封，将MicroScint-O(50μl)加到每个孔中。将板密封(TopSeal A)，过滤器所结合的放射性用闪烁计数器(TopCount，Packard BioScience)使用3分钟计数方案来测量。
总特异性结合(B0)通过从平均最大结合中扣除平均NSB来确定。也从由所有其它孔得到的值中扣除NSB值。将这些数据表达成占B0的百分比。化合物浓度-作用曲线(对[3H]-哌唑嗪结合的抑制)使用范围通常为0.1nM至10μM的系列稀释度来确定。将数据拟合成四参数逻辑方程以确定化合物效力，将其表达成pIC50(对[3H]-哌唑嗪结合产生50％抑制的摩尔浓度的负对数)。结果示于下表1中。
肾上腺素能β1
膜制备
包含重组人肾上腺素能β1受体的膜得自Euroscreen。将这些膜稀释在 测定缓冲液(50mM HEPES，1mM EDTA，120mM NaCl，0.1％明胶，pH 7.4)中，使膜的最终浓度在最大和最小特异性结合之间提供合适的窗口。
实验方法
测定在U形底96孔聚丙烯板中进行。将10μl[125I]-碘代氰基吲哚洛尔(0.036nM最终浓度)和10μl化合物A(10×最终浓度)加到每个试验孔中。对于每块测定板，针对在10μl媒介物(10％(v/v)DMSO在测定缓冲液中)(用于定义最大结合)存在下的[125I]-碘代氰基吲哚洛尔结合或针对在10μl普萘洛尔(10μM最终浓度)(用于定义非特异性结合(NSB))存在下的[125I]-碘代氰基吲哚洛尔结合，一式八份进行实验。然后加入膜，使最终体积为100μl。将板在室温孵育2小时，然后使用96孔板Tomtec细胞收集器过滤到经PEI涂覆的GF/B滤板(在测定缓冲液中预浸泡1小时)上。在4℃用250μl洗涤缓冲液(50mM HEPES，1mM EDTA，120mM NaCl，pH 7.4)洗涤五次以除去未结合的放射性。将板干燥，然后使用Packard板密封剂将板由下部密封，将MicroScint-O(50μl)加到每个孔中。将板密封(TopSeal A)，过滤器所结合的放射性用闪烁计数器(TopCount，Packard BioScience)使用3分钟计数方案来测量。
总特异性结合(B0)通过从平均最大结合中扣除平均NSB来确定。也从由所有其它孔得到的值中扣除NSB值。将这些数据表达成占B0的百分比。化合物浓度-作用曲线(对[125I]-碘代氰基吲哚洛尔结合的抑制)使用范围通常为0.1nM至10μM的系列稀释度来确定。将数据拟合成四参数逻辑方程以确定化合物效力，将其表达成pIC50(对[125I]-碘代氰基吲哚洛尔结合产生50％抑制的摩尔浓度的负对数)。结果示于下表1中。
多巴胺D2
膜制备
包含重组人多巴胺D2s亚型受体的膜得自Perkin Elmer。将这些膜稀释在测定缓冲液(50mM HEPES，1mM EDTA，120mM NaCl，0.1％明胶，pH 7.4)中，使膜的最终浓度在最大和最小特异性结合之间提供合适的窗口。
实验方法
测定在U形底96孔聚丙烯板中进行。将30μl[3H]-螺哌隆(0.16nM最终浓度)和30μl化合物A(10×最终浓度)加到每个试验孔中。对于每块测定板，针对在30μl媒介物(10％(v/v)DMSO在测定缓冲液中)(用于定义最大结合)存 在下的[3H]-螺哌隆结合或针对在30μl氟哌啶醇(10μM最终浓度)(用于定义非特异性结合(NSB))存在下的[3H]-螺哌隆结合，一式八份进行实验。然后加入膜，使最终体积为300μl。将板在室温孵育2小时，然后使用96孔板Tomtec细胞收集器过滤到经PEI涂覆的GF/B滤板(在测定缓冲液中预浸泡1小时)上。在4℃用250μl洗涤缓冲液(50mM HEPES，1mM EDTA，120mM NaCl，pH7.4)洗涤五次以除去未结合的放射性。将板干燥，然后使用Packard板密封剂将板由下部密封，将MicroScint-O(50μl)加到每个孔中。将板密封(TopSeal A)，过滤器所结合的放射性用闪烁计数器(TopCount，Packard BioScience)使用3分钟计数方案来测量。
总特异性结合(B0)通过从平均最大结合中扣除平均NSB来确定。也从由所有其它孔得到的值中扣除NSB值。将这些数据表达成占B0的百分比。化合物浓度-作用曲线(对[3H]-螺哌隆结合的抑制)使用范围通常为0.1nM至10μM的系列稀释度来确定。将数据拟合成四参数逻辑方程以确定化合物效力，将其表达成pIC50(对[3H]-螺哌隆结合产生50％抑制的摩尔浓度的负对数)。结果示于表3中。
表3
  化合物 β2pEC50   β2内在活性 α1结合pIC50   β1结合pIC50  D2结合pIC50
  BA1   8.2   0.8   6.6   ＜5   6.1
  BA2   8.3   0.7   ＜6.1   ＜5   5.6
  BA3   9.2   0.8   7.6   6.9   5.8
体外组合模型
在由豚鼠分离的用醋甲胆碱预收缩的气管环上评价化合物活性
以下方案可用于评价与β2激动剂组合的本发明毒蕈碱性M3受体拮抗剂的作用。
β2肾上腺素受体激动剂和/或毒蕈碱性M3受体拮抗剂的加入使所分离的用毒蕈碱性激动剂醋甲胆碱预收缩的豚鼠气管环松弛。雄性白化Dunkin Hartley豚鼠(300-350g)通过颈脱位法来处死并切下气管。除去附着的结缔组织并将气管切成环状节段(2-3mm宽)。将这些节段混悬在10ml含有改性Krebs溶液的器官浴槽中，所述改性Krebs溶液的组分(mM)为NaCl(117.56)、KCl(5.36)、NaH2PO4(1.15)、MgSO4(1.18)、葡萄糖(11.10)、NaHCO3(25.00)和CaCl2(2.55)。将其保持在37℃并用5％CO2/O2连续通气，向Krebs溶液中加入吲哚美辛(2.8μM)、皮质酮(10μM)、抗坏血酸(1mM)、CGP20712A(1μM)和酚妥拉明(3μM)，其中吲哚美辛用于防止由于环氧合酶产物的合成而出现 的平滑肌张力，皮质酮用于抑制摄取过程，抗坏血酸用于防止儿荼酚胺的氧化，及CGP20712A和酚妥拉明分别用于避免β1肾上腺素受体活化和α肾上腺素受体活化的任意合并作用。将气管环挂在两个不锈钢钩子之间，其中一个钩子与等长力(isometric force)传感器相连，而另一个钩子与器官浴槽中的固定物相连。记录等长力的变化。乙酰基-β-甲基氯化胆碱(醋甲胆碱)、吲哚美辛、皮质酮-21-乙酸酯、盐酸酚妥拉明、抗坏血酸及甲磺酸CGP20712A可由Sigma Chemical Company得到。将吲哚美辛溶解在10％w/v Na2CO3中，将皮质酮-21-乙酸酯溶解在乙醇中，且将其它化合物溶解在DMSO中。将毒蕈碱性拮抗剂和福莫特罗稀释在Krebs中，然后加到组织中，且DMSO在浴液中的水平＜0.1％。
在每次实验开始时，向组织施加1.0g.wt.的力，并历时30分钟平衡期使其恢复直到保持稳定。然后使组织与1μM毒蕈碱性激动剂醋甲胆碱接触以评价组织活力。组织通过更换Krebs浴液三次来洗涤。30分钟后，组织再次用1μM醋甲胆碱预收缩。当收缩达到稳态时，向浴液介质中加入1nM福莫特罗、10nM毒蕈碱性拮抗剂或这两者的组合并静置60分钟。
数据使用针对Windows软件的ADInstruments Chart5来收集，在加入醋甲胆碱前和在其响应达到稳态后测量所产生的张力。对毒蕈碱性拮抗剂和/或福莫特罗的响应在加入它们后每隔10分钟测量一次。将所有响应表达为对由醋甲胆碱诱导的收缩的抑制百分比。
体内组合模型
在经麻醉的豚鼠中评价肺功能
以下方案可用于评价与β2激动剂组合的本发明毒蕈碱性M3受体拮抗剂的作用。
对雄性Dunkin-Hartley豚鼠(300-600g)进行称重并在可恢复性气体麻醉(5％氟烷/氧气)下经由气管内途径给药媒介物(0.05M磷酸盐，0.1％吐温80，0.6％盐水，pH6)或化合物。在给药醋甲胆碱前两小时，向动物给药化合物或媒介物。在第一次给药支气管收缩剂前约30分钟，豚鼠用戊巴比妥(1mL/kg，60mg/mL溶液，腹膜内)麻醉。对气管进行插管并使用恒体积呼吸泵(Harvard Rodent Ventilator 683型)以60次呼吸/分钟的速率和5mL/kg的潮气量对动物进行换气。对颈静脉进行插管以给药醋甲胆碱或保持麻醉(0.1mL戊巴比妥溶液，60mg/mL，根据需要)。
将动物转移至Flexivent System(SCIREQ，Montreal，Canada)中以测量气道阻力。以60次呼吸/分钟和5mL/kg潮气量对动物进行换气(拟正弦换气模式)。施加大小为2-3cm H2O的呼气末正压。呼吸阻力使用Flexivent“快照”设备(持续时间为1秒且频率为1Hz)来测量。一旦得到稳定的基线阻力值，就经由颈静脉插管以约4分钟的间隔按增加的剂量(0.5、1、2、3和5μg/kg，静脉内)向动物给药醋甲胆碱。每次给药支气管收缩剂后，记录阻力峰值。肺功能测量结束后，通过静脉内给药约1.0mL戊巴比妥钠(Euthatal)对豚鼠进行安乐死。
化合物在支气管收缩剂的每个剂量下所产生的支气管保护百分比如下计算：
Figure BDA0000054819380000501
其中R媒介物变化百分比(％)为媒介物处置组中气道阻力最大变化百分比的平均值。

Claims (12)

1.一种药物产品，其以组合方式包含第一活性成分和第二活性成分，所述第一活性成分为选自以下的毒蕈碱性拮抗剂：
(R)-1-[5-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-[1，3，4]噁二唑-2-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X；
(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X；
(R)-3-(3-氟-4-甲基-苯氧基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X；
(R)-3-(3-氟-苯基硫基)-1-[3-(羟基-二苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X；
(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(4-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X；
其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子；及
所述第二活性成分为β2肾上腺素受体激动剂。
2.权利要求1的产品，其中所述第一活性成分为毒蕈碱性拮抗剂，其为溴化物盐。
3.权利要求1或权利要求2的产品，其中所述β2肾上腺素受体激动剂为福莫特罗。
4.权利要求1或权利要求2的产品，其中所述β2肾上腺素受体激动剂选自：
N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酰胺，
N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-3-[2-(3-氯苯基)乙氧基]丙酰胺，及
7-[(1R)-2-({2-[(3-{[2-(2-氯苯基)乙基]氨基}丙基)硫基]乙基}氨基)-1-羟基乙基]-4-羟基-1，3-苯并噻唑-2(3H)-酮，
或其可药用盐。
5.权利要求1或权利要求2的产品，其中所述β2肾上腺素受体激动剂为N-环己基-N3-[2-(3-氟苯基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-β-丙氨酸酰胺或其可药用盐。
6.权利要求1的产品，其中所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为N-[2-(二乙基氨基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-3-[2-(萘-1-基)乙氧基]丙酰胺或其可药用盐。
7.权利要求1的产品，其中所述毒蕈碱性受体拮抗剂为(R)-1-[3-((R)-环己基-羟基-苯基-甲基)-异噁唑-5-基甲基]-3-(3-氟-苯氧基)-1-氮鎓-二环[2.2.2]辛烷X，其中X表示可药用一价酸或多价酸的阴离子，及所述β2肾上腺素受体激动剂为N-环己基-N3-[2-(3-氟苯基)乙基]-N-(2-{[2-(4-羟基-2-氧代-2，3-二氢-1，3-苯并噻唑-7-基)乙基]氨基}乙基)-β-丙氨酸酰胺或其可药用盐。
8.权利要求1-7中任一项的产品在制备用于治疗呼吸系统疾病的药物中的用途。
9.权利要求7的用途，其中所述呼吸系统疾病为慢性阻塞性肺病。
10.治疗呼吸系统疾病的方法，所述方法包括向有此需要的患者同时、依次或分开给药：
(a)一定剂量(治疗有效剂量)的第一活性成分，其为权利要求1或权利要求2中定义的毒蕈碱性受体拮抗剂；和
(b)一定剂量(治疗有效剂量)的第二活性成分，其为β2肾上腺素受体激动剂。
11.一种试剂盒，其包含第一活性成分的制剂和第二活性成分的制剂及任选的有关向有此需要的患者同时、依次或分开给药所述制剂的说明书，所述第一活性成分为权利要求1或权利要求2中定义的毒蕈碱性受体拮抗剂，所述第二活性成分为β2肾上腺素受体激动剂。
12.一种药物组合物，其以混合物形式包含第一活性成分和第二活性成分，所述第一活性成分为权利要求1或权利要求2中定义的毒蕈碱性受体拮抗剂，所述第二活性成分为β2肾上腺素受体激动剂。
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